Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Målrettet plasmamembran Levering af en hydrofob Cargo indkapslet i en Liquid Crystal Nanopartikel Carrier

Published: February 8, 2017 doi: 10.3791/55181
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1, 1
1Center for Biomolecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2Optical Sciences Division, Naval Research Laboratory, 3Sotera Defense Solutions

Summary

En flydende krystal nanopartikler (LCNP) Nanobærer udnyttes som et køretøj til kontrolleret afgivelse af en hydrofob last til plasmamembranen af ​​levende celler.

Abstract

Den kontrollerede afgivelse af lægemiddel / billeddannende midler til celler er kritisk for udviklingen af ​​terapeutiske midler og til undersøgelse af cellulære signalprocesser. For nylig er nanopartikler (NPS) vist signifikant løfte i udviklingen af ​​sådanne administrationssystemer. Her, har et flydende krystal NP (LCNP) -baseret afgivelsessystem blevet anvendt til kontrolleret afgivelse af et vanduopløseligt farvestof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat (DIO), inde fra NP kernen til det hydrofobe område af et plasma membrandobbeltlag. Under syntesen af ​​NPS, blev farvestoffet effektivt inkorporeres i den hydrofobe LCNP kerne, hvilket bekræftes af flere spektroskopiske analyser. Konjugation af en PEGyleret kolesterolderivatet til NP overflade (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktiveret bindingen af ​​farvestoffet-loaded NP'er til plasmamembranen i HEK 293T / 17 celler. Tidsopløst laserscanning konfokal mikroskopi og Forster-resonansenergioverførsel (FRET) billeddannelse bekræftede passive efflux af DIO fra LCNP kerne og dets insertion i plasmamembranen dobbeltlaget. Endelig levering af DIO som LCNP-PEG-Chol svækket cytotoksicitet af DIO; NP formen af DIO udviste ~ 30-40% mindre toksicitet sammenlignet med DiO fri leveret fra bulkopløsning. Denne fremgangsmåde viser anvendeligheden af ​​LCNP platform som en effektiv modalitet for membranen-specifikke levering og modulering af hydrofobe molekylære ladninger.

Introduction

Siden indførelsen af ​​interfacing nanomaterialer (materialer ≤100 nm i mindst én dimension) med levende celler, har en fortsat mål været at drage fordel af de unikke størrelse-afhængige egenskaber af nanopartikler (NPS) til forskellige applikationer. Disse anvendelser omfatter celler og væv mærkning / imaging (både in vitro og in vivo), real-time sensorteknik og kontrolleret levering af medikamenter og andre laster 1. Eksempler på sådanne relevante NP egenskaber omfatter størrelsen-afhængige udledning af halvledernanokrystaller (quantum dots, QDs); de fototermisk egenskaber af guld nanopartikler; den store lastkapacitet af den vandige kerne af liposomer; og den ballistiske ledningsevne af kulstof allotropes, såsom single-væg kulstof nanorør og graphene.

For nylig er betydelig interesse opstået i anvendelsen af ​​NP'er til reguleret modulering af medikamenter og andre ladninger, såsom kontrast / imaging aherretoilettet. Her rationalet er markant at forbedre / optimere den samlede opløselighed, udsendte dosis samt cirkulation tid, og eventuel clearance af lægemidlet last ved at levere det som et NP-formulering. Det er kommet til at blive kendt som NP-medieret drug delivery (NMDD), og der er i øjeblikket syv FDA-godkendte NP narkotika formuleringer til brug i klinikken til behandling af forskellige kræftformer og hundredvis flere i forskellige stadier af kliniske forsøg. I det væsentlige, målet er at "opnå mere med mindre" det vil sige at bruge NP som et stillads til at levere mere lægemiddel med færre dosering administrationer ved at udnytte det store overfladeareal: volumen (fx hårde partikler, såsom QDs og metaloxider) NPS eller deres store indre volumen til lastning store cargo nyttelast (f.eks liposomer eller miceller). Formålet her er at reducere behovet for flere systemisk leveret doseringsregimer, mens på samme tid at fremme vandig stabilitet og øget omsætning, især forudfordrende hydrofobt lægemiddel ladninger, at selv meget effektiv, er tungtopløselige i vandige medier.

Derfor er målet af arbejdet beskrevet heri var at bestemme levedygtigheden af ​​anvendelse af en hidtil ukendt NP stillads for det specifikke og styret afgivelse af hydrofobe ladninger til den lipofile plasmamembran dobbeltlaget. Motivationen for arbejdet var den iboende begrænset opløselighed og vanskeligheder i leveringen af ​​hydrofobe molekyler til celler fra vandige medier. Typisk levering af sådanne hydrofobe molekyler kræver anvendelse af organiske opløsningsmidler (f.eks DMSO) eller amfifile overfladeaktive midler (f.eks poloxamerer), som kan være giftige og kompromis celler og væv levedygtighed 2, eller micelle-bærere, som kan have begrænset intern loading kapaciteter. NP bærer valgt her var en hidtil ukendt flydende krystal NP (LCNP) formulering tidligere udviklet 3 og at der var blevet vist tidligere for at opnå en ~ 40-fold forbedring af effektiviteten af anticancer drug doxorubicin i dyrkede celler 4.

I arbejdet beskrevet heri, den repræsentative last valgte var den potentiometrisk membran farvestof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat (DIO). DiO er et vanduopløseligt farvestof, der er blevet anvendt til anterograd og retrograd sporing i levende og fikserede neuroner, membranpotentialet målinger, og til generel membran mærkning 5, 6, 7, 8, 9. På grund af dets hydrofobe natur er DiO typisk tilsættes direkte til cellemonolag eller væv i en krystallinsk form 10, eller det inkuberes ved meget høje koncentrationer (~ 1-20 uM) efter fortynding fra en koncentration stamopløsning 11, 12.

indhold "> Her fremgangsmåde var brug for LCNP platform, er en multifunktionel NP hvis indre kerne er helt hydrofob og hvis overflade er samtidig hydrofil og modtagelig for bioconjugation, som et køretøj levering til DiO. DiO inkorporeret i LCNP kerne under syntesen og NP overflade derpå funktionaliseret med en PEGyleret cholesterol-del for at fremme membranbinding af DIO-LCNP ensemble til plasmamembranen. Denne fremgangsmåde resulterede i et afgivelsessystem, der fordeltes DIO ind plasmamembranen med større nøjagtighed og membran opholdssted tid end den frie form af DIO leveres fra bulkopløsning (DIO fri). Endvidere viste denne fremgangsmåde, at LCNP-medieret levering af DIO væsentlige modulerer og driver hastigheden for specifik opdeling af farvestoffet i den lipofile plasmamembran dobbeltlaget. det er opnås, mens samtidig reducere cytotoksiciteten af ​​det frie lægemiddel ved ~ 40% ved at levere den som en LCNP formulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af DIO-LCNP og DIO-LCNP-PEG-Chol

  1. Opløs flydende krystallinsk diacrylat tværbindingsmiddel (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat (DIO, 2 mg), og en fri radikal-initiator (azobisisobutyronitril, 1 mg) til polymerisation i 2 ml chloroform. Tilføje dette til en vandig opløsning af acrylat-funktionaliseret overfladeaktivt middel (AC10COONa, 13 mg i 7 ml).
  2. Omrør blandingen i 1 time og soniker ved 80% amplitude i 5 min for at fremstille en miniemulsion bestående af små dråber af det organiske materiale omgivet af polymeriserbar overfladeaktivt middel i vand.
  3. Blandingen opvarmes til 64 ° C i et oliebad at initiere polymeriseringen af ​​både tværbindingsmiddel og overfladeaktivt middel som chloroformen langsomt fordamper og efterlader en DiO-indeholdende NP suspension, er stabiliseret af det overfladeaktive middel.
  4. Foretage NP suspension (3 gange) gennem et 0,2 um sprøjtefilter til fjernelse af eventuelt aggregering. Store den filtrerede NP-opløsning ved 4 ° C indtil yderligere anvendelse.
  5. Konjugation af PEG-Chol Dio-LCNP via EDC-kobling.
    1. Opløs Chol-PEG-NH2 · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) i 25 mM HEPES-buffer (pH 7,0).
    2. Der fremstilles en arbejdsopløsning indeholdende N-hydroxy-sulfosuccinimidester natriumsalt (NHSS, 40 mM) og 1-ethyl-3- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimid-hydrochlorid (EDC, 400 mM) i HEPES-buffer fra koncentrerede stamopløsninger.
    3. Umiddelbart tilsættes 20 pi af frisk fremstillet arbejder opløsning af NHSS / EDC til 1,0 ml af DIO-LCNP i HEPES puffer og omrøres i 5 minutter.
    4. Tilsæt 20 pi stamopløsning af Chol-PEG-NH2 · HCl til denne blanding, og omrør i 2 timer.
    5. Kort fortalt centrifugeres reaktionsblandingen ved maksimal hastighed (~ 2.000 x g) i 30 sekunder under anvendelse af en bordplade mini centrifuge og passere supernatanten gennem en PD-10 gelpermeationskromatografisøjle 13 ækvilibreret medDulbeccos phosphatbufrede saltvand (DPBS, 0,1x).

2. Karakterisering af DIO-LCNP og DIO-LCNP-PEG-Chol

  1. Bekræfter den succesfulde kovalent konjugering af PEG-Chol til DIO-LCNP overflade ved gelelektroforese.
    1. Opløs 0,5 g agarose i 50 ml (1x) af tris-borat elektroforese (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM borsyre og 2 mM EDTA) buffer. Opvarm opløsningen i en mikrobølgeovn for at opløse agarosen. Lad opløsningen køle lidt og hældes indholdet i en gel plade i elektroforese boksen. Indsæt en gel kam til at skabe prøvebrønde.
    2. Når gelen er størknet, tilsættes den nødvendige mængde (nok til at nedsænke gelen i kammeret) i TBE løbende buffer til kammeret.
    3. Tilsættes 35 pi af DIO-LCNP prøve (ændret med glycerol, 5% v / v) til brøndene i gelen og køre i 20 minutter ved en spænding på 110 V.
    4. Billede gelen under anvendelse af en gel imaging system with excitation og emission filtre på 488 nm og 500-550 nm.
  2. Vurdere partikelstørrelse og fordeling ved dynamisk lysspredning (DLS) ved fortynding DIO-LCNP opløsning (~ 200-gange fortynding) i PBS (pH ~ 8, 0,1x) og måling på en DLS instrument 14. Mål Zeta-potentialet af DIO-LCNPs anvendelse af en passende zetapotentiale instrument måling.

3. Udarbejdelse af Cell Culture Retter til levering Eksperimenter og Imaging

BEMÆRK: DiO-LCNP mærkning udføres på HEK 293T / 17 humane embryoniske nyreceller (mellem passagerne 5 og 15), der er dyrket som tidligere 4 beskrevne. Udfør levering eksperimenter og den efterfølgende cell imaging som beskrevet nedenfor.

  1. Forbered 35 mm tissue diameter dyrkningsskåle (udstyret med 14 mm No. 1 dækglas indsætter) ved at coate dem med bovin fibronectin (~ 100 pi ved en koncentration på 20 ug/ Ml) i DPBS i 2 timer ved 37 ° C.
  2. Fjern fibronectin belægningsopløsningen fra dyrkningsskålen. Harvest HEK 293 T1 / 7-celler fra T-25-kolbe ved først at vaske cellemonolaget med 3 ml DPBS og derpå ved tilsætning af 2 ml trypsin-EDTA (0,5% trypsin-0,25% EDTA).
  3. Inkuber kolben ved 37 ° C i ~ 3 min. Fjern trypsin-EDTA og kolben tilbage til inkubatoren. Når cellerne er frigjort fra kolben, neutralisere trypsin ved tilsætning af 4 ml komplet medium (Dulbeccos Modified Eagle Medium, DMEM, ændret til at indeholde 10% føtalt bovint serum, 5% natriumpyruvat og 5% antibiotikum / antimykotikum) til kolben . Bestem koncentrationen cellen i suspension ved at tælle dem i en celletæller.
  4. Juster cellekoncentrationen til ~ 8 x 10 4 celler / ml med vækstmediet. Tilsæt 3 ml af cellesuspensionen til fadet og kultur i inkubatoren natten over; den næste dag, bør cellerne være på ~ 70% sammenflydning og bør være klar til brug. tilstrækkeligcelledensitet er kritisk for robust og effektiv mærkning af en høj procentdel af celler.

4. Cellulær Levering af DIO og DIO-LCNPs og Imaging af faste celler

  1. Forbered 1 ml løsninger af DIO, Dio-LCNP, og DIO-LCNP-PEG-Chol i levering medium (HEPES-DMEM; DMEM indeholdende 25 mM HEPES) ved at fortynde stamopløsninger af DIO fri og DIO-LCNPs; passende DIO koncentrationer til inkubation på celler vil være ~ 1-10 uM (udtrykt som enten den koncentration af DIO gratis eller DiO i form af DIO-LCNP).
  2. Fjern vækstmediet fra dyrkningsskålene under anvendelse af en serologisk pipette og vaske cellemonolag (se trin 3) to gange med HEPES-DMEM (2 ml hver vask). Udfør vasker ved forsigtigt at tilføje og fjerne HEPES-DMEM ved hjælp af en pipette til / fra kanten af ​​retterne.
  3. Tilsæt 0,2 ml af de fremstillede DIO gratis eller DiO-LCNP levering løsninger til centrum af kultur retter og returnere retter til incubator i et passende tidsrum (typisk 15 eller 30 min, afhængigt af behovene i forsøget). Længere inkubationstider føje til mere uspecifik cellulær mærkning af ikke-hindeagtige områder (f.eks, cytosol).
  4. Efter inkubationstiden, fjerne levering løsninger ved hjælp af en serologisk pipette. Vask cellemonolagene to gange med DPBS (2 ml hver vask). Udfør vasker ved forsigtigt at tilføje og fjerne DPBS til / fra kanten af ​​skålen.
  5. Fix cellemonolagene anvendelse af 4% paraformaldehyd (fremstillet i DPBS) i 15 minutter ved stuetemperatur.
    ADVARSEL: Paraformaldehyd er brændbar, en respiratorisk irriterende, og en mistænkt kræftfremkaldende.
  6. Fjern paraformaldehydopløsning med en pipette og forsigtigt vaske cellerne 1 gang med DPBS (2 ml) ved at tilføje og fjerne DPBS hjælp pipette til / fra kanten af ​​retterne.
  7. De fikserede celler er klar til at blive afbildet for tilstedeværelsen af ​​en membranøs fluorescens signal under anvendelse af konfokal laser scanningmikroskopi (CLSM). Udfør imaging straks eller alternativt erstatte mediet med DPBS indeholdende 0,05% NaN3 og gemme retter ved 4 ° C.
    ADVARSEL: NaN 3 er giftigt; udvise ekstrem forsigtighed, når du bruger NaN3.
    BEMÆRK: Fast prøver opbevaret på denne måde, bør afbildes indenfor 48 timer for optimale resultater.

5. Cellulær Levering af DIO og DIO-LCNPs og FRET Imaging i levende celler

BEMÆRK: I denne metode, er celler colabeled med 6 pM hver DiO-LCNP-PEG-Chol (hvor DiO er en FRET donor) og 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorat (DII fri, hvor Dil er en FRET-acceptor). Frigivelsen af ​​DIO fra DiO-LCNP-PEG-Chol og dets inkorporering i plasmamembranen bekræftes af en observeret stigning i energioverførsel fra DIO donor til Dil acceptor.

  1. Label celler sekventielt med DiO-LCNP-PEG-Chol og Dil free ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet i trin 4.
  2. Efter farvning vaskes cellerne 1 gang med DPBS (2 ml) under anvendelse af en serologisk pipette og erstatte vaskepufferen med 2 ml af levende celler opløsning (LCIS).
  3. På et mikroskop fase udstyret med en opvarmet inkubation kammer, afbilde levende celle prøve ved hjælp konfokalt mikroskop (60X objektiv) med et FRET billeddannelse konfiguration ved 30 minutters intervaller i løbet af en 4 timers periode ved spændende DIO donor ved 488 nm og opsamling fuld emission spektre af både DIO donor og acceptor Dil fra 490-700 nm med en 32-kanal spektral detektor.
  4. BEMÆRK: Yderligere oplysninger om FRET billeddannelse, se referere 15.
  5. Bestem tidsopløst emission intensiteten af ​​både DIO donor og Dil acceptor fra celler farvet med DiO-LCNP-PEG-Chol og Dil. Beregn tidsopløst acceptor / donor FRET-forholdet (Dil EMI / DiO emi) for billederne, der støt vil stige, og i sidste ende pladeau når mængden af DIO donor fordelt i membranen har nået et maksimum 16.

6. cytotoksicitetsanalyse af DIO og DIO-LCNPs til HEK 293T / 17 Cells

BEMÆRK: Cytotoksiciteten af DIO-LCNP materialer vurderes under anvendelse af et tetrazolium farvestof-baserede proliferation assay 17. Celler dyrkes i en flerbrøndsplade i nærvær af varierende koncentrationer af de materialer, under betingelser, der emulerer levering / mærkning. Cellerne dyrkes derefter i 72 timer for at muliggøre proliferation. En farvestof (MTS, (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) tilsættes derefter til brøndene, og metabolisk aktive celler konvertere farvestoffet til et blåt formazanprodukt. mængden af ​​farvedannelse er direkte proportional med antallet af levedygtige celler.

  1. Harvest HEK 293 T1 / 7-celler fra T-25-kolbe ved at følge fremgangsmåden beskrevet i trin 3.2.SeedHEK 293T / 17-celler (5000 celler / 100 pi / brønd) til brøndene i en 96-brønds vævskulturplade behandlet plade og kultur i 24 timer.
  2. Helt at fjerne dyrkningsmediet fra brønde med en mikropipette, og der tilsættes 50 pi HEPES-DMEM indeholdende DiO fri, Dio-LCNPs eller DiO-LCNP-PEG-Chol ved stigende koncentrationer til at replikere brønde. Inkuber på cellerne ved 37 ° C i 30 minutter.
    BEMÆRK: Typisk replikater udført tre gange eller fire gange, er tilstrækkelig til at give statistisk pålidelige data.
    1. Efter inkubation fjernes levering medium indeholdende materialerne ved hjælp af en mikropipette og erstatte det med 100 pi vækstmedium. Dyrke cellerne i 72 timer.
  3. Tilsæt 20 pi af tetrazolium substrat til hver brønd, returnere pladen til inkubatoren, og tillade farvedannelse forløbe ved 37 ° C i 4 timer. Læs absorbansen (abs) af det formazan produkt ved 570 nm (absorption minima for DIO-LCNPs anvendes i denne study) og 650 nm (for subtraktion af ikke-specifik baggrund absorbans) under anvendelse af en mikrotiterpladelæser.
  4. Plot forskellen absorbans værdi (abs 570 - abs 650) versus materiale koncentration og rapportere resultaterne som procent af kontrol celleproliferation (grad af proliferation af celler i kun cellekulturmedium).

7. Data Analysis

  1. Statistisk analyse af data med en univariat variansanalyse (ANOVA). For multiple sammenligninger, anvende Bonferroni post hoc test. Give alle gennemsnitsværdier som ± standardafvigelse af middelværdien (SEM), medmindre andet er nævnt.
    BEMÆRK: Den acceptable sandsynlighed for signifikans var p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LCNPs blev fremstillet, hvori den hydrofobe kerne af NP blev indlæst med en repræsentativ membran-mærkning probe til at påvise anvendeligheden af ​​LCNP som en effektiv levering køretøj til hydrofobe ladninger. Til dette formål, den valgte lasten var det stærkt vanduopløselige potentiometrisk membran-mærkning farvestof, Dio. DiO-loaded LCNPs (DIO-LCNPs) blev syntetiseret under anvendelse af en tofaset mini-emulsion teknik med kemiske komponenter DACTP11, AC10COONa, og DIO, som vist i figur 1 18. I dette NP system, kovalent bundet polymernetværk af den krystallinske tværbindingsmiddel DACTP11 giver en stabil hydrofob kerne, hvor DIO bopæl inden de interstitielle rum i det tværbundne netværk. Carboxylatgrupperne på NP overflade giver kolloid stabilitet til partiklen i vandige medier, samtidig tjener som en funktionel gruppe "håndtag" til fastgørelse af celle-targeting ligander(Og andre biologiske). At tether DIO-LCNPs til plasmamembranen, blev en amintermineret PEGyleret cholesterol-del (PEG-Chol) kovalent bundet til LCNP overflade via EDC-kobling (figur 1). Efter NP syntese og bekræftelsen af ​​en vellykket bioconjugation, evnen af ​​DIO-LCNPs mærke plasmamembranen af ​​levende celler og levere den integrerede DiO last til den lipofile del af plasmamembranen dobbeltlaget med forbedret specificitet og kinetik sammenlignet med den frie formen (DIO free) leveret fra bulkopløsning blev vurderet.

Som vist i figur 2 A, Dio fri (6,0 uM) robust farves plasmamembranen med høj effektivitet (næsten 100% af celler mærket) efter 15 minutters inkubation med HEK 293T / 17 celler. Imidlertid blev signifikant cellulær internalisering af DIO fri observeret ved kun en beskeden stigning iinkubationstid til 30 min (figur 2 A og C). Omfanget af DIO fri internalisering blev bestemt ved tidsopløst co-lokaliseringstoppe forsøg, hvor cellerne først blev inkuberet med 6,0 pM DiO fri (30 min). DIO fri holdig inkubationsmediet blev derefter fjernet, og cellerne blev efterfølgende dyrket i op til 4 timer. Plasmamembraner cellerne blev modfarvet med et farvestof-mærket membran phospholipid (phosphoethanolamin konjugeret til rhodamin B, PE-Rhoda). Som vist i figur 2 C, efter 15 minutters inkubation, blev næsten 100% af DIO fri colocalized med PE-Rhoda markør (Pearsons colokalisering koefficient; PCC = 0,99 ± 0,01). Men efter 30 minutters inkubation ~ 80% af DIO fri forblev bundet til membranen (~ 20% internaliseret). Graden af DIO gratis internalisering steget støt som the inkubationstiden blev udvidet til så længe fire timer, og dette blev afspejlet i den ledsagende fald i PCC mellem DIO og Rhoda-PE (figur 2 C). En tilpasning af data til en én-fase eksponentielt henfald ligning afslørede, at DIO gratis internalisering nåede et maksimum på ~ 50% på 1 time, med en internalisering sats (k = 0,045 min -1) og halveringstid (15 min) som afspejlede en hurtig og effektiv cellulær optagelse af DIO fri. Disse data viser den hurtige tidsafhængige overgang af DIO fri fra plasmamembranen til cytosolen, hvor det stort set forblevet udelukket fra kernen over 4 timer tidsperiode undersøgt.

I betragtning af den ukontrollerede cellulære optagelse af DIO gratis, målet blev at modulere denne adfærd gennem levering af DIO som LCNP-PEG-Chol NP formulering. Når leveres som en LCNP-PEG-Chol biokonjugat, en mere vedvarende membran residning tid af DIO sammenlignet med DiO fri blev bemærket (fig 2 B). Efter 15 minutters inkubation af DIO-LCNP-PEG-Chol med cellerne, blev næsten 100% af DIO signalet placeret ved plasmamembranen, hvor den blev colocalized med PE-Rhoda membran markering, et resultat, der var sammenlignelig med der observeres for DiO gratis. Det blev imidlertid bemærkes, at selv DIO fri mærkning af membranen var helt ensartet og sammenhængende, farvningsmønstret af DIO-LCNP-PEG-Chol efter 15 minutters inkubation var mere punktformig og ikke nær så ensartet karakter (figur 2 B). Dette resultat indikerede, at DIO-LCNP-PEG-Chol NP'er indsamlede i diskrete områder inden plasmamembranen. Når inkubationstiden blev forøget til 30 min, ~ 94% af DIO signalet forblev på membranen (sammenlignet med ~ 80% for DiO fri på denne samme tidspunkt) (figur 2 B og 2C). Denne tendens blev endnu mere udtalt, når cellerne blev dyrket med DIO-LCNP-PEG-Chol NP'er for stadig længere tid efter den første 30 minutters inkubation. For eksempel efter dyrkning i 1 time efter den første inkubation, næsten 80% af DIO-LCNP-PEG-Chol NP signal forblev membranøs og colocalized med PE-Rhoda markør (i forhold til ~ 55% for DiO gratis). Især den cellulære internalisering af DIO-LCNP-PEG-Chol NP'er nåede et maksimum på 30% på 2 timer (70% membran retention). Dette svarer til en cellulær optagelse sats (k = 0,024 min-1; halveringstid = 29 min), der er præcis halvdelen af den observeret for internalisering af DIO fri.

Dernæst evne NP-embedded DiO last til effektivt udstrømning ud af LCNP kerne og indtaste den lipofile miljø af plasmamembranen dobbeltlaget på en kontrolleret og tidsafhængig måde blev bestemt. Tilvurdere dette blev en FRET-baseret strategi udtænkt hvor DIO tjener som en FRET donor involveret i energioverførsel til acceptoren farvestof, Dil. Som forventet ved første mærkning (t = 0 min), blev emission signal domineret af DIO donor indeholdt i membran-forankrede NP'er (figur 3 B). FRET billeddannelse af dette samme område 4 timer senere (t = 240 min), imidlertid viste en signifikant stigning i emissionen signalet fra Dil acceptor, hvilket giver stærke beviser for overgangen af ​​DIO donor fra LCNP kernen i plasmamembranen dobbeltlaget (Figur 3 C). Undersøgelse af tidsopløst karakter af denne overgang viste et støt fald i DiO donor emission kombineret med en tilsvarende stigning i Dil acceptor emission over 4 hr eksperimentelle vindue (Figur 3 D). Især FRET effektivitet i denne overgangsperiode nåede sit maximum på ~ 180 minutter efter initial mærkning, hvilket antyder, at udstrømningen og membran opdeling af DIO donor havde nået sit maksimum på dette tidspunkt (fig 3 E). Disse data forudsat stærke beviser for tidsopløst opdeling af DIO fra NP til plasmamembranen dobbeltlag, der nåede sit maksimum ~ 3 timer efter initial mærkning med DIO-LCNP-PEG-Chol NP'er.

Endelig blev sammenlignende cytotoksicitet analyse udført for DiO gratis versus DiO-LCNP-PEG-Chol. Når inkuberes med HEK 293T / 17 celler (ved en DiO koncentration på 6 uM i begge tilfælde), var det klart, at indkapsling af DIO i LCNP kerne svækket sin cytotoksicitet. Mens DiO fri fremkaldte cellulære levedygtigheder af ~ 50%, celler inkuberet med DiO-LCNP-PEG-Chol udviste cellulære levedygtighed ~ 90%. (Figur 4). Kumulativt, data mærkning celle kombineret med den cellulære toxibydata demonstrere forbedringer i både effektiviteten af ​​DIO-baserede membran mærkning og modulering af cytotoksiciteten af ​​DIO.

figur 1
Figur 1: Skematisk fremstilling af membran-bindende DiO-LCNP-PEG-Chol. DiO-LCNP er sammensat af et acrylat flydende krystal tværbindingsmiddel (DACTP11); en carboxyl-termineret polymeriserbar overfladeaktivt middel (AC10COONa); og en lipofil farvestof, Dio. Kolesterol-termineret poly (ethylenglycol) (PEG-Chol) blev konjugeret til DiO-LCNP via EDC-kobling. Tilsætning af Chol til DIO-LCNP overflade medierer præferentiel binding af NP til plasmamembranen. Klik her for at se en større version af dette tal.


Figur 2: Time-løst cellulære optagelse af DIO fri i HEK 293 T / 17 celler. DiO fri (6,0 uM, panel (A) eller DiO-LCNP-PEG-Chol ([DiO] = 6,0 uM, panel (B) blev inkuberet på cellemonolag i 15 min, fjernet og erstattet med vækstmedium, blev cellerne dyrket i de angivne tidsrum (op til 4 timer). Celler blev efterfølgende farvet med PE-Rhoda (2,0 uM) og fikseres. prøverne blev afbildet for DiO (grøn) og membranbundet PE-Rhoda (rød) under anvendelse CLSM. ( C) tidsopløst plot af procentdelen af membranbundne DiO gratis eller DiO-LCNP-PEG-Chol signal som en funktion af stigende inkubationstid. dataene blev opnået fra Pearsons colokalisering koefficient (PCC, n = 3 & #177; standardafvigelse) af den grønne (DIO) og rød (PE-Rhoda) kanaler, og udtrykkes som en procentdel (± SEM) efter normalisering til PCC svarende til 15 min inkubation. Scale bar = 20 um. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 18. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: tidsopløst FRET bekræfter udstrømningen af DIO fra DiO-LCNP-PEG-Chol til plasmamembranen. HEK293T / 17 celler blev costained med DiO-LCNP-PEG-Chol og Dil, hvor DIO (grøn udsender) og Dil (rød udsender) farvestoffer fungerer som FRET donor og acceptor, hhv. (A) DIC billede af de levende celler costained med DiO-LCNP-PEG-Chol ([DiO] = 6,0 uM) og Dil (6,0 uM). srigelig blev afbildet at overvåge ændringen i FRET signal over en periode på 4 timer. (B) og (C) er FRET billeder af levende celler på samme fokale plan ved t = 0 min og t = 240 min. (D) Normalized, tidsopløst emission intensitet af DIO donor og Dil acceptor fra celler farvet med DiO-LCNP-PEG-Chol og Dil og afbildet i FRET excitation mode. (E) Time-løst FRET-forholdet (Dil EMI / DiO emi) for celler mærket med DiO-LCNP-PEG-Chol og Dil og afbildet i FRET konfiguration. Scale bar = 20 um. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 18. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4 Kvantificering af cytotoksicitet. DiO fri, LCNP, Dio-LCNPs eller DiO-LCNP-PEG-Chol blev inkuberet på HEK 293T / 17 cellemonolag i 15 minutter og derefter fjernet. Celler blev vasket og dyrket i vækstmedium i 72 timer før MTS assay. Søjlediagrammet viser en sammenligning af cellelevedygtigheden (n = 5 ± SEM) af DIO fri, LCNP, Dio-LCNP, og DIO-LCNP-PEG-Chol på [DiO] = 6,0 uM. Forskellen mellem DiO fri og LCNP, Dio-LCNP eller DiO-LCNP-PEG-Chol er signifikant (p <0,001) efter 72 timer inkubation. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning 18. Dataene blev analyseret under anvendelse af univariate variansanalyse (ANOVA); Bonferroni post hoc test blev anvendt til multiple sammenligninger. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En fortsat modstanderen NMDD er det kontrollerede målretning og afgivelse af lægemiddelformuleringer til celler og væv, kombineret med samtidig forbedret lægemiddeleffektivitet. En specifik klasse af lægemiddelmolekyler, hvor dette har udgjort en betydelig udfordring er hydrofobe lægemidler / billeddannende midler, der har sparsomt til ingen opløselighed i vandige medier. Dette problem har plaget overgang potente lægemidler fra in vitro cellekultursystemer til det kliniske miljø og har resulteret i en række lovende lægemiddelmolekyler er "henlagt" eller opgivet og ikke forfulgt yderligere i det kliniske miljø. Wortmannin (Wtmn), for eksempel, er en potent hæmmer af phosphatidylinositol 3'kinaser og phosphatidylinositol 3'-kinase-relaterede kinaser og har stort potentiale som et anticancermiddel, men dens manglende vandopløselighed har hæmmet dens progression i kliniske forsøg.

For nylig Karve et al. viste forbedret vand solubility af Wtmn når formuleret som en lipid-polymer-NP samling 19. En arena, der i høj grad kunne drage fordel af denne type forbedret, kontrolleret levering som et NP formulering er leveringen af ​​hydrofobe stoffer og billedbehandling agenter til plasmamembranen. Således målet her var at løse dette tekniske hurdle og at udvikle en metode til at overvinde denne teknologiske hurdle.

Ved udviklingen af ​​denne metode, en model membran-targeting farvestof, Dio, blev valgt som historisk har været plaget af dårlig opløselighed i vandige medier. Dette bibringer betydelige udfordringer i den specifikke levering af farvestoffet til plasmamembranen. Blandt disse udfordringer er behovet for at tilsætte den krystallinske form af farvestoffet direkte til celler eller væv 10 eller at inkubere celler med meget høje koncentrationer af DIO efter fortynding fra stamopløsninger indeholdende opløsningsmidler, såsom DMSO 11, 12.Tilgangen her var dobbelt: 1) indarbejde DIO ind i den hydrofobe kerne af LCNPs under NP-syntese og 2) kovalent ændre as-syntetiserede Dio-LCNPs med PEGyleret kolesterol konjugat (DIO-LCNP-PEG-Chol) for at lette den direkte interaktion af DIO-fyldte NP'er med plasmamembranen. Faktisk denne tilgang effektivt forbedret en række aspekter af levering af DIO til plasmamembranen.

Først blev membranen opholdstiden af ​​DIO effektivt fordobles, når leveret som en LCNP formulering sammenlignet med, når DiO blev leveret fri for bulkopløsning. Denne udvidede membran opholdstid blev tilskrevet lokaliseringen af ​​DIO-LCNP-PEG-Chol konjugater til lipidklump mikrodomæner af plasmamembranen, som bekræftes ved co-farvende eksperimenter. For det andet blev opdelingen af ​​DIO lasten i lipiddobbeltlaget bekræftet af FRET forsøg, hvor DIO tjente som donor til en membran-resident Dil acceptor. Endeliglangsom, vedvarende frigivelse af DIO lasten i membrandobbeltlaget dæmpet effektivt cytotoksiciteten af ​​DIO med ~ 40%.

Det er vigtigt at fremhæve flere punkter i den protokol, er afgørende for succes. For det første skal den procentvise belastning af DIO i LCNP kernen være empirisk optimeres i prøveperiode syntese løber til opnåelse af en balance mellem frembringelsen af ​​høj kvalitet DiO-LCNP-PEG-Chol NPs og det ønskede niveau af fluorescenssignal i cellulære levering eksperimenter . Ligeledes skal bioconjugation af Chol-PEG-NH2-del til DIO-LCNP overflade optimeres for at opnå det ønskede niveau af cellulær mærkning. Endelig er antallet af celler anvendes på fibronectincoatede dyrkningsskåle er kritisk for succes, og skal være omhyggelig med at pode cellerne ved en densitet på ~ 8 x 10 4 celler / ml (~ 2,4 x 10 5 celler pr skål) . Når cellerne podes for tyndt, det resulterer i ineffektiv mærkning membran, mens podning af ceLLS også tættest resultater i køb af fattige billeder, der ikke tydeligt viser membranøs mærkning.

En potentiel begrænsning af den som beskrevne protokol er, at effektiviteten af ​​inkorporering af forskellige andre membran-målretning farvestoffer og lægemidler vil variere afhængigt af hydrofobicitet af farvestoffet / lægemiddel fragt. I disse tilfælde vil LCNP synteseprotokol skal testes empirisk for at bestemme de optimale syntesebetingelser for ideelle farvestof / lægemiddel fragt inkorporering.

Sammenfattende er der blevet udviklet en metode til LCNP-baserede styret afgivelse af et hydrofobt farvestof fragt til plasmamembranen af ​​levende celler, der overvinder mange af de tekniske udfordringer der er forbundet med den cellulære levering af vanduopløselige ladninger. Den samlede betydning for fremgangsmåden er, at den klart forbedrer specifikke afgivelse af last til plasmamembranen samtidig dæmpe ledsagende cytotoksicitet, der er Associated med levering af hydrofobe ladninger ved høje koncentrationer fra bulkopløsning. Denne tilgang bør finde bred anvendelighed i leveringen af ​​tilsvarende udfordrende hydrofobe farvestof / imaging agent ladninger og vil sandsynligvis bidrage til at lette overgangen for effektiv, men dårligt vandopløselige, ladninger fra den eksperimentelle regime til den kliniske indstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NRL Base Funding Program (Work Unit MA041-06-41-4943). ON understøttes af en National Research Council Postdoc Research Associateship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).

Tags

Bioengineering nanopartikel flydende krystal 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat kolesterol bioconjugation plasmamembranen
Målrettet plasmamembran Levering af en hydrofob Cargo indkapslet i en Liquid Crystal Nanopartikel Carrier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E.,… More

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter