Summary
Vloeibaar kristal nanodeeltje (LCNP) Nanodrager wordt benut als middel voor de gecontroleerde afgifte van een hydrofoob lading naar de plasmamembraan van levende cellen.
Abstract
De gecontroleerde afgifte van geneesmiddel / beeldvormingsmiddelen cellen is cruciaal voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en voor de studie van cellulaire signaleringsprocessen. Onlangs, nanodeeltjes (NP) zijn veelbelovend in de ontwikkeling van dergelijke afgiftesystemen getoond. Hier is een vloeibaar kristal NP (LCNP) gebaseerde afgiftesysteem toegepast voor de gecontroleerde afgifte van een in water oplosbare kleurstof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO), vanuit de NP kern het hydrofobe gebied van een plasma membraan dubbellaag. Tijdens de synthese van de NP werd de kleurstof efficiënt opgenomen in de hydrofobe kern LCNP, zoals bevestigd door meerdere spectroscopische analyses. Conjugatie van een gePEGyleerd cholesterolderivaat de NP oppervlak (DIO-LCNP-PEG-Chol) kon de binding van de kleurstof beladen NPs naar de plasmamembraan in HEK 293T / 17 cellen. Tijdsgeresolveerde laser scanning confocale microscopie en Förster resonance energy transfer (FRET) beeldvorming bevestigde de pasive uitstroom van DIO uit de LCNP kern en het inbrengen in het plasmamembraan dubbellaag. Ten slotte is de levering van DIO als LCNP-PEG-Chol verzwakt de cytotoxiciteit van DIO; de NP vorm van Dio tentoongesteld ~ 30-40% minder toxiciteit in vergelijking met Dio gratis geleverd vanuit bulk-oplossing. Deze benadering demonstreert de bruikbaarheid van de LCNP platform als efficiënte modaliteit voor membraan-specifieke afgifte en modulatie van hydrofobe moleculaire ladingen.
Introduction
Sinds de komst van interfacing nanomaterialen (materialen ≤100 nm in ten minste één dimensie) met levende cellen, is een voortdurend doel geweest om te profiteren van de unieke grootte-afhankelijke eigenschappen van nanodeeltjes (NP) voor verschillende toepassingen. Deze toepassingen omvatten weefsel- en labeling / beeldvorming (zowel in vitro als in vivo), real-time detectie en de gereguleerde afgifte van geneesmiddelen en andere ladingen 1. Voorbeelden van dergelijke relevante NP eigenschappen zijn onder andere de grootte-afhankelijke uitstoot van halfgeleider nanokristallen (quantum dots, QDs); de fotothermische eigenschappen van gouden nanodeeltjes; de grote laadcapaciteit van de waterige kern van liposomen; en de ballistische geleidbaarheid van koolstof allotropen, zoals enkelwandige koolstofnanobuizen en grafeen.
Meer recent heeft aanzienlijke interesse ontstaan in het gebruik van NPs voor de geregelde modulatie van drugs en andere ladingen, zoals contrast / a beeldvormingheren. Hier, de reden is om aanzienlijk te verbeteren / optimaliseren van de totale oplosbaarheid, toegediende dosis, de circulatie tijd, en de uiteindelijke goedkeuring van de drug lading door het leveren van het als een NP formulering. Dit is bekend geworden als NP-gemedieerde geneesmiddelafgifte (NMDD) aan, en er zijn nog zeven FDA goedgekeurde NP geneesmiddelformuleringen voor gebruik in de kliniek verschillende kankers en honderden meer in verschillende stadia van klinische proeven behandelen. In wezen is het doel om "meer met minder te bereiken;" dat wil zeggen, de NP als een scaffold meer-medicijn met minder dosering besturen door gebruik te maken van het grote oppervlak: volume (bijvoorbeeld, harde deeltjes, zoals QDs en metaaloxiden) NPS of hun grote binnenruimte voor laden grote vracht ladingen (bijvoorbeeld liposomen of micellen). Het doel hiervan is om de noodzaak voor meerdere systemisch afgeleverd doseringsregimes verminderen terwijl het tegelijkertijd bevorderlijk waterige stabiliteit en verbeterde circulatie, met name vooruitdagende hydrofoob geneesmiddel dat ladingen, terwijl zeer effectief, matig oplosbaar in waterige media.
Aldus is het doel van de hierin beschreven werk was om de levensvatbaarheid van het gebruik van een nieuwe NP matrix voor de specifieke en gecontroleerde afgifte van hydrofobe ladingen aan de lipofiele plasmamembraan bilaag bepalen. De motivatie voor het werk was de inherente beperkte oplosbaarheid en moeilijkheden bij de levering van hydrofobe moleculen aan cellen uit waterige media. Typisch, de levering van dergelijke hydrofobe moleculen vereist het gebruik van organische oplosmiddelen (bijvoorbeeld DMSO) of amfifiele oppervlakteactieve stoffen (bijvoorbeeld Poloxameren), die toxisch en compromissen cel- en levensvatbaarheid van het weefsel 2 of micel dragers kunnen, waarin de interne belasting kan beperkt capaciteiten. De NP carrier hier gekozen was een nieuw vloeibaar kristal NP (LCNP) formulering eerder ontwikkelde 3 en dat was eerder aangetoond dat een ~ 40-voudig bereiken verbetering van de werkzaamheid van het antikankermiddel doxorubicine in gekweekte cellen 4.
In de hierin beschreven werk, de vertegenwoordiger van de lading gekozen was de potentiometrische membraan kleurstof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO). DIO is een in water onoplosbare kleurstof die is gebruikt voor anterograde en retrograde traceren in levende en vaste neuronen, membraanpotentiaal metingen, en voor algemene membraan labeling 5, 6, 7, 8, 9. Door de hydrofobe aard is DIO gewoonlijk rechtstreeks toegevoegd aan celmonolagen of weefsels in een kristallijne vorm 10, of het wordt geïncubeerd bij zeer hoge concentraties (~ 1-20 uM) na verdunning van een concentratie stockoplossing 11, 12.
content "> Hier de benadering gebruik de LCNP platform, een multifunctioneel NP waarvan de binnenkern volledig hydrofoob en waarvan het oppervlak tegelijkertijd hydrofiel en vatbaar voor bioconjugatie, als transportmiddel Dio. Dio is opgenomen in de LCNP kern tijdens de synthese en de NP oppervlak wordt vervolgens gefunctionaliseerd met een gePEGyleerd cholesterol groep aan het membraan binding van het DIO-LCNP pakket bij het plasmamembraan bevorderen. Deze benadering resulteerde in een afgiftesysteem dat DIO verdeeld in het plasmamembraan met een grotere betrouwbaarheid en membraan residence tijd dan de vrije vorm van Dio geleverd vanuit bulk-oplossing (Dio gratis). Verder is deze methode is gebleken dat het-LCNP gemedieerde levering van DIO aanzienlijk moduleert en drijft het tempo van de specifieke verdeling van de kleurstof in de lipofiele plasmamembraan dubbellaag. dit is bereikt terwijl gelijktijdig de cytotoxiciteit van de vrije geneesmiddel door het leveren van het als een LCNP formulering verminderen door ~ 40%.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van DIO-LCNP en DIO-LCNP-PEG-Chol
- Ontbinden vloeibaar kristallijne diacrylaat verknopingsmiddel (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO, 2 mg), en een vrije radicaal initiator (azobisisobutyronitril, 1 mg) voor polymerisatie in 2 ml chloroform. Voeg dit toe aan een waterige oplossing van acrylaatgefunctionaliseerd surfactant (AC10COONa, 13 mg in 7 ml).
- Roer het mengsel gedurende 1 uur en ultrasone trillingen bij 80% amplitude gedurende 5 minuten om een mini-emulsie bestaat uit kleine druppeltjes van de organische materiaal omgeven door polymeriseerbaar oppervlakteactief middel in water te produceren.
- Verwarm het mengsel tot 64 ° C in een oliebad de polymerisatie van zowel het verknopingsmiddel en surfactant initiëren als chloroform langzaam verdampt, waardoor een DIO-bevattende NP suspensie die wordt gestabiliseerd door de oppervlakteactieve stof.
- Filter de NP suspensie (3 keer) door een 0,2 urn spuitfilter om eventuele samenvoeging verwijderen. Stoopnieuw de gefilterde NP oplossing bij 4 ° C tot verder gebruik.
- Conjugatie van PEG-Chol Dio-LCNP via EDC koppeling.
- Oplossen Chol-PEG-NH2 · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) in 25 mM HEPES buffer (pH 7,0).
- Bereid een werkoplossing die N-hydroxy-succinimide-natriumzout (NHSS, 40 mM) en 1-ethyl-3- (3- (dimethylamino) propyl) carbodiimide hydrochloride (EDC, 400 mM) in HEPES buffer uit geconcentreerde voorraadoplossingen.
- Voeg onmiddellijk 20 ul van vers bereide werkoplossing van NHSS / EDC 1,0 ml DIO-LCNP in HEPES buffer en roer gedurende 5 min.
- Voeg 20 pl voorraadoplossing van Chol-PEG-NH2 · HCl aan dit mengsel en roer gedurende 2 uur.
- Kort centrifugeren van het reactiemengsel bij maximale snelheid (~ 2000 xg) voor 30 sec met een mini tabletop centrifuge en laat de bovenstaande vloeistof op een PD-10 gelpermeatiechromatografie kolom geëquilibreerd met 13Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS, 0,1x).
2. Karakterisering van DIO-LCNP en DIO-LCNP-PEG-Chol
- Bevestig de succesvolle covalente vervoeging van PEG-Chol de DIO-LCNP oppervlak door gelelektroforese.
- Los op 0,5 g agarose in 50 ml (1x) tris-boraat elektroforese (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM boorzuur en 2 mM EDTA) buffer. Verwarm de oplossing in een magnetron om de agarose op te lossen. Laat de oplossing enigszins afkoelen en giet de inhoud in een gel plaat in de elektroforese doos. Plaats een gel kam om monsterputjes te creëren.
- Zodra de gel gestold, voeg de benodigde hoeveelheid (genoeg om de gel in de kamer onder water) van TBE loopbuffer naar de kamer.
- Voeg 35 ul van DIO-LCNP monster (gewijzigd met glycerol, 5% v / v) aan de putjes van de gel en een looptijd van 20 minuten bij een spanning van 110 V.
- Beeld de onder toepassing van een gel beeldvormingssysteem with excitatie en emissie filters bij 488 nm en 500-550 nm.
- Beoordelen van de deeltjesgrootte en verdeling door dynamische lichtverstrooiing (DLS) door verdunning van de DIO-LCNP-oplossing (~ 200-voudige verdunning) in PBS (pH ~ 8, 0.1x) en het meten op een DLS-instrument 14. Meet de zeta-potentiaal van de DIO-LCNPs met een geschikt zetapotentiaal meetinstrument.
3. Voorbereiding van Cultuur van de Cel Gerechten voor Delivery Experimenten en Imaging
OPMERKING: dio-LCNP labeling uitgevoerd op HEK 293T / 17 humane embryonale niercellen (passages tussen 5 en 15) die zijn gekweekt zoals eerder beschreven 4. Voer de levering experimenten en de daaropvolgende cell imaging zoals hieronder beschreven.
- Bereid 35 mm weefselkweekschalen (voorzien van 14 mm No. 1 dekglaasje inserts) door ze te coaten met bovine fibronectine (~ 100 pi bij een concentratie van 20 ug/ Ml) in DPBS gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Verwijder de fibronectine bekledingsoplossing uit de kweekschaal. Oogst HEK 293 T1 / 7 cellen van de T-25 kolf door eerst wassen van de monolaag met 3 ml DPBS en vervolgens door toevoeging van 2 ml trypsine-EDTA (0,5% trypsine-EDTA 0,25%).
- Incubeer de kolf bij 37 ° C gedurende 3 min ~. Verwijder de trypsine-EDTA en de terugkeer van de kolf naar de incubator. Zodra cellen losgemaakt van de fles, neutraliseren de trypsine door toevoeging van 4 ml compleet medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium, DMEM, gewijzigd in 10% foetaal runderserum, 5% natriumpyruvaat en 5% antibioticum / antimycoticum bevatten) aan de kolf . Bepaal de cel concentratie in de opschorting door ze te tellen in een cel teller.
- Stel de celconcentratie te ~ 8 x 10 4 cellen / ml met groeimedium. Voeg 3 ml van de celsuspensie om de schotel en cultuur in de incubator 's nachts; De volgende dag zou de cellen bij ~ 70% confluentie en gebruiksklaar moet zijn. voldoendeceldichtheid is essentieel voor robuuste en efficiënte labeling van een hoog percentage cellen.
4. Cellular Levering van DIO en DIO-LCNPs en beeldvorming van gefixeerde cellen
- Bereid 1 ml oplossingen van DIO, DIO-LCNP en DIO-LCNP-PEG-Chol in de levering medium (HEPES-DMEM; DMEM dat 25 mM HEPES) door het verdunnen van voorraad oplossingen van Dio gratis en DIO-LCNPs; gepaste dio concentraties voor incubatie op cellen zullen ~ 1-10 urn (uitgedrukt als hetzij de van Dio gratis of DIO in de vorm van DIO-LCNP) zijn.
- Verwijder het groeimedium uit de kweekschalen onder toepassing van een serologische pipet en was de cel monolagen (zie stap 3) tweemaal met DMEM-HEPES (2 ml elke was). Voer de afwassen door voorzichtig toevoegen en verwijderen HEPES-DMEM met een pipet van / naar de rand van de schotels.
- Voeg 0,2 ml van de bereide DIO vrije of DIO-LCNP bezorgoplossingen naar het midden van de kweekschalen en terugkeer van de schalen in de incubator voor een passende periode (meestal 15 of 30 minuten, afhankelijk van de behoeften van het experiment). Langere incubatietijden toe te voegen aan meer niet-specifieke cellulaire etikettering van niet-membraneuze gebieden (bijvoorbeeld cytosol).
- Na de incubatieperiode, verwijdert u de oplossingen met behulp van een serologische pipet. Was de celmonolagen twee keer met DPBS (2 ml per wasbeurt). Voer de afwassen door voorzichtig toevoegen en verwijderen DPBS / naar de rand van de schaal.
- Bevestig de celmonolagen middels 4% paraformaldehyde (bereid in DPBS) gedurende 15 min bij kamertemperatuur.
LET OP: Paraformaldehyde is ontvlambaar, een respiratoire irriterende en een verdacht carcinogeen. - Verwijder de paraformaldehyde oplossing met een pipet en voorzichtig was de cellen 1 uur met DPBS (2 ml) door het toevoegen en verwijderen DPBS gebruiken pipet / naar de rand van de schotels.
- De gefixeerde cellen gereed zijn afgebeeld op de aanwezigheid van een vliezige fluorescentiesignaal met behulp van confocale laser scanningmicroscopie (CLSM). Voer de beeldvorming direct of alternatief vervangen medium met DPBS met 0,05% NaN3 en bewaar de schaaltjes 4 ° C.
LET OP: NaN3 is giftig; uitoefenen uiterste voorzichtigheid bij het gebruik van NaN3.
OPMERKING: Vaste monsters in deze wijze moet worden afgebeeld binnen 48 uur voor een optimaal resultaat.
5. Cellulaire Levering van DIO en DIO-LCNPs en FRET Imaging in levende cellen
NB: Bij deze methode worden cellen colabeled met 6 uM elk DIO-LCNP-PEG-Chol (waar DIO is een FRET donor) en 1,1-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DII gratis, waarbij Dii is een FRET acceptor). De release van DIO van DIO-LCNP-PEG-Chol en de opname in het plasmamembraan wordt bevestigd door een waargenomen toename van de energie-overdracht van de DIO donor naar de DII acceptor.
- Label cellen achtereenvolgens met DIO-LCNP-PEG-Chol en Dil-free toepassing van de werkwijze in stap 4 beschreven.
- Na het kleuren was de cellen 1 uur met DPBS (2 ml) met behulp van een serologische pipet en vervang de wasbuffer met 2 ml live cell imaging oplossing (LCIS).
- Op een microscoop podium met een verwarmd incubatiekamer, het live celmonster met een confocale microscoop (60X objectief) met een FRET beeldvorming configuratie intervallen van 30 min in een 4 uur periode met spannende DIO donor bij 488 nm en verzamelen volledige emissie spectra van zowel de donor als de DIO Dil acceptor 490-700 nm met een 32-kanaals spectrale detector.
- LET OP: Voor meer informatie over FRET beeldvorming, zie referentie 15.
- Bepaal de tijdsopgeloste emissie-intensiteit van zowel de DIO donor en acceptor Dil uit cellen gekleurd met DIO-LCNP-PEG-Chol en Dii. Bereken de tijdsopgeloste acceptor / donor FRET-ratio (DII EMI / DIO EMI) voor de beelden, die gestaag zal toenemen en uiteindelijk plaatau zodra de hoeveelheid dio donor verdeeld in het membraan heeft een maximum 16 bereiken.
6. cytotoxiciteit Assay van DIO en DIO-LCNPs aan de HEK 293T / 17 Cells
LET OP: De cytotoxiciteit van de DIO-LCNP materialen wordt beoordeeld aan de hand van een tetrazolium kleurstof gebaseerde proliferatie assay 17. Cellen worden gekweekt in een plaat met meerdere putjes in aanwezigheid van variërende concentraties van de stoffen onder omstandigheden die levering / labeling emuleren. De cellen worden vervolgens gekweekt gedurende 72 uur om voor proliferatie. Een kleurstof (MTS (3- (4,5-dimethyl-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyfenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) toegevoegd aan de putjes en metabolisch actief cellen zetten de kleurstof in een blauw formazan product. de hoeveelheid kleurvorming is recht evenredig met het aantal levensvatbare cellen.
- Oogst HEK 293 T1 / 7 cellen van de T-25 kolf door de procedure beschreven in stap 3.2.SeedHEK 293T / 17-cellen (5000 cellen / 100 pl / putje) aan de putjes van een 96-well weefselkweek behandelde plaat en kweek gedurende 24 uur.
- Volledig verwijderen van het kweekmedium uit de putjes met behulp van een micropipet en voeg 50 ul van HEPES-DMEM met Dio gratis, DIO-LCNPs of DIO-LCNP-PEG-Chol bij toenemende concentraties aan putjes te repliceren. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
LET OP: Typisch, repliceert gedaan in drievoud of viervoud voldoende zijn om statistisch betrouwbare gegevens opleveren.- Na incubatie, verwijdert u de medium dat het materiaal met behulp van een micropipet en vervangen door 100 ui groeimedium. Kweken van de cellen gedurende 72 uur.
- Voeg 20 ul van de tetrazolium substraat aan elk putje, de plaat terug in de incubator en laat kleurvorming verlopen bij 37 ° C gedurende 4 uur. Lees de absorptie (ABS) van de formazan product bij 570 nm (absorptie minima voor de DIO-LCNPs gebruikt in deze study) en 650 nm (voor het aftrekken van niet-specifieke achtergrond absorptie) met behulp van een microtiterplaat reader.
- Zet de differentiële absorptiewaarde (abs 570 - abs 650) versus de concentratie materiaal en de resultaten als percentage van de controle celproliferatie (mate van proliferatie van cellen in alleen celkweekmedium).
7. Data Analysis
- Statistisch analyseren van de gegevens met een univariate variantie-analyse (ANOVA). Voor meerdere vergelijkingen, gelden post hoc-test van de Bonferroni's. Helpen gemiddelde waarden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) tenzij anders vermeld.
OPMERKING: De aanvaardbare kans op significantie was p <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCNPs werden bereid, waarbij de hydrofobe kern van de NP werd geladen met een representatieve membraan labeling sonde naar de bruikbaarheid van de LCNP tonen als efficiënte transportmiddel voor hydrofobe ladingen. Daartoe gekozen lading was zeer goed in water oplosbaar membraan potentiometrische-labeling kleurstof, dio. DIO-loaded LCNPs (DIO-LCNPs) werden gesynthetiseerd met behulp van een tweefasige mini-emulsietechniek met de chemische componenten DACTP11, AC10COONa en DIO, zoals weergegeven in figuur 1 18. In dit systeem NP, de covalent gebonden polymeer netwerk van de kristallijne verknopingsmiddel DACTP11 een stabiele hydrofobe kern waar de DIO bevindt in de interstitiële ruimtes in het verknoopte netwerk. De carboxylaatgroepen op de NP oppervlak colloïdale stabiliteit aan de deeltjes in waterige media zorgt bovendien een functionele groep "handvat" voor de hechting van celgericht liganden(En andere biologische). De DIO-LCNPs de plasmamembraan tether werd een met amine beëindigd gePEGyleerde cholesterol groep (PEG-Chol) covalent aan het oppervlak via LCNP EDC koppeling (figuur 1). Na NP synthese en de bevestiging van succesvolle bioconjugatie, het vermogen van de DIO-LCNPs het plasmamembraan van levende cellen label en de ingebedde DIO lading leveren aan het lipofiele gedeelte van het plasmamembraan dubbellaag met verbeterde specificiteit en kinetiek vergeleken met de vrije formulier (DIO gratis) verlost van bulk-oplossing werd beoordeeld.
Zoals getoond in figuur 2 A, dio vrij (6,0 uM) krachtig gekleurd het plasmamembraan met een hoge efficiëntie (bijna 100% van de cellen gemerkt) na 15 min incubatie met HEK 293T / 17 cellen. Echter, significante cellulaire internalisatie van Dio vrije werd waargenomen na slechts een bescheiden toename van deincubatietijd 30 minuten (Figuur 2 A en C). De mate van DIO vrije internalisatie werd bepaald door tijdsopgeloste colocalization experimenten waarbij cellen eerst geïncubeerd met 6,0 uM dio vrij (30 min). DIO vrije bevattend incubatiemedium werd vervolgens verwijderd en de cellen werden vervolgens gekweekt gedurende maximaal 4 uur. De plasma membranen van de cellen tegengekleurd met een kleurstof gemerkte fosfolipide membraan (fosfo geconjugeerd aan Rhodamine B, PE-Rhoda). Zoals getoond in figuur 2 C, na 15 min incubatie, bijna 100% van Dio vrije colocalized werd de PE-Rhoda marker (Pearson's colocalization coëfficiënt; PCC = 0,99 ± 0,01). Echter, na 30 min incubatie ~ 80% DIO vrij bleef gebonden aan het membraan (~ 20% geïnternaliseerd). De mate van Dio gratis internalisatie gestaag toegenomen als the incubatietijd verlengd zolang 4 uur en dit werd weerspiegeld in de gelijktijdige verlaging van de PCC tussen DIO en Rhoda-PE (figuur 2 C). Een fit van de gegevens in één fase exponentiële verval vergelijking bleek dat de DIO vrije internalisatie bereikt een maximum van ~ 50% in 1 uur, met een percentage internalisatie (k = 0,045 min -1) en halfwaardetijd (15 min) dat het gevolg van de snelle en efficiënte cellulaire opname van Dio gratis. Deze gegevens tonen de snelle tijdsafhankelijke overgang Dio vrij van het plasmamembraan naar het cytosol waar het grotendeels uit de kern via 4 uur tijd onderzocht bleef uitgesloten.
Gezien de ongecontroleerde cellulaire opname van Dio gratis, het doel werd om dit gedrag te moduleren door het leveren van Dio als een LCNP-PEG-Chol NP formulering. Wanneer geleverd als LCNP-PEG-Chol bioconjugaat, een persistente membraan residlingen de tijd van de DIO ten opzichte van Dio gratis werd opgemerkt (figuur 2 B). Na 15 min incubatie van het DIO-LCNP-PEG-Chol met de cellen bijna 100% van de dio signaal werd bij het plasmamembraan, waar het colocalized de PE-Rhoda membraan marker, een resultaat dat vergelijkbaar was dat waargenomen voor Dio gratis. Opgemerkt werd echter, dat hoewel de DIO etiketteer- van het membraan was vrij uniform en aangrenzend het kleuringspatroon van de DIO-LCNP-PEG-Chol na 15 min incubatie was punctata en niet zo uniform karakter (fig 2 B). Dit resultaat gaf aan dat de DIO-LCNP-PEG-Chol NP's verzamelden in discrete regio's binnen het plasmamembraan. Wanneer de incubatietijd werd verhoogd tot 30 min, ~ 94% van de dio signaal bleef op het membraan (tegenover ~ 80% Dio bij ditzelfde tijdstip) (Fig 2 B en 2C). Deze tendens werd nog toenemen wanneer de cellen werden gekweekt met de DIO-LCNP-PEG-Chol NP voor steeds langere tijden na de eerste 30 minuten incubatie. Bijvoorbeeld, na het kweken gedurende 1 uur na de eerste incubatie, bijna 80% van de DIO-LCNP-PEG-Chol NP signaal bleef membraneuze en colocalized de PE-Rhoda marker (tegenover ~ 55% voor Dio gratis). Met name de cellulaire internalisatie van het DIO-LCNP-PEG-Chol NP bereikt een maximum van 30% bij 2 uur (70% retentie membraan). Dit komt overeen met een mobiele opnamesnelheid (k = 0,024 min -1, halfwaardetijd = 29 min) dat precies de helft van die waargenomen bij de internalisatie van dio vrij.
Vervolgens werd het vermogen van de NP-ingebedde Dio lading efficiënt uitstromen uit de LCNP kern en voer het lipofiele milieu van de plasmamembraan bilaag in een gecontroleerde en tijdsafhankelijke wijze bepaald. Totdit te beoordelen, werd een FRET-based strategie bedacht waarbij de DIO fungeert als een FRET donor die zich bezighouden met energie-overdracht naar de acceptor kleurstof, DII. Zoals verwacht, bij eerste labeling (t = 0 min), werd het emissiesignaal gedomineerd door de DIO donor opgenomen in het membraan-gebonden NP (figuur 3 B). FRET beeldvorming van dit zelfde gebied 4 uur later (t = 240 min), maar onthulde een aanzienlijke toename van het emissiesignaal van de Dil acceptor, sterke aanwijzingen van de overgang van de DIO donor van de LCNP kern in de plasmamembraan dubbellaag (figuur 3 C). Onderzoek van de tijdsopgeloste karakter van deze overgang vertoonden een gestage afname dio donor emissie in combinatie met een overeenkomstige toename van Dil acceptor emissie via 4 hr experimentele (Figuur 3 D). Met name de FRET-efficiëntie tijdens deze overgang bereikte zijn maximum bij ~ 180 min postinitieel labeling, wat suggereert dat de uitstroom en het membraan opdeling van de DIO donor zijn maximum op dit tijdstip (figuur 3 E) had bereikt. Deze gegevens levert sterke bewijs van de tijdsopgeloste afscherming van de DIO uit de NP aan het plasmamembraan dubbellaag dat het maximale ~ 3 uur postinitieel labeling met de DIO-LCNP-PEG-Chol NP bereikt.
Tenslotte werd de vergelijkende cytotoxiciteit analyse uitgevoerd voor Dio gratis versus DIO-LCNP-PEG-Chol. Geïncubeerd met HEK 293T / 17-cellen (in een concentratie van Dio 6 uM in beide gevallen), was het duidelijk dat de inkapseling van DIO binnen de kern LCNP verzwakt de cytotoxiciteit. Terwijl Dio gratis uitgelokt cellulaire levensvatbaarheid van ~ 50%, de cellen geïncubeerd met DIO-LCNP-PEG-Chol tentoongesteld cellulaire levensvatbaarheid ~ 90%. (Figuur 4). Cumulatief, de cel labeling gegevens in combinatie met de cellulaire toxistad gegevens tonen aan verbeteringen in zowel de efficiëntie van DIO-membraanfilters op de etikettering en de modulatie van de cytotoxiciteit van Dio.
Figuur 1: Schematische weergave van membraan-bindend DIO-LCNP-PEG-Chol. Dio-LCNP bestaat uit een acrylaat vloeibaar kristal verknopingsmiddel (DACTP11); een carboxyl beëindigde polymeriseerbaar oppervlakteactief middel (AC10COONa); en een lipofiele kleurstof, Dio. -Cholesterol beëindigd poly (ethyleenglycol) (PEG-Chol) werd geconjugeerd aan DIO-LCNP via EDC koppeling. Toevoeging van Chol de DIO-LCNP oppervlak medieert preferentiële binding van het NP naar de plasmamembraan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Tijdopgeloste cellulaire opname van Dio gratis in HEK 293 T / 17-cellen. DIO gratis (6,0 uM, paneel (A) of DIO-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 uM, paneel (B) werd geïncubeerd op celmonolagen gedurende 15 minuten, verwijderd en vervangen door groeimedium, werden de cellen gekweekt gedurende de aangegeven (maximaal 4 uur). de cellen tijden werden vervolgens gekleurd met PE-Rhoda (2,0 uM) en gefixeerd. de monsters werden afgebeeld Dio (groen) en membraangebonden PE-Rhoda (rood) via CLSM. ( C) Tijdopgeloste grafiek van het percentage membraangebonden DIO vrij of DIO-LCNP-PEG-Chol als een functie van toenemende incubatietijd. de gegevens werden verkregen uit de Pearson's colocalization coëfficiënt (PCC, n = 3 & #177; standaarddeviatie) van de groene (DIO) en rode (PE-Rhoda) kanalen, en wordt uitgedrukt als een percentage (± SEM) na normalisatie naar de PCC overeenkomt met 15 minuten incubatie. Schaal bar = 20 micrometer. Met toestemming overgenomen uit referentie 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Tijdsgeresolveerde FRET bevestigt de efflux van DIO van DIO-LCNP-PEG-Chol naar de plasmamembraan. HEK293T / 17-cellen werden costained met DIO-LCNP-PEG-Chol en Dil, waar de DIO (groen emitting) en Dil (rood emitterende) kleurstoffen fungeren als FRET donor en acceptor, respectievelijk. (A) DIC beeld van de levende cellen costained met DIO-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 uM) en DII (6,0 pm). de svoldoende is afgebeeld om de verandering in FRET signaal over de periode van 4 uur volgen. (B) en (C) de FRET beelden van de levende cellen in hetzelfde brandvlak bij t = 0 min en t = 240 min, respectievelijk. (D) De genormaliseerde, tijdsopgeloste emissie-intensiteit van de DIO donor en acceptor Dil uit cellen gekleurd met DIO-LCNP-PEG-Chol en DII en afgebeeld in FRET excitatie-modus. (E) Tijdopgeloste FRET-ratio (DII EMI / DIO EMI) voor de cellen gemerkt met DIO-LCNP-PEG-Chol en DII en afgebeeld in FRET configuratie. Schaal bar = 20 micrometer. Met toestemming overgenomen uit referentie 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
figuur 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een voortdurende doel van NMDD is de gecontroleerde targeting en afgifte van geneesmiddel formuleringen aan cellen en weefsels, in combinatie met gelijktijdige verbeterde werkzaamheid van het geneesmiddel. Een specifieke klasse van geneesmiddel moleculen, en is een belangrijke uitdaging gesteld hydrofoob drugs / beeldvormingsmiddelen die slecht tot geen oplosbaarheid in waterige media. Dit probleem heeft de overgang van krachtige geneesmiddelen geplaagd uit in vitro celkweek systemen om de klinische setting en heeft geresulteerd in een aantal veelbelovende geneesmiddelmoleculen zijn "plank" of achtergelaten en niet in de klinische setting verder gezet. Wortmannin (Wtmn), bijvoorbeeld, is een krachtige remmer van fosfatidylinositol 3 'kinases en fosfatidylinositol 3'-kinase-verwante kinasen en heeft een groot potentieel als antikankermiddel, maar het gebrek aan oplosbaarheid in water heeft de progressie belemmerd in klinische studies.
Recentelijk Karve et al. vertoonden verbeterde water solubility van Wtmn wanneer geformuleerd als een lipide-polymeer NP samenstel 19. Een arena die sterk kunnen profiteren van dit type verbeterde, gecontroleerde aflevering als NP formulering de afgifte van hydrofobe geneesmiddelen en beeldvormende middelen aan het plasmamembraan. Zo is het doel hier was om deze technische hindernis te pakken en naar een methodologie om deze technologische hindernis te overwinnen ontwikkelen.
Bij het ontwikkelen van deze methodiek, een model membraan-targeting kleurstof, Dio, werd geselecteerd die in het verleden al heeft geteisterd door een slechte oplosbaarheid in waterige media. Dit zorgt voor aanzienlijke uitdagingen in de specifieke afgifte van de kleurstof naar de plasmamembraan. Onder deze uitdagingen zijn de noodzaak om de kristallijne vorm van de kleurstof direct in cellen of weefsels 10 cellen toevoegen of incuberen met zeer hoge concentraties dio na verdunning van voorraadoplossingen oplosmiddelen zoals DMSO 11, 12.De aanpak hier was tweeledig: 1) op te nemen DIO in de hydrofobe kern van LCNPs tijdens NP synthese en 2) covalent de als zodanig gesynthetiseerde DIO-LCNPs met een gePEGyleerde cholesterol conjugaat (DIO-LCNP-PEG-Chol wijzigen) te vergemakkelijken de directe interactie van de DIO-geladen NP met het plasmamembraan. Inderdaad, deze benadering effectief verbeterd aantal aspecten van de levering van DIO naar de plasmamembraan.
Eerst werd de membraan verblijftijd van Dio effectief verdubbeld wanneer geleverd als LCNP formulering dan wanneer DIO vrij van bulkoplossing werd opgeleverd. Deze uitgebreide membraan verblijftijd werd toegeschreven aan de lokalisatie van DIO-LCNP-PEG-conjugaten Chol aan de lipide raft microdomeinen van het plasmamembraan, zoals bevestigd door co-kleuring experimenten. Ten tweede, de verdeling van de DIO lading in de lipide bilaag werd bevestigd door FRET experimenten waarbij de DIO diende als de donor aan een membraan-resident Dii acceptor. Tenslotte delangzame, langdurige afgifte van de DIO lading in het membraan bilaag doeltreffend verzwakt de cytotoxiciteit van DIO met ~ 40%.
Het is belangrijk om een aantal punten in het protocol die essentieel zijn voor succes markeren. Ten eerste moet het percentage belading van de DIO in de LCNP kern empirisch worden geoptimaliseerd proces synthese loopt naar een evenwicht tussen de generatie van high-kwaliteit DIO-LCNP-PEG-Chol NPS en het gewenste niveau van fluorescentie-signaal in cellulaire levering experimenten te verkrijgen . Tevens dient de bioconjugatie van de Chol-PEG-NH2 groep aan de DIO-LCNP oppervlak worden geoptimaliseerd om de gewenste cellulaire labeling verkrijgen. Tenslotte wordt het aantal cellen toegepast op de met fibronectine gecoate kweekschalen is cruciaal voor het succes en voorzichtigheid is geboden om de cellen zaad met een dichtheid van ~ 8 x 10 4 cellen / ml (~ 2,4 x 10 5 cellen per schaal) . Wanneer de cellen te dun zijn gezaaid, het resulteert in inefficiënt membraan labeling, terwijl het zaaien van de ceLLS te dicht resultaten in de verwerving van een slechte foto's die niet duidelijk doen zien membraneuze labeling.
Een mogelijke beperking van de zoals beschreven protocol is dat de efficiëntie van opname van verschillende andere membraan gericht kleurstoffen en drugs zullen variëren afhankelijk van de hydrofobiciteit van de kleurstof / drug lading. In deze gevallen zal de LCNP syntheseprotocol moet empirisch worden getest om de optimale condities voor synthese ideale kleurstof / geneesmiddel lading opname bepalen.
Samenvattend is een werkwijze ontwikkeld voor de LCNP gevestigde gereguleerde afgifte van een hydrofobe kleurstof lading naar de plasmamembraan van levende cellen dat veel van de technische uitdagingen in verband met de cellulaire afgifte van wateronoplosbare ladingen overwint. De algemene betekenis van de methode is dat duidelijk verbetert de specifieke afgifte van vracht naar de plasmamembraan tegelijkertijd verzachtende gelijktijdig cytotoxiciteit die associated met de levering van hydrofobe lading bij hoge concentraties van bulkoplossing. Deze aanpak dient ruim nut vinden in de levering van eveneens uitdagende hydrofobe kleurstof / beeldvormingsmiddel ladingen en zal waarschijnlijk bijdragen aan de overgang van effectieve vergemakkelijken, maar slecht in water oplosbare, ladingen van het experimentele regime de klinische setting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de NRL Base Funding Program (Work Unit MA041-06-41-4943). ON wordt ondersteund door een National Research Council postdoctoraal onderzoek associateship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
