Summary
Un cristallo liquido nanoparticella (LCNP) nanocarrier viene sfruttato come veicolo per l'erogazione controllata di un carico idrofoba sulla membrana plasmatica delle cellule viventi.
Abstract
L'erogazione controllata di agenti droga / imaging per cellule è critico per lo sviluppo di terapie e per lo studio dei processi di segnalazione cellulare. Recentemente, le nanoparticelle (NP) hanno mostrato significativa promessa per lo sviluppo di tali sistemi di consegna. Qui, un cristallo liquido NP (LCNP) sistema di erogazione sede è stato impiegato per l'erogazione controllata di un colorante insolubile in acqua, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), all'interno del nucleo NP alla regione idrofobica di un plasma doppio strato di membrana. Durante la sintesi delle nanoparticelle, il colorante è stato efficacemente incorporato nel nucleo LCNP idrofobico, come confermato da analisi spettroscopica multiple. Coniugazione di un colesterolo derivato PEGylated alla superficie NP (Dio-LCNP-PEG-Chol) ha consentito il legame delle NP dye-caricato alla membrana plasmatica in HEK 293T / 17 cellule. Risolta in tempo scansione laser confocale microscopia e Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) di imaging ha confermato il passaggioive efflusso di DiO dal nucleo LCNP e il suo inserimento nel doppio strato membrana plasmatica. Infine, la consegna della DIO come LCNP-PEG-Chol attenuato la citotossicità della DIO; la forma NP della DIO esposto ~ 30-40% in meno tossicità rispetto al DiO gratuito consegnato dalla soluzione di massa. Questo approccio dimostra l'utilità della piattaforma LCNP come una modalità efficace per la fornitura specifica membrana e modulazione dei carichi molecolari idrofobiche.
Introduction
Dal momento che l'avvento di interfacciarsi nanomateriali (materiali ≤100 nm in almeno una dimensione) con cellule viventi, un obiettivo costante è stato quello di sfruttare le proprietà uniche dipendenti dalle dimensioni delle nanoparticelle (NPS) per varie applicazioni. Queste applicazioni comprendono cellule e tessuti etichettatura / immagini (sia in vitro che in vivo), rilevamento in tempo reale, e l'erogazione controllata di farmaci e altri carichi 1. Esempi di tali importanti proprietà NP includono l'emissione dipendente dalle dimensioni dei nanocristalli semiconduttori (punti quantici, QD); le proprietà fototermiche di nanoparticelle d'oro; la grande capacità di carico del nucleo acquosa di liposomi; e la conduttività balistica allotropi di carbonio, come nanotubi di carbonio a parete singola e grafene.
Più recentemente, notevole interesse è sorto nell'uso delle NP per la modulazione controllato di farmaci e altri carichi, come contrasto / dell'imaging unsignori. Qui, la logica è quella di migliorare in modo significativo / ottimizzare la solubilità generale, la dose erogata, tempo di circolazione, e la clearance eventuale del carico di droga consegnandola come una formulazione NP. Questo è venuto per essere conosciuta come la somministrazione di farmaci NP-mediata (NMDD), e ci sono attualmente sette approvati dalla FDA NP formulazioni farmaceutiche per l'uso in clinica per il trattamento di vari tipi di cancro e di altre centinaia in varie fasi di sperimentazione clinica. In sostanza, l'obiettivo è quello di "ottenere di più con meno;" cioè, di utilizzare la NP come impalcatura per fornire più farmaci con minori amministrazioni dosaggio sfruttando la grande superficie: volume (per esempio, particelle dure, come QD e ossidi metallici) di NP o loro grande volume interno di carico grandi payload carico (ad esempio, liposomi o micelle). Lo scopo è quello di ridurre la necessità di diversi regimi di dosaggio sistemicamente consegnati mentre allo stesso tempo promuovere stabilità acquosa e una maggiore circolazione, in particolare perimpegnativi carichi di droga idrofobiche che, pur altamente efficace, sono moderatamente solubile in ambiente acquoso.
Pertanto, l'obiettivo del lavoro qui descritto era di determinare la possibilità di utilizzare un nuovo NP scaffold per l'erogazione specifica e controllata di carichi idrofobi al doppio strato membrana plasmatica lipofilo. La motivazione per il lavoro era la limitata solubilità intrinseca e difficoltà nella consegna di molecole idrofobe alle cellule da mezzi acquosi. Tipicamente, la consegna di tali molecole idrofobe richiede l'uso di solventi organici (ad esempio, DMSO) o tensioattivi anfifilici (ad esempio, poloxamers), che possono essere di cellule e tessuti redditività tossici e di compromesso 2, o portatori di micella, che può hanno limitato carico interno capacità. Il vettore NP scelta qui è stato un cristallo liquido NP (LCNP) formulazione romanzo sviluppato in precedenza 3 e che era stato mostrato in precedenza per ottenere un ~ 40 volte miglioramento nell'efficacia della antitumorale doxorubicina farmaco in cellule coltivate 4.
Nel lavoro qui descritto, il carico rappresentante scelto era il colorante membrana potenziometrico, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO è un colorante insolubile in acqua che è stata utilizzata per anterograda e tracciatura retrograda nel potenziale di membrana misurazioni neuroni fissi vita e, e per membrane generale etichettatura 5, 6, 7, 8, 9. Grazie alla sua natura idrofoba, DiO è tipicamente aggiunto direttamente monostrati di cellule o tessuti in una forma cristallina 10, oppure viene incubata a concentrazioni molto elevate (~ 1-20 micron) dopo la diluizione da una soluzione di concentrazione magazzino 11, 12.
content "> uso Qui, l'approccio è stato alla piattaforma LCNP, un NP multifunzionale il cui nucleo interno è completamente idrofobico e la cui superficie è simultaneamente idrofila e suscettibili di bioconjugation, come veicolo di consegna per DiO. DiO è incorporato nel nucleo LCNP durante la sintesi , e la superficie NP viene funzionalizzato con un colesterolo frazione PEGylated promuovere la membrana vincolante dell'insieme DiO-LCNP alla membrana plasmatica. Questo approccio ha portato a un sistema di erogazione che partizionato DIO nella membrana plasmatica con maggiore fedeltà e residenza membrana volta che la forma libera della DIO consegnato dalla soluzione di massa (DIO gratuito). Inoltre, questo metodo ha dimostrato che la consegna LCNP-mediata della DIO modula in modo sostanziale e spinge il tasso di specifica partizionamento del colorante nel doppio strato membrana plasmatica lipofila. questo è raggiunto mentre contemporaneamente riducendo la citotossicità del farmaco libero da ~ 40% consegnandola come una formulazione LCNP.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione di Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol
- Sciogliere liquido diacrilato cristallina agente reticolante (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO, 2 mg), e un iniziatore radicale libero (azobisisobutirronitrile, 1 mg) per la polimerizzazione in 2 ml di cloroformio. Aggiungere questo ad una soluzione acquosa di tensioattivo acrilato-funzionalizzato (AC10COONa, 13 mg in 7 ml).
- Mescolare la miscela per 1 ora e sonicare all'80% ampiezza per 5 minuti per produrre una miniemulsion composto di piccole goccioline di materiale organico circondato da tensioattivo polimerizzabile in acqua.
- Riscaldare la miscela a 64 ° C in un bagno d'olio di avviare la polimerizzazione sia l'agente tensioattivo e reticolazione come cloroformio evapora lentamente, lasciando una sospensione NP DiO contenente che viene stabilizzato dal tensioattivo.
- Filtrare la sospensione NP (3 volte) attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron per rimuovere eventuali aggregazione. Store la soluzione NP filtrata a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Coniugazione del PEG-Chol a DIO-LCNP tramite accoppiamento EDC.
- Sciogliere Chol-PEG-NH 2 · HCl (PEG-Chol, 0.9 mM) in 25 mM tampone HEPES (pH 7,0).
- Preparare una soluzione di lavoro contenente N-idrossi-sulfosuccinimide sale sodico (NHSs, 40 mm) e 1-etil-3- (3- (dimetilammino) propil) carbodiimmide cloridrato (EDC, 400 mm) in tampone HEPES da soluzioni di riserva concentrate.
- Aggiungere immediatamente 20 ml di soluzione di lavoro preparata al momento di NHSs / EDC a 1,0 ml di Dio-LCNP in tampone HEPES e mescolare per 5 min.
- Aggiungere 20 ml di soluzione madre di Chol-PEG-NH 2 · HCl a questa miscela e mescolare per 2 ore.
- Centrifugare brevemente la miscela di reazione alla massima velocità (~ 2.000 xg) per 30 secondi usando un mini centrifuga da tavolo e passare il surnatante con una PD-10 dimensione di colonna cromatografia di esclusione 13 equilibrata conPBS Dulbecco (DPBS, 0.1x).
2. Caratterizzazione di Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol
- Confermare il covalente coniugazione di successo di PEG-Chol alla superficie DIO-LCNP mediante elettroforesi su gel.
- Sciogliere 0.5 g di agarosio in 50 ml (1x) di tris-borato elettroforesi (TBE, 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM di acido borico, e 2 mM EDTA) buffer. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio. Lasciare che la soluzione per raffreddare leggermente e versare il contenuto in una piastra di gel nella casella di elettroforesi. Inserire un pettine gel per creare pozzetti dei campioni.
- Una volta che il gel è solidificato, aggiungere la quantità necessaria (basta immergere il gel nella camera) di TBE tampone di corsa alla camera.
- Aggiungere 35 ml di campione DiO-LCNP (modificato con glicerolo, 5% v / v) ai pozzetti del gel e correre per 20 minuti a una tensione di 110 V.
- Immagine il gel utilizzando una connessione Wi sistema di imaging geleccitazione ed emissione filtri th a 488 nm e 500-550 nm, rispettivamente.
- Valutare la dimensione delle particelle e la distribuzione dalla dispersione della luce dinamica (DLS) diluendo la soluzione di Dio-LCNP (diluizione ~ 200 volte) in PBS (pH ~ 8, 0.1x) e misurare su uno strumento DLS 14. Misurare la zeta-potenziale del Dio-LCNPs utilizzando un potenziale strumento di misura zeta adeguato.
3. Preparazione di colture cellulari piatti per gli esperimenti di consegna e imaging
NOTA: etichettatura DIO-LCNP viene eseguita su HEK 293T / 17 cellule renali di embrioni umani (tra i passaggi 5 e 15), che sono coltivate come descritto in precedenza 4. Eseguire gli esperimenti di consegna e l'imaging cellulare successiva come descritto di seguito.
- Preparare 35 mm piastre di coltura tissutale diametro (dotati di inserti No. 1 vetrose 14 mm) mediante rivestimento con fibronectina bovina (~ 100 microlitri ad una concentrazione di 20 ug/ Ml) in DPBS per 2 ore a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento fibronectina dal piatto cultura. Harvest HEK 293 T1 / 7 cellule dal matraccio T-25 di primo lavaggio il monostrato cellulare con 3 ml di DPBS e poi aggiungendo 2 ml di tripsina-EDTA (0,5% tripsina-EDTA 0,25%).
- Incubare la beuta a 37 ° C per ~ 3 min. Rimuovere la tripsina-EDTA e riportare il pallone al incubatore. Una volta che le cellule vengono staccate dal pallone, neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 ml di mezzo completo (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM, modificato per contenere il 10% di siero fetale bovino, 5% sodio piruvato, e 5% di antibiotico / antimicotico) al pallone . Determinare la concentrazione cellulare nella sospensione da essi contando in un contaglobuli.
- Regolare la concentrazione cellulare a ~ 8 x 10 4 cellule / ml con terreno di coltura. Aggiungere 3 ml di sospensione cellulare al piatto e alla cultura in incubatrice durante la notte; Il giorno successivo, le cellule devono essere a ~ 70% di confluenza e dovrebbe essere pronto per l'uso. Adeguatodensità delle cellule è critico per l'etichettatura robusto ed efficiente di una elevata percentuale di cellule.
4. Consegna cellulare della DIO e DIO-LCNPs e imaging di cellule fissate
- Preparare 1 ml di soluzioni della DIO, DIO-LCNP, e Dio-LCNP-PEG-Chol a mezzo di consegna (HEPES-DMEM; DMEM contenente 25 mM HEPES) diluendo soluzioni di riserva della DIO gratuito e DIO-LCNPs; adeguate concentrazioni di DIO per l'incubazione di cellule saranno ~ 1-10 micron (espresso come sia la concentrazione di DiO libero o DiO in forma di Dio-LCNP).
- Rimuovere il terreno di crescita dalle piastre di coltura con una pipetta sierologica e lavare i monostrati cellulari (vedi punto 3) due volte con HEPES-DMEM (2 ml ogni lavaggio). Eseguire i lavaggi aggiungendo delicatamente e rimuovere HEPES-DMEM con una pipetta a / da bordo dei piatti.
- Aggiungere 0,2 ml delle soluzioni preparate la consegna gratuita o DIO-LCNP DIO al centro dei piatti della cultura e restituire i piatti per l'incubator per un congruo periodo di tempo (tipicamente 15 o 30 minuti, a seconda delle esigenze dell'esperimento). Tempi di incubazione più lunghi aggiungono all'etichettatura cellulare più non specifico di aree non membranose (ad esempio, citoplasma).
- Dopo il periodo di incubazione, rimuovere le soluzioni di consegna con una pipetta sierologica. Lavare i monostrati cellulari due volte con DPBS (2 ml ogni lavaggio). Eseguire i lavaggi aggiungendo delicatamente e rimuovere DPBS al / dal bordo del piatto.
- Fissare i monostrati cellulari utilizzando 4% paraformaldeide (preparato in DPBS) per 15 min a temperatura ambiente.
ATTENZIONE: Paraformaldeide è infiammabile, irritante delle vie respiratorie, e un sospetto cancerogeno. - Rimuovere la soluzione paraformaldeide con una pipetta e lavare delicatamente le cellule 1 volta con DPBS (2 ml) con l'aggiunta e la rimozione di DPBS usando pipetta da / per il bordo dei piatti.
- Le cellule fissate sono pronte per essere ripreso per la presenza di un segnale di fluorescenza membranosa usando scansione laser confocalemicroscopia (CLSM). Eseguire imaging immediatamente o, in alternativa, sostituire il mezzo con DPBS contenente 0,05% NaN 3 e memorizzare i piatti a 4 ° C.
ATTENZIONE: NaN 3 è tossico; prestare la massima attenzione quando si usano NaN 3.
NOTA: fisso campioni conservati in questo modo devono essere esposte entro 48 ore per ottenere risultati ottimali.
5. Consegna cellulare della DIO e DIO-LCNPs e FRET imaging in cellule vive
NOTA: In questo metodo, le cellule sono colabeled con 6 micron ogni Dio-LCNP-PEG-Chol (dove DiO è un donatore FRET) e 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine (DII libero, dove DII è un accettore FRET). Il rilascio della DIO da Dio-LCNP-PEG-Chol e la sua integrazione nella membrana plasmatica è confermata da un incremento osservato nel trasferimento di energia dal donatore DiO al accettore DII.
- Cellule Label sequenzialmente con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII free con il metodo descritto al punto 4.
- Dopo la colorazione, lavare le cellule 1 volta con DPBS (2 ml) con una pipetta sierologica e sostituire il tampone di lavaggio con 2 ml di soluzione di imaging cellulare dal vivo (LCI).
- Su un palco microscopio dotato di una camera di incubazione riscaldata, immagine campione cellulare diretta utilizzando un microscopio confocale (obiettivo 60X) con una configurazione di imaging FRET ad intervalli di 30 min per un periodo di 4 ore eccitando donatore DiO a 488 nm e la raccolta di emissione completa spettri del donatore DiO e l'accettore DII dal 490-700 nm con un rivelatore spettrale a 32 canali.
- NOTA: Per ulteriori informazioni sulle immagini FRET, vedere riferimento 15.
- Determinare l'intensità di emissione risolta in tempo del donatore DiO e l'accettore DII da cellule colorate con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII. Calcolare il tempo-risolta accettore / donatore FRET rapporto (DII emi / DIO EMI) per le immagini, che sarà in costante aumento e, infine, piattoau volta la quantità di DiO donatore partizionato nella membrana ha raggiunto un massimo 16.
6. citotossicità Assay della DIO e DIO-LCNPs alle HEK 293T / 17 celle
NOTA: la citotossicità dei materiali Dio-LCNP è valutato attraverso un saggio di proliferazione a base dye tetrazolio 17. Le cellule sono coltivate in una piastra multipozzetto in presenza di concentrazioni variabili di materiali in condizioni che emulano consegna / etichettatura. Le cellule vengono quindi coltivate per 72 ore per permettere la proliferazione. Un colorante (MTS, (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-solfofenil) -2H-tetrazolio) viene poi aggiunto ai pozzetti e metabolicamente attiva cellule convertono il colorante in un prodotto formazano blu. la quantità di formazione di colore è direttamente proporzionale al numero di cellule vitali.
- Harvest HEK 293 T1 / 7 cellule dal pallone T-25 seguendo la procedura descritta nella fase 3.2.SeedHEK 293T / 17 celle (5.000 cellule / 100 pl / pozzetto) ai pozzetti di una piastra a 96 pozzetti tessuto cultura coltura trattata e per 24 ore.
- Rimuovere completamente il terreno di coltura dai pozzi usando una micropipetta e aggiungere 50 ml di HEPES-DMEM contenenti DiO libera, Dio-LCNPs, o Dio-LCNP-PEG-Chol a concentrazioni crescenti di replicare i pozzi. Incubare le cellule a 37 ° C per 30 min.
NOTA: in genere, di repliche fatto in triplice copia o quadruplicato sono sufficienti per produrre dati statisticamente attendibili.- Dopo l'incubazione, rimuovere il terreno consegna contenente i materiali utilizzando una micropipetta e sostituirlo con 100 ml di mezzo di crescita. Coltivare le cellule per 72 ore.
- Aggiungere 20 ml di substrato tetrazolio in ogni pozzetto, riportare la piastra per l'incubatore e consentire la formazione di colore di procedere a 37 ° C per 4 ore. Leggere l'assorbanza (ABS) del prodotto formazano a 570 nm (minimi assorbimento per la DIO-LCNPs utilizzati in questo study) e 650 nm (per sottrazione di fondo non specifica assorbanza) utilizzando un lettore di micropiastre.
- Tracciare il valore della differenza di assorbanza (ass 570 - abs 650) in funzione della concentrazione di materiale e riferire i risultati come percentuale della proliferazione delle cellule di controllo (grado di proliferazione delle cellule in terreno di coltura cellulare solo).
Analisi 7. I dati
- Statisticamente analizzare i dati con un'analisi univariata della varianza (ANOVA). Per confronti multipli, applicare prova hoc posto del Bonferroni. Fornire tutti i valori medi ± errore standard della media (SEM), se non diversamente indicato.
NOTA: La probabilità accettabile per significato era p <0.05.
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Representative Results
LCNPs sono stati preparati in cui il nucleo idrofobico del NP è stato caricato con una sonda membrana etichettatura rappresentante per dimostrare l'utilità del LCNP come veicolo consegna efficiente per carichi idrofobiche. A questo scopo, il carico scelto è stato il potenziometrica colorante membrana etichettatura altamente insolubile in acqua, DiO. LCNPs DiO-caricati (DIO-LCNPs) sono stati sintetizzati utilizzando una tecnica mini-emulsione a due fasi con i componenti chimici DACTP11, AC10COONa e DiO, come mostrato nella Figura 1 18. In questo sistema NP, la rete polimerica legata covalentemente dell'agente reticolante cristallina DACTP11 fornisce un core idrofobico stabile dove la DiO risiede negli spazi interstiziali del reticolo tridimensionale. I gruppi carbossilato sulla superficie NP forniscono la stabilità colloidale alla particella in mezzi acquosi, mentre anche servire come un gruppo funzionale "maniglia" per il fissaggio di ligandi cellulari targeting(E altri biologici). Per legare i DIO-LCNPs alla membrana plasmatica, un PEGylated colesterolo porzione ammina-terminato (PEG-Chol) è stato covalentemente attaccata alla superficie LCNP via di accoppiamento EDC (Figura 1). Dopo la sintesi NP e la conferma della bioconjugation successo, la capacità della DIO-LCNPs per etichettare la membrana plasmatica delle cellule viventi e per trasportare il carico DiO incorporato alla porzione lipofila del doppio strato membrana plasmatica con una migliore specificità e cinetica rispetto alla libera modulo (DIO gratuito) consegnato dalla soluzione di massa è stata valutata.
Come mostrato in Figura 2, DiO libera (6.0 mM) robustamente macchiato membrana plasmatica con alta efficienza (quasi il 100% delle cellule etichettato) dopo 15 min di incubazione con HEK 293T / 17 cellule. Tuttavia, significativo internalizzazione cellulare della DIO libera è stato osservato dopo solo un modesto aumento dellatempo di incubazione 30 min (Figura 2 A e C). L'entità della DIO libera internalizzazione è stata determinata da esperimenti di colocalizzazione risolte nel tempo in cui le cellule sono state prima incubate con 6.0 mM DiO libero (30 min). La libera -aventi tenore medio di incubazione DiO è stato poi rimosso, e le cellule sono state quindi messa in coltura per un massimo di 4 ore. Le membrane plasmatiche delle cellule sono state di contrasto con un fosfolipide tintura marcato a membrana (fosfoetanolamina coniugato con rodamina B, PE-Rhoda). Come mostrato in figura 2 C, dopo 15 min di incubazione, quasi il 100% della DiO libero fu colocalizzava con il marcatore PE-Rhoda (coefficiente colocalizzazione di Pearson; PCC = 0.99 ± 0.01). Tuttavia, dopo 30 min di incubazione ~ 80% di DiO libera rimase legata alla membrana (~ 20% internalizzato). Il grado di DiO libera internalizzazione è aumentato costantemente come esimotempo e di incubazione è stato esteso a tutto il tempo di 4 ore, e questo si è riflesso nella diminuzione concomitante nel PCC tra il DiO e Rhoda-PE (Figura 2 C). Una misura dei dati di una equazione esponenziale decadimento monofase ha rivelato che l'internalizzazione libera DiO raggiunto un massimo di ~ 50% a 1 ora, con un tasso di internalizzazione (k = 0.045 min -1) e l'emivita (15 min) che riflette la captazione cellulare rapida ed efficiente della DIO libero. Questi dati dimostrano la transizione dipendente dal tempo rapido della DIO liberi dalla membrana plasmatica al citosol, dove è rimasta in gran parte esclusi dal nucleo nel periodo di tempo di 4 ore in esame.
Data la captazione cellulare incontrollata della DIO libera, l'obiettivo è diventato per modulare questo comportamento attraverso la consegna di DiO come una formulazione LCNP-PEG-Chol NP. Quando fornito come bioconjugate LCNP-PEG-Chol, una resid membrana più persistentetempo za della DIO rispetto a DiO gratuito è stato osservato (Figura 2 B). Dopo 15 min di incubazione della DIO-LCNP-PEG-Chol con le cellule, quasi il 100% del segnale DiO era situato a livello della membrana plasmatica, dove è stato colocalizzava con il marcatore di membrana PE-Rhoda, un risultato che era paragonabile a quello osservato per DiO gratuitamente. È stato osservato, tuttavia, che mentre la libera etichettatura DiO della membrana era molto uniforme e contigui, il pattern di colorazione della DIO-LCNP-PEG-Chol dopo 15 min di incubazione era più puntata e non altrettanto uniforme in natura (Figura 2 B). Questo risultato indica che le DIO-LCNP-PEG-Chol NP sono stati raccogliendo nelle regioni discrete all'interno della membrana plasmatica. Quando il tempo di incubazione è stata aumentata a 30 min, ~ 94% del segnale DiO rimasto a membrana (rispetto a ~ 80% per DiO libera a questo stesso punto temporale) (Figura 2 B e 2C). Questa tendenza è diventata ancora più evidente come le cellule sono state coltivate con le NP Dio-LCNP-PEG-Chol per tempi sempre più lunghi dopo il 30 min di incubazione iniziale. Ad esempio, dopo la cultura per 1 ora dopo l'incubazione iniziale, quasi l'80% del segnale Dio-LCNP-PEG-Chol NP è rimasto membranosa e colocalized con il pennarello PE-Rhoda (rispetto al ~ 55% per DiO gratuito). In particolare, l'internalizzazione cellulare del Dio-LCNP-PEG-Chol NP ha raggiunto un massimo del 30% in 2 ore (ritenzione della membrana 70%). Ciò corrisponde ad un tasso di captazione cellulare (k = 0,024 min -1; emivita = 29 min) che è esattamente la metà di quella osservata per l'internalizzazione della DiO libera.
Successivamente, la capacità del carico DiO NP-embedded di efflusso in modo efficiente del nucleo LCNP e immessa nell'ambiente lipofilo del doppio strato membrana plasmatica in modo controllato e dipendente dal tempo è stato determinato. Avalutare questo, una strategia basata su FRET è stato ideato in cui il DiO serve come donatore FRET impegnato nel trasferimento di energia per il colorante accettore, DII. Come previsto, dopo l'etichettatura iniziale (t = 0 min), il segnale di emissione è stata dominata da donatore DiO contenuta entro i NP membrana-tethered (Figura 3 B). FRET imaging questo stesso campo 4 ore dopo (t = 240 min), tuttavia, ha rivelato un aumento significativo del segnale di emissione del accettore DII, fornendo una forte evidenza della transizione del donatore DiO dal nucleo LCNP nel doppio strato membrana plasmatica (Figura 3 C). Esame della natura risolta nel tempo di questa transizione ha mostrato una diminuzione costante DiO emissione del donatore accoppiato con un corrispondente aumento delle emissioni accettore DII sulla finestra sperimentale 4 hr (Figura 3 D). In particolare, l'efficienza FRET durante questa transizione ha raggiunto il suo maximum a ~ 180 min etichettatura post-iniziale, suggerendo che l'efflusso e la membrana partizionamento del donatore DiO aveva raggiunto il suo massimo a questo punto di tempo (Figura 3 E). Questi dati forniti forte evidenza del partizionamento time-resolved della DIO dalla NP per il doppio strato membrana plasmatica che ha raggiunto la sua etichettatura post-iniziale massimo ~ 3 ore con il Dio-LCNP-PEG-Chol NP.
Infine, l'analisi comparativa citotossicità è stata effettuata per DiO gratuitamente contro Dio-LCNP-PEG-Chol. Quando incubate con HEK 293T / 17 celle (ad una concentrazione DiO di 6 micron in entrambi i casi), era chiaro che l'incapsulamento della DIO all'interno del nucleo LCNP attenuato la sua citotossicità. Mentre DiO libera suscitato Viabilità cellulari del ~ 50%, cellule incubate con Dio-LCNP-PEG-Chol esposto Viabilità cellulari ~ 90%. (Figura 4). Complessivamente, i dati dell'etichetta cellulare accoppiato con il cellulare toxiDati città dimostrano miglioramenti sia l'efficienza di etichettatura membrana DiO-based e la modulazione della citotossicità di DiO.
Figura 1: Rappresentazione schematica di membrana vincolante Dio-LCNP-PEG-Chol. DiO-LCNP è composto da un cristallo liquido reticolante acrilato (DACTP11); un tensioattivo polimerizzabile carbossi-terminati (AC10COONa); e un colorante lipofile, DIO. Colesterolo-terminato poli (glicole etilenico) (PEG-Chol) è stato coniugato con Dio-LCNP tramite accoppiamento EDC. L'aggiunta di Chol alla superficie Dio-LCNP media legame preferenziale della NP alla membrana plasmatica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Time-risolta assorbimento cellulare della DIO libera in HEK 293 T / 17 cellule. DiO libera (6.0 micron, pannello (A) o Dio-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6.0 micron, pannello (B) è stato incubato su monostrati di cellule per 15 minuti, rimosso, e sostituito con terreno di coltura, le cellule sono state in coltura per i tempi indicati (fino a 4 ore). le cellule sono state poi colorate con PE-Rhoda (2,0 micron) e fissati. i campioni sono stati ripresi per Dio (verde) e di membrana in PE-Rhoda (rosso) utilizzando CLSM. ( C) plot risolta nel tempo della percentuale di segnale di libero o Dio-LCNP-PEG-Chol DiO di membrana in funzione di aumentare il tempo di incubazione. I dati sono stati ottenuti dal coefficiente di co-localizzazione di Pearson (PCC, n = 3 & #177; deviazione standard) del verde (DIO) e canali rosso (PE-Rhoda), e viene espresso in percentuale (± SEM) dopo la normalizzazione al PCC corrispondente a 15 min di incubazione. barra della scala = 20 micron. Ristampato con il permesso di riferimento 18. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Time-risolta FRET conferma l'efflusso di DiO da Dio-LCNP-PEG-Chol alla membrana plasmatica. HEK293T / 17 cellule sono state costained con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII, dove il Dio (verde che emette) e DII (che emettono rosso) coloranti agiscono come il donatore e accettore FRET, rispettivamente. Immagine (A) DIC delle cellule vive costained con Dio-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 micron) e DII (6,0 micron). i sAmpio spazio è stato ripreso per monitorare il cambiamento del segnale FRET per il periodo di 4 ore. (B) e (C) sono le immagini FRET della cella diretta sullo stesso piano focale at = 0 min e t = 240 min, rispettivamente. (D), intensità di emissione tempo risolto normalizzato del donatore DiO e accettore DII da cellule colorate con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII e ripreso in modalità di eccitazione FRET. (E) Tempo risolta rapporto FRET (DII emi / DIO EMI) per cellule marcate con Dio-LCNP-PEG-Chol e DII e ripreso in configurazione FRET. barra della scala = 20 micron. Ristampato con il permesso di riferimento 18. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4
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Discussion
Un obiettivo costante di NMDD è il targeting e l'erogazione controllata di formulazioni di farmaci a cellule e tessuti, in combinazione con contestuale miglioramento della efficacia del farmaco. Una specifica classe di molecole di farmaco per il quale questa ha posto una sfida significativa è idrofobe agenti farmaci / imaging che hanno parsimonia per non solubilità in mezzi acquosi. Questo problema ha afflitto la transizione di potenti farmaci da sistemi di coltura cellulare in vitro per l'impostazione clinica e ha portato ad un numero di molecole di farmaci promettenti essere "accantonato" o abbandonati e non perseguito ulteriormente in ambito clinico. Wortmannina (Wtmn), per esempio, è un potente inibitore della fosfatidilinositolo 3 'chinasi e fosfatidilinositolo 3' chinasi chinasi legate e ha un grande potenziale come agente antitumorale, ma la sua mancanza di solubilità in acqua ha ostacolato la sua progressione negli studi clinici.
Recentemente, Karve et al. ha mostrato una migliore sol acquaubility di Wtmn quando formulato come un assemblaggio NP lipidi-polimero 19. Un ambito che potrebbe grande beneficio da questo tipo di miglioramento, consegna controllata come una formulazione NP è la consegna di farmaci idrofobi e agenti di imaging alla membrana plasmatica. Così, l'obiettivo era quello di affrontare questo ostacolo tecnico e di sviluppare una metodologia per superare questo ostacolo tecnologico.
Nello sviluppo di questa metodologia, un colorante modello di membrana-targeting, DiO, è stata selezionata che è stata storicamente afflitta da scarsa solubilità in mezzi acquosi. Questo conferisce sfide significative nella consegna specifica del colorante alla membrana plasmatica. Tra queste sfide sono la necessità di aggiungere la forma cristallina del colorante direttamente alle cellule o tessuti 10 o per incubare le cellule con concentrazioni molto elevate di DiO dopo diluizione da soluzioni archivi contenenti solventi come DMSO 11, 12.L'approccio qui era duplice: 1) inserire DIO nel nucleo idrofobico di LCNPs durante la sintesi NP e 2) in modo covalente modificare le DIO-LCNPs as-sintetizzati con PEGylated colesterolo coniugato (Dio-LCNP-PEG-Chol) per facilitare l'interazione diretta dei NP Dio-caricati con la membrana plasmatica. In effetti, questo approccio efficace migliorato una serie di aspetti della consegna della DIO alla membrana plasmatica.
In primo luogo, il tempo di permanenza della membrana della DIO è stato effettivamente raddoppiato al momento della consegna come una formulazione LCNP rispetto a quando DiO è stato consegnato privo di soluzione in massa. Questo tempo di permanenza membrana estesa è stato attribuito alla localizzazione del Dio-LCNP-PEG-Chol coniuga ai microdomini raft lipidici della membrana plasmatica, come confermato da esperimenti di co-colorazione. In secondo luogo, la ripartizione del carico DiO nel doppio strato lipidico è stata confermata da esperimenti FRET in cui DIO servito come il donatore ad un accettore DII membrana residente. Infine, lalento, rilascio prolungato del carico DiO nel doppio strato di membrana in modo efficace attenuato la citotossicità della DIO da ~ 40%.
È importante sottolineare diversi punti nel protocollo che sono critici per il successo. Innanzitutto, il carico percentuale della DIO nel nucleo LCNP deve essere empiricamente ottimizzata in sintesi collaudi per ottenere un equilibrio tra la generazione di alta qualità DiO-LCNP-PEG-Chol NP ed il livello desiderato di segnale di fluorescenza in esperimenti di consegna cellulari . Analogamente, la bioconjugation della porzione Chol-PEG-NH2 alla superficie DiO-LCNP deve essere ottimizzato per ottenere il livello desiderato di etichettatura cellulare. Infine, il numero di cellule applicati ai piatti della cultura fibronectina rivestite è un fattore critico per il successo, e la cura deve essere presa per seminare le cellule ad una densità di ~ 8 x 10 4 cellule / ml (~ 2,4 x 10 5 cellule per piatto) . Quando le cellule sono seminate troppo poco, il risultato e 'etichettatura membrana inefficiente, mentre semina il ceLLS risultati troppo densamente per l'acquisizione di immagini poveri che non lo fanno mostrano chiaramente l'etichettatura membranosa.
Una potenziale limitazione del protocollo come descritta è che l'efficienza di incorporazione di vari altri coloranti e farmaci membrana targeting varierà a seconda delle idrofobicità del carico tintura / farmaco. In questi casi, il protocollo di sintesi LCNP dovrà essere testato empiricamente per determinare le condizioni di sintesi ottimali per ideale colorante / farmaco cargo incorporazione.
In sintesi, un metodo è stato sviluppato per l'erogazione controllata LCNP a base di un colorante carico idrofoba alla membrana plasmatica di cellule viventi che supera molti dei problemi tecnici connessi con la consegna cellulare di carichi insolubili in acqua. Il significato generale del metodo è che migliora nettamente la consegna particolare di merce alla membrana plasmatica contemporaneamente attenuando la citotossicità concomitante che è assocIATED con la consegna dei carichi idrofobi ad alte concentrazioni di soluzione in massa. Questo approccio dovrebbe trovare ampia utilità nella fornitura di simile impegnativi idrofobiche carichi agente colorante / di imaging e probabilmente contribuire a facilitare la transizione di un efficace, ma poco solubile in acqua, carichi dal regime sperimentale per l'impostazione clinica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NRL base di finanziamento del programma (unità di lavoro MA041-06-41-4943). ON è supportata da un Postdoctoral Research Associateship Consiglio Nazionale delle Ricerche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
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