Summary
Bir sıvı kristal nanopartikül (LCNP) nanocarrier canlı hücrelerin plazma zarına bir hidrofobik yük sürekli verilme için uygun bir araç olarak kullanılarak.
Abstract
hücrelere ilaç / görüntüleme maddeleri kontrollü dağıtım terapötik maddelerin geliştirilmesi için ve hücresel sinyal işlev çalışmaları için önemlidir. Son zamanlarda, nanopartiküller (NPS), teslimat sistemlerinin gelişiminde önemli söz göstermiştir. Burada, sıvı kristal NP (LCNP) tabanlı dağıtım sistemi, bir plazma hidrofobik bölgeye NP çekirdek içinde bir suda-çözünmeyen boya, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) kontrollü olarak bırakılmaları için kullanılmaktadırlar edilmiştir membran iki tabakalı. NPlerin sentezi sırasında, boya verimli çoklu spektroskopik analizleri ile teyit edildiği gibi, hidrofobik LCNP orta tabakasına dahil edilmiştir. NP yüzeyi (DIO-LCNP-PEG-Chol) bir PEG'lenmiş kolesterol türevi çekimi HEK 293T / 17 hücrelerinde plazma zarı boya yüklü NPS bağlanmasını sağladı. Zamana bağımlı lazer tarama konfokal mikroskopi ve Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme geçmek doğruladıLCNP çekirdek ve plazma zarı bilayeri içine yerleştirilmesi gelen Dio çıkışını ive. Son olarak, bir LCNP-PEG-Chol olarak Dio teslim Dio sitotoksisitesini zayıflatılmış; Dio NP formu Dio ücretsiz toplu bir çözüm teslim kıyasla ~% 30-40 daha az toksisite sergiledi. Bu yaklaşım, bir hidrofobik molekül yüklerin membran spesifik gönderimi ve düzenlenmesi için etkili bir yöntem olarak LCNP platformun faydasını ortaya koyar.
Introduction
canlı hücreler ile (en azından bir boyutta malzeme ≤100 nm) nanomalzemeler arayüz gelişiyle bu yana, sürekli bir gol çeşitli uygulamalar için nanopartiküller (NPS) benzersiz boyut özelliklerine yararlanmak olmuştur. Bu uygulamalar, hücre ve doku markalama / görüntüleme (in vitro ve hem de in vivo), gerçek zamanlı algılama ve ilaç ve diğer yüklerin 1 kontrollü olarak verilmesini içerir. Böyle İlgili NP özelliklerin örnekleri yarı iletken Nanokristallerin boyutu bağımlı emisyon (kuantum noktaları, QD'lerin) arasında; altın nanopartiküllerin fototermal özellikleri; Lipozomlar sulu iç kısım büyük yükleme kapasitesi; Bu tür tek duvarlı karbon nanotüpler ve grafen olarak karbon allotropes, ve balistik iletkenlik.
Daha yakın zamanlarda, önemli derecede bir faiz gibi kontrast / görüntüleme a gibi ilaçlar ve diğer yükler, kontrollü modülasyonu için NPS kullanımında ortaya çıkmıştırbeyler. Burada, gerekçe anlamlı / geliştirmek bir NP formülasyonu olarak sunarak ilaç kargo genel çözünürlüğü, teslim dozu, dolaşım süresi ve nihai açıklığı optimize etmektir. Bu NP-aracılı ilaç dağıtım (NMDD) olarak bilinen hale geldi ve çeşitli kanserler ve klinik çalışmaların çeşitli aşamalarında daha yüzlerce tedavisinde klinikte kullanılmak üzere yedi FDA onaylı NP ilaç formülasyonları şu anda. "Daha az ile daha başarmak;" Özünde, amaç etmektir diğer bir deyişle, geniş yüzey alanı yararlanarak daha az dozaj idareleri devamı getirilmiş ilacı uygulamak için bir iskele olarak NP kullanımı: hacim (örneğin, bu tür QDS ve metal oksitler gibi sert parçacıklar) NPS veya yükleme için geniş iç hacme büyük kargo yükleri (örneğin, lipozomlar veya miseller). Buradaki amaç, sulu istikrar ve gelişmiş dolaşımını teşvik ederken aynı zamanda, özellikle için, birden fazla sistemik teslim doz rejimleri için gerekliliğini azaltmakÇok etkili olmakla beraber, sulu ortamda çok az çözünen, zor hidrofobik ilaç yükler.
Bu nedenle, burada tarif edilen çalışmanın amacı lipofilik plazma zarı çift tabakaya hidrofobik yükün spesifik ve kontrollü verilmesi için, yeni bir NP iskele ile canlılığı belirlemekti. iş için motivasyon sulu ortamdan hücrelere hidrofobik moleküllerin teslim doğasında sınırlı çözünürlük ve zorluk oldu. Tipik haliyle, bu tür hidrofobik moleküllerin dağıtım iç yükleme sınırlı toksik ve uzlaşma doku ve hücre canlılığı 2 veya misel taşıyıcısı olabilir organik çözücüler (örneğin, DMSO) ya da amfifilik yüzey aktif (örneğin, Poloksamerler) kullanımını gerektirir kapasiteleri. Burada seçilen NP taşıyıcı önceden 3 geliştirilen yeni sıvı kristal NP (LCNP) formülasyonu ve bu ~ 40 kat ulaşmak için daha önce gösterilen olmuştu kültürlenmiş hücrelerde 4 antikanser ilaç doksorubisin etkinlikteki artış.
Burada tarif edilen çalışmada seçilmiştir Örnek kargo potansiyometrik membran boya, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) idi. DIO yaşam ve sabit nöronlar, membran potansiyeli ölçümlerde anterograd ve retrograd izleme için kullanılan bir suda çözülmeyen bir boya, ve genel membran etiketleme 5, 6, 7, 8, 9. Dolayı hidrofobik doğası, DIO, genellikle bir kristal formunda 10 hücre mono tabakaları veya dokulara doğrudan ilave edilir, ya da çok yüksek konsantrasyonlarda kuluçkaya yatırılır Bir konsantrasyon stok solüsyonu 11, 12 seyreltme sonra (~ 1-20 mcM).
içerik "LCNP platformuna> Burada, yaklaşımdır kullanımı, DIO. DIO için bir iletim aracı olarak olan iç kısım tam olarak hidrofobiktir ve, yüzeyi aynı zamanda, hidrofilik ve bioconjugation için uygun olan bir çok fonksiyonlu NP, sentez esnasında LCNP çekirdek içine dahil edilen ve NP yüzey daha sonra plazma zarına DIO-LCNP topluluğu zar bağlanmasını teşvik etmek için PEG'lenmiş kolesterol yarımı ile işlevlendirilmektedir. Bu yaklaşım daha fazla doğruluk ve membran ikamet plazma zarına DIO paylaştırıldı bir salma sistemi ile sonuçlanmıştır Dio serbest bir şekilde ana çözeltiye teslim kereden (DIO serbest). Ayrıca, bu yöntemle Dio LCNP aracılı teslim edilmesini düzenleyen ve lipofilik plazma zarı ikili katmanı içine boyanın özel bir bölme oranını teşvik ettiği görülmüştür. Bu, eş zamanlı bir LCNP formülasyonu olarak sunarak% 40 ~ tarafından serbest ilacın sitotoksisite düşürürken elde etti.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 1. Hazırlık
- sıvı kristalin diakrilat çapraz bağlama maddesi (DACTP11, 45 mg) içinde çözülür, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO, 2 mg) ve 2 ml kloroform içinde polimerizasyonu için bir serbest radikal başlatıcı (azobisizobütironitril, 1 mg) eklenmiştir. akrilat işlevselleştirilmiş yüzey aktif maddenin bir sulu çözelti (AC10COONa, 7 ml, 13 mg), bu ekleyin.
- su içinde polimerize yüzey ile çevrili bir organik malzemenin küçük damlacıklar içeren bir miniemulsion üretilmesi için 5 dakika için% 80 genlik de 1 saat süreyle karışımın sonikasyon karıştırın.
- Bir yağ banyosu içinde 64 ° C'ye ısıtın karışımı Kloroform yavaş yüzey aktif madde ile stabilize edilmiş olan bir DIO-ihtiva eden NP süspansiyon bırakarak buharlaştıkça çapraz bağlama maddesi ve yüzey aktif madde hem de polimerizasyonunu başlatmak için.
- bir toplama ayrılması için bir 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir NP süspansiyon (3 kez) filtre. Stosonraki kullanıma kadar 4 ° C sıcaklıkta filtre edildi NP çözelti yeniden.
- EDC bağlantı yoluyla Dio-LCNP PEG-Chol çekimi.
- Kol-PEG-NH2 çözülür · 25 mM HEPES tampon maddesi (pH 7.0) içerisinde HCI (PEG-kol, 0.9 mM).
- N-hidroksi-sülfosukkinimid sodyum tuzu (NHSS, 40 mM) ve konsantre stok çözeltilerinden HEPES tampon maddesi içinde 1-etil-3- (3- (dimetilamino) -propil) karbodiimid hidroklorür (EDC, 400 mM) ihtiva eden bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
- Hemen HEPES tamponunda DIO-LCNP ve 1.0 ml NHSS / EDC yeni hazırlanmış çalışma çözeltisinin 20 ul ekle ve 5 dakika karıştırın.
- Bu karışıma, kol-PEG-NH2 HCI stok çözeltisi 20 ul ilave edin ve 2 saat karıştırın.
- Kısaca, bir masa üstü santrifüj kullanılarak küçük ile dengelenmiş bir PD-10 ebat eksklüzyon kromatografi kolonundan 13 süpernatanın geçen 30 saniye için maksimum hızda (~ 2.000 x g), reaksiyon karışımı santrifüjDulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS, 0.1X).
Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 2. Karakterizasyonu
- Jel elektroforezi ile Dio-LCNP yüzeye PEG-Chol başarılı kovalent çekimlerini onaylayın.
- (; 89 mM Tris (pH 7.6), 89 mM borik asit, 2 mM EDTA, TBE) tampon maddesi 50 tris-borat elektroforezinin ml (1 x) 'de agaroz 0.5 g çözündürülür. agaroz çözmek için bir mikrodalga fırında çözüm ısıtın. Çözelti biraz soğumasını ve elektroforez kutusuna bir jel tabakası içine içeriğini dökün izin verin. numune kuyuları oluşturmak için bir jel tarağı yerleştirin.
- Jel katılaşmış sonra, bölmeye çalışan tampon TBE içinde (bölme jel daldırın kadar) gerekli miktarda ilave edin.
- DIO-LCNP örnek 35 ul ekle jel oyuklarına 110 V'luk bir gerilim 20 dakika boyunca çalışması (% 5 hacim / hacim gliserol ile değişik)
- Görüntü jel görüntüleme sistemi wi kullanarak jelinci uyarılma ve radyasyon filtreleri, sırasıyla 488 nm ve 500-550 nm'de.
- PBS içinde DIO-LCNP çözeltisi (~ 200-kat seyreltme) (pH-8, 0.1X) seyreltilmesi ve DLS cihazının 14 ölçüm dinamik ışık saçılımı (DLS) ile partikül ebadı ve dağılımı değerlendirilmesi. Uygun bir zeta potansiyeli ölçüm aleti kullanılarak Dio-LCNPs zeta-potansiyelini ölçün.
Teslim Deney ve Görüntüleme Hücre Kültürü Yemekleri 3. hazırlanması
Not: DIO-LCNP markalama daha önce tarif edildiği gibi 4 kültürlenir HEK 293T (geçitler 5 ile 15 arasında) / 17, insan embriyonik böbrek hücreleri üzerinde gerçekleştirilir. aktarma deneyleri ve aşağıda tarif edildiği gibi daha sonra hücre görüntüleme gerçekleştirin.
- 20 ug konsantrasyonunda ~ sığır fibronektin (ile kaplanarak 100 ul (14 mm No 1 coverglass uçlar ile donatılmış) 35 mm çapında bir doku kültür tabakları hazırlanması37 ° C'de 2 saat boyunca DPBS / ml).
- kültür çanak fibronektin kaplama çözüm çıkarın. Hasat HEK İlk yıkama T-25 balonuna 293 T1 / 7 hücreleri DPBS 3 ml ve daha sonra tripsin-EDTA (% 0.5 tripsin,% 0.25 EDTA) 2 ml eklenerek hücre tekli-tabakası.
- ~ 3 dakika için 37 ° C 'de balon inkübe edin. tripsin-EDTA çıkarın ve inkübatör şişeyi geri dönün. Hücreler şişeden ayrıldıktan sonra, tam bir ortamda 4 ml ekleyerek tripsin nötralize şişeye (; DMEM Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu,% 5 sodyum piruvat ve% 5 antibiyotik / antimikotik içeren değiştirilmiş) . hücre sayacında sayarak göre süspansiyon içindeki hücre konsantrasyonunu saptamak.
- Büyüme ortamı ile yaklaşık 8 x 10 4 hücre / ml hücre yoğunluğu ayarlayın. Gece boyunca kuluçka makinesi içinde çanak ve kültür hücre süspansiyonu 3 ml ilave edilir Sonraki gün, hücreler,% 70 ortak akışkanlığa olmalıdır ve kullanıma hazır olması gerekir. YeterliHücre yoğunluğu, hücrelerin yüksek oranda sağlam ve etkili bir etiketleme için kritik önem taşır.
4. Hücresel Dio ve Dio-LCNPs teslimi ve Sabit Hücre Görüntüleme
- Teslimat ortamında Dio, Dio-LCNP ve Dio-LCNP-PEG-Chol 1 ml çözümleri hazırlayın (HEPES-DMEM; DMEM 25 mM HEPES içeren) Dio ücretsiz ve Dio-LCNPs stok çözümleri seyreltilmesi ile; hücreler üzerindeki inkübasyon için uygun Dio konsantrasyonları (DIO DIO-LCNP şeklinde serbest veya Dio konsantrasyonu ya da ifade edilir) ~ 1-10 mcM olacaktır.
- serolojik bir pipet kullanılarak kültür kaplarından büyüme ortamı çıkarın ve hücre tek tabakaları yıkama HEPES-DMEM (her biri 2 ml yıkama) ile iki kez (adım 3). yavaşça ekleme ve yemekler kenarından için / bir pipet kullanarak HEPES-DMEM kaldırarak yıkar gerçekleştirin.
- Kültür kaplarına merkezine hazırlanan Dio ücretsiz veya Dio-LCNP teslim çözümleri 0.2 ml ekleyin ve i yemekler dönmekncubator uygun bir zaman süresi (deney ihtiyaçlarına bağlı olarak, tipik olarak 15 ya da 30 dakika) için. Daha uzun inkübasyon süreleri olmayan membranöz alanlarda daha nonspesifik hücresel etiketleme (örneğin, sitosol) ekleyin.
- Kuluçka döneminden sonra, serolojik bir pipet kullanarak dağıtım çözümleri çıkarın. DPBS (2 ml her yıkama) ile hücre tekli iki kez yıkayın. yavaşça yemeğin kenarından / 'e DPBS ekleyerek ve çıkararak yıkar gerçekleştirin.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (DPBS hazırlanmıştır)% 4 paraformaldehid kullanılarak hücre mono tabakaları sabitleyin.
UYARI: Paraformaldehyde yanıcı, bir solunum tahriş ve şüpheli kanserojen. - bir pipet kullanılarak paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve yavaşça eklenmesi ve yemekler kenarı için / pipet kullanılarak DPBS kaldırarak hücreler DPBS ile 1 kez (2 mi) yıkayın.
- Sabitlenen hücreler konfokal lazer tarama kullanılarak bir zar floresans sinyalinin varlığı için görüntülenmek üzere hazırmikroskobu (CLSM). Görüntülemeden hemen önce gerçekleştirmek ya da seçenek olarak, NaN3,% 0.05 ihtiva eden DPBS orta yerine ve 4 ° C'de yemekler saklayın.
DİKKAT: NaN3 zehirlidir; NaN 3 kullanırken çok dikkatli.
NOT: Bu şekilde depolanan sabit numuneler en iyi sonuçlar için 48 saat içinde görüntülü olmalıdır.
Canlı hücreler Dio ve Dio-LCNPs ve FRET Görüntüleme 5. Hücresel Teslimat
NOT: Bu yöntemde, hücreler 6 uM (DIO FRET donör) her bir DIO-LCNP-PEG-kol ve 1,1'-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (DII ile colabeled edilir ücretsiz DII) FRET alıcı olduğu. plazma zarı içine Dio-LCNP-PEG-Chol ve kurulduğu gelen Dio salınımı DII alıcısı için Dio donörden enerji transferi gözlenen artış ile teyit edilir.
- Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII fre ile sırayla etiket hücrelerie aşama 4'te tarif edilen yöntem kullanılarak.
- Boyama işleminden sonra hücreler DPBS ile 1 kez (2 mi) bir serolojik bir pipet kullanarak yıkama ve canlı hücre görüntüleme çözeltisi, 2 ml (LCIS) ile yıkama tamponu değiştirin.
- ısıtılmış bir kuluçka odasına, resim tam emisyon 488 nm heyecanlı Dio donör tarafından 4 saatlik bir süre boyunca 30 dakika aralıklarla bir FRET görüntüleme yapılandırma ile bir konfokal mikroskop (60X objektif) kullanılarak ve toplama canlı hücre örneği ile donatılmış bir mikroskop sahnede Dio donör ve 32 kanallı spektral dedektörü ile 490-700 nm DII alıcısı hem spektrumları.
- NOT: FRET görüntüleme hakkında daha fazla bilgi için, 15 başvuru bakın.
- Dio donör ve Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII ile boyanmış hücrelerden DII alıcısı hem zamana bağımlı emisyon yoğunluğunu belirler. Zamana bağımlı alıcı / verici giderek artacak oranını görüntüler için (DII emi / DIO emi), ve sonunda plaka FRET hesaplamakau membran içine bölümlenmiş Dio donör miktarı bir kez maksimum 16 ulaşmıştır.
6. Dio Sitotoksisitenin Deneyi ve Dio-LCNPs HEK 293T / 17 Hücreleri
Not: DIO-LCNP malzeme sitotoksisite bir tetrazolyum boya bazlı proliferasyon analizi 17 kullanılarak tayin edilir. Hücreler, dağıtım / etiketleme taklit koşulları altında malzemelerin değişen konsantrasyonlarının varlığında, çok oyuklu bir plaka içerisinde kültürlenir. Hücreler daha sonra çoğalması için izin 72 saat boyunca kültürlenir. Bir boya (MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-karboksimetoksifenil) -2- (4-sülfofenil) -2H-tetrazolyum) daha sonra oyuklara ilave edildi ve metabolik olarak aktif olan hücreler mavi formazan ürüne boya dönüştürün. renk oluşumu miktarı canlı hücre sayısı ile doğru orantılıdır.
- Hasat HEK aşama 3.2.Seed tarif edilen prosedür takip edilerek, T-25 balonuna 293 T1 / 7 hücreleri24 saat için 96-yuvalı doku kültürü ile muamele edilmiş levha ve kültür çukurlarına HEK 293T / 17 hücreleri (/ 100 ul / oyuk 5.000 hücre).
- Tamamen ücretsiz dio içeren HEPES-DMEM 50 ul bir mikropipet kullanarak kuyulardan kültür ortamı çıkarın ve ekleyin, kuyu çoğaltmak Artan konsantrasyonlarda DIO-LCNPs veya Dio-LCNP-PEG-Chol. 30 dakika boyunca, 37 ° C'de hücreler üzerinde inkübe edin.
Not: Genellikle, üç kopya ya da dört yapılan çoğaltır istatistiksel güvenilir veri elde etmek için yeterlidir.- İnkübasyondan sonra, bir mikropipet kullanılarak malzemeler ihtiva eden dağıtım orta kaldırmak ve büyüme ortamında 100 ul ile değiştirin. Kültür 72 saat boyunca hücre.
- Her bir oyuğa tetrazolyum alt-tabaka 20 ul ekle inkübatör plaka dönüş ve renk oluşumu 4 saat 37 ° C'de ilerlemesine izin. 570 nm (bu stu kullanılan Dio-LCNPs için emme minimada formazan ürünün absorbansı (abs) Okudy) ve spesifik olmayan arka plan emmesinin çıkartma için 650 nm () bir mikrotitre plaka okuyucusu kullanılarak.
- Ayırıcı emme değeri (ABS 570 - ABS 650) Konu malzeme konsantrasyonuna karşı ve kontrol hücre çoğalması (hücre kültür ortamı, yalnızca hücrelerin proliferasyonunun derecesi) yüzdesi olarak sonuçları şu şekildedir.
7. Veri analizi
- İstatistiksel varyansın tek değişkenli analizi (ANOVA) ile verileri analiz. çoklu karşılaştırmalar için, Bonferroni post hoc testi uygulayın. ortalama ± standart hata olarak belirtilmiştir (SEM) gibi tüm ortalama değerler sağlamak.
NOT: anlamlılık için kabul edilebilir olasılık p <0.05 idi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCNPs olan NP hidrofobik merkez hidrofobik yükler için etkili bir taşıma aracı olarak LCNP yararını göstermek için temsili bir zar markalama probu ile yüklenmiştir hazırlanmıştır. Bu amaç için, seçilen kargo yüksek ölçüde suda çözünür olmayan potansiyometrik membran etiketleme boya dio idi. Şekil 1 ila 18 'de gösterildiği gibi, DIO-yüklü LCNPs (DIO-LCNPs), kimyasal bileşenleri DACTP11, AC10COONa ve Dio iki fazlı bir mini emülsiyon tekniği kullanılarak sentezlendi. Bu NP sisteminde, kristalli çapraz bağlama maddesi DACTP11 birlik oluşturacak şekilde bağlanan polimer ağı DIO çapraz bağlanmış ağ geçiş boşluklar içinde bulunan sabit bir hidrofobik çekirdeği sağlar. Ayrıca, hücre hedefleme ligandlarının birleştirilmesi için bir fonksiyonel grup olarak "kolu" hizmet ederken NP yüzeyi üzerinde karboksilat gruplarının sulu ortam içinde parçacık koloidal stabilite(Ve diğer biologicals). Plazma zarına DIO-LCNPs halata bir amin ile sona eren PEG'lenmiş kolesterol yarımı (PEG-Chol) kovalent EDC Eşleme ile LCNP yüzeyi (Şekil 1) bağlanmıştır. NP sentezi ve başarılı bioconjugation onaylanmasından sonra, Dio-LCNPs yeteneği canlı hücre plazma zarı etiket ve ücretsiz karşılaştırıldığında geliştirilmiş özgüllük ve kinetik plazma zarı çift katlı lipofilik kısmına gömülü dio kargo teslim etmek toplu çözüm teslim formu (Dio ücretsiz) değerlendirildi.
Şekil 2 de gösterildiği gibi, DIO bilgilerini (6.0 uM) sağlam yüksek verimlilik, plazma membranı lekeli HEK 293T / 17 hücreleri ile inkübasyon 15 dakika sonra (hücrelerin yaklaşık% 100 etiketli). Bununla birlikte, DIO Free önemli hücresel içselleşme ancak orta derecede bir artış üzerine gözlenmiştir30 dakika (Şekil 2'de A ve C) kadar olan kuluçka süresi. DIO serbest içselleştirme ölçüde hücreleri ilk 6.0 uM DIO bilgilerini (30 dakika) ile inkübe edildiği zaman çözümlü ko deneyleri ile belirlenmiştir. DIO bilgilerini içeren yeni inkübasyon ortamı, daha sonra çıkarıldı ve hücreler, 4 saat kadar sonradan tekrar kültüre edildi. hücrelerin plazma membranları (; PE-Rhoda Rodamin B konjüge fosfoetanolamin) bir boya etiketli zar fosfolipid ile zıt. Şekil 2, C'de gösterildiği gibi, kuluçka 15 dakika sonra, DIO Free neredeyse% 100 PE-Rhoda işaretleyici (PCC = 0.99 ± 0.01 Pearson ko katsayısı) ile birlikte lokalize edildi. Bununla birlikte inkübasyon, 30 dakika sonra ~ DIO Free% 80 zarı (~ içsel% 20) bağlı kaldı. Dio ücretsiz içselleştirme derecesi inci gibi sürekli artışe inkübasyon süresi sürece 4 olarak saat uzatıldı ve bu DIO ve Rhoda-PE (Şekil 2 C) arasında PCC eşlik eden azalma yansıdı. Bir tek fazlı üstel çürüme denklemine verilerin uyum Dio serbest içselleştirilmesi maksimum ulaştığı ortaya ~ bir içselleştirme oranı (k = 0.045 dk -1) ve yarılanma ömrü (15 dk) ile 1 saatte% 50, serbest Dio hızlı ve verimli hücresel alımı yansıtıyordu. Bu veriler büyük ölçüde incelenen 4 saat süre boyunca çekirdekten dışında kaldı sitoplazmada, plazma zarının serbest Dio hızlı zamana bağlı geçiş göstermektedir.
Ücretsiz Dio kontrolsüz hücresel alımını göz önüne alındığında, hedef bir LCNP-PEG-Chol NP formülasyonu olarak Dio teslim yoluyla bu davranışı modüle etmek oldu. Bir LCNP-PEG-Chol Bioconjugate olarak teslim bir daha kalıcı zar residDio azade kıyasla Dio ence süresi (Şekil 2 B) not edildi. hücrelerle DIO-LCNP-PEG-kol inkübasyonundan 15 dakika sonra, DIO sinyalinin yaklaşık% 100 daha PE-Rhoda membran işaretleyici ile lokalize edilmiş plazma membranı, karşılaştırılabilir bir sonucu olduğu tespit edildi serbest Dio için gözlemledik. Bu membran DIO ücretsiz etiketleme oldukça düzgün ve bitişik ise, kuluçkalama 15 dakika sonra DIO-LCNP-PEG-Chol boyama modeli daha fazla noktasal ve neredeyse doğada üniform (Şekil Bununla birlikte not edilmiştir 2 B). Bu sonuç DIO-LCNP-PEG-Chol NPS plazma zarı içinde ayrı bölgelerde toplanması olduğunu belirtti. Kuluçka süresi 30 dakika 'e yükseltildiği zaman, ~ DIO sinyali% 94 (şekil (DIO aynı zaman noktasında ücretsiz ~% 80 ile karşılaştırıldığında) membran kalmıştır 2 B ve 2C). Hücreler ilk 30 dakika inkübasyondan sonra artan daha uzun süre DIO-LCNP-PEG-Chol NPler kültürlenmiştir gibi bu eğilimin daha da belirginleşmiştir. Örneğin, ilk inkübasyondan sonra 1 saat kültürden sonra, Dio-LCNP-PEG-Chol NP sinyalinin yaklaşık% 80 membranöz ve (Dio ücretsiz% 55 ~ kıyasla) PE-Rhoda işaretleyici ile kolokalize kalmıştır. Özellikle, DIO-LCNP-PEG-Chol NPS hücresel içselleştirilmesi 2 saat (% 70 zar tutma)% 30 maksimum ulaştı. Bu hücresel alım hızına karşılık gelir (K = 0.024 dk-1; yarılanma ömrü = 29 dakika) ile tam olarak bir devre, serbest DIO içselleştirme için gözlenenden taşımaktadır.
Daha sonra, NP-gömülü dio yük kabiliyeti etkin LCNP çekirdek dışına akıttığı belirlenen ve bir kontrol ve zamana bağlı bir şekilde plazma zarı çift katlı lipofilik ortam girmek için kullanılır. içinDio alıcı boya, DII enerji transferi yapan bir FRET donör olarak hizmet burada bu değerlendirmek, bir FRET tabanlı strateji geliştirildi. Beklendiği gibi, ilk etiketleme (t = 0 dakika) üzerine, emisyon sinyal membran gergin NP (Şekil 3 B) içinde bulunan Dio donör hakim oldu. Bu aynı alan 4 saat sonra (t = 240 dakika) görüntüleme FRET Ancak plazma membranı ikili katmanı içine LCNP çekirdekten DIO vericinin geçiş güçlü bir kanıt sağlar DII alıcısı emisyon sinyalinin önemli bir artış olduğunu göstermiştir (Şekil 3 C). Bu geçişin zamana bağımlı doğa Sınav 4 saat deneysel pencere üzerinde DII alıcı emisyon karşılık gelen bir artış (Şekil 3 D) ile birleştiğinde Dio donör emisyon istikrarlı bir düşüş gösterdi. Özellikle, bu geçiş sırasında FRET verimliliği onun maxi ulaştıdio vericinin akış ve membran bölümleme, bu zaman noktasında maksimuma (Şekil 3 E) varıldığını düşündüren ~ 180 dakika sonrası ilk etiketleme de anne. Bu veriler Dio-LCNP-PEG-Chol NPS ile maksimum ~ 3 saat sonrası ilk etiketleme ulaştı plazma zarı çift tabakaya np Dio zaman çözülmüş bölümleme güçlü kanıtlar sunmaktadır.
Son olarak, karşılaştırmalı sitotoksisite analizi Dio-LCNP-PEG-Chol karşı ücretsiz Dio için yapıldı. (Her iki durumda da 6 mcM bir Dio konsantrasyonda) HEK 293T / 17 hücreleri ile inkübe, LCNP çekirdek içinde Dio kapsülleme onun sitotoksisite zayıflatılmış açıktı. Dio ücretsiz ~ hücresel canlılığı ortaya iken% 50, Dio-LCNP-PEG-Chol ile kuluçkaya hücreler hücresel canlılığı ~% 90 sergiledi. (Şekil 4). Toplu olarak, hücre etiketleme verileri cep TOXI ile birlikteŞehir verileri DIO-esaslı membran etiketleme verimlilik ve Dio ve sitotoksisite modülasyonu hem de geliştirmeler göstermektedir.
Şekil 1: membrana bağlanma DIO-LCNP-PEG-kol şematik temsili. DIO-LCNP bir akrilat sıvı kristal çapraz bağlama maddesi (DACTP11) oluşmaktadır; bir karboksil-ile-sonlanan polimerize edilebilir yüzey aktif madde (AC10COONa); ve bir lipofilik boya, Dio. Kolesterol-sonlanan bir poli (etilen glikol) (PEG-Chol) EDC Eşleme ile DIO-LCNP konjüge edildi. Dio-LCNP yüzeye Chol eklenmesi plazma zarına NP bağlanma tercihli aracılık eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: HEK 293 T / 17 hücreleri Dio Zaman çözülmüş hücresel alımı ücretsiz. DIO bilgilerini (6.0 uM, panel (A) ya da DIO-LCNP-PEG-kol ([dio] = 6.0 uM, panel (B), 15 dakika boyunca hücre tekli katmanları üzerinde inkübe çıkarıldı ve büyüme ortamı ile değiştirildi; hücreler (en fazla 4 saat kadar). Hücreler belirtilen zamanlar için kültüre daha sonra PE-Rhoda (2.0 uM) ile boyandı ve fikse edildi. numuneler CLSM kullanarak Dio (yeşil) ve için görüntülü PE-Rhoda (kırmızı) membranı bağlı bulundu. ( C) enkübasyon süresini arttıran bir fonksiyonu olarak, membrana bağlı dio serbest veya DIO-LCNP-PEG-Chol sinyalinin yüzde süre-çözülmüş alan. veriler Pearson ko katsayısı (PCC elde edilen n, 3 ve # = edildi177; inkübasyon 15 dakika tekabül PCC için normalleştirme sonra standart yeşil (DIO) ve kırmızı (PE-Rhoda) kanallarının sapma) ve ± SEM yüzdesi (olarak ifade edilir). Ölçek çubuğu 20 mikron =. Referans 18 izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Zaman çözülmesi FRET plazma zarı Dio-LCNP-PEG-Chol gelen Dio çıkışını doğrular. HEK293T / 17 hücreleri Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII, DIO (yeşil yayan) ve DII (kırmızı yayan) boyalar sırasıyla FRET donör ve alıcı olarak hareket ile costained bulundu. Dio-LCNP-PEG-Chol ([dio] = 6.0 iM) ve DII (6.0 uM) ile costained canlı hücreler (A) DIC görüntü. sGeniş 4 saat arasında bir süre boyunca, FRET sinyali değişimini izlemek için görüntülendi. (B) ve (C), sırasıyla, t = 0 dakika, t = 240 dakikada aynı odak düzlemi canlı hücrenin FRET görüntüleridir. (D) Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII ile boyandı ve FRET uyarma modunda görüntülü hücrelerden Dio donör ve DII alıcısı Normalize, zamana bağımlı emisyon yoğunluğu. Dio-LCNP-PEG-Chol ve DII etiketli ve FRET yapılandırmasında görüntülü hücreler için (E) Zaman çözülmesi FRET oranı (DII emi / DIO emi). Ölçek çubuğu 20 mikron =. Referans 18 izniyle. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NMDD bir sürekli amacı aynı anda geliştirilmiş ilaç etkinliği ile kombine kontrol hedefleme ve hücre ve dokulara ilaç formülasyonlarının içerisinden dağıtım olmaktadır. Bu önemli bir sorun teşkil ettiği için ilaç moleküllerinin belirli bir sınıf sulu ortamda hiçbir çözünürlüğüne idareli sahip hidrofobik ilaçlar / görüntüleme ajanları olduğunu. Bu sorun, klinik ortamda in vitro hücre kültür sistemleri ile ilgili potansiyel ilaçların geçişi saran ve "rafa" olarak ümit vaadeden bir ilaç molekülleri ile sonuçlandığı veya terk ve klinik ortamda daha da takip edilmemiştir. Wortmannin (Wtmn), örneğin, fosfatidilinositol 3 'kinazlar ve fosfatidilinositol 3' kinaz ile ilgili kinazların bir inhibitörü ve bir anti-kanser madde olarak büyük bir potansiyele sahiptir, ancak suda çözünürlüğü eksikliğine klinik çalışmalarda ilerlemesini engellemiştir.
Son zamanlarda, Karve ve ark. gösterdi geliştirilmiş su solWtmn ve ubility zaman lipit polimer NP montaj 19 olarak formüle edilmiştir. büyük ölçüde bir NP formülasyon olarak geliştirilmiş, kontrollü teslimat bu tip yararlanabilir Bir arena plazma zarı hidrofobik ilaçlar ve görüntüleme maddeleri teslim olduğunu. Böylece, burada amaç bu teknik engelini kaldırmaya yönelik ve bu teknolojik engel aşmak için bir metodoloji geliştirmekti.
Bu metodoloji geliştirirken, bir model, membran hedefleme boya, Dio, tarihsel sulu ortamlarda düşük çözünürlük boğulmuş edildiğini seçildi. Bu plazma zarına boya özel teslimat önemli zorluklar verir. Bu güçlükler arasında, DMSO, 11, 12 gibi çözücüler içeren stok çözeltilerinden seyreltildikten sonra Dio çok yüksek konsantrasyonlu hücreler hücrelere veya dokulara 10 doğrudan boyanın kristal şeklini eklemek veya inkübe için ihtiyaç vardır.yaklaşım burada iki kat oldu: 1) NP sentez sırasında LCNPs hidrofobik çekirdek içine Dio dahil ve 2) kovalent PEG'lenmiş kolesterol konjugat (DIO-LCNP-PEG-Chol gibi sentezlenmiş Dio-LCNPs değiştirmek) kolaylaştırmak için plazma zarı ile Dio yüklü NPS doğrudan etkileşim. Nitekim, bu yaklaşım etkili bir plazma zarı Dio teslim yönlerini bir dizi gelişmiş.
Dio toplu çözüm ücretsiz teslim edildi kıyasla LCNP formülasyonu olarak teslim olduğunda ilk olarak, Dio membran kalma süresi etkili bir şekilde iki katına çıkarıldı. ko-boyama deneyleri ile teyit edildiği gibi bu genişletilmiş membran kalma süresi Dio-LCNP-PEG-Chol lokalizasyonu bağlandı, plazma zarı lipid salı mikrodomainleri için konjugatları. İkinci olarak, çift katlı lipid içine Dio kargo bölümleme Dio bir zar yerleşik DII alıcısı için donör olarak görev yaptığı FRET deneyler ile teyit edilmiştir. Son olarak,Membran bilayeri içine Dio kargo yavaş, sürekli salım etkin bir% 40 ~ tarafından Dio sitotoksisitesini zayıflatılmış.
Başarı için kritik olan protokolde çeşitli noktaları vurgulamak için önemlidir. İlk olarak, LCNP çekirdek içine Dio yüzde yükleme ampirik test sentezinde optimize edilmesi gereken, yüksek kaliteli DIO-LCNP-PEG-Chol NPlerin üretimi ve hücre aktarma deneyleri floresan sinyalinin istenen düzeyi arasında bir denge elde etmek için çalıştırır . Benzer şekilde, DIO-LCNP yüzeyine kol-PEG-NH2 grubu arasında bioconjugation hücre etiketleme istenen seviyesi elde etmek için optimize edilmelidir. Son olarak, fibronektin kaplı kültür tabaklarında uygulanan hücrelerin sayısı başarısı için kritiktir ve bakımı yaklaşık 8 x 10 4 hücre / ml'lik bir yoğunlukta hücreler tohum alınmalıdır (~ tabak başına 2.4 x 10 5 hücre) . Hücreler çok seyrek numaralı seribaşı zaman ce tohumlama sırasında, bu verimsiz membran etiketleme ile sonuçlanıraçıkça yok yoksul görüntülerin ediniminde LLS çok yoğun sonuçlar membranöz etiketleme göstermektedir.
olarak tarif edilen protokol potansiyel bir sınırlama çeşitli diğer zara-hedefleme boyalar ve ilaç dahil etkinliği boya maddesi / ilaç kargo hidrofobisitesine göre değişir olmasıdır. Bu gibi durumlarda, LCNP sentez protokolü doğru boya maddesi / ilaç kargo dahil edilmek için uygun sentez koşullarının belirlenmesi ampirik test edilmesi gerekir.
Özet olarak, bir yöntem olup, suda çözünür olmayan yüklerin hücre teslimat ile ilgili teknik sorunların üstesinden gelen bir çok canlı hücrelerin plazma zarına bir hidrofobik boya yük LCNP bazlı kontrollü verilmesi için geliştirilmiştir. Yöntemin genel önemi aynı anda doç olan eşlik eden sitotoksisite zayıflatma ise açıkça plazma zarına kargo özgü teslim geliştirir olduğunuyığın solüsyonu yüksek konsantrasyonlarda hidrofobik yüklerin teslim iated. Bu yaklaşım benzer zorlu hidrofobik boya / görüntüleme ajanı kargoların teslim geniş programı bulmalı ve büyük olasılıkla etkili geçişini kolaylaştırmak için yardımcı olacaktır, ancak zayıf suda çözünür, klinik ortama deneysel rejimden kargolar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NRL Bankası Fonlama Programı (Çalışma Birimi MA041-06-41-4943) tarafından desteklenmiştir. ON Ulusal Araştırma Konseyi Doktora Sonrası Araştırma Associateship tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
