Introduction
L'obésité est un problème de santé en plein essor dans les pays développés et en développement. Il a été rapporté comme étant l' une des conditions coexistant fréquemment associés à la stéatose non alcoolique du foie (stéatose hépatique non alcoolique), avec une prévalence variant entre 30 et 100 pour cent chez les patients NAFLD 1. En raison de la forte corrélation entre le foie gras et l' obésité, (DIO) modèles induits par l' alimentation de souris obèses sont largement utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires complexes associés au développement de NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. La stéatose hépatique est la première étape de NAFLD, et il peut évoluer vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH), la cirrhose, et finalement, un cancer du foie 7. Par conséquent, l'objectif global de cette méthode est de générer des modèles animaux et cellulaires des conditions stéatosiques hépatiques et de provide protocoles détaillés pour la mesure des lipides efficace et précis. Ces modèles et mesures sont également utiles pour l'étude d'autres troubles métaboliques, tels que la résistance à l'insuline et le diabète de type 2.
Comme l'obésité est identifiée comme l'un des principaux facteurs de risque pour la SHNA, une haute teneur en matières grasses, de haute-sucrose alimentation (HFHS) qui imite le style occidental régime riche en graisses est utilisé pour induire l'obésité chez les souris. Par la suite, le degré de stéatose hépatique peut être évaluée à l'aide de différentes méthodes. Tout d'abord, le poids corporel et de l'analyse de la composition corporelle avec la résonance magnétique nucléaire (RMN) montrent l'accumulation de lipides pendant l'heure du repas. La masse grasse et la masse maigre peuvent être quantifiés de façon non invasive et en temps réel.
En outre, l'imagerie par résonance magnétique (IRM) est utilisée pour montrer à la fois l'ensemble du corps et de la répartition du foie de la graisse. Le signal de niveau de gris de l'analyse de l'IRM peut être convertie en une image lisible en pseudo-couleurs, et l'intensité dele niveau de gris et la couleur est hémi-quantifiable. Cette technologie offre des avantages uniques pour la mesure de l'accumulation des lipides dans les animaux vivants. Deuxièmement, l'analyse histologique du foie est la méthode la plus couramment utilisée pour déterminer la stéatose hépatique. Hématoxyline et à l'éosine (H & E) fournit des informations de coloration histologique, comme une morphologie hépatocytaire et l'infiltration des macrophages, tandis que l'huile rouge O coloration indique la taille et la position des gouttelettes lipidiques dans les hépatocytes. En troisième lieu, l'analyse de la teneur en lipides par extraction au chloroforme / méthanol est une mesure précise et quantitative des lipides hépatiques. Total des taux de triglycérides et de cholestérol peuvent être mesurés avec des méthodes biochimiques. Fait important, l'analyse de l'extraction des lipides et à l'huile rouge O coloration peuvent également être utilisés dans génétiquement manipulées ou traitées pharmaceutiquement hépatocytes.
L'avantage du présent procédé est son utilisation d'approches multiples optimisées pour générer des modèles de stéatose hépatiqueet de caractériser complètement les phénotypes in vivo et in vitro. Les modèles DIO de souris peuvent récapituler les pathologies métaboliques et phénotypes de la maladie du foie gras humain. D' autres paramètres métaboliques chez l' homme peuvent être reproduits dans ce modèle ainsi 8. La génération du modèle d'hépatocytes stéatosique en réponse à glucose élevé, plus l'insuline est efficace, utile, et surmonte la limitation des travaux coûteux et fastidieux souris. Pris ensemble, ces méthodes sont suffisantes et indispensables pour l'étude de la dysfonction hépatique des lipides et de la résistance à l'insuline lors de la surcharge des éléments nutritifs.
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Protocol
Tous les animaux protocoles expérimentaux ont été approuvés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel à l'Institut des sciences de la nutrition, les instituts de Shanghai des sciences biologiques, Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine).
1. DIO Modèle de souris
- HFHS alimentation
- Nourrir les huit semaines vieux mâle C57BL / 6 avec un HFHS qui contient 40 kcal% de matières grasses et 40 kcal% de saccharose. Maison eux dans 12 h conditions de cycle sombre lumière.
- Garder la souris en HFHS état alimentation-alimentation pour quatre à seize semaines. Vérifiez l'hebdomadaire de poids corporel.
- Body analyse de la composition et de pseudo-couleur analyse d'image
- Soumettre les souris à une analyse de composition corporelle de l'analyseur.
- Fixer des souris conscientes, non anesthésié dans un tube en plastique dans le. Mesurer la masse de graisse corporelle, la masse maigre, et les fluides en utilisant un système RMN, comme décrit précédemment 2.
- Balayer tout le corps de chaque souris en utilisant un système d'IRM.
- Anesthésier les souris avec 1% d'Avertin par injection intrapéritonéale (25 ul / g) et d'effectuer l'analyse d'imagerie dans des tubes en verre spécialisés.
NOTE: Le processus d'imagerie dure près de 0,5 h pour chaque souris. Lorsque la mesure est terminée, retourner les souris dans leur cage.
- Anesthésier les souris avec 1% d'Avertin par injection intrapéritonéale (25 ul / g) et d'effectuer l'analyse d'imagerie dans des tubes en verre spécialisés.
- Numériser l'ensemble des corps des souris en dorsale, au milieu, et les couches ventrales; balayer le foie dans la direction verticale. Utiliser un aimant 0,55 T et les paramètres instrumentaux suivants: K espace = 192 x 256 um, l'épaisseur de la section = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, nombre de balayages = 8. balayage en utilisant le même état magnétique pour les tous les groupes de souris.
- Carte de l'image en niveaux de gris sur une image pseudo-couleur en fonction de l'intensité du signal 9.
- Soumettre les souris à une analyse de composition corporelle de l'analyseur.
- l' euthanasie Souris
- Stériliser dissectioutils ng, tels que pinces et ciseaux.
- Verser isoflurane suffisante sur une serviette en papier et laissez l'isoflurane volatiliser dans un bocal en verre. Assurez-vous que les souris sont euthanasiées par l'isoflurane.
- Fixer les souris sur une table d'opération. Vaporiser chaque abdomen avec 75% d'éthanol, faire une incision dans le derme du processus xiphoïde avec des ciseaux, et déchirer le derme longueur à travers la ligne médiane avec les mains pour exposer le péritoine.
- Serrer l'appendice xiphoïde avec une pince et couper le sens de la largeur du péritoine à travers le fond des nervures pour exposer les viscères.
- Recueillir le sang dans des tubes EDTA revêtu par ponction cardiaque.
- Couper le diaphragme le long du foie et retirer délicatement le foie des enterocoelia en utilisant des ciseaux fins. Couper trois morceaux de tissu du foie pour les mesures de lipides suivantes: a) 6 x 3 x 3 mm pour une coloration H & E, b) 6 x 3 x 3 mm pour l'Oil Red O coloration, et c) de 20 à 40 mg de foie chloroforme / l'extraction du méthanol.
- Coloration H & E
- Fixer le foie dans 4% tamponné au phosphate acétate de formaline à 4 ° C pendant une nuit, puis l'incorporer dans de la cire de paraffine.
- Couper des sections de paraffine (5 um) et les monter sur des lames de verre pour coloration H & E, comme décrit précédemment 3, 10.
- Oil Red O coloration
- préparation Regent
- Préparer la solution de travail Oil Red O avec 10% de formaline, 60% d'isopropanol, l'hématoxyline, et le glycérol gelée. Dissoudre 0,5 g d'huile rouge O poudre avec 100 ml d'isopropanol et chauffer dans un bain de 60 ° pour obtenir une solution stock à 0,5%.
- Diluer avec de l' eau distillée deux fois (ddH 2 O) dans un rapport de 3: 2 (3 ml de solution mère et 2 ml de ddH 2 O). Filtrer la solution de travail et laisser reposer pendant au moins 10 min à température ambiante.
- Incluez le foie de la température de coupe optimale (OCT) composé dans apboîte d'encastrement lastic. Congeler à -20 ° C pendant 30 min. Coupez-les en sections de 8 pm dans un microtome de congélation, monter le tissu sur une lame, et placez-le à température ambiante pendant 30 min.
- Placez une serviette en papier dans le fond d'une cuve de coloration et verser une petite quantité de formol à 10% pour mouiller la serviette en papier. Placer la lame dans le bain de coloration et de fixer les coupes congelées dans des vapeurs de formaldéhyde pendant 5 min à 4 ° C.
- Plonger la lame dans 60% d'isopropanol dans le bain de coloration pendant 3 s; répéter une fois.
- Ajouter quelques gouttes de solution de travail Oil Red O à la diapositive pour couvrir tous les tissus et incuber pendant 15 min. Protéger le tissu de la lumière à température ambiante.
- Rincer la lame dans une nouvelle isopropanol à 60% dans le bain de coloration pendant 3 s; répéter deux fois.
- Rincer délicatement la lame à travers l'eau distillée deux fois et éliminer l'eau autour du tissu. Assurez-vous de ne pas sécher le tissu.
- Placez la lame dans hématoxyline pendant 1 min et rincer doucement à l'eau du robinet pendant 5-10min. Rincer délicatement la lame dans l'eau distillée deux fois et garder le dans de l'eau distillée jusqu'à ce que prêt à mettre sur la lamelle.
- Chauffer la gelée de glycérol dans le micro-ondes et de placer plusieurs gouttes sur le dessus du tissu. Placez délicatement la lamelle sur le dessus et de prendre soin de ne pas former des bulles.
- Observer la tache sous un microscope et capturer des images caractéristiques en utilisant 20X et 40X objectifs.
- préparation Regent
- Mesure des lipides hépatiques
- Placer le tissu du foie disséqué dans un nouveau tube de centrifugation de 2 ml en matière plastique. Homogénéiser dans 1 ml de PBS avec un homogénéiseur et transférer le lysat dans un nouveau tube en verre de 15 ml.
- Ajouter 5 ml de chloroforme / méthanol (2: 1, v / v) solution, vortex vigoureusement le mélange pendant 1 min, et laisser reposer pendant 2 h sur la glace.
- Centrifugeuse à 1.650 xg pendant 10 min à 4 ° C; le mélange doit être séparée en 3 couches: la couche supérieure du méthanol, le disque de la protéine du milieu, et le chloroforme et les lipides de fond.
- Tran sfer la phase inférieure dans un nouveau tube de verre en utilisant un verre pipette Pasteur; il n'y a pas besoin d'obtenir chaque goutte de la fraction de queue. Réglez le tube de côté sur la glace.
- Ajouter 600 ul de 4 mM de MgCl2 et 1,5 ml de chloroforme à la fraction de surnageant à gauche dans le tube précédent et vortexer vigoureusement. Incuber sur la glace pendant 30 min et centrifuger à 1.650 xg pendant 10 min à 4 ° C.
- Combiner la phase inférieure du premier tube de phase inférieure en utilisant une pipette Pasteur. Jeter les couches moyennes et supérieures.
- Evaporer le chloroforme sous azote gazeux dans un bain à 37 °. Laver les côtés des tubes en verre à fond avec 200 ul de 1% de Triton X-100 / chloroforme (v / v). S'évaporer sous azote gazeux. Dissoudre le lipide avec 200 ul de ddH 2 O et vortex bien pour faire l'émulsion finale.
- Mesurer le triglycéride totale (TG) et le cholestérol (TC), les niveaux en utilisant un kit de triglycérides ou de cholestérol selon le protocole du fabricantxref "> 3.
Remarque: Les valeurs lipidiques sont normalisées par rapport à celles des concentrations de protéines dans l'homogénat initial, tel que déterminé par la quantification des protéines 3.
2. Primaire souris hépatocytes Modèle
- Isolement des hépatocytes primaires de souris
- Anesthésier chaque souris avec 6% de l'hydrate de chloral (10 ul / g par voie intrapéritonéale).
- Isoler hépatocytes primaires, comme décrit précédemment 10. Cultiver des cellules sur des lamelles de verre revêtues de collagène dans une plaque à 6 puits à une coloration rouge d'huile O. Pour l' extraction des lipides, ensemencer les cellules sur 10 cm boîte de culture cellulaire 10.
- Traitement cellulaire et Oil Red O coloration
- Remplacer le milieu avec 2 ml de milieu de famine et incuber à 37 ° C pendant 24 h. Traiter avec 30 mM de glucose et 100 nM d'insuline. Incuber dans un incubateur à 37 ° C, culture pendant 24 h.
- Aspirer le milieu. Ajouter 2 mL de PBS et agiter doucement pour rincer le milieu; répéter une fois.
- Fixer la lamelle à la lame avec une bande de caoutchouc. Exposer les cellules adhérentes à la surface extérieure. Effectuer la coloration Oil Red O comme décrit ci-dessus (étape 1.5).
NOTE: Les niveaux de base de l'accumulation de lipides sont stimulés avec une glycémie élevée, plus le traitement de l'insuline après privation de sérum. Les gouttes de lipides sont visualisés par Oil Red O coloration.
- Mesure des lipides
- Traiter les hépatocytes avec glucose élevé, plus l'insuline dans le même état (étape 2.2.1). Ajouter 1 ml de PBS à chaque boîte de culture cellulaire de 10 cm. Grattez les cellules et les récolter dans de nouveaux tubes de verre de 15 ml, à partir de laquelle des aliquotes de 100 ul sont transférés dans des tubes frais de 1,5 ml pour la quantification des protéines.
- Ajouter 4 ml de chloroforme / méthanol (2: 1, v / v) à 900 ul de cellules restantes. Soniquer pour approximativement 20 bips, puis vortexer vigoureusement pour libérerles lipides dans les cellules. Incuber le mélange sur de la glace pendant 2 h. Effectuer l'extraction des lipides (étape 1.6).
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Representative Results
Comme le montre la figure 1A, le poids du corps de la souris a été porté à 45 ± 1,2 g après 16 semaines de HFHS alimentation, qui est d' environ 1,5 fois plus élevée que dans le groupe régime alimentaire chow. La composition corporelle analyses RMN montrant la masse grasse et la masse maigre de souris sont indiqués (figure 1B). La distribution de graisse du corps tout entier et du foie ont été déterminées par IRM, et représentatives d' images en pseudo-couleurs, les souris conscientes en temps réel sont présentés sur la figure 1C-D. La composition du poids corporel et du corps ont été mesurés et visualisée pendant le processus d'alimentation de l'alimentation HFHS.
À disséquer les phénotypes stéatosiques, les souris ont été sacrifiées et une analyse histologique du foie a été réalisée. Le H & E et Oil Red O coloration des foies sont présentés dans la figure 2A-B, dans lequel les gouttelettes lipidiques grossissent et occupent les espaces les plushépatocytes après 4 mois de HFHS régime alimentaire. Le degré de stéatose hépatique des souris de régime alimenté HFHS est facilement visualisé en comparant avec des souris de régime alimenté chow. Les principaux composants du lipide, tels que les triglycérides et le cholestérol, ont été mesurés par extraction chloroforme / méthanol (figure 2C). Chez les souris DIO, la surcharge en nutriments en excès causé l'accumulation de triglycérides dans le foie anormal. Avec les données de RMN, l'IRM et l'analyse histologique, le degré de dépôt de lipides peut être déterminée de façon efficace et précise.
Comme on le voit sur la figure 3, les niveaux des lipides dans les hépatocytes primaires ont été induites par l' insuline glucose plus élevée pendant 24 h. Les gouttelettes de lipides accumulés ont été déterminées par coloration à l' huile rouge O (figure 3A), et l'analyse quantitative des lipides a été utilisé par la suite pour mesurer les taux de triglycérides et de cholestérol dans les hépatocytes (figure 3B). Basé sur cecimodèle, les effets de la modification génétique ou d'un traitement pharmaceutique sur l'homéostasie des lipides dans les hépatocytes peut être étudiée d'une manière efficace et rapide.
Figure 1. Haute teneur en matière grasse, régime riche en saccharose (HFHS) augmente l' obésité et la stéatose hépatique chez la souris. Huit semaines d'âge C57BL mâle / 6 souris ont été nourries sur un chow ou un régime HFHS pendant 8 semaines et 16 semaines, respectivement. Poids (A) du corps des souris. Composition (B) du corps des souris. (C - D) image par résonance magnétique représentant de la souris et le foie. La zone blanche dans l'image d'échelle de gris indique la graisse, tandis que la zone rouge dans l'image pseudo-couleur indique la graisse. Les données sont représentées par la moyenne ± l'erreur standard (SEM) n = 5-8. * P <0,05 par rapport aux souris de régime alimenté chow. Les barres d'erreur représentent la SEM. Statisticaanalyse de l a été réalisée en utilisant le test t de l'apparié, deux tailed étudiants. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Analyse de la stéatose hépatique chez les souris nourries avec un régime HFHS. Huit semaines d'âge C57BL mâle / 6 souris ont été nourries sur un chow ou un régime HFHS pendant 8 semaines et 16 semaines, respectivement. (A) de la morphologie brute représentant de enterocoelia et le foie. (B) représentant H & E et Oil Red O coloration (barres d'échelle: 50 um). Oil Red O colore la graisse et la graisse neutre, et les points rouges indiquent des gouttelettes lipidiques accumulés dans les hépatocytes. (C) , de triglycérides et de cholestérol total niveaux de l'extraction de lipides dans le foie en utilisant la méthode du chloroforme / méthanol. Les données ont été normalisées à til poids du foie, et sont représentés par la moyenne ± l'erreur standard (SEM) n = 5-8. * P <0,05 par rapport aux souris nourries avec un régime alimentaire chow. Les barres d'erreur représentent la SEM. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test t de l'apparié, deux tailed étudiants. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La stéatose hépatique est induite dans les hépatocytes primaires de souris exposées à haute glucose plus d' insuline. (A) Oil Red O coloration des hépatocytes primaires cultivées traitées avec ou sans glucose et de l' insuline, comme indiqué (barres d'échelle: 50 um). (B) au niveau de triglycéride dans les hépatocytes primaires a été mesuré et normalisé à la concentration en protéines. Les données sont représentées comme la moyenne ±l'erreur standard (SEM). * P <0,05 par rapport au groupe témoin. Les barres d'erreur représentent la SEM. L'analyse statistique a été effectuée en utilisant le test t de l'apparié, deux tailed étudiants. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
NAFLD est une série de maladies hépatiques progressives qui est associée au syndrome métabolique, l' obésité, la résistance à l'insuline, ou diabète de type 2 (DT2) 11. La caractéristique de NAFLD est stéatose, l'accumulation de lipides dans les hépatocytes. Ici, un éventail de méthodes est présentée pour caractériser les phénotypes et les paramètres de la stéatose hépatique utilisant des souris DIO et les hépatocytes primaires de souris. Cette procédure pourrait être utile pour élucider les mécanismes moléculaires de NAFLD et d'autres maladies métaboliques.
La combinaison in vivo et dans des essais in vitro, ces procédés fournissent des analyses et des évaluations globales de la stéatose hépatique. À l'heure actuelle, les modèles animaux de la stéatose hépatique non alcoolique se composent principalement de modèles génétiques et alimentaires. Le régime HFHS utilisé ici est destiné à imiter le style de régime moderne et est suffisante pour induire l'obésité et la stéatose hépatique chez la souris. Cependant, pour étudier les mécanismes moléculaires dans le déveppement de la déréglementation des lipides, le dosage à base de cellules contient des avantages évidents sur l'étude des animaux, y compris une manipulation aisée par mutation génétique ou un traitement pharmacologique, ainsi que des coûts relativement faibles et des engagements de temps. Pour générer une stéatose hépatique primaire des hépatocytes de souris, des concentrations élevées de glucose plus d' insuline sont utilisées pour induire l' accumulation de lipides, qui est un procédé nouveau et efficace dans un modèle in vitro pour mimer in vivo , une hyperglycémie et une hyperinsulinémie induite par l' alimentation. Ce traitement est également applicable à d'autres lignées de cellules hépatiques, telles que des cellules HepG2. Étant donné que les hépatocytes génétiquement modifiés sont accessibles à une variété de traitements pharmaceutiques, le modèle in vitro dans stéatosique décrit ci surmonte les limitations et les étapes chronophages pour la génération de modèles animaux en utilisant des approches et des pertes intensité forte de fonction.
Les analyses de la composition du corps, y compris la RMN et l'IRM, fournir les données non-invasive et en temps réel surdes lipides dans le corps entier et le foie. Il est un gain de temps non-invasive, visualisable, et la mesure semi-qualitative. En outre, la précision des analyses de la composition du corps peut être grandement améliorée en combinant d'autres mesures histologiques et biochimiques. Il est essentiel et nécessaire pour déterminer la stéatose hépatique in vivo et in vitro en utilisant coloration H & E, Oil Red O coloration, et la mesure des lipides, qui sont des mesures étalon-or pour le diagnostic et le classement de la stéatose hépatique.
L'une des limites de la présente méthode est son incapacité à mesurer l'inflammation et dépôt de collagène quand stéatose simple progresse à l'hépatite, la fibrose, et finalement, la cirrhose et le cancer du foie. Étant donné que les souris obèses induites par l'alimentation ont un faible risque pour le développement de NASH, le protocole actuel est suffisant pour évaluer la stéatose hépatique chez les souris DIO. Cependant, dans l'état de la NASH, d'autres mesures biochimiques, telles que Alani plasmatiquesne aminotransférase (ALT) et aspartate aminotransférase (AST) les niveaux, devraient être utilisés.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Financement: Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation naturelles de la Chine (n ° 81270930, 31471129 et 31671224) et les Cent Talents Programme de l'Académie chinoise des sciences (2013OHTP04) à YL
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1 mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10 cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet (HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
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