Summary
Uma nanopartícula cristal líquido (LCNP) nanocarrier é utilizado como um veículo para a libertação controlada de uma carga hidrofóbico à membrana plasmática de células vivas.
Abstract
A entrega controlada de agentes fármaco / imagiologia de células é crucial para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e para o estudo de processos de sinalização celular. Recentemente, nanopartículas (PN) mostraram promessa significativa no desenvolvimento de tais sistemas de distribuição. Aqui, um NP (LCNP) sistema de libertação com base na cristal líquido tem sido empregue para a libertação controlada de um corante insolúvel em água, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), a partir de dentro do núcleo NP para a região hidrofóbica de um plasma bicamada da membrana. Durante a síntese das NPs, o corante foi eficientemente incorporado no núcleo hidrófobo LCNP, tal como foi confirmado por análises espectroscópicas múltiplas. A conjugação de um derivado de colesterol PEGuilado para a superfície da NP (DIO-LCNP-PEG-Chol) permitiu a ligação das NPs carregadas com corante para a membrana plasmática em células HEK 293T / 17. a laser microscopia confocal e Förster transferência de energia por ressonância resolvida no tempo (FRET) imaging confirmou a passagemive efluxo de DiO a partir do núcleo LCNP e sua inserção na bicamada da membrana do plasma. Finalmente, a entrega de DiO como um LCNP-PEG-Chol atenuou a citotoxicidade de DiO; a forma NP da OID exibiu ~ 30-40% menor toxicidade em comparação com Dio livre entregues a partir de solução em massa. Esta abordagem demonstra a utilidade da plataforma LCNP como uma modalidade eficaz para a entrega específica à membrana e modulação de cargas moleculares hidrofóbicas.
Introduction
Desde o advento da interface (nanomateriais materiais ≤100 nm de, pelo menos, uma dimensão) com as células vivas, um objectivo contínuo tem sido a de tirar partido das propriedades únicas dependente do tamanho das nanopartículas (NPS) para várias aplicações. Estas aplicações incluem células e tecidos rotulagem / imagiologia (tanto in vitro como in vivo), a detecção em tempo real, e a libertação controlada de drogas e de outras cargas 1. Exemplos de tais propriedades relevantes NP incluem a emissão dependente do tamanho dos nanocristais semicondutores (quantum dots, QDs); as propriedades fototérmicos de nanopartículas de ouro; a grande capacidade de carga do núcleo aquoso de lipossomas; e a condutividade balístico de formas alotrópicas de carbono, tais como os nanotubos de carbono de parede única e grafeno.
Mais recentemente, tem surgido um interesse significativo na utilização de NPS para a modulação controlada de drogas e de outras cargas, tais como o contraste / imagiologia umsenhores. Aqui, a lógica é aumentar / otimizar a solubilidade global, dose administrada, o tempo de circulação, e eventual apuramento da carga de drogas por entregá-lo como uma formulação NP significativamente. Isto veio a ser conhecido como a entrega de drogas NP-mediada (NMDD), e existem actualmente sete formulações de drogas NP aprovados pela FDA para uso na clínica para tratar vários tipos de câncer e outras centenas em várias fases de ensaios clínicos. Em essência, o objectivo é o de "conseguir mais com menos;" isto é, para usar o NP como um andaime para fornecer mais fármaco com menos administrações de dosagem, tirando partido da grande área superficial: volume (por exemplo, partículas duras, tais como QDs e óxidos de metal) de PN ou ao seu grande volume interior para o carregamento grandes cargas de carga (por exemplo, lipossomas ou micelas). O objectivo aqui é reduzir a necessidade de múltiplos regimes de dosagem entregues sistemicamente e, ao mesmo tempo que promove a estabilidade aquosa e melhorada a circulação, em particular paracargas de drogas hidrofóbicas desafiantes que, embora altamente eficaz, são pouco solúveis em meios aquosos.
Assim, o objectivo do trabalho aqui descrito foi o de determinar a viabilidade de utilização de um novo NP andaime para a entrega controlada e específica de cargas hidrofóbicas na bicamada de membrana plasmática lipofílico. A motivação para o trabalho foi a solubilidade limitada inerente e dificuldade na entrega de moléculas hidrofóbicas para as células a partir de meios aquosos. Tipicamente, o fornecimento de tais moléculas hidrofóbicas requer o uso de solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) ou agentes tensioactivos anfifílicos (por exemplo, poloxâmeros), que pode ser celular e do tecido viabilidade tóxico e compromisso 2, ou transportadores de micelas, o qual pode ter limitados carga interna capacidades. O transportador escolhido NP aqui era um cristal líquido NP (LCNP) nova formulação desenvolvida anteriormente 3 e que tinha sido mostrado anteriormente para conseguir um ~ 40 vezes maior melhoria na eficácia do fármaco anticancro doxorrubicina em células de cultura 4.
No trabalho aqui descrito, a carga representativo seleccionado foi o corante membrana potenciométrica, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO é um corante insolúvel em água que tem sido utilizado para anterógrada e rastreamento retrógrado em vida e neurônios fixos, membrana medidas de potencial, e por membrana geral rotulagem 5, 6, 7, 8, 9. Devido à sua natureza hidrofóbica, a DIO é tipicamente adicionado directamente a monocamadas de células ou tecidos numa forma cristalina 10, ou que é incubada a concentrações muito altas (~ 1-20 uM) após diluição a partir de uma solução de estoque de concentração 11, 12.
conteúdo "> Aqui, a abordagem foi a utilização para a plataforma LCNP, um NP multifuncional cujo núcleo interior é completamente hidrofóbico e cuja superfície é simultaneamente hidrófilo e passíveis de bioconjugação, como um veículo de entrega para DiO. DiO é incorporado no núcleo LCNP durante a síntese , e a superfície de NP é então funcional izado com uma porção de colesterol PEGuilado para promover a ligação do conjunto DIO-LCNP para a membrana do plasma da membrana. Esta abordagem resultou em um sistema de entrega que particionado DIO na membrana de plasma com uma maior fidelidade e residência membrana tempo do que a forma livre do DiO libertos de solução em massa (DiO livre). Além disso, este método mostrou que o transporte mediado por LCNP de DiO substancialmente modula e dirige a taxa de partição específica do corante na bicamada da membrana do plasma lipofilico. esta é alcançados enquanto reduzindo concomitantemente a citotoxicidade do fármaco livre por ~ 40% por entregá-lo como uma formulação LCNP.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de DIO-LCNP e DIO-LCNP-PEG-Chol
- Dissolve-se diacrilato de líquido cristalino agente de reticulação (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiO, 2 mg), e um iniciador de radical livre (azobisisobutironitrilo, 1 mg) para a polimerização em 2 ml de clorofórmio. Adicionar esta a uma solução aquosa de tensioactivo funcionalizado com acrilato (AC10COONa, 13 mg em 7 ml).
- Agita-se a mistura durante 1 hora e sonicado a 80% de amplitude, durante 5 min para produzir uma miniemulsão constituído por pequenas gotículas do material orgânico polimerizável rodeado por agente tensioactivo em água.
- Aquecer a mistura a 64 ° C num banho de óleo para iniciar a polimerização de ambos o agente de reticulação e surfactante como o clorofórmio se evaporar lentamente, deixando uma suspensão contendo NP-DiO que é estabilizado pelo tensioactivo.
- Filtra-se a suspensão NP (3 vezes) através de um filtro de seringa 0,2 fim para remover qualquer agregação. Store a solução NP filtrado a 4 ° C até uso posterior.
- Conjugação de PEG-Chol para Dio-LCNP através de acoplamento EDC.
- Dissolve-Chol-PEG-NH2-HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) em tampão HEPES 25 mM (pH 7,0).
- Preparar uma solução de trabalho contendo sal N- -hidroxi-sulfossuccinimida de sódio (NHSs, 40 mM) e 1-etil-3- (3- (dimetilamino) -propil) carbodiimida (EDC, 400 mM) em tampão HEPES a partir de soluções stock concentradas.
- Imediatamente adicionar 20 ul da solução de trabalho preparada de fresco de NHSs / EDC, para 1,0 ml de DIO-LCNP em tampão HEPES e agita-se durante 5 min.
- Adicionar 20 ul de solução de estoque de Chol-PEG-NH2-HCl a esta mistura e agita-se durante 2 h.
- Resumidamente, centrifugar a mistura de reacção à velocidade máxima (~ 2000 x g) durante 30 segundos usando um tampo de mesa e mini-centrifugador passar o sobrenadante através de um PD-10 coluna de cromatografia de exclusão de tamanho 13 equilibrada comsolução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS, 0,1X).
2. Caracterização do DIO-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol
- Confirmar o sucesso a conjugação covalente de PEG-Chol à superfície do DIO-LCNP por electroforese em gel.
- Dissolve-se 0,5 g de agarose em 50 ml (1x) de electroforese Tris-borato (TBE; Tris 89 mM (pH 7,6), ácido bórico 89 mM e EDTA 2 mM) tampão. Aquece-se a solução num forno de microondas para dissolver a agarose. Deixe a solução esfriar um pouco e despeje o conteúdo em uma placa de gel na caixa de eletroforese. Insira um pente de gel para criar poços de amostra.
- Uma vez que o gel tem solidificado, adicione a quantidade necessária (suficiente para submergir o gel na câmara) de TBE tampão de corrida para a câmara.
- Adicionar 35 ul de amostra DIO-LCNP (alterado com glicerol, 5% v / v) para os poços do gel e correr durante 20 min a uma voltagem de 110 V.
- Imagem do gel usando um sistema de imagem wi gelfiltros de excitação e emissão de th a 488 nm e 500-550 nm, respectivamente.
- Avaliar o tamanho de partículas e distribuição por dispersão de luz dinâmica (DLS), diluindo a solução DIO-LCNP (diluição ~ 200 vezes) em PBS (pH ~ 8, 0,1x) e medição de um instrumento de DLS 14. Medir o potencial zeta do DIO-LCNPs utilizando um instrumento de medição de potencial zeta apropriado.
3. Preparação de Cultura Celular Loiça para Experimentos de entrega e de imagem
NOTA: rotulagem DIO-LCNP é realizada em células HEK 293T / 17 células de rim embrionário humano (entre as passagens 5 e 15) que são cultivadas tal como descrito anteriormente 4. Execute as experiências de entrega ea imagens de células subsequente conforme descrito abaixo.
- Preparar 35 mm pratos de cultura de tecido de diâmetro (14 mm equipado com inserções lamela No. 1) por revestimento com fibronectina bovina (~ 100 ul a uma concentração de 20 ug/ Ml) em DPBS durante 2 h a 37 ° C.
- Remover a solução de revestimento de fibronectina a partir da placa de cultura. Colheita HEK 293 T1 / 7 células do frasco T-25 por primeira lavagem da monocamada de células com 3 ml de DPBS e depois pela adição de 2 ml de tripsina-EDTA (0,5% de tripsina-EDTA a 0,25%).
- Incubar o balão a 37 ° C durante ~ 3 min. Remover a tripsina-EDTA e devolver o balão para a incubadora. Uma vez que as células são separadas do balão, neutralizar a tripsina por adição de 4 ml de meio completo (Dulbecco Modified Eagle Médium; DMEM; alterado de modo a conter 10% de soro fetal bovino, 5% de piruvato de sódio, e 5% de antibiótico / antimicótico) ao balão . Determinar a concentração de células na suspensão fazendo a contagem num contador de células.
- Ajustar a concentração de células a 8 x 10 ~ 4 células / ml com meio de crescimento. Adicionar 3 mL da suspensão de células para o prato e a cultura na incubadora durante a noite; no dia seguinte, as células devem estar a ~ 70% de confluência e deve estar pronto para uso. Adequadodensidade celular é crítica para a rotulagem robusto e eficiente de uma percentagem elevada de células.
4. Entrega Cellular da OID e Dio-LCNPs e imagem das células fixas
- Prepare 1 ml de soluções de Dio Dio-LCNP e Dio-LCNP-PEG-Chol em meio de entrega (HEPES-DMEM; DMEM contendo HEPES 25 mM) por diluição de soluções de reserva da OID gratuito e Dio-LCNPs; Dio concentrações adequadas para a incubação sobre as células serão ~ 1-10 uM (expresso como a concentração de DiO livre ou DiO sob a forma de DIO-LCNP).
- Remover o meio de crescimento a partir das placas de cultura, utilizando uma pipeta serológica e lava-se as monocamadas de células (ver etapa 3), duas vezes com HEPES-DMEM (2 ml cada lavagem). Realizar as lavagens por adição e remoção de HEPES-DMEM, usando uma pipeta para / a partir do bordo dos pratos suavemente.
- Adicionar 0,2 ml das soluções de entrega livre ou DIO-LCNP preparados Dio para o centro das placas de cultura e devolver os pratos à incubator por um período de tempo adequado (tipicamente 15 ou 30 minutos, dependendo das necessidades da experiência). Períodos de incubação mais longos adicionar à rotulagem celular mais não específica de áreas não-membranoso (por exemplo, citosol).
- Após o período de incubação, remove as soluções de transferência, usando uma pipeta serológica. Lavam-se as monocamadas de células duas vezes com DPBS (2 ml cada lavagem). Realizar as lavagens, adicionando suavemente e removendo DPBS para / a partir da borda do prato.
- Fixar as monocamadas celulares utilizando 4% de paraformaldeído (preparado em DPBS) durante 15 min à temperatura ambiente.
CUIDADO: O paraformaldeído é inflamável, um irritante respiratório, e um cancerígeno. - Remover a solução de paraformaldeído, utilizando uma pipeta e lavar cuidadosamente as células uma vez com DPBS (2 ml) por adição e remoção de DPBS utilizando pipeta para / a partir do bordo dos pratos.
- As células fixadas são pronto a ser trabalhada para a presença de um sinal de fluorescência utilizando membranosa confocal de varrimento lasermicroscopia (CLSM). Realizar a imagiologia imediatamente, ou, alternativamente, substituir o meio com DPBS contendo 0,05% de NaN 3 e armazenar os pratos a 4 ° C.
CUIDADO: NaN 3 é tóxico; exercer extrema cautela quando se utiliza NaN 3.
NOTA: Fixo amostras armazenadas deste modo deverão ser trabalhada dentro de 48 horas para os melhores resultados.
5. Entrega Cellular da OID e Dio-LCNPs e FRET imagem latente em células vivas
NOTA: Neste método, as células são colabeled com 6 uM cada DIO-LCNP-PEG-Chol (onde DiO é um dador FRET) e 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-perclorato tetramethylindocarbocyanine (DII livre, onde DII é um aceitador FRET). O lançamento do DIO junto da DIO-LCNP-PEG-Chol e sua incorporação na membrana plasmática é confirmada por um aumento observado na transferência de energia do doador DiO ao aceitante DII.
- Células de etiquetas sequencialmente com Dio-LCNP-PEG-Chol e DII freE Utilizando o método descrito no passo 4.
- Após a coloração, lavar as células uma vez com DPBS (2 ml) usando uma pipeta serológica e substituir o tampão de lavagem com 2 ml de solução de imagem de células vivas (LCI).
- Em um estágio do microscópio equipado com uma câmara de incubação aquecida, imagem da amostra de células vivas usando um microscópio confocal (objetiva 60X) com uma configuração de imagens FRET em intervalos de 30 min durante um período de 4 horas por emocionante o doador DiO a 488 nm e recolhendo a emissão completa os espectros de ambos o dador e o aceitador DiO DII 490-700 nm com um detector espectral 32 canais.
- NOTA: Para mais informações sobre imagens FRET, por favor ver referência 15.
- Determinar a intensidade de emissão resolvida no tempo do dador e do aceitador DiO DII a partir de células coradas com o DIO-LCNP-PEG-Chol e DII. Calcule o tempo resolvido doador / receptor FRET relação (DII emi / DiO emi) para as imagens, o que irá aumentar de forma constante e, eventualmente, placaau uma vez que a quantidade de doador DiO particionado na membrana atingiu um máximo de 16.
6. Ensaio de Citotoxicidade de DiO e DIO-LCNPs para os HEK 293T / 17 células
NOTA: A citotoxicidade dos materiais DIO-LCNP é avaliada utilizando um ensaio de proliferação com base-corante de tetrazólio 17. As células são cultivadas numa placa de poços múltiplos na presença de várias concentrações dos materiais, sob condições que simulam a entrega / rotulagem. As células são então cultivadas durante 72 horas para permitir a proliferação. Um corante (MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) é então adicionada aos poços, e metabolicamente ativo células converter o corante num produto de formazano azul. a quantidade de formação de cor é directamente proporcional ao número de células viáveis.
- Colheita HEK 293 T1 / 7 células do frasco T-25, seguindo o procedimento descrito no passo 3.2.SeedHEK 293T 17 / células (5000 células / 100 ^ l / poço) para os poços de uma placa de 96 poços de cultura de tecidos tratados com cultura e durante 24 h.
- Remover completamente os meios de cultura dos poços utilizando uma micropipeta e adicionar 50 ul de HEPES-DMEM contendo DiO livre, Dio-LCNPs ou DIO-LCNP-PEG-Chol em concentrações crescentes para replicar poços. Incubar as células em a 37 ° C durante 30 min.
NOTA: Normalmente, replica feito em triplicado ou quadruplicado são suficientes para produzir dados estatisticamente fiáveis.- Após a incubação, remover o meio de entrega que contém os materiais utilizando uma micropipeta e substituí-la com 100 ul de meio de crescimento. Cultura das células durante 72 horas.
- Adicionar 20 uL de substrato a cada poço de tetrazólio, o retorno da placa para a incubadora, e permitir a formação de cor para prosseguir a 37 ° C durante 4 h. Leia a absorvância (Abs) do produto formazano a 570 nm (absorção mínimos para os DIO-LCNPs utilizados neste Study) e 650 nm (para subtracção do fundo não específico absorvância) utilizando um leitor de placas de microtitulação.
- A partir do valor de absorvância diferencial (abs 570 - Abs 650) versus a concentração de material e de comunicar os resultados como percentagem de controlo da proliferação celular (grau de proliferação de células apenas em meio de cultura celular).
Análise 7. Os dados
- Analisar estatisticamente os dados com uma análise de variância univariada (ANOVA). Para comparações múltiplas, aplicar o teste post hoc de Bonferroni. Fornecer todos os valores médios ± erro padrão da média (SEM), a menos que mencionado de outro modo.
NOTA: A probabilidade aceitável para significância foi p <0,05.
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Representative Results
LCNPs foram preparados na qual o núcleo hidrófobo da NP foi carregado com uma sonda de marcação da membrana-representativo para demonstrar a utilidade do LCNP como um veículo de entrega eficiente para cargas hidrofóbicas. Para este efeito, a carga foi escolhido o corante-marcação da membrana potenciométrica altamente insolúvel em água, DiO. LCNPs DIO-carregados (DIO-LCNPs) foram sintetizados usando uma técnica mini-emulsão de duas fases, com os componentes químicos DACTP11, AC10COONa, e DiO, como mostrado na Figura 1 18. Neste sistema NP, a rede polimérica ligado de forma covalente do agente de ligação cruzada DACTP11 cristalino fornece um núcleo hidrofóbico estável onde o DiO reside dentro dos espaços intersticiais da rede de ligações cruzadas. Os grupos carboxilato na superfície da NP proporcionar estabilidade coloidal para as partículas em meio aquoso ao mesmo tempo que serve como um grupo funcional "pega" para a ligação de ligandos de direccionamento celular(E outros Biologicals). Para amarrar as DIO-LCNPs para a membrana plasmática, uma porção PEGuilado colesterol terminado em amina (PEG-Chol) foi covalentemente ligado à superfície do LCNP através de acoplamento EDC (Figura 1). Após a síntese de NP e a confirmação da bioconjugação bem sucedida, a capacidade dos DIO-LCNPs para rotular a membrana plasmática de células vivas e para entregar a carga DiO incorporado para a porção lipofílica da bicamada de membrana de plasma com uma melhor especificidade e cinética em comparação com a livre forma DIO (livre) entregues a partir de solução em massa foi avaliada.
Como mostrado na Figura 2 A, DiO livre (6,0 uM) robustamente manchado da membrana de plasma com alta eficiência (praticamente 100% de células marcadas) após 15 min de incubação com células HEK 293T / 17. No entanto, foi observada internalização celular significativa da OID gratuitamente, mediante apenas um aumento modesto notempo de incubação de 30 minutos (Figura 2 A e C). O grau de internalização DiO livre foi determinada por experiências de co-localização resolvidas no tempo em que as células foram incubadas em primeiro lugar com 6,0 uM DiO livre (30 min). O meio de incubação molecular contendo DiO livre foi, em seguida, removido, e as células foram subsequentemente cultivadas durante até 4 horas. As membranas de plasma das células foram contrastadas com um fosfolípido marcado com corante de membrana (fosfoetanolamina conjugado com rodamina B; PE-Rode). Como mostrado na Figura 2 C, após 15 min de incubação, quase 100% da OID livre foi co-localizada com o marcador de PE-Rode (coeficiente de co-localização de Pearson; PCC = 0,99 ± 0,01). No entanto, após 30 min de incubação ~ 80% de DiO livre permaneceu ligada à membrana (~ 20% internalizado). O grau de DiO internalização livre aumentou de forma constante como thtempo e incubação foi estendida para contanto que 4 horas, e isso se refletiu na diminuição concomitante do PCC entre Dio e Rhoda-PE (Figura 2 C). Um ajuste dos dados a uma equação de decaimento exponencial de uma fase revelou que a internalização DiO livre atingiu um máximo de cerca de 50% em 1 hora, com uma taxa de internalização (k = 0,045 min -1) e meia-vida (15 min) que refletiu a captação celular rápida e eficiente da OID livre. Estes dados demonstram a transição dependente do tempo rápido de DiO livre a partir da membrana plasmática para o citosol, onde permaneceu em grande parte excluída do núcleo durante o período de tempo de 4 horas examinados.
Dada a captação celular descontrolada da OID livre, o objetivo tornou-se para modular este comportamento através da entrega da OID como uma formulação LCNP-PEG-Chol NP. Quando entregue como um bioconjugado LCNP-PEG-Chol, uma membrana resid mais persistentetempo cia da DIO comparado com Dio livre foi observado (Figura 2 B). Após 15 minutos de incubação do DIO-LCNP-PEG-Chol com as células, cerca de 100% do sinal DiO foi localizado na membrana de plasma, onde foi co-localizada com o marcador de membrana PE-Rode, um resultado que é comparável ao que a observada para DiO livre. Notou-se, no entanto, que enquanto o DiO rotulagem livre da membrana era muito uniforme e contíguo, o padrão de coloração do DIO-LCNP-PEG-Chol após 15 min de incubação foi mais punctata e não tão uniforme na natureza (Figura 2 B). Este resultado indicou que o DIO-LCNP-PEG-Chol foram NPs de recolha em regiões discretas no interior da membrana plasmática. Quando o tempo de incubação foi aumentado para 30 minutos, ~ 94% do sinal DiO manteve-se a membrana (em comparação com 80% para ~ DiO livre neste mesmo ponto de tempo) (Figura 2 B e 2C). Esta tendência tornou-se ainda mais pronunciada à medida que as células foram cultivadas com os PN DIO-LCNP-PEG-Chol para tempos cada vez mais longos após a inicial de 30 minutos de incubação. Por exemplo, depois da cultura durante 1 h após a incubação inicial, cerca de 80% do sinal de DIO-LCNP-PEG-Chol NP permaneceu membranoso e co-localizada com o marcador de PE-Rode (em comparação com 55% para ~ DiO livre). Notavelmente, a internalização celular do DIO-LCNP-PEG-Chol NPs atingiu um máximo de 30% em 2 horas (70% de retenção da membrana). Isto corresponde a uma taxa de absorção celular (k = 0,024 min @ 1; meia-vida = 29 min) que é exactamente a metade da observada para a internalização de DiO livre.
A seguir, a capacidade da carga DiO NP-ef luxar incorporado eficientemente para fora do núcleo LCNP e entrar no ambiente lipofílica da bicamada de membrana plasmática de uma forma controlada e dependente do tempo foi determinado. Paraavaliar isto, uma estratégia baseada em FRET foi concebido em que o DiO serve como um dador FRET envolvidos em transferência de energia para o corante aceitador, DII. Como esperado, sob a rotulagem inicial (t = 0 min), o sinal de emissão foram dominados pelo doador DiO contido dentro das NPs de membrana-tethered (Figura 3 B). FRET de imagem dessa mesma campo 4 h mais tarde (t = 240 min), no entanto, revelou um aumento significativo no sinal de emissão do aceitador de DII, proporcionando uma forte evidência da transição do dador DiO a partir do núcleo LCNP na bicamada da membrana do plasma (Figura 3 C). O exame da natureza resolvida no tempo desta transição mostrou uma diminuição constante no doador de emissão DiO acoplado com um aumento correspondente na emissão de aceitador de DII sobre a janela experimental a 4 horas (Figura 3 D). Notavelmente, a eficiência de FRET durante esta transição atingiu o seu maximum a 180 minutos pós-etiquetagem inicial ~, sugerindo que o efluxo e a membrana de particionamento do dador DiO tinha atingido o seu máximo nesta altura (Figura 3E). Estes dados fornecidos forte evidência da particionamento resolvida no tempo da DIO do NP para a bicamada da membrana plasmática que atingiu o seu máximo ~ 3 horas pós-inicial rotulagem com as DIO-LCNP-PEG-Chol NPS.
Finalmente, a análise de citotoxicidade comparativa foi realizada para DiO livre versus o DIO-LCNP-PEG-Chol. Quando incubada com células HEK 293T / 17 (a uma concentração de 6 DiO? M em ambos os casos), ficou claro que o encapsulamento da DIO dentro do núcleo LCNP atenuado a sua citotoxicidade. Enquanto DiO livre eliciada viabilidades celulares de ~ 50%, as células incubadas com o DIO-LCNP-PEG-Chol viabilidades celulares exibiu ~ 90%. (Figura 4). Cumulativamente, os dados de rotulagem de células juntamente com a toxi celularcidade de dados demonstram melhorias tanto na eficiência de marcação da membrana à base de DiO e a modulação da citotoxicidade de DiO.
Figura 1: Representação esquemática de ligação membrana DIO-LCNP-PEG-Chol. DiO-LCNP é composto de um cristal líquido agente acrilato de reticulação (DACTP11); um agente tensioactivo polimerizãvel terminados em carboxilo (AC10COONa); e um corante lipofico, DiO. -Colesterol terminado poli (etileno glicol) (PEG-Chol) foi conjugado com o DIO-LCNP através de acoplamento EDC. A adição de Chol à superfície do DIO-LCNP medeia a ligação preferencial do NP para a membrana plasmática. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: captação celular resolvida no tempo da OID livre em HEK 293 células T / 17. DiO livre (6,0 um, painel (a) ou o DIO-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 uM, o painel (B) foi incubada em monocamadas de células durante 15 minutos, removido, e substituído com meio de crescimento, as células eram cultivadas durante os tempos indicados (até 4 horas). as células foram subsequentemente coradas com PE-Rode (2,0 uM) e fixa. as amostras foram fotografadas para DiO (verde) e de membrana-bound PE-Rode (vermelho) usando CLSM. ( C) trama resolvida no tempo da percentagem de sinal livre ou DIO-LCNP-PEG-Chol DiO ligada a membrana, como uma função de aumento do tempo de incubação. os dados foram obtidos a partir de coeficiente de co-localização de Pearson (PCC, n = 3 & #177; desvio padrão) do verde (DIO) e fontes de luz vermelha (PE-Rhoda), e é expressa como uma percentagem (± SEM) após a normalização para o PCC correspondente a 15 minutos de incubação. Barra de escala = 20 mm. Reproduzido com permissão de referência 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Tempo-resolvido FRET confirma o efluxo de DiO de DIO-LCNP-PEG-Chol para a membrana plasmática. células HEK293T / 17 foram costained com Dio-LCNP-PEG-Chol e DII, onde DIO (verde emissor de luz) e DII (emissores de vermelho) corantes agir como dador FRET e receptor, respectivamente. De imagem (A) DIC das células vivas costained com DIO-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 uM) e DII (6,0 uM). os samplo foi representada por imagem para monitorizar a alteração no sinal de FRET ao longo do período de 4 h. (B) e (C) são as imagens FRET da célula viva no mesmo plano focal no instante t = 0 min e t = 240 min, respectivamente. (D) normalizado, a intensidade de emissão resolvida no tempo do dador e aceitador de DII DiO a partir de células coradas com o DIO-LCNP-PEG-Chol e DII e fotografada no modo de excitação de FRET. Rácio de FRET (E)-Time resolvido (DII emi / DiO emi) para as células marcadas com Dio-LCNP-PEG-Chol e DII e fotografada na configuração FRET. Barra de escala = 20 mm. Reproduzido com permissão de referência 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4
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Discussion
Um objectivo permanente de NMDD é a segmentação controlada e entrega de formulações de droga para as células e tecidos, combinada com a eficácia da droga melhorada simultânea. Uma classe específica de moléculas de fármaco para o qual este tem sido um desafio significativo é agentes de drogas / imagiologia hidrófobos que têm moderação para nenhuma solubilidade em meios aquosos. Este problema tem atormentado a transição dos fármacos potentes em sistemas de cultura celular in vitro para o ambiente clínico e resultou num número de moléculas de fármacos promissores sendo "arquivado" ou abandonada e não prosseguida no contexto clínico. A wortmanina (Wtmn), por exemplo, é um potente inibidor de fosfatidilinositol 3-cinases e fosfatidilinositol '3' cinases relacionadas com a cinase e tem um grande potencial como agente anti-cancro, mas a sua falta de solubilidade em água tem impedido a sua progressão em ensaios clínicos.
Recentemente, Karve et ai. mostrou melhorou sol águaubility de Wtmn quando formulados na forma de uma montagem de NP lípido-polímero 19. Uma arena que poderiam beneficiar grandemente melhorada deste tipo de entrega, controlada tal como uma formulação de NP é a administração de fármacos hidrofóbicos e agentes de imagiologia para a membrana plasmática. Assim, o objetivo aqui era abordar este obstáculo técnico e desenvolver uma metodologia para superar este obstáculo tecnológico.
Ao elaborar esta metodologia, um corante modelo de membrana de metas, DIO foi selecionado que tem sido historicamente atormentado por baixa solubilidade em meio aquoso. Isto confere desafios significativos na entrega específica do corante para a membrana plasmática. Entre estes desafios são a necessidade de adicionar a forma cristalina do corante directamente para as células ou tecidos a incubar 10 ou células com concentrações muito elevadas de DiO após diluição a partir de soluções de reserva contendo solventes, tais como DMSO 11, 12.A abordagem aqui foi duplo: 1) incorporar The Dio no núcleo hidrofóbico de LCNPs durante a síntese de NP e 2) covalentemente modificar as DIO-LCNPs como sintetizados com um colesterol conjugado PEGylated (DIO-LCNP-PEG-Chol) para facilitar a interação direta dos NPs DIO-carregado com a membrana plasmática. De facto, esta abordagem melhorada eficazmente um número de aspectos da entrega de DiO para a membrana plasmática.
Em primeiro lugar, o tempo de permanência da membrana da OID foi efetivamente dobrou quando entregue como uma formulação LCNP em comparação com quando DiO foi entregue livre de solução a granel. Este tempo de residência prolongado membrana foi atribuída à localização do DIO-LCNP-PEG-Chol conjuga para microdomínios jangada lipídica da membrana plasmática, tal como confirmado por experiências de co-coloração. Em segundo lugar, a partição da carga DiO na bicamada lipídica foi confirmada por experiências de FRET, em que o DiO serviram de dador para um aceitador de DII membrana residente. Finalmente, ouma libertação lenta, sustentada da carga DiO na bicamada da membrana eficazmente atenuou a citotoxicidade da DIO por ~ 40%.
É importante destacar vários pontos do protocolo que são críticos para o sucesso. Em primeiro lugar, o carregamento por cento da DIO no núcleo LCNP deve ser empiricamente optimizados na síntese de ensaio é executado para obter um balanço entre a geração de alta qualidade DIO-LCNP-PEG-Chol PN e o desejado nível de sinal de fluorescência em experiências de administração celular . Da mesma forma, a bioconjugação da porção Chol-PEG-NH2 à superfície do DIO-LCNP deve ser optimizado para obter o nível desejado de rotulagem celular. Finalmente, o número de células aplicadas às placas de cultura revestidas com fibronectina é crítica para o sucesso, e deve ser tomado cuidado para semear as células a uma densidade de ~ 8 x 10 4 culas / ml (~ 2,4 x 10 5 células por prato) . Quando as células são semeadas muito baixa densidade, que resulta na marcação da membrana ineficiente, enquanto semeando o ceLLS muito densamente resulta na aquisição de imagens pobres que não o fazem mostram claramente rotulagem membranoso.
Uma limitação potencial do protocolo como descrito é que a eficiência da incorporação de vários outros corantes de direccionamento de membrana e drogas irão variar dependendo da hidrofobicidade da carga de corante / fármaco. Nestes casos, o protocolo de síntese LCNP terá que ser testada empiricamente para determinar as condições óptimas para a síntese de incorporação ideal de carga de corante / fármaco.
Em resumo, um método tem sido desenvolvido para a libertação controlada baseia-LCNP de uma carga de corante hidrofóbica para a membrana plasmática de células vivas que ultrapassa muitos dos desafios técnicos associados com a administração celular de cargas insolúveis em água. O significado geral do método é que ele melhora claramente a entrega de carga específica para a membrana plasmática, enquanto, simultaneamente, atenuando a citotoxicidade concomitante que é Associated com a entrega de cargas hidrofóbicas em altas concentrações de solução a granel. Esta abordagem deve encontrar utilidade ampla na entrega de semelhante desafiadoras cargas de agente corante / imagem hidrofóbicos e provavelmente vai ajudar a facilitar a transição de eficaz, mas pouco solúvel em água, cargas do regime experimental no ambiente clínico.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Financiamento Base de NRL (Trabalho Unidade MA041-06-41-4943). ON é apoiado por uma Pós-Investigação Associateship National Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
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