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Medicine

Análise otimizada de doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

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A obesidade é um problema de saúde crescente em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Tem sido relatada como sendo uma das condições coexistentes frequentemente associadas com doença hepática não-alcoólica (EHNA), com uma prevalência que varia entre 30 e 100 por cento em pacientes NAFLD 1. Devido à forte correlação entre o fígado gordo e obesidade, obesos (DIO) modelos de rato induzida por dieta são amplamente usadas para estudar os mecanismos moleculares complexas associadas com o desenvolvimento de EHNA 2, 3, 4, 5, 6. A esteatose hepática é o primeiro estágio de DHGNA, e pode evoluir para esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose, e, finalmente, câncer de fígado 7. Portanto, o objetivo geral deste método é gerar modelos animais e celulares de condições com esteatose hepática e ao PROvide protocolos detalhados para a medição de lípidos eficiente e preciso. Estes modelos e medições são também úteis para a investigação de outros distúrbios metabólicos, tais como a resistência à insulina e diabetes tipo 2.

Como a obesidade é identificado como sendo um dos principais factores de risco para EHNA, um alto teor de gordura, alta-sacarose dieta (HFHS) que imita a dieta de alta gordura de estilo ocidental é utilizado para induzir obesidade em ratos. Subsequentemente, o grau de esteatose hepática pode ser avaliada utilizando métodos diferentes. Primeiro, o peso corporal e análise de composição corporal com ressonância magnética nuclear (RMN) mostra a acumulação de lípidos durante a alimentação. A massa de gordura e massa magra pode ser quantificado de um modo não-invasivo e em tempo real.

Além disso, a imagem por ressonância magnética (MRI) é usado para mostrar tanto a todo o organismo e a distribuição de gordura no fígado. O sinal de escala de cinzentos da análise de ressonância magnética pode ser convertido numa imagem de pseudo-cor legível, e a intensidade dea escala de cinza e cor é hemi-quantificáveis. Esta tecnologia proporciona vantagens únicas para a medição da acumulação de lípidos nos animais vivos. Segundo, a análise histológica do fígado é o método mais comummente utilizado para determinar a esteatose hepática. Hematoxilina e Eosina (H & E) Coloração histológica fornece informações, tais como a morfologia dos hepatócitos e infiltração de macrófagos, enquanto Oil Red O coloração mostra o tamanho e a posição das gotículas lipídicas em hepatócitos. Em terceiro lugar, a análise do conteúdo de lípidos utilizando extracção com clorofórmio / metanol é uma medida precisa e quantitativa de lípidos hepática. Os níveis totais de triglicérides e colesterol pode ser medido com métodos bioquímicos. Mais importante, a análise de extracção lipídica e Oil Red O coloração pode também ser usado em geneticamente manipuladas ou tratadas farmaceuticamente hepatócitos.

A vantagem do presente método é a sua utilização de várias abordagens optimizadas para gerar modelos de esteatose hepáticae caracterizar exaustivamente os fenótipos tanto in vivo como in vitro. Os modelos de ratos DIO pode recapitular a patologia e metabólicas fenótipos de doença hepática gordurosa humano. Outros parâmetros metabólicos em seres humanos pode ser replicado neste modelo bem 8. A geração do modelo de hepatócitos esteatótica em resposta ao alto teor de glucose e insulina é eficiente, útil, e supera a limitação do trabalho caro e demorado rato. Tomados em conjunto, estes métodos são suficientes e é essencial para o estudo da disfunção lípidos hepática e resistência à insulina durante a sobrecarga de nutrientes.

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Protocol

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Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional do Instituto de Ciências da Nutrição, Instituto Xangai de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China).

1. DIO Modelo rato

  1. alimentação HFHS
    1. Alimente a oito semanas de idade, do sexo masculino camundongos C57BL / 6 com um HFHS que contém 40 kcal% de gordura e 40 kcal% de sacarose. Abrigá-los em 12 h condições do ciclo escuro de luz.
    2. Mantenha os ratos em estado dieta de alimentação HFHS de quatro a 16 semanas. Verifique semanalmente o peso corporal.
  2. Análise de composição corporal e análise de imagem pseudo-color
    1. Sujeitar os ratos para uma análise de composição corporal analisador.
      1. Fixar ratos conscientes, não anestesiados num tubo de plástico no. Medir a massa de gordura corporal, massa magra, e fluidos usando um sistema de RMN, conforme descrito anteriormente 2.
    2. Digitalizar todo o corpo de cada rato utilizando um sistema de ressonância magnética.
      1. Anestesiar os ratos com 1% Avertin através de injecção intraperitoneal (25 mL / g) e realizar a análise de imagens em tubos de vidro especializados.
        NOTA: O processo de imagiologia tem a duração de cerca de 0,5 h para cada rato. Quando a medição está concluída, retornar os ratos às suas gaiolas.
    3. Verificar todo o corpo dos ratos no dorsal, médio e camadas ventral; digitalizar o fígado na direcção vertical. Use um ímã 0,55 T e os seguintes parâmetros instrumentais: Espaço K = 192 x 256 mm, espessura de corte = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e o número de scans = 8. Digitalizar usando a mesma condição magnética para todos os grupos de camundongos.
    4. Mapear a imagem em tons de cinza em uma imagem pseudo-cor de acordo com a intensidade do sinal 9.
  3. rato eutanásia
    1. esterilizar dissectiferramentas Ng, tais como pinça e tesouras.
    2. Despeje isoflurano suficiente sobre uma toalha de papel e deixar que o isoflurano volatilizar em um frasco de vidro. Assegure-se que os ratos são sacrificados pelo isoflurano.
    3. Corrigir os ratos numa mesa de operação. Spray de cada abdômen com 75% de etanol, fazer uma incisão na derme do apêndice xifóide usando uma tesoura, e desgaste da derme longitudinalmente através da linha média com as mãos para expor o peritônio.
    4. Prender o processo xifóide com uma pinça e cortar o peritoneu da largura através do fundo das nervuras para expor as vísceras.
    5. Recolha de sangue em tubos revestidos com EDTA por punção cardíaca.
    6. Cortar o diafragma ao longo do fígado e remova cuidadosamente o fígado dos enterocoelia usando uma tesoura fina. Corte três pedaços de tecido de fígado para as seguintes medições de lipidos: a) 6 x 3 x 3 mm para a coloração de H & E, b) 6 x 3 x 3 mm de Oil Red O coloração, e c) 20-40 mg de fígado de clorofórmio / extracção de metanol.
  4. Coloração H & E
    1. Corrigir o fígado em 4% de acetato de formalina tamponada com fosfato a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incorporá-lo em cera de parafina.
    2. Cortar secções de parafina (5 uM) e montá-los em lâminas de vidro para coloração com H @ E, conforme anteriormente descrito 3, 10.
  5. Oil Red O coloração
    1. preparação Regent
      1. Preparar solução de trabalho Oil Red O com formalina a 10%, isopropanol a 60%, de hematoxilina, e gelatina de glicerol. Dissolve-se 0,5 g de Oil Red O pó com 100 ml de isopropanol e aquecê-lo em um banho de 60 ° C para produzir uma solução stock a 0,5%.
      2. Dilui-se com água bidestilada (ddH2O), a uma proporção de 3: 2 (3 mL de uma solução de estoque e 2 ml de ddH2O). Filtra-se a solução de trabalho e deixar em repouso durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente.
    2. Incorporar o fígado na temperatura ideal de corte composto (OCT) em apcaixa de encaixe lastic. Congelá-lo a -20 ° C durante 30 min. Corte-o em seções 8 mícrons em micrótomo de congelação, montar o tecido em um slide, e colocá-lo à temperatura ambiente durante 30 min.
    3. Coloque uma toalha de papel no fundo de uma banheira de coloração e derramar uma pequena quantidade de formalina a 10% para molhar a toalha de papel. Coloque o slide na banheira de coloração e corrigir os cortes congelados em vapores de formaldeído por 5 min a 4 ° C.
    4. Mergulhe a lâmina em 60% isopropanol na banheira de coloração por 3 s; repetir uma vez.
    5. Adicionar algumas gotas de solução de trabalho de Oil Red O para o deslizamento para cobrir todos os tecidos e incubar durante 15 min. Proteger o tecido da luz à temperatura ambiente.
    6. Lave o slide na nova isopropanol 60% na banheira de coloração por 3 s; repetir duas vezes.
    7. Lave o slide através de água destilada duas vezes e remover a água em torno do tecido. Não se esqueça de secar o tecido.
    8. Coloque o slide em hematoxilina durante 1 min e lavar cuidadosamente com água da torneira durante 5-10min. Lave o slide em água destilada duas vezes e manter o que em água destilada até que esteja pronto para colocar sobre a lamela.
    9. Aquece-se a gelatina glicerol no micro-ondas e colocar várias gotas na parte superior do tecido. Delicadamente, coloque a lamela em cima e tomar cuidado para não formar bolhas.
    10. Observe a mancha sob um microscópio e capturar imagens característicos usando 20X e 40X objectivos.
  6. Medição de lipidos do fígado
    1. Colocar o tecido de fígado dissecado em um novo tubo de centrífuga de plástico de 2 ml. Homogeneizar em 1 ml de PBS com um homogeneizador e transferir o lisado para um novo tubo de vidro de 15 ml.
    2. Adicionar 5 mL de clorofórmio / metanol (2:, 1 v / v) de solução, de vórtice a mistura vigorosamente durante 1 min, e deixar em repouso durante 2 horas em gelo.
    3. Centrifugar a 1.650 xg durante 10 min a 4 ° C; a mistura deve separar em 3 camadas: a camada superior de metanol, o disco proteína meio, eo clorofórmio fundo e lipídios.
    4. Tran sfer a fase inferior para um tubo de vidro de novo usando uma pipeta de Pasteur de vidro; não há necessidade de obter cada gota da fração inferior. Definir o tubo de lado no gelo.
    5. Adicionar 600 mL de 4 mM de MgCl2 e 1,5 ml de clorofórmio para a fracção do sobrenadante a esquerda no tubo anterior e vortex vigorosamente. Incubar em gelo durante 30 minutos e centrifugar a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C.
    6. Combine a fase de fundo com o tubo primeira fase inferior usando Pasteur pipeta. Descartar as camadas média e alta.
    7. Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de azoto num banho de 37 ° C. Lavar os lados dos tubos de vidro cuidadosamente com 200 uL de 1% de Triton X-100 / clorofórmio (v / v). Evaporar sob atmosfera de azoto. Dissolve-se o lípido com 200 uL de ddH2O e vórtice bem para tornar a emulsão final.
    8. Medir a triglicéridos totais (TG) e colesterol (TC) níveis usando um kit de triglicéridos ou de colesterol de acordo com o protocolo do fabricantexref "> 3.
      NOTA: Os valores são normalizados de lípidos aos das concentrações de proteína no homogenato inicial, tal como determinado por quantificação de proteínas 3.

2. principal do mouse Hepatócito Modelo

  1. O isolamento de hepatócitos primários de rato
    1. Anestesiar cada rato com 6% de hidrato de cloral (10 mL / g por via intraperitoneal).
    2. Isolar hepatócitos primários, como previamente descrito 10. Cresça as células em lamelas de vidro revestidas com colagénio de uma placa de 6 poços para Oil Red O coloração. Para extracção de lípidos, semear as células numa placa de cultura celular de 10 cm 10.
  2. Tratamento com células e Oil Red O coloração
    1. Substituir o meio com 2 ml de meio de privação e incubar a 37 ° C durante 24 h. Trate-o com glucose 30 mM e 100 nM de insulina. Incubar em que uma temperatura de 37 ° C incubadora de cultura durante 24 h.
    2. Aspirar o meio. Adicionar 2 mL de PBS e agite cuidadosamente para lavar o material; repetir uma vez.
    3. Fixar a lamela para o slide com um elástico. Expor as células aderentes à superfície do lado de fora. Realizar a coloração de Vermelho de Óleo O, conforme descrito acima (passo 1.5).
      NOTA: Os níveis basais de acumulação de lípidos são estimuladas com um elevado teor de glucose, mais tratamento com insulina após privação de soro. As gotas de lípidos são visualizadas por coloração com Oil Red O.
  3. Medição de lípidos
    1. Tratar os hepatócitos com alto teor de glucose e insulina no mesmo estado (passo 2.2.1). Adicionar 1 mL de PBS a cada placa de cultura celular de 10 cm. Raspar as células e colhem-los para novos tubos de vidro de 15 ml, a partir do qual se alíquotas de 100 ul são transferidos para tubos frescos de 1,5 ml para a quantificação de proteína.
    2. Adicionar 4 ml de clorofórmio / metanol (2: 1, v / v) para os restantes 900 ul de células. Sonicate por aproximados 20 sinais sonoros e, em seguida, vortex vigorosamente para liberaro lípido nas células. Incubar a mistura em gelo durante 2 h. Realizar a extração de lipídios (passo 1.6).

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Representative Results

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Como mostrado na Figura 1A, o peso do corpo do rato foi aumentada para 45 ± 1,2 g depois de 16 semanas de alimentação HFHS, que é aproximadamente 1,5 vezes maior do que o grupo de dieta de comida de alimentação. A análise de RMN da composição corporal que mostra a massa de gordura e massa magra de ratos são indicados (Figura 1B). As distribuições de gordura do corpo inteiro e do fígado foram determinados por ressonância magnética e imagens de pseudo-cor representativos em ratos vivo, consciente são mostrados na Figura 1C-D. A composição do peso corporal e do corpo foram medidos e visualizados durante o processo de alimentação dieta HFHS.

Para dissecar ainda mais os fenótipos esteatóticos, os ratos foram sacrificados e uma análise histológica do fígado. A coloração de H & E e Oil Red O dos fígados são mostrados na Figura 2A-B, em que gotículas lipídicas crescer e ocupar os espaços em maishepatócitos após 4 meses de HFHS alimentação dieta. O grau de esteatose hepática de ratos dieta alimentado HFHS é facilmente visualizado através da comparação com os ratos alimentados com ração. Os principais componentes do lípido, tais como triglicéridos e colesterol, foram medidos com extracção com clorofórmio / metanol (Figura 2C). Em ratinhos DIO, o excesso de nutrientes sobrecarga causada anormal acumulação de triglicéridos no fígado. Com os dados de RMN, ressonância magnética, e para análise histológica, o grau de deposição de lípidos pode ser determinada com precisão e eficientemente.

Como mostrado na Figura 3, os níveis de lípidos em hepatócitos primários foram induzidos pelo alto teor de glucose e insulina durante 24 h. As gotículas de lípidos acumulados foram determinadas por coloração com Oil Red O (Figura 3A), e a análise quantitativa de lípido foi utilizado subsequentemente para medir os níveis de triglicéridos e de colesterol em hepatócitos (Figura 3B). Com base nissomodelo, os efeitos de modificação genética ou tratamento farmacêutico na homeostase de lípidos em hepatócitos podem ser investigadas de uma forma eficiente e rápida.

Figura 2
Figura 1. Alto teor de gordura, dieta rica em sacarose (HFHS) aumenta a obesidade e esteatose hepática em ratos. C57BL machos de oito semanas de idade / 6 murganhos foram alimentados com uma dieta de comida ou HFHS durante 8 semanas e 16 semanas, respectivamente. Peso (A) do corpo dos ratos. A composição (B) do corpo dos ratos. (C - D) Ressonância magnética Representante do mouse e fígado. A área branca na imagem em escala de cinza indica o teor de gordura, enquanto a área vermelha na imagem pseudo-cor indica a gordura. Os dados estão representados como a média ± o erro padrão (SEM), n = 5-8. * P <0,05 em relação os ratos alimentados com ração. As barras de erro representam o SEM. Statisticaanálise l foi realizada utilizando o teste t não pareado um, de Student bilateral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Análise de esteatose hepática em ratos alimentados com uma dieta HFHS. C57BL machos de oito semanas de idade / 6 murganhos foram alimentados com uma dieta de comida ou HFHS durante 8 semanas e 16 semanas, respectivamente. (A) Morfologia bruto representativas de enterocoelia e fígado. (B) Representante H & E e Oil Red O coloração (barras de escala: 50 mm). Oil Red O mancha a gordura e gordura neutra e pontos vermelhos indicam gotículas lipídicas acumulados em hepatócitos. (C) Total de triglicérides e colesterol níveis das extrações de lipídios no fígado, utilizando o método clorofórmio / metanol. Os dados foram normalizados para tque o peso do fígado, e são representados como a média ± o erro padrão (SEM), n = 5-8. * P <0,05 contra os ratos alimentados com dieta padrão. As barras de erro representam o SEM. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t não pareado um, de Student bilateral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. esteatose hepática é induzida em hepatócitos primários de rato expostos a elevado teor de glucose e insulina. (A) Oil Red O coloração de hepatócitos primários em cultura tratadas com ou sem glicose e insulina, conforme indicado (barras de escala: 50 mm). (B) o nível de triglicéridos no hepatócitos primários foi medida e normalizada para a concentração de proteína. Os dados estão representados como a média ±o erro padrão (SEM). * P <0,05 versus o grupo de controlo. As barras de erro representam o SEM. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t não pareado um, de Student bilateral. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Esteatose hepática é uma série de doenças do fígado progressivas que está associado com o síndrome metabólico, a obesidade, resistência à insulina, ou diabetes mellitus tipo 2 (DM2) 11. A marca da DHGNA é esteatose, a acumulação de lípidos nos hepatócitos. Aqui, um espectro de métodos é apresentada para caracterizar os fenótipos e parâmetros de esteatose hepática utilizando ratinhos DIO e hepatócitos primários de rato. Este procedimento pode ser útil para elucidar os mecanismos moleculares da esteatose hepática e outras doenças metabólicas relacionadas.

Combinando in vivo e ensaios in vitro, estes métodos fornecem análises e avaliações de esteatose hepática abrangentes. Actualmente, os modelos animais de EHNA consistem principalmente em modelos genéticos e nutricionais. A dieta HFHS utilizada aqui destina-se a imitar o estilo dieta moderna e é suficiente para induzir a obesidade e esteatose hepática em ratos. No entanto, para estudar os mecanismos moleculares para o desenpamento de desregulação lipídica, o ensaio baseado em células contém vantagens óbvias sobre estudo em animais, incluindo manipulação fácil por mutação genética ou tratamento farmacológico, bem como a custos relativamente baixos e compromissos de tempo. Para gerar esteatose hepática em hepatócitos primários de rato, altas concentrações de glucose e insulina são utilizados para induzir a acumulação de lípidos, que é um processo novo e eficiente modelo in vitro para imitar in vivo hiperglicemia induzida por dieta e hiperinsulinemia. Este tratamento é também aplicável a outras linhas de células hepáticas, tais como as células HepG2. Dado que os hepatócitos geneticamente modificados são acessíveis a uma variedade de tratamentos farmacêuticos, o modelo in vitro descrito aqui esteatótica supera a limitação e passos que consomem tempo para a geração de modelos animais usando abordagens gain- e perda de função.

A composição corporal análises, incluindo NMR e MRI, fornecer os dados não-invasivas e em tempo real sobrelipídico em todo o corpo e do fígado. É um não-invasivo, economia de tempo, visualizável, e medição semi-qualitativa. Além disso, a precisão da análise da composição do corpo pode ser significativamente melhorado através da combinação de outras medições histológicas e bioquímicas. É essencial e necessário para determinar esteatose hepática in vivo e in vitro utilizando coloração H & E, Oil Red O coloração, e a medição de lípidos, todos os quais são medidas padrão-ouro para o diagnóstico e classificação de esteatose hepática.

Uma das limitações do presente método é a sua incapacidade de medir a inflamação e deposição de colagénio quando simples esteatose progride para a hepatite, fibrose, e, finalmente, cirrose e cancro do fígado. Dado que os ratinhos com obesidade induzida por dieta tem um baixo risco para o desenvolvimento de Nash, o protocolo de corrente é suficiente para avaliar esteatose hepática em ratinhos DIO. No entanto, na condição de Nash, outras medidas bioquímicas, tais como plasma alaniníveis de aspartato aminotransferase (AST) NE-aminotransferase (ALT) e, deve ser utilizada.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81270930, 31471129 e 31671224) e os cem talentos Programa da Academia Chinesa de Ciências (2013OHTP04) para YL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

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References

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Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática
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Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

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