Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

ניתוח אופטימלי של doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השמנה היא בעיה בריאותית המתפתחת במדינות מפותחות ומתפתחות. זה כבר דווח להיות אחד מחלות רקע קשורה לעיתים קרובות עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עם שכיחות הנע בין 30 ל -100 אחוזים בחולים NAFLD 1. בשל הקשר החזק בין כבד שומני והשמנה, שמנים-induced דיאטה (DIO) במודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים מורכבים הקשורים בפיתוח NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosis כבדיה היא השלב המוקדם של NAFLD, וזה יכול להתקדם steatohepatitis אלכוהולי (NASH), שחמת כבד, ובסופו של דבר, סרטן כבד 7. לכן, המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מודלים של בעלי חיים ותא של תנאי steatotic בכבד ל- PRפרוטוקולי ovide מפורטים למדידת שומנים יעילה ומדויקת. מודלים ומדידות אלה שימושיים גם עבור החקירה של הפרעות מטבוליות אחרות, כגון עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2.

כפי מזוהה שמן להיות אחד מגורמי הסיכון המרכזיים עבור NAFLD, א-שומן גבוה, סוכרוז דיאטה (HFHS) המחקה את הדיאטה עתיר שומן בסגנון המערבי משמשת לגרום להשמנה בעכברים. בהמשך לכך, מידת steatosis הכבד ניתן להעריך באמצעות שיטות שונות. ראשית, משקל הגוף וניתוח הרכב הגוף עם תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להראות את הצטברות השומנים במהלך שעת ההאכלה. מסת שומן המסה רזה ניתן לכמת באופן פולשני בזמן אמת.

בנוסף, הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) משמשת כדי להראות הוא את הגוף ואת חלוקת הכבד של שומן. האות בגווני אפור של ניתוח MRI ניתן להמיר תמונה פסאודו צבע קריא, ואת עוצמתאת הגוון האפור והצבע הוא חם לכימות. טכנולוגיה זו מספקת יתרונות ייחודיים למדידת הצטברות שומנים בבעלי חיים. שנית, ניתוח היסטולוגית של הכבד הוא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע steatosis בכבד. מכתים Hematoxylin ו Eosin (H & E) מספק מידע היסטולוגית, כגון מורפולוגיה hepatocyte וחדירה מקרופאג, בעוד מכתים האדום O שמן מראה את הגודל והמיקום של טיפות השומנים ב hepatocytes. שלישית, ניתוח תוכן השומנים באמצעות מיצוי כלורופורם / מתנול הוא מדידה מדויקת וכמותית של שומנים בכבד. רמות הטריגליצרידים והכולסטרול סה"כ ניתן למדוד עם שיטות ביוכימיות. חשוב לציין, ניתוח שאיבת שומנים מכתים האדום O שמן יכול לשמש גם מניפולציה גנטית או hepatocytes מטופלים pharmaceutically.

היתרון של השיטה הנוכחית הוא הניצול של גישות אופטימיזציה מרובות כדי ליצור מודלי steatotic כבדיםולאפיין את פנוטיפים הוא in vivo ו במבחנה מקיפה. המודלים העכבר DIO יכול לשחזר את פנוטיפים פתולוגיה מטבולית של מחלת כבד שומני האדם. פרמטרים מטבוליים אחרים בבני אדם ניתן לשכפל במודל זה, כמו גם 8. הדור של מודל hepatocyte steatotic בתגובה גבוהה גלוקוז בתוספת אינסולין יעיל, שימושי, מתגבר על מגבלה של עבודה עכבר זמן רב ויקר. יחדיו, שיטות אלה מספיקות וחיוניים לחקר תפקוד ועמידות לאינסולין שומנים בכבדים במהלך עומס יתר מזין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל פרוטוקולי הניסוי בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת טיפול שימוש בבעלי חיים המוסדית במכון למדעי תזונה, המכונה שנחאי עבור מדעי ביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (שנחאי, סין).

1. במודל עכבר DIO

  1. האכלת HFHS
    1. להאכיל את העכברים שמונה שבועות בן זכר C57BL / 6 עם HFHS המכיל 40 שומן קלוריות% סוכרוז% 40 קלוריות. לשכן אותם 12 שעות בתנאי מחזור כהה אור.
    2. שמור על עכברים במצב דיאטה האכלה HFHS במשך ארבע עד שש עשרה שבועות. בדוק שבועון משקל גוף.
  2. ניתוח הרכב הגוף ועל ניתוח התמונה פסאודו צבע
    1. נושא העכברים לניתוח מנתח הרכב הגוף.
      1. Secure מודע, עכברים הרדים לא בתוך שפופרת פלסטיק. מדוד את מסת השומן בגוף, מסת גוף רזה, ונוזלים באמצעות מערכת NMR, כפי שתואר לעיל 2.
    2. סרוק את כל הגוף של כל עכבר באמצעות מערכת MRI.
      1. להרדים את העכברים עם 1% Avertin באמצעות הזרקה הזרקה (25 μL / g) ולבצע ניתוח הדמיה צינורות זכוכית מיוחדים.
        הערה: תהליך ההדמיה נמשכת כמעט 0.5 שעות עבור כל עכבר. בסיום הבדיקה תושלם, להחזיר את העכברים לכלוב שלהם.
    3. סרוק את הגופים השלמים של עכברי גב, באמצע, ושכבות גחון; לסרוק את הכבד בכיוון האנכי. להשתמש במגנט 0.55 T והפרמטרים אינסטרומנטלי הבאים: שטח K = 192 x 256 מיקרומטר, עובי סעיף = 3 מ"מ, TE = 14.8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 מ"מ, FOVPhase = 100 מ"מ, ומספר סריקות = 8. סריקה באמצעות אותו המצב מגנטי עבור כל הקבוצות של עכברים.
    4. מפה את התמונה בגוונים האפורה על גבי תמונה פסאודו צבע בהתאם לאות בעצמה 9.
  3. המתת חסד עכבר
    1. לעקר dissectiכלי ng, כגון מלקחיים ומספריים.
    2. יוצקים isoflurane מספיק על מגבת נייר ולתת isoflurane לנדוף בתוך צנצנת זכוכית. ודא כי עכברים מומתים על ידי isoflurane.
    3. תקן העכברים על שולחן הניתוחים. ריסוס כל הבטן עם אתנול 75%, עושים חתך הדרמיס של תהליך xiphoid באמצעות מספריים, ולקרוע את הדרמיס לאורכו דרך קו האמצע עם הידיים כדי לחשוף את הצפק.
    4. הצמד את תהליך xiphoid עם מלקחיים לחתוך את לרוחב הצפק דרך התחתון של הצלעות לחשוף את הקרביים.
    5. איסוף דם צינורות מצופים EDTA על ידי לנקב לב.
    6. חותכים את הסרעפת לאורך הכבד ובזהירות להסיר את הכבד מן enterocoelia באמצעות מספריים בסדר. חותכים שלוש חתיכות של רקמת הכבד למדידות השומנים הבאים: א) 6 x 3 x 3 מ"מ עבור צביעת H & E, B) 6 x 3 x 3 מ"מ עבור מכתים O אדום שמן, ו- C) 20-40 מ"ג של הכבד עבור כלורופורם / מיצוי מתנול.
  4. צביעת H & E
    1. תקן הכבד אצטט פורמלין 4% שנאגרו פוספט ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ואז להטביע אותו שעוות פרפין.
    2. חותכים חלקים פרפין (5 מיקרומטר) ו הר להם על שקופיות זכוכית צביעת H & E, כפי שתואר לעיל 3, 10.
  5. מכתים שמן האדום O
    1. הכנת Regent
      1. כן פתרון עובד שמן האדום O עם 10% פורמלין, 60% isopropanol, Hematoxylin, וריבת גליצרול. ממיסים 0.5 גרם של אבקת O האדום שמן עם 100 מ"ל של isopropanol ומחממים אותו באמבט C 60 ° לעשות פתרון המניה 0.5%.
      2. לדלל עם מים מזוקקים פעמיים (DDH 2 O) בכל 3: יחס 2 (3 מ"ל של פתרון המניות ו -2 מ"ל של DDH 2 O). סנן את הפתרון עובד ולתת לעמוד במשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
    2. שבץ הכבד בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) מתחם apתיבת הטבעה lastic. להקפיא אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חותכים אותו לחלקים 8-מיקרומטר בתוך microtome מקפיא, הר רקמת בשקופית, ולמקם אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    3. מניחים מגבת נייר בתחתית גיגית מכתים לשפוך כמות קטנה של פורמלין 10% להרטיב מגבת נייר. מניחים את השקף באמבטיה מכתים ולתקן את הסעיפים קפוא אדי פורמלדהיד במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    4. טובלים את השקופית isopropanol 60% באמבטיה מכתים עבור 3 s; לחזור פעם.
    5. הוסף כמה טיפות של תמיסת עבודה האדומה שמן O לשקופית כדי לכסות את כל רקמות דגירה במשך 15 דקות. הגן על הרקמות מפני אור בטמפרטורת חדר.
    6. יש לשטוף את שקופית isopropanol 60% החדשים באמבטיה המכתימה עבור 3 s; וחזור פעמיים.
    7. לשטוף בעדינות את והחלק דרך מים מזוקקים פעמיים ולהסיר את המים סביב הרקמה. הקפד לא לייבש את הרקמה.
    8. מניחים את השקף ב Hematoxylin דקות 1 ולשטוף בעדינות עם מי ברז למשך 5-10דקות. לשטוף בעדינות את השקף במים מזוקקים פעמיים ולשמור על אותו במים מזוקקים עד מוכן לשים על coverslip.
    9. חממו את ג'לי גליצרול במיקרוגל ומניחים כמה טיפות על גבי הרקמה. בעדינות במקום coverslip על גבי ולדאוג שלא ליצור בועות.
    10. שים את הכתם מתחת למיקרוסקופ ללכוד תמונות מאפיינות באמצעות מטרות 20X ו 40X.
  6. מדידת שומנים בכבד
    1. מניחים את רקמת הכבד גזור צינור צנטריפוגות 2 מ"ל פלסטיק חדש. Homogenize ב 1 מ"ל של PBS עם homogenizer ולהעביר את lysate אל צינור זכוכית 15 מ"ל חדש.
    2. הוסף 5 מ"ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) פתרון, מערבולת את התערובת במרץ דקות 1, ולתת לעמוד במשך 2 שעות על הקרח.
    3. צנטריפוגה ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס; התערובת צריכה להתחלק 3 שכבות: שכבת מתנול העליונה, דיסק החלבון באמצע, ואת כלורופורם ושומנים התחתונים.
    4. טראן ספיר השלב התחתון לתוך צינור זכוכית חדש באמצעות pipet זכוכית פסטר; אין צורך לקבל כל טיפה של השבר התחתון. הגדר את הצינור בצד על קרח.
    5. להוסיף 600 μL של 4 מ"מ MgCl 2 ו -1.5 מ"ל של כלורופורם לשבר supernatant עזב בצינור מערבולת הקודם במרץ. דגירה על קרח למשך 30 דקות ו צנטריפוגות ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
    6. מערבב את השלב התחתון עם צינור השלב התחתון הראשון באמצעות pipet פסטר. מחק את השכבות הגבוהות ובינוניות.
    7. לאדות את כלורופורם תחת גז חנקן באמבט 37 מעלות צלזיוס. שטפו את צידי צינורות זכוכית ביסודיות עם 200 μL של 1% Triton X-100 / כלורופורם (v / v). להתאדות תחת גז חנקן. ממיסים את השומנים עם 200 μL של DDH 2 O ו מערבולת היטב כדי להפוך את תחליב הסופי.
    8. מדוד את הטריגליצרידים הכולל (TG) וכולסטרול (TC) רמות באמצעות ערכת טריגליצרידים או כולסטרול על פי פרוטוקול של היצרןXref "> 3.
      הערה: ערכי השומנים הם מנורמלים לאלה של ריכוזי חלבון homogenate הראשוני, כפי שנקבעו על ידי חלבון כימות 3.

2. דגם ראשונים העכבר Hepatocyte

  1. בידוד של hepatocytes העיקרי העכבר
    1. להרדים כל עכבר עם 6% הכלורל-הידרט (10 μL / g intraperitoneally).
    2. לבודד hepatocytes העיקרי, כפי שתואר לעיל 10. לגדל תאים על coverslips זכוכית מצופה קולגן צלחת 6-גם עבור מכתים O האדום השמן. להפקת שומנים בדם, זרע התאים על צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים 10.
  2. טיפול בתאי והכתים O האדום השמן
    1. החלף בינוני עם 2 מ"ל של מדיום רעב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. טפל בו עם 30 גלוקוז מ"מ ו -100 אינסולין ננומטר. דגירה זה תרבות חממת 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
    2. לשאוב את המדיום. הוסף 2 מ"ל של PBS ו מערבולת בעדינות כדי לשטוף את בינוני; לחזור פעם.
    3. תקן את coverslip לשקופית עם גומייה. לחשוף את התאים חסידים אל פני השטח החיצוניים. בצע את מכתים O האדום השמן כפי שתואר לעיל (שלב 1.5).
      הערה: רמות הבסיס של הצטברות שומנים הם מגורה עם טיפול גלוקוז בתוספת אינסולין גבוה לאחר רעב בסרום. טיפות השומנים הם דמיינו ידי מכתים שמן האדום O.
  3. מדידת שומנים
    1. פנק את hepatocytes עם גלוקוז גבוה בתוספת אינסולין באותו המצב (שלב 2.2.1). הוסף 1 מ"ל של PBS על כל צלחת תרבית תאים של 10 ס"מ. לגרד את התאים למסוק אותם לתוך צינורות זכוכית חדש 15 מ"ל, שממנו aliquots של 100 μL מועברים צינורות 1.5 מ"ל טריים כימות חלבון.
    2. הוסף 4 מ"ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) על 900 μL של התאים הנותרים. Sonicate במשך 20 צפצופים המשוער ולאחר מכן מערבולת במרץ לשחררהשומנים בתאים. דגירה את התערובת על קרח למשך 2 שעות. בצע את מיצוי השומנים (שלב 1.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', משקל גוף העכבר הוגדל ל 45 ± 1.2 גרם לאחר 16 שבועות של האכלת HFHS, וזה בערך פי 1.5 גבוה יותר מאשר קבוצת האכלת דיאטת צ'או. הרכב הגוף NMR ניתוחי מראה את מסת השומן ומסת רזה של עכברים מסומנים (איור 1B). התפלגויות השומן של הגוף ושל הכבד נקבעו על ידי בדיקת MRI, ותמונות פסאודו צבע נציג בעכברים חיים, מודעים מוצגות באיור 1C-D. הגוף במשקל גוף הרכב נמדד ו מדמיין תוך כדי תהליך האכלת דיאטת HFHS.

על מנת לנתח עוד פנוטיפים steatotic, העכברים הוקרבו וניתוח היסטולוגית כבד בוצע. H & E ושמן האדום O הכתמה של כבדי מוצגים באיור 2A-B, שבו טיפות השומנים לגדול יותר לכבוש את החללים ברובhepatocytes לאחר 4 חודשים של האכלת דיאטת HFHS. מידת steatosis בכבד של עכברים בדיאטה שתיזון HFHS היא דמיינה בקלות על ידי השוואה עם עכברי דיאטה הניזונים צ'או. הרכיבים העיקריים של שומנים בדם, כגון טריגליצרידים וכולסטרול, נמדדו עם מיצוי כלורופורם / מתנול (איור 2 ג). בעכברי DIO, עומס המזין העודף נגרם הצטברות טריגליצרידים חריג בכבד. עם נתוני התמ"ג, MRI, וניתוח היסטולוגית, מידת בתצהיר השומנים ניתן לקבוע ביעילות ובדייקנות.

כפי שניתן לראות בתרשים 3, רמות השומנים ב hepatocytes העיקרי היו מושרה על ידי גלוקוז בתוספת אינסולין הגבוהים במשך 24 שעות. הטיפות השומנים שהצטברו נקבעו על ידי מכתים שמן האדום O (איור 3 א), ועל ניתוח השומנים כמותי שימש לאחר מכן על מנת למדוד את רמות הטריגליצרידים והכולסטרול hepatocytes (איור 3 ב). על בסיס זהמודל, את ההשפעות של הנדסה גנטית או טיפול תרופות על הומאוסטזיס שומנים ב hepatocytes יכול להיחקר בצורה יעילה ומהירה.

איור 2
איור 1. שומן גבוה, גבוהה סוכרוז דיאטה (HFHS) מגבירה שמנה steatosis בכבד בעכברים. שמונה שבועות בן C57BL זכר / 6 עכברים הואכלו על Chow או דיאטה HFHS במשך 8 שבועות ו -16 שבועות, בהתאמה. (א) משקל גוף של עכברים. (ב) רכב גוף של העכברים. (C - D) תמונת תהודה מגנטית נציג של העכבר וכבד. האזור הלבן בתמונת המידה האפורה מציין את השומן, ואילו השטח האדום בתמונה פסאודו הצבע מציין את השומן. הנתונים מיוצגים כממוצע ± שגיאת התקן (SEM), n = 5-8. * P <0.05 לעומת עכברי צ'או-fed הדיאטה. ברי השגיאה מייצגים את SEM. Statisticaניתוח l בוצע באמצעות מבחן t מזווג, שני זנב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
ניתוח איור 2. של steatosis בכבד אצל עכברים שהוזנו בדיאטה HFHS. שמונה שבועות בן C57BL זכר / 6 עכברים הואכלו על Chow או דיאטה HFHS במשך 8 שבועות ו -16 שבועות, בהתאמה. (א) מורפולוגיה ברוטו נציג של enterocoelia וכבד. (ב) נציג H & E ו- שמן מכתים האדום O (ברים בקנה מידה: 50 מיקרומטר). שמן אדום O מכתים את השומן ושומן ניטראלי, ונקודות אדומות מצביעות טיפות שומנים שהצטברו hepatocytes. (ג) רמות הטריגליצרידים והכולסטרול סה"כ של עקירות השומנים בכבד בשיטת כלורופורם / מתנול. הנתונים מנורמלים tהוא המשקל הכבד, והם מיוצגים כממוצע ± שגיאת התקן (SEM), n = 5-8. * P <0.05 לעומת העכברים שהוזנו עם דיאטת צ'או. ברי השגיאה מייצגים את SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t מזווג, שני זנב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. steatosis כבדית מושרת hepatocytes העיקרי עכבר חשוף גלוקוז בתוספת אינסולין גבוה. (א) מכתים האדום O שמן hepatocytes העיקרי תרבותי מטופלים ללא או עם גלוקוז ואינסולין, כמצוין (ברים בקנה מידה: 50 מיקרומטר). (ב) רמת הטריגליצרידים ב hepatocytes העיקרי נמדדה ו מנורמל את ריכוז החלבון. הנתונים מוצגים כאילו הם ± הממוצעסטיית התקן (SEM). * P <0.05 לעומת קבוצת הביקורת. ברי השגיאה מייצגים את SEM. ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t מזווג, שני זנב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NAFLD היא סדרה של מחלות כבד מתקדמת אשר מזוהה עם תסמונת מטבולית, השמנה, עמידות לאינסולין, או סוכרת סוג 2 (T2DM) 11. המאפיין העיקרי של NAFLD הוא steatosis, הצטברות של שומנים hepatocytes. הנה, קשת של שיטות מוצגת לאפיין את פנוטיפים ופרמטרים של steatosis בכבד באמצעות עכברי DIO ו hepatocytes העיקרי עכבר. הליך זה יכול להיות מועיל על מנת להבהיר את המנגנונים המולקולריים של NAFLD ומחלות מטבוליות נלוות אחרות.

שילוב in vivo ו מבחני חוץ גופייה, שיטות אלה מספקים ניתוחים והערכות מקיפים של steatosis בכבד. נכון לעכשיו, במודלים של בעלי החיים של NAFLD כוללים בעיקר מודלים גנטיים ותזונתיים. דיאטת HFHS משמשת כאן נועדה לחקות את סגנון התזונה המודרני והוא מספיק כדי לגרום להשמנת steatosis בכבד בעכברים. עם זאת, כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של development של דה-רגולצית שומנים, assay מבוסס התאים מכיל יתרונות ברורים על פני מחקר בבעלי חיים, כוללים מניפולציה קלה על ידי מוטציה גנטית או טיפול תרופתי, כמו גם עלויות והתקשרויות זמן נמוכות יחסית. כדי ליצור steatosis הכבד ב hepatocytes העיקרי העכבר, ריכוזים גבוהים של גלוקוז בתוספת אינסולין משמשים כדי לגרום הצטברות שומנים בדם, שהוא רומן ויעיל במודל חוץ גופית לחקות in vivo הנגרמת דיאטה היפרגליקמיה היפראינסולינמיה. טיפול זה הוא גם החלים על שורות תאים בכבד אחרות, כגון תאי HepG2. בהתחשב בכך hepatocytes מהונדס גנטי נגיש למגוון טיפולי תרופות, המודל במבחנת steatotic המתואר כאן מתגבר על המגבלה וצעדי זמן רב עבור הדור של במודלים של בעלי חיים באמצעות gain- וגישות פסד של פונקציה.

הרכב הגוף מנתח, כולל תמ"ג ו- MRI, לספק את הנתונים פולשני בזמן אמת עלשומנים בגוף ובכבד כולו. זוהי מדידה בלתי פולשנית, חוסכת זמן, visualizable, למחצה איכותית. בנוסף, את הדיוק של ניתוחי רכב גוף ניתן לשפר במידה רבה על ידי שילוב של מדידות היסטולוגית ביוכימיים אחרות. זה קריטי והכרחי כדי לקבוע steatosis הכבד in vivo ו במבחנה באמצעות צביעה H & E, צביעות O אדום השמן, ומדידת שומנים, שכולן הן מדידות תקן זהב לאבחון לדירוג steatosis בכבד.

אחת המגבלות של השיטה הנוכחית היא חוסר יכולתו למדוד בתצהיר דלקת קולגן כאשר steatosis פשוט מתקדם כדי צהבת, סיסטיק, ובסופו של דבר, שחמת וסרטן הכבד. בהתחשב בכך עכברים שמנים הנגרמת דיאטה יש סיכון נמוך להתפתחות NASH, הפרוטוקול הנוכחי מספיק כדי להעריך steatosis בכבד בעכברי DIO. עם זאת, במצב של NASH, מדידות ביוכימיים אחרים, כגון ALANI פלזמהaminotransferase ne (ALT) ו aminotransferase aspartate (AST) רמות, צריך להיות מנוצל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע טבעי של סין (מס '81,270,930, 31,471,129, ו 31,671,224) והתכנית מאה ככר האקדמיה הסינית למדעים (2013OHTP04) כדי י.ל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346, (16), 1221-1231 (2002).
  2. Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65, (7), 1904-1915 (2016).
  3. Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13, (4), 376-388 (2011).
  4. Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146, (2), 539-549 (2014).
  5. Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3, (2), 87-98 (2006).
  6. Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116, (6), 1494-1505 (2006).
  7. Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332, (6037), 1519-1523 (2011).
  8. Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8, (1), 35-44 (2011).
  9. Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35, (38), 10058-10069 (2014).
  10. Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64, (2), 425-438 (2016).
  11. Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (6), 330-344 (2013).
ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter