Summary
ננו-חלקיק גביש נוזלי (LCNP) nanocarrier מנוצלת ככלי עבור במסירה מבוקרת של מטען הידרופובי אל קרום הפלזמה של תאים חיים.
Abstract
המשלוח המבוקר של סוכני סמים / הדמיה לתאים הוא קריטי עבור בפיתוח תרופות לחקר תהליכי איתות הסלולר. לאחרונה חלקיקים (NPS) הראו הבטחה משמעותית לפיתוח של מערכות שיגור כזה. כאן, מערכת מסירה מבוססת גביש נוזל NP (LCNP) הועסקה על במסירה המבוקרת של צבע מים מסיסים, פרכלורט-dioctadecyloxacarbocyanine 3,3' (DIO), מתוך ליבת NP לאזור ההידרופובי של פלזמה bilayer הממברנה. במהלך הסינתזה של הצירופים, לצבוע התאגד ביעילות לתוך ליבת LCNP הידרופובי, כפי שאושר על ידי ספקטרוסקופיות מרובים המנתח. נטיה של נגזרת כולסטרול PEGylated אל פני השטח NP (Dio-LCNP-PEG-חול) איפשר המחייב של צירופים טעון לצבוע הממברנה ב HEK 293T / 17 תאים. זמן נפתרה מיקרוסקופיה confocal סריקת לייזר והעברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) הדמיה אישר את המסירהive בזרימה של Dio מליבת LCNP והחדרתו לתוך bilayer הממברנה. לבסוף, את המסירה של Dio בתור LCNP-PEG-צ'ול החלישה את cytotoxicity של Dio; בצורת NP של Dio הציגה ~ 30-40% פחות רעילה לעומת DIO מובא חינם מפתרון בתפזורת. גישה זו ממחישה את השירות של פלטפורמת LCNP כקובץ האפנות ביותר עבור משלוח הקרום ספציפי אפנון של מטענים מולקולריים הידרופובי.
Introduction
מאז כניסתו של התממשקות ננו (חומרים ≤100 ננומטר לפחות ממד אחד) עם תאי חיים, מטרה מתמשכת כבר לנצל את מאפייני גודל תלוי הייחודיים של חלקיקים (NPS) עבור יישומים שונים. יישומים אלה כוללים תא ו / תיוג רקמות הדמיה (הן במבחנה in vivo), חישה בזמן אמת, ואת במסירה מבוקרת של תרופות ומטענים אחרים 1. דוגמאות של תכונות NP רלוונטיות אלו כוללות את הפליטה תלוי בגודל של nanocrystals מוליך למחצה (נקודות קוונטיות, QDs); מאפייני photothermal של חלקיקי זהב; יכולת ההעמסה הגדולה של הליבה המימית של ליפוזומים; ואת מוליכות בליסטיים של allotropes פחמן, כגון צינורות פחמן חד-הקיר גרפן.
לאחרונה, עניין משמעותי שקם בשימוש צירופים עבור האפנון המבוקר של תרופות ומטענים אחרים, כגון ניגוד / הדמיהגברים. הנה, את הרציונל הוא לשפר משמעותית / לייעל את המסיסות הכוללת, מינון נמסר, זמן מחזור, ופינוי סופי של מטען הסמים על ידי מתן אותו בתור ניסוח NP. זה הגיע להיות המכונה משלוח סמים בתיווך NP (NMDD), וכיום ישנם שבעה ניסוחים סמים NP ה- FDA לשימוש במרפאה לטיפול בסוגי סרטן שונים ומאות נוספים בשלבים שונים של ניסויים קליניים. בעיקרו של דבר, המטרה היא "להשיג יותר בפחות;" כלומר, להשתמש NP כמו פיגום כדי לספק סמים יותר עם ממשלי מינון פחות על ידי ניצול של שטח הפנים הגדול: נפח (למשל, חלקיקים קשים, כגון QDs תחמוצות מתכת) של צירופים או נפח הפנים הגדול שלהם לטעינה מטעני מטען גדולים (למשל, ליפוזומים או מיצלות). המטרה כאן היא לצמצם את הצורך המשטר מינון מרובה נמסרו מערכתי בעוד באותו הזמן בקידום יציבות מימית ומחזור דם מוגבר, במיוחד עבורמטעני תרופה הידרופובי ומאתגרים, תוך יעיל, הם מסיסים במשורה בתקשורת המימית.
לפיכך, המטרה של העבודה המתוארת במסמך זה הייתה לקבוע את הכדאיות של שימוש פיגום NP רומן עבור המשלוח הייחודי והמבוקר של מטענים הידרופובי אל bilayer הממברנה lipophilic. מוטיבצית העבודה הייתה המסיסות מוגבלת הטמון וקושי מסירת מולקולות הידרופוביות לתאי מהמדיה מימית. בדרך כלל, את המסירה של מולקולות הידרופוביות כזה דורש שימוש בממסים אורגניים (למשל, DMSO) או פעיל שטח amphiphilic (למשל Poloxamers,) שיכול להיות תא רעיל ופשרה ורקמות כדאיות 2, או נישא micelle, אשר יכולה להיות מוגבל טעינה פנימית קיבולות. מנשא NP נבחר כאן היה ניסוח רומן גביש נוזל NP (LCNP) שפותח בעבר 3 וכי הוכח בעבר להשיג ~ פי 40 שיפור היעילות של דוקסורוביצין התרופה נגד הסרטן בתאים בתרבית 4.
בשנת העבודה המתוארת במסמך זה, מטען הנציג שנבחר היה צבע קרום פוטנציומטרית, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט (DIO). DIO הוא צבע מסיס-מים, שבו נעשה שימוש עבור האנטרוגרד התחקות מדרדר חיים ונוירונים קבועים, מדידות פוטנציאל הממברנה, ועל קרום כללי תיוג 5, 6, 7, 8, 9. בשל האופי הידרופובי שלה, בדרך כלל DIO מתווסף ישירות monolayers תא או רקמות בצורה גבישית 10, או שהוא וטופח בריכוזים גבוהים מאוד (~ 1-20 מיקרומטר) לאחר דילול מפתרון מניות ריכוז 11, 12.
תוכן "> הנה, גישת שימוש הייתה לפלטפורמת LCNP, NP רב תכליתי אשר גרעין פנימי הוא לגמרי הידרופובי השטח שלה הוא הידרופילי בו זמנית מקובל bioconjugation, כרכב משלוח עבור Dio. DIO הוא שולב ליבת LCNP במהלך סינתזה , ועל פני שטח NP הוא פונקציונלי אז עם מחצית כולסטרול PEGylated לקדם את הממברנה המחייב של אנסמבל DIO-LCNP קרום הפלזמה. גישה זו ביאת מערכת מסירה כי חלקה את DIO לתוך קרום הפלזמה עם דיוק גדול ומגורי הממברנה זמן מאשר בצורה חופשית של Dio נמסר מפתרון בתפזורת (Dio חינם). יתר על כן, שיטה זו הראה כי משלוח בתיווך LCNP של Dio מודולציה משמעותי שמניע את שיעור החלוקה הספציפית של צבע לתוך bilayer הממברנה lipophilic. זהו מושגת תוך הפחתת הרעילות של התרופה בחינם על ידי ~ 40% על ידי אספקה אותו כקובץ ניסוח LCNP במקביל.התחת = "jove_content"> זה צפוי כי המתודולוגיה המתוארת במסמך זה יהיה טכניקה המאפשרת עוצמה עבור חוקרים שעבודתם כרוכה או מחייב משלוח הסלולר של מטענים הידרופובי מאוד כי הם מסיסים במשורה או לא מסיסים לחלוטין בתמיסה מימית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת DIO-LCNP ו Dio-LCNP-PEG-צ'ול
- ממיסים diacrylate גבישי נוזלי סוכן cross-linking (DACTP11, 45 מ"ג), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine פרכלורט (Dio, 2 מ"ג), וכן יוזם רדיקלים חופשיים (azobisisobutyronitrile, 1 מ"ג) פילמור ב 2 מ"ל של כלורופורם. הוסף קטע קוד זה בתמיסה מימית של פעילי שטח פונקציונלי acrylate (AC10COONa 13 מ"ג ב 7 מיליליטר).
- מערבב את התערובת למשך שעה 1 ו sonicate ב משרעת 80% למשך 5 דקות כדי לייצר miniemulsion המורכב טיפות קטנות של החומר האורגני מוקף פעיל שטח polymerizable במים.
- מחממים את התערובת עד 64 מעלות צלזיוס באמבט שמן הן ליזום את פילמור של הסוכן הפעיל שטח cross-linking כמו כלורופורם מתאדה לאט, עוזב השעית NP DIO המכיל כי הוא התייצב על ידי פעיל השטח.
- סנן את ההשעיה NP (3 פעמים) דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר כדי להסיר כל צבירה. סטיתימחדש פתרון NP המסונן על 4 מעלות צלזיוס עד בשימוש עוד.
- נטיה של PEG-צ'ול כדי DIO-LCNP באמצעות צימוד EDC.
- ממיסים חול-PEG-NH 2 · HCl (PEG-צ'ול, 0.9 מ"מ) ב 25 מ"מ HEPES חיץ (pH 7.0).
- כן פתרון עבודה המכיל מלח נתרן -hydroxy-sulfosuccinimide N (NHSS, 40 מ"מ) ו 1-אתיל-3- (3- (dimethylamino) -propyl) hydrochloride carbodiimide (EDC, 400 מ"מ) במאגר HEPES מפתרונות מניות מרוכזים.
- מיד להוסיף 20 μl של הפתרון עובד מוכן טרי של NHSS / EDC ל -1.0 מ"ל של Dio-LCNP במאגר HEPES ומערבבים במשך 5 דקות.
- הוסף 20 μl של פתרון המניות של חול-PEG-NH 2 · HCl לתערובת זו ומערבבים במשך שעה 2..
- בקצרה בצנטריפוגה תערובת התגובה במהירות המרבית (~ 2,000 XG) במשך 30 שניות באמצעות צנטריפוגות מיני השולחן ולהעביר את supernatant דרך עמודה כרומטוגרפיה הדרה PD-10 בגודל 13 equilibrated עםפוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS, 0.1x).
.2 אפיון DIO-LCNP ו Dio-LCNP-PEG חול-
- אשר את נטיית קוולנטיים המוצלחת של PEG-צ'ול אל פני שטח DIO-LCNP ידי ג'ל אלקטרופורזה.
- ממיסים 0.5 גרם של agarose ב 50 מ"ל (1x) של אלקטרופורזה טריס-borate (TBE; 89 מ"מ טריס (pH 7.6), 89 מ"מ חומצת בור, ו 2 מ"מ EDTA) המאגר. מחממים את הפתרון במיקרוגל כדי להמיס את agarose. אפשר פתרון להתקרר מעט ויוצקים את תוכן לתוך צלחת ג'ל בתיבה אלקטרופורזה. הכנס מסרק ג'ל ליצור בארות מדגמות.
- לאחר ג'ל יש הקרושה, להוסיף את הסכום הנדרש (מספיק כדי להטביע את ג'ל בתא) של TBE הפעלת המאגר אל החדר.
- להוסיף 35 μl של מדגם DIO-LCNP (מתוקן עם גליצרול, 5% V / V) כדי הבארות של ג'ל ולהפעיל למשך 20 דקות במתח של 110 V.
- Image הג'ל באמצעות wi מערכת הדמיה ג'למסנני עירור ופליטת ה ב 488 ננומטר 500-550 ננומטר, בהתאמה.
- הערכת גודל החלקיקים והפצה על ידי פיזור אור דינאמי (DLS) על ידי דילול פתרון DIO-LCNP (~ דילול פי 200) ב- PBS (pH ~ 8, 0.1x) ומדידת על מכשיר DLS 14. מדוד את-פוטנציאל זטה של Dio-LCNPs באמצעות מכשיר מדידת פוטנציאל זטה מתאים.
3. הכנת מנות תרבית תאים לניסויי משלוח והדמיה
הערה: DIO-LCNP תיוג מתבצע על HEK 293T / 17 תאי כליה עובריים אנושיים (בין הקטעים 5 ו -15) כי הם מתורבתים כפי שתוארו לעיל -4. בצע את הניסויים המשלוחים ואת הדמית התא הבאה כמפורטת להלן.
- הכינו מאכלים בתרבית רקמה 35 מ"מ קוטרו (מצויד עם מוסיף 14 מ"מ מס '1 coverglass) על ידי ציפוי אותם עם פיברונקטין שור (~ 100 μl בריכוז של 20 מיקרוגרם/ מ"ל) ב DPBS עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את פתרון הציפוי פיברונקטין מצלחת התרבות. קציר HEK 293 T1 / 7 תאים מהבקבוק T-25 על ידי שטיפה הראשון בשכבה תא עם 3 מ"ל של DPBS ולאחר מכן על ידי הוספת 2 מ"ל של טריפסין EDTA (0.5% טריפסין-0.25% EDTA).
- דגירה את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך ~ 3 דקות. הסר את-EDTA טריפסין ולהחזיר את הבקבוק אל האינקובטור. לאחר תאים מנותקים מהבקבוק, לנטרל את טריפסין על ידי הוספת 4 מיליליטר של מדיום מלא (בינוני הנשר השונה של Dulbecco; DMEM; שתוקן להכיל 10% בסרום שור עוברי, 5% פירובט נתרן, ו -5% אנטיביוטיים / antimycotic) אל הבקבוק . קבע את ריכוז תא ההשעיה על ידי ספירה אותם דלפק תא.
- התאם את הריכוז התא ~ 8 x 10 מ"ל 4 תאים / עם מדיום הגידול. הוסף 3 מיליליטר של השעית התא כדי בצלחת התרבות בחממת הלילה; למחרת, התאים צריכים להיות בבית confluency ~ 70% והוא אמור להיות מוכן לשימוש. נאותצפיפות תאים היא קריטית עבור תיוג חזק ויעיל של אחוז גבוה של תאים.
משלוח סלולארי 4. של Dio ו Dio-LCNPs והדמיה של תאים קבועים
- הכן 1 פתרונות מ"ל של דיו, דיו-LCNP, ו Dio-LCNP-PEG-צ'ול במדיום משלוח (HEPES-DMEM; DMEM המכיל 25 HEPES מ"מ) על ידי דילול מניות פתרונות של Dio בחינם DIO-LCNPs; ריכוזי DIO מתאימים דגירה על תא יהיו ~ 1-10 מיקרומטר (מבוטא גם הריכוז של Dio בחינם או DIO בצורת DIO-LCNP).
- הוצא את מדיום הגידול של תרבות מנות בעזרת פיפטה סרולוגיות ולשטוף את monolayers התא (ראה שלב 3) פעמיים עם HEPES-DMEM (2 מ"ל כל אחד לשטוף). בצע שוטף על ידי הוספת בעדינות והסרת HEPES-DMEM בעזרת פיפטה מ / אל קצה את הכלים.
- להוסיף 0.2 מ"ל של אספקת פתרונות DIO בחינם או DIO-LCNP מוכן במרכז תרבות מנות ולהחזיר את הכלים אל incubator לתקופה בלתי הולם של זמן (בד"כ 15 או 30 דקות, בהתאם לצרכים של הניסוי). פעמים הדגירה כבר להוסיף תיוג הסלולר ספציפי יותר של השטחים הלא-קרומי (למשל, cytosol).
- לאחר תקופת דגירה, להסיר את אספקת פתרונות בעזרת פיפטה סרולוגיות. שטפו את monolayers תא פעמיים עם DPBS (2 מ"ל כל אחד לשטוף). בצע שוטף על ידי הוספת בעדינות והסרת DPBS מ / אל קצה המנה.
- לתקן את monolayers התא באמצעות paraformaldehyde (4% ערוכים DPBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
זהירות: Paraformaldehyde הוא דליק, מגרה נשימה, קרצינוגן חשד. - הסר את הפתרון paraformaldehyde בעזרת פיפטה בעדינות לשטוף את תאי פעם 1 עם DPBS (2 מ"ל) על ידי הוספת והסרת DPBS באמצעות פיפטה / מהקצה של המנות.
- התאים הקבועים מוכנים להיות צלם את קיומו של אות קרינה קרומית באמצעות סריקת ליזר confocalמיקרוסקופיה (CLSM). בצע הדמיה מיד או, לחילופין, להחליף את מדיום עם DPBS המכיל 0.05% NaN 3 ולאחסן את הכלים ב 4 ° C..
זהירות: NaN 3 רעילים; לנהוג בזהירות רבה בעת שימוש NaN 3.
הערה: קבוע דגימות מאוחסנות באופן זה צריכות להיות צלמו בתוך 48 שעות עבור תוצאות אופטימליות.
5. משלוח סלולארי של Dio ו Dio-LCNPs ו סריג הדמיה בתאים חיים
הערה: שיטה זו, התאים colabeled עם 6 מיקרומטר אחד DIO-LCNP-PEG-חול (בהתאם DIO הוא תורם סריג) ו 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ", 3'-tetramethylindocarbocyanine פרכלורט (DiI חינם, שבו DiI הוא acceptor סריג). שחרור DIO מ DIO-LCNP-PEG-צ'ול ושילובה לתוך קרום הפלזמה אושר על ידי גידול שנצפתה העברת אנרגיה מגוף התורם DIO אל acceptor DiI.
- תאי תווית ברצף עם DIO-LCNP-PEG-חול ו DiI freדואר בשיטה המתוארת בשלב 4.
- לאחר מכתים, לשטוף את תאי פעם 1 עם DPBS (2 מ"ל) בעזרת פיפטה סרולוגיות ולהחליף את חיץ לשטוף עם 2 מ"ל של תמיסת הדמיה של תא חי (LCIS).
- על במת מיקרוסקופ מצוידת בתא דגירה מחומם, תמונת מדגם התא החי באמצעות מיקרוסקופ confocal (אובייקטיבי 60X) עם תצורת הדמית סריג ב 30 מרווחי דקות על פני תקופת 4 hr ידי מרגש תורם DIO ב 488 ננומטר איסוף פליטה מלאה ספקטרום של התורם DIO ואת acceptor DiI מ ננומטר 490-700 עם גלאי ספקטרלי 32 ערוצים.
- הערה: לקבלת מידע נוסף על הדמית סריג, אנא ראה התייחסות 15.
- קבע את עוצמת פליטת הזמן נפתר של תורם DIO ואת acceptor DiI מתאי מוכתם DIO-LCNP-PEG חול-ו DiI. חשב את acceptor נפתרה-time / התורם יחס סריג (DiI EMI / Dio EMI) עבור התמונות, אשר יתחיל לעלות בהתמדה, בסופו של דבר הצלחתau אחת בסך של תורם DIO למחיצות לתוך הקרום הגיעה מרבי של 16.
6. Cytotoxicity Assay של Dio ו Dio-LCNPs אל תאים HEK 293T / 17
הערה: cytotoxicity של חומרי DIO-LCNP נבחן באמצעות tetrazolium לצבוע מבוססי התפשטות assay 17. הם תאים בתרבית בצלחת multiwell בנוכחות ריכוזים שונים של חומרים בתנאים לחקות משלוח / תיוג. התאים אז הם מתורבתים במשך 72 שעות כדי לאפשר התפשטות. לצבוע (MTS, (3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) אז מתווסף בארות, מבחינת חילוף החומרים הפעילים תאים להמיר את הצבע לתוך מוצר כחול formazan. כמות היווצרות צבע עומדת ביחס ישר למספר תאי קיימא.
- קציר HEK 293 T1 / 7 תאים מן הבקבוק T-25 על ידי ביצוע ההליך המתואר בשלב 3.2.SeedHEK 293T / 17 תאים (5,000 תאים / 100 μl / טוב) אל הבארות של צלחת תרבות שטופלו רקמות 96-היטב בתרבות למשך 24 שעות.
- להסיר לחלוטין את תרבות התקשורת מבארות באמצעות micropipette ולהוסיף 50 μl של HEPES-DMEM המכיל DIO חינם, Dio-LCNPs, או DIO-LCNP-PEG-צ'ול להגדיל ריכוזים לשכפל בארות. דגירה על התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: בדרך כלל, משכפל נעשה בשלושה עותקים או ארבעה פעמים מספיקות להניב נתונים אמינים סטטיסטי.- לאחר דגירה, להסיר את מדיום המשלוח המכיל את החומרים באמצעות micropipette ולהחליפה 100 μl של מדיום גידול. תרבות התאים למשך 72 שעות.
- הוסף 20 μl של מצע tetrazolium היטב כל, להחזיר את הצלחת אל האינקובטור, ולאפשר היווצרות צבע כדי להמשיך ב 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. קראו את הספיגה (ABS) של מוצר formazan ב 570 ננומטר (נקודות מינימום קליטה עבור Dio-LCNPs המשמש סטה זהdy) ו -650 ננומטר (לגריעת ספיגת רקע ספציפי) באמצעות קורא צלחת microtiter.
- מגרש את הערך הספיג הפרש (ABS 570 - ABS 650) לעומת ריכוז חומר ולדווח על התוצאות כאחוז התפשטות תאים מלאים (מידת ההתפשטות של תאים במדיום תרבית תאים בלבד).
ניתוח 7. נתונים
- סטטיסטית לנתח את הנתונים עם וניתוח שונה של שונות (ANOVA). להשוואות מרובות, להחיל את מבחן פוסט הוק של Bonferroni. לספק את כל הערכים הממוצע כפי ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM), אלא אם כן צוין אחרת.
הערה: ההסתברות המקובלת משמעות הייתה p <0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCNPs הוכן שבו הליבה ההידרופובי של NP הועמסה עם בדיקת קרום תיוג נציג כדי להדגים את התועלת של LCNP כרכב אספקה יעיל עבור מטענים הידרופובי. לשם כך, את המטען שנבחר היה צבע קרום תיוג פוטנציומטרית מים מסיסים מאוד, Dio. Dio טעון LCNPs (Dio-LCNPs) היו מסונתז באמצעות טכניקה שני שלבים מיני אמולסיה עם DACTP11 מרכיבים כימיים, AC10COONa, ו Dio, כפי שמוצג באיור 1 18. במערכת NP זו, רשת פולימרי מקושר קוולנטית של סוכן cross-linking גבישי DACTP11 מספקת ליבה הידרופובי יציבה שבו Dio מתגורר בתוך חללי ביניים ברשת crosslinked. קבוצות carboxylate על פני שטח NP לספק יציבות קולואידים לחלקיק בהמדים מהימיים תוך משרתי כקבוצה פונקציונלית "ידית" המצורף של הליגנדים מיקוד תאים(וביולוגיה אחרת). כדי לקשור את DIO-LCNPs קרום פלזמה, מחצית כולסטרול PEGylated הסתיים אמין (PEG-חול) צורפה קוולנטית אל פני השטח LCNP באמצעות צימוד EDC (איור 1). לאחר סינתזת NP ואת אישור bioconjugation המוצלחת, היכולת של Dio-LCNPs לתייג קרום הפלזמה של תאי חיים, וכדי לספק את מטען DIO מוטבע על חלק lipophilic של bilayer קרום פלזמה עם ייחוד משופר קינטיקה בהשוואה חינם הטופס (Dio חינם) נמסר מפתרון בתפזורת הוערך.
כפי שניתן לראות בתרשים 2, Dio חינם (6.0 מיקרומטר) וחסונה מוכתם קרום הפלזמה עם יעילות גבוהה (כמעט 100% של תאים שכותרתו) לאחר 15 דקות של דגירה עם HEK 293T / 17 תאים. עם זאת, הפנמה הסלולר משמעותית חינם DIO נצפתה על עלייה מתונה בלבדזמן הדגירה עד 30 דקות (איור 2 A ו- C). מידת הפנמה חינם DIO נקבעה על ידי ניסויי colocalization נפתר זמן שבו תאי הודגרו ראשונים עם 6.0 מיקרומטר DIO חינם (30 דק '). מדיום הדגירה חינם המכיל DIO הוסר מכן, והתאים היו ובהמשך בתרבית של עד 4 שעות. ממברנות פלזמה של התאים היו counterstained עם פוספוליפידים בממברנה שכותרתו לצבוע (phosphoethanolamine מצומדות כדי Rhodamine B; PE-רודה). כפי שניתן לראות בתרשים 2 C, לאחר 15 דק 'של דגירה, כמעט 100% של Dio החופשי colocalized עם סמן PE-רודה (מקדם colocalization של פירסון; PCC = 0.99 ± 0.01). עם זאת, לאחר 30 דקות של דגירה ~ 80% של Dio חינם נשאר צמוד אל הממברנה (~ 20% הפנימו). מידת ההפנמה חינם DIO גדל בהתמדה כמו הזמן דגירת הדואר הוארך עד עוד 4 שעות, וזה בא לידי ביטוי הירידה המקבילה ב PCC בין DIO ורודה-PE (איור 2 ג). התאמה של הנתונים למשוואת ריקבון אחד פאזיים מעריכים חשפה כי ההפנמה חינם DIO הגיעה למקסימום של ~ 50% ב 1 hr, עם שיעור הפנמה (k = 0.045 דקות -1) זמן מחצית חיים (15 דקות) ששקף את ספיגת הסלולר המהירה ויעילה של Dio בחינם. נתונים אלה ממחישים את המעבר שזמן הגרם המהיר של DIO חינם מן קרום הפלזמה אל cytosol, שם נשאר במידה רבה נעדר מהגרעין פני תקופת 4 שעות זמן בחן.
בהתחשב ספיגת תאים בלתי-נשלטת של Dio חינם, המטרה הפך לווסת התנהגות זו באמצעות אספקת דיו כמו ניסוח LCNP-PEG-צ'ול NP. כאשר נמסר בתור bioconjugate LCNP-PEG-צ'ול, resid קרום עיקש יותרזמן ence של Dio לעומת DIO חינם צוין (איור 2 ב '). לאחר 15 דקות של הדגירה של Dio-LCNP-PEG-צ'ול עם תאים, כמעט 100% של האות DIO היה ממוקם על הממברנה פלזמה, איפה זה היה colocalized עם סמן קרום PE-רודה, מכך כי היה להשוות מזה שנצפה עבור Dio בחינם. צוין, עם זאת, כי בעוד התיוג חינם DIO של הקרום היה די אחיד ורציף, הדפוס המכתים של Dio-LCNP-PEG-צ'ול לאחר 15 דקות של דגירה היה יותר punctate ולא כמעט כאחידות בטבע (איור 2 B). תוצאה זו עולה כי DIO-LCNP-PEG-צ'ול צירופים היו איסוף באזורים בדידים בתוך קרום התא. כאשר זמן הדגירה הוגדל ל 30 דק ', ~ 94% של האות DIO נשאר בבית הממברנה (לעומת כ -80% עבור Dio חינם באותו זו נקודת זמן) (איור 2 B ו- 2C). מגמה זו הפכה אפילו יותר בולט כמו התאים היו בתרבית עם DIO-LCNP-PEG-צ'ול צירופים עבור פעמים יותר ויותר לאחר הדגירה 30 דקות הראשונית. לדוגמה, לאחר תרבות עבור שעה 1 לאחר הדגירה הראשונית, קרוב ל -80% של האות DIO-LCNP-PEG-צ'ול NP נותר קרומי ו colocalized עם סמן PE-רודה (לעומת ~ 55% עבור Dio חינם). יש לציין, כי ההפנמה הסלולר של צירופי DIO-LCNP-PEG-צ'ול הגיעה למקסימום של 30% ב 2 hr (שימור קרום 70%). זה מקביל בשיעור ספיגת הסלולר (k = 0.024 דקות -1; מחצית החיים = 29 דקות) זה בדיוק מחצית מזה שנצפה עבור הפנמת DIO בחינם.
בשלב בא, את היכולת של מטען DIO NP-מוטבע בזרימה ביעילות מתוך ליבת LCNP וזן סביבת lipophilic של bilayer הממברנה באופן מבוקר וזמן תלוי נקבעה. ללהעריך את זה, אסטרטגיה מבוססת סריג תוכננה שבה DIO משמש תורם סריג עוסק העברת אנרגיה כדי לצבוע acceptor, DiI. כצפוי, על תיוג ראשוני (t = 0 דקות), אות הפליטה הייתה בשליטתה של תורם DIO הכלול בתוך צירופי הקרום קשור (איור 3 ב '). סריג הדמיה של hr שדה 4 הזהה בעתיד (t = 240 דק '), לעומת זאת, מתגלה גידול משמעותי אות הפליטה של acceptor DiI, מתן ראיות חזקות של המעבר של תורם DIO מליבת LCNP לתוך bilayer קרום הפלזמה (איור 3 ג). בדיקת אופי הזמן נפתר של המעבר הזה הראתה ירידה עקבית פליטת תורם DIO יחד עם גידול מקביל פליטת acceptor DiI על חלון 4 hr הניסוי (איור 3 ד '). יש לציין, הסריג היעיל במהלך המעבר הזה הגיע מקסי שלהאמא ב ~ 180 דקות תיוג שלאחר ראשוני, דבר המצביעה על כך המחיצות בזרימת הממברנה של תורם DIO הגיעו המקסימלית שלה בנקודת זמן זו (איור 3 E). נתונים אלה ספקו ראיות חזקות של מחיצות הזמן נפתר של Dio מן NP אל bilayer קרום הפלזמה שהגיע תיוג המקסימלית שלה ~ 3 שעות שלאחר ראשוני עם צירופי DIO-LCNP-PEG-צ'ול.
לבסוף, ניתוח cytotoxicity השוואתי בוצע עבור Dio חינם לעומת DIO-LCNP-PEG-צ'ול. כאשר מודגרות עם HEK 293T / 17 תאים (בריכוז DIO של 6 מיקרומטר בשני המקרים), היה ברור כי אנקפסולציה של Dio בתוך הליבה LCNP נחלש cytotoxicity שלה. בעוד DIO חינם שהושרו viabilities הסלולר של ~ 50%, תאים מודגרות עם DIO-LCNP-PEG-צ'ול הציג viabilities הסלולר ~ 90%. (איור 4). במצטבר, נתוני תיוג תא יחד עם toxi הסלולר נתונים עיר להפגין שיפורים הוא היעילות של תיוג קרום מבוסס DIO ואת האפנון של הרעילות של Dio.
איור 1: ייצוג סכמטי של קושרי קרום DIO-LCNP-PEG-צ'ול. Dio-LCNP מורכב סוכן cross-linking גביש נוזל acrylate (DACTP11); פעיל שטח polymerizable הסתיים carboxyl (AC10COONa); לבין צבע lipophilic, Dio. כולסטרול הסתיים פולי (אתילן גליקול) (PEG-חול) היה מצומדות כדי DIO-LCNP באמצעות צימוד EDC. תוספת של חול אל פני שטח DIO-LCNP מתווכת מועדפת מחייב של NP קרום הפלזמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"1"> 
איור 2: ספיגת הסלולר זמן נפתר של Dio חופשית HEK 293 T / 17 תאים. חינם DIO (6.0 מיקרומטר, לוח (א) או DIO-LCNP-PEG-צ'ול ([Dio] = 6.0 מיקרומטר, לוח (B) הודגר על משטחי תא במשך 15 דקות, מוסר, והוחלף מדיום גידול, התאים היו בתרבית למשך במועדים המצוינים (עד 4 שעות). תאים הוכתמה ובהמשך עם-רודת PE (2.0 מיקרומטר) וקבועה. הדגימות צלמו עבור Dio (ירוק) קרום נכנס PE-רודה (אדום) באמצעות CLSM. ( C) עלילת זמן נפתר של אחוז האות בחינם DIO הקרום נכנס או DIO-LCNP-PEG-צ'ול כפונקציה של הגדלת זמן דגירה. הנתונים הושגו ממקדם colocalization של פירסון (PCC, n = 3 & #177; סטיית התקן) של ירוק (DIO) ואדום (PE-רודה) ערוצים, והוא מבוטא באחוזים (± SEM) לאחר הנורמליזציה אל PCC המקביל ל -15 דקות של דגירה. בר סולם = 20 מיקרומטר. הודפס מחדש באישור בהפניה 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: הזמן נפתר סריג מאשר את בזרימה של DIO מ DIO-LCNP-PEG-צ'ול קרום הפלזמה. HEK293T / 17 תאים היו costained עם DIO-LCNP-PEG-חול ו DiI, שבו DIO (הירוק פולט) ו DiI צבעים (פולטות אדומים) לפעול בתור תורם acceptor הסריג, בהתאמה. (א) התמונה DIC של תאים חיים costained עם DIO-LCNP-PEG-צ'ול ([Dio] = 6.0 מיקרומטר) DiI (6.0 מיקרומטר). ה- sמספיק היה צלם לפקח על שינוי אות סריג פני התקופה 4 שעות. (ב) ו- (ג) הן תמונות סריג של תא חי על אותו מישור המוקד בזמן t = 0 דקות t = 240 דקות, בהתאמה. (ד) מנורמלת, עוצמת פליטת זמן נפתר של תורם Dio ו acceptor DiI מתאי מוכתם DIO-LCNP-PEG-חול ו DiI הדמיה במצב עירור סריג. (ה) זמן נפתרה יחס סריג (DiI EMI / Dio EMI) עבור תאים שכותרתו עם DIO-LCNP-PEG-חול ו DiI הדמיה בתצורת סריג. בר סולם = 20 מיקרומטר. הודפס מחדש באישור בהפניה 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרה מתמשכת של NMDD היא המיקוד המבוקר מסירת ניסוחי תרופה לתאים ורקמות, בשילוב עם יעילות תרופה משופרת סימולטני. אחת מסוג ספציפי של מולקולות תרופה עבורו זו הציבה בפני אתגר משמעותי הוא סוכנים הידרופובי תרופות / הדמיה שיש במשורה, כדי לא מסיסות תקשורת מימית. בעיה זו הטרידה את המעבר של תרופות חזקות מן במערכות תרבית תאים במבחנה להגדרה הקלינית הביאה מספר מולקולות תרופה מבטיחות להיות "גנז" או נטושים ולא רדף נוסף במסגרת הקלינית. Wortmannin (Wtmn), למשל, הוא מעכב חזק של phosphatidylinositol 3 'קינאזות ו phosphatidylinositol 3' קינאזות הקשורות קינאז ויש לו פוטנציאל גדול כסוכן אנטי סרטני, אך המחסור במי מסיסותו עכב ההתקדמות שלה בניסויים קליניים.
לאחרונה, Karve et al. סול מים משופר הראהubility של Wtmn כאשר ניסח כאסיפה NP השומנים-פולימר 19. בזירה אחד שיכול להפיק תועלת רבה מן סוג זה של משלוח השתפר, הנשלטת על ניסוח NP היא משלוח של תרופות הידרופובי וסוכני הדמיה קרום הפלזמה. לפיכך, המטרה כאן הייתה להתייחס המכשול הטכני הזה לפתח מתודולוגיה כדי להתגבר על המכשול הטכנולוגי הזו.
בפיתוח מתודולוגיה זו, לצבוע מיקוד-קרום מודל, Dio, נבחרה כי כבר סובלת היסטורית על ידי מסיסות עניים התקשורת מימית. זה מקנה אתגרים משמעותיים משלוח מסוים של צבע קרום הפלזמה. בין האתגרים הללו הם צורך להוסיף צורה גבישית של צבע ישירות תאים או רקמות 10 או דגירה תאים עם ריכוזים גבוהים מאוד של Dio לאחר דילול מפתרונות המניות שמכילים ממסים כגון DMSO 11, 12.הגישה כאן הייתה כפולה: 1) לשלב את DIO לתוך ליבת הידרופובי של LCNPs במהלך הסינתזה NP ו -2) קוולנטית לשנות את כמו-מסונתז DIO-LCNPs עם המצומד כולסטרול PEGylated (Dio-LCNP-PEG-חול) כדי להקל על האינטראקציה הישירה של הצירופים הטעונים DIO עם קרום הפלזמה. ואכן, גישה זו יעילה משופרת מספר היבטים של מסירת DIO קרום הפלזמה.
ראשית, בזמן מגוריו הממברנה של Dio הוכפל ביעילות כאשר מועברת כמו ניסוח LCNP לעומת כאשר DIO נמסרה חינם מפתרון בתפזורת. מגורי קרום מורחב הפעם יוחס ל הלוקליזציה של Dio-LCNP-PEG-צ'ול conjugates אל microdomains רפסודת השומנים של קרום התא, כפי שאושר על ידי ניסויים מכתימים שיתוף. שנית, חלוקת המטען DIO לתוך bilayer השומנים אושרה על ידי ניסויים סריג שבו DIO שימש לתורם acceptor DiI קרום-תושב. לבסוף,שחרור איטי וממושך של מטען DIO לתוך bilayer הקרום ביעילות החליש את cytotoxicity של Dio ידי ~ 40%.
חשוב להדגיש מספר נקודות בפרוטוקול כי הם קריטיים להצלחה. ראשית, טוען אחוזי DIO לתוך ליבת LCNP חייב להיות מותאם באופן אמפירי בסינתזה במבחנים שנערכו להשיג איזון בין הדור איכותי DIO-LCNP-PEG-צ'ול צירופים ואת הרמה הרצויה של אותות קרינה בניסויי משלוח הסלולר . כמו כן, bioconjugation של מחצית חול-PEG-NH2 אל פני השטח DIO-LCNP חייב להיות מותאם על מנת להשיג את הרמה הרצויה של תיוג הסלולר. לבסוף, מספר תאים להחיל את הכלים תרבות מצופה פיברונקטין הוא קריטי להצלחה, יש להקפיד כדי לזרוע את התאים בצפיפות של ~ 8 x 10 4 תאים / מ"ל (~ 2.4 x 10 5 תאים לכל צלחת) . כאשר התאים הם זורעים בדלילות מדי, התוצאה היא תיוג קרום יעיל, תוך זריעת ceLLS תוצאות בצפיפות מדי ברכישת תמונות עניות כי לא מראות בבירור תיוג קרומי.
מגבלה פוטנציאלית אחת של הפרוטוקול כפי המתואר הוא כי היעילות של שילוב של צבעים ותרופות מיקוד קרום שונים אחרים ישתנו בהתאם הידרופוביות של המטען צבע / סמים. במקרים אלה, פרוטוקול סינתזת LCNP יצטרך להיבדק באופן אמפירי כדי לקבוע את תנאי סינתזה האופטימליים עבור התאגדות מטען צבע / סמים אידיאליים.
לסיכום, שיטה פותחה עבור במסירה המבוקרת המבוססת LCNP של מטען צבע הידרופובי אל קרום הפלזמה של תאי חיים כי מתגבר רב של אתגרים הטכניים הקשורים משלוח הסלולר של מטעני מים מסיסים. המשמעות הכוללת של השיטה היא שהיא בבירור משפרת את המשלוח המסוים של מטענים אל קרום הפלזמה תוך התעלמות מגירויים בעת ובעונה אחת את cytotoxicity במקביל כי הוא associated עם משלוח מטענים הידרופובי בריכוזים גבוהים מפתרון בתפזורת. גישה זו צריכה למצוא כלי רחב באספקת מטעני סוכן הדמית צבע / הידרופובי מאתגר דומה ותסייע עשוי להקל על המעבר של יעיל, עדיין גרוע מסיסים במים, מטענים ממשטר ניסיוני להגדרה הקלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תכנית מימון מאגר NRL (עבודת יחידת MA041-06-41-4943). ON נתמך על ידי Associateship מחקר מלגות המועצה הלאומית למחקר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
