Summary
Eine Flüssigkristall-Nanopartikel (LCNP) Nanotransporter wird als Träger für die kontrollierte Abgabe eines hydrophoben Ladung an die Plasmamembran lebender Zellen ausgenutzt.
Abstract
Die kontrollierte Abgabe von Arzneimittel / Abbildungsmittel für Zellen ist entscheidend für die Entwicklung von Therapeutika und für die Untersuchung von zellulären Signalprozessen. Vor kurzem Nanopartikel (NPs) sehr vielversprechend sind in der Entwicklung solcher Abgabesysteme gezeigt. Hierbei wird ein Flüssigkristall NP (LCNP) basierende Verabreichungssystem wurde für die kontrollierte Abgabe eines wasserunlöslichen Farbstoff eingesetzt, 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO), von innerhalb des NP Kern zu den hydrophoben Bereich eines Plasma Membran-Doppelschicht. Während der Synthese der NPs wurde der Farbstoff effizient in den hydrophoben Kern LCNP eingebaut, wie bestätigt durch mehrere spektroskopische Analysen. Konjugation eines PEGylierten Cholesterinderivat zur NP Oberfläche (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktiviert die Bindung der farbstoffbeladenen NPs an die Plasmamembran in HEK 293T / 17-Zellen. Zeitaufgelöste Laser-Scanning-konfokale Mikroskopie und Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) Bildgebung bestätigte den Passive Efflux von DiO vom LCNP Kern und seine Insertion in die Plasmamembran-Doppelschicht. Schließlich abgeschwächt die Lieferung der OVI als LCNP-PEG-Chol die Zytotoxizität von DiO; die NP Form Dio ausgestellt ~ 30-40% geringere Toxizität im Vergleich zu DiO frei von Massenlösung geliefert. Dieser Ansatz zeigt die Nützlichkeit der LCNP Plattform als effiziente Modalität für die membranspezifische Abgabe und Modulation der hydrophoben Molekül cargos.
Introduction
Seit dem Aufkommen der Schnittstelle Nanomaterialien (Materialien ≤100 nm in mindestens einer Dimension) mit lebenden Zellen, ein kontinuierliches Ziel wurde für verschiedene Anwendungen Vorteile der einzigartigen größenabhängigen Eigenschaften von Nanopartikeln (NPs) zu nehmen. Diese Anwendungen umfassen die Zell- und Gewebemarkierungs / imaging (sowohl in vitro als auch in vivo), Echtzeiterfassung, und die gesteuerte Abgabe von Arzneimitteln und anderen cargos 1. Beispiele für solche relevanten NP Eigenschaften umfassen die größenabhängige Emission von Halbleiter-Nanokristallen (Quantum Dots, QD); die Eigenschaften Lichtwärmeumsetzmaterial von Gold-Nanopartikeln; die große Ladekapazität des wässrigen Kern von Liposomen; und die ballistische Leitfähigkeit von Kohlenstoffallotrope, wie einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren und Graphen.
In jüngerer Zeit hat großes Interesse an der Verwendung von NPs für die kontrollierte Modulation von Arzneimitteln und anderen Frachten, wie Kontrast / Abbildungs a entstandenHerren. Hier ist das Grundprinzip deutlich zu verbessern / optimieren den gesamten Löslichkeit abgegebenen Dosis, Kreislaufzeit und eventuelle Clearance des Arzneimittels Ladung durch sie als NP-Formulierung zu liefern. Dies hat sich als NP-vermittelte Arzneimittelabgabe bekannt sein (NMDD), und es gibt derzeit sieben FDA-zugelassenen NP Arzneimittel-Formulierungen für den Einsatz in der Klinik verschiedene Krebsarten und Hunderte mehr in verschiedenen Phasen der klinischen Studien zu behandeln. Im Wesentlichen ist es das Ziel, "mehr mit weniger zu erreichen;" Das heißt, das NP als Gerüst zu verwenden , um mehr Medikament mit weniger Dosierungs Verabreichungen liefern durch Ausnutzung der großen Oberflächenbereich einnehmen: Volumen (beispielsweise harte Partikel, wie QD und Metalloxiden) von NPs oder deren großen Innenvolumen zum Beladen große Fracht Nutzlasten (zB Liposomen oder Mizellen). Der Zweck ist hier die Notwendigkeit für mehrere systemisch zugeDosierungsSchemata zu reduzieren, während gleichzeitig die wässrige Stabilität und eine verbesserte Durchblutung fördern, insbesondere füranspruchsvolle hydrophobe Arzneimittel cargos, die zwar hochwirksam, in wässrigen Medien schwer löslich sind.
Somit war das Ziel der hierin beschriebene Arbeit, die Lebensfähigkeit der Verwendung eines neuen NP-Gerüst für die spezifische und gesteuerte Abgabe von hydrophoben cargos dem lipophilen Plasmamembran-Doppelschicht zu bestimmen. Die Motivation für die Arbeit war die inhärente begrenzte Löslichkeit und die Schwierigkeit bei der Bereitstellung von hydrophoben Molekülen an Zellen aus wäßrigen Medien. Typischerweise erfordert die Lieferung solcher hydrophoben Molekülen die Verwendung von organischen Lösungsmitteln (beispielsweise DMSO) oder amphiphile Tenside (beispielsweise Poloxamere), die 2 oder Mizelle Träger toxischen und Kompromisse Zell- und Gewebelebensfähigkeit sein kann, die interne Belastung begrenzt haben kann Kapazitäten. Der NP Träger ausgewählt hier war eine neue Flüssigkristall NP (LCNP) Formulierung zuvor 3 entwickelt und dass zuvor eine ~ 40-fache zu erreichen gezeigt worden war Verbesserung der Wirksamkeit des Antikrebsmedikament Doxorubicin in kultivierten Zellen 4.
In der hier beschriebenen Arbeiten wählte die repräsentative Ladung war die potentiometrischen Membranfarbstoff, 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO). DiO ist ein wasserunlöslicher Farbstoff, der für die anterograde und retrograden Tracing in lebenden und fixierten Neuronen, Membranpotentialmessungen verwendet wurde und für die allgemeine Kennzeichnung Membran 5, 6, 7, 8, 9. Aufgrund seiner hydrophoben Natur ist DiO typischerweise direkt zu Zellmonolayern oder Geweben in einer kristallinen Form 10, oder es wird in sehr hohen Konzentrationen inkubiert (~ 1-20 uM) nach Verdünnung von einer Konzentration Stammlösung 11, 12.
content "> Hierbei ist die Vorgehensweise war die Verwendung zur LCNP Plattform, ein multifunktionales NP, dessen innere Kern vollständig hydrophob ist und deren Oberfläche gleichzeitig hydrophile und zugänglich Biokonjugation, als Abgabevehikel für DiO. DiO in die LCNP Kern während der Synthese eingearbeitet und die NP Oberfläche dann mit einem PEGylierten Cholesterin-Einheit zu fördern, um die Bindung an die Membran der OVI-LCNP Ensemble an der Plasmamembran. Dieser Ansatz führte zu einem Abgabesystem, das partitioniert Dio in die Plasmamembran mit größerer Treue und Membran Residenz funktionalisiert ist Zeit als die freie Form von DiO von Massenlösung geliefert (DIO frei). Ferner ist dieses Verfahren zeigte , dass die LCNP-vermittelte Abgabe von DiO moduliert wesentlich und treibt die Rate der spezifischen Unterteilung des Farbstoffes in die lipophile Plasmamembran bilayer. Dies ist erreicht, während gleichzeitig die Zytotoxizität des freien Arzneimittels von ~ 40% zu reduzieren, indem es als LCNP Formulierung zu liefern.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung der OVI-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol
- Auflösen flüssigkristallines Diacrylat-Vernetzungsmittel (DACTP11, 45 mg), 3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin Perchlorat (DIO, 2 mg) und einem Radikalinitiator (Azobisisobutyronitril, 1 mg) für die Polymerisation in 2 ml Chloroform gegeben. Fügen diese zu einer wässrigen Lösung von Acrylat-funktionalisierten Tensids (AC10COONa, 13 mg in 7 ml).
- Rühre das Gemisch 1 h und beschallen bei 80% Amplitude für 5 min, um eine Miniemulsion herzustellen, das aus kleinen Tröpfchen des organischen Materials von polymerisierbarem Tensid in Wasser umgeben.
- Das Gemisch wird auf 64 ° C in einem Ölbad zu initiieren die Polymerisation sowohl des Vernetzungsmittels und des Tensids, wie das Chloroform langsam verdampft, so dass eine DiO enthaltenden NP Suspension, die durch das oberflächenaktive Mittel stabilisiert ist.
- Filtern Sie die NP-Suspension (3 mal) durch einen 0,2 & mgr; m Spritzenfilter auf jede Aggregation zu entfernen. Store der gefilterten NP-Lösung bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Konjugation von PEG-Chol Dio-LCNP über EDC - Kopplung.
- Auflösen Chol-PEG-NH 2 · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) in 25 mM HEPES - Puffer (pH 7,0).
- Bereiten einer Arbeitslösung , enthaltend N -hydroxy-sulfosuccinimide Natriumsalz (NHSS, 40 mM) und 1-Ethyl-3- (3- (dimethylamino) -propyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC, 400 mM) in HEPES - Puffer aus konzentrierten Stammlösungen.
- Sofort im 20 ul der frisch hergestellten Arbeitslösung von NHSS / EDC bis 1,0 ml der OVI-LCNP in HEPES-Puffer und rühre 5 min.
- In 20 ul Stammlösung von Chol-PEG-NH 2 · HCl zu dieser Mischung und rühre 2 Stunden.
- Zentrifuge kurz die Reaktionsmischung bei maximaler Geschwindigkeit (~ 2.000 × g) für 30 sec eine Tischplatte Mini - Zentrifuge und übergeben Sie den Überstand durch eine PD-10 Grßenausschlußchromatographie Säule 13 ins Gleichgewicht gebracht mitDulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS, 0,1x).
2. Charakterisierung der OVI-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol
- Bestätigen Sie die erfolgreiche kovalente Konjugation von PEG-Chol zu DIO-LCNP Oberfläche durch Gelelektrophorese.
- Man löst 0,5 g Agarose in 50 ml (1x) Tris-Borat-Elektrophorese (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM Borsäure und 2 mM EDTA) -Puffer. Die Lösung wird in einem Mikrowellenofen, um die Agarose aufzulösen. Lassen Sie die Lösung leicht abkühlen, und der Inhalt in eine Gelplatte in die Elektrophorese-Box gießen. Legen Sie eine Gelkamm zu Probenschächten erstellen.
- Sobald das Gel erstarrt ist, fügen die erforderliche Menge (genug, um das Gel in die Kammer unterzutauchen) von TBE-Laufpuffer in die Kammer.
- Mit 35 ul DiO-LCNP Probe (amended mit Glycerin, 5% v / v) in die Vertiefungen des Gels und bei einer Spannung von 110 V. 20 min laufen
- Bild das Gel ein Gel Imaging-System wi mitth Anregungs- und Emissionsfilter bei 488 nm und 500-550 nm.
- Beurteilen Sie Partikelgröße und -verteilung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) von Dio-LCNP Lösung verdünnt (~ 200-fache Verdünnung) in PBS (pH ~ 8, 0,1x) und Messen auf einem DLS Instrument 14. Messen Sie die Zeta-Potential der OVI-LCNPs ein entsprechendes Zeta-Potential Messinstrument.
3. Herstellung von Zellkulturschalen für Lieferung Experimente und Imaging
HINWEIS: DIO LCNP Kennzeichnung auf HEK 293T / 17 menschliche embryonale Nierenzellen (zwischen den Kanälen 5 und 15) durchgeführt wird , die kultiviert werden , wie zuvor 4 beschrieben. Führen Sie die Lieferung Experimente und die nachfolgende Zelle Bildgebung wie unten beschrieben.
- Vorbereitung 35 mm Durchmesser-Gewebekulturschalen (ausgestattet mit 14 mm No. 1 Abdeckglas Einsätze), indem sie mit bovine Fibronectin Beschichtung (~ 100 & mgr; l bei einer Konzentration von 20 ug/ Ml) in DPBS 2 Stunden lang bei 37 ° C.
- Entfernen Sie die Fibronektin Beschichtungslösung von der Kulturschale. Ernte HEK 293 T1 / 7-Zellen aus dem T-25-Kolben, indem zuerst Waschen der Zellmonoschicht mit 3 ml DPBS und dann durch Zugabe von 2 ml Trypsin-EDTA (0,5% Trypsin-0,25% EDTA).
- Inkubieren der Kolben bei 37 ° C für ~ 3 min. Entfernen Sie die Trypsin-EDTA und kehren die Kolben in den Inkubator. Sobald Zellen vom Kolben abgelöst werden, Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von 4 ml vollständigem Medium (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM; geänderte 10% fötalem Rinderserum, 5% Natriumpyruvat enthielt, und 5% Antibiotikum / Antimykotikum) in den Kolben . Bestimmen Sie die Zellkonzentration in der Suspension, indem sie in einem Zellzähler gezählt.
- Stellen Sie die Zellkonzentration auf ~ 8 × 10 4 Zellen / ml mit Wachstumsmedium. 3 ml der Zellsuspension in die Schale und Kultur in den Inkubator über Nacht; Am nächsten Tag sollten die Zellen bei ~ 70% Konfluenz sein und sollten zur Verwendung bereit sein. AngemesseneZelldichte ist von entscheidender Bedeutung für eine robuste und effiziente Markierung von einem hohen Prozentsatz von Zellen.
4. Cellular Lieferung von DIO und DIO LCNPs und Bildgebung von fixierten Zellen
- Bereiten Sie 1 ml Lösungen Dio Dio-LCNP und DIO LCNP-PEG-Chol in Fördermedium (HEPES-DMEM; DMEM , das 25 mM HEPES) durch Verdünnen von Stammlösungen der OVI frei und DIO LCNPs; geeignete DiO Konzentrationen für die Inkubation auf Zellen werden ~ 1-10 uM (ausgedrückt als entweder die Konzentration der OVI frei oder Dio Form der OVI-LCNP).
- Entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den Kulturschalen eine serologische Pipette und die Zellmonolayern waschen (siehe Schritt 3) zweimal mit HEPES-DMEM (je 2 ml Wasch). Führen Sie die Waschungen durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von HEPES-DMEM eine Pipette zum / vom Rand der Speisen verwenden.
- In 0,2 ml der vorbereiteten DiO frei oder DIO LCNP - Delivery - Lösungen zum Zentrum der Kulturschalen und geben die Gerichte an die incubator für einen angemessenen Zeitraum (typischerweise 15 oder 30 min, je nach den Bedürfnissen des Experimentes). Längere Inkubationszeiten in den mehr unspezifische zelluläre Kennzeichnung von nicht-membranartige Bereiche (zB Cytosol).
- Nach der Inkubationszeit, entfernen Sie die Delivery-Lösungen eine serologische Pipette. Waschen Sie die Zellmonolayern zweimal mit DPBS (je 2 ml Wasch). Führen Sie die Waschungen durch leichtes Hinzufügen und Entfernen von DPBS zum / vom Rand der Schale.
- Fix die Zellmonolayern unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd (hergestellt in DPBS) für 15 min bei Raumtemperatur.
ACHTUNG: Paraformaldehyd ist brennbar, ein Atmungsreizmittel, und ein Verdacht, karzinogen. - Entfernen Sie die Paraformaldehydlösung mit einer Pipette und die Zellen vorsichtig 1-mal mit DPBS waschen (2 ml) durch Hinzufügen und Entfernen von DPBS zum / vom Rand der Gerichte mit Pipette.
- Die fixierten Zellen sind bereit für die Anwesenheit eines membranösen Fluoreszenzsignal unter Verwendung von konfokaler Laserscanning abgebildet werdenMikroskopie (CLSM). Führen Sie die Bild sofort oder alternativ, ersetzen Sie das Medium mit DPBS mit 0,05% NaN 3 und speichern Sie die Gerichte bei 4 ° C.
ACHTUNG: NaN 3 ist giftig; äußerste Vorsicht walten lassen, wenn man 3 NaN verwenden.
HINWEIS: Feste Proben auf diese Weise gelagert werden, sollten innerhalb von 48 Stunden für optimale Ergebnisse abgebildet werden.
5. Cellular Lieferung von DIO und DIO LCNPs und FRET-Imaging in lebenden Zellen
HINWEIS: In diesem Verfahren werden Zellen colabeled mit 6 & mgr; M jedes DiO-LCNP-PEG-Chol (wobei DiO ein FRET-Donor) und 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanin Perchlorat (DiI frei, wo Dil ist ein FRET - Akzeptor). Die Veröffentlichung der OVI von DiO-LCNP-PEG-Chol und dessen Einbau in die Plasmamembran wird durch eine beobachtete Zunahme der Energieübertragung von den DIO-Donor auf den Akzeptor Dil bestätigt.
- Label - Zellen nacheinander mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil free unter Verwendung der in Schritt beschriebenen Verfahren 4.
- Nach dem Färben Waschen Sie die Zellen 1 mal mit DPBS (2 ml) einer serologischen Pipette und der Waschpuffer mit 2 ml Live Cell Imaging-Lösung (LCIS) ersetzen.
- Auf einem Mikroskoptisch mit einem beheizten Inkubationskammer ausgestattet, Bild der Live-Zellprobe mit einem konfokalen Mikroskop (60x Objektiv) mit einem FRET-Imaging-Konfiguration in 30-Minuten-Intervallen über einen 4 Stunden-Zeitraum durch Anregung des DiO Spender bei 488 nm und das Sammeln volle Emission mit Spektren der beiden Dio Spender und Dil Akzeptor 490-700 nm mit einem 32-Kanal-spektral-Detektor.
- HINWEIS: Weitere Informationen über FRET - Imaging finden Sie unter 15 verweisen.
- Bestimmen Sie die zeitaufgelöste Emissionsintensität sowohl den DIO-Spender und Dil Akzeptor von Zellen gefärbt mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil. Berechnen Sie die zeitaufgelöste Akzeptor / Donor - FRET - Verhältnis (Dil emi / DiO EWI) für die Bilder, die stetig zunehmen wird und schließlich Platteau einmal die Menge der OVI Spender in die Membran unterteilt ist maximal 16 erreicht.
6. Zytotoxizitätstest von DIO und DIO LCNPs zu den HEK 293T / 17-Zellen
HINWEIS: Die Zytotoxizität der OVI-LCNP Materialien bewertet wird 17 einen Tetrazoliumfarbstoffs basierten Proliferationstest verwendet wird . Zellen werden in einer Mikrotiterplatte in Gegenwart von variierenden Konzentrationen der Materialien unter Bedingungen, die Lieferung / Kennzeichnung emulieren. Die Zellen werden dann für 72 Stunden kultiviert Proliferation zu ermöglichen. Ein Farbstoff (MTS (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) wird dann zu den Vertiefungen und metabolisch aktiv Zellen wandeln den Farbstoff in einem blauen Formazan Produkt. die Menge an Farbbildung auf die Anzahl der lebensfähigen Zellen direkt proportional ist.
- Ernte HEK 293 T1 / 7-Zellen aus dem T-25-Kolben durch das Verfahren beschrieben in Schritt folgenden 3.2.SeedHEK 293T / 17-Zellen (5000 Zellen / 100 ul / Vertiefung) zu den Vertiefungen einer 96-Well-Gewebekultur-behandelte Platte und die Kultur für 24 Std.
- Entfernen Sie vollständig die Kulturmedien aus den Vertiefungen mit einer Mikropipette und 50 ul HEPES-DMEM frei dio-LCNPs oder DiO-LCNP-PEG-Chol bei steigenden Konzentrationen Brunnen zu replizieren enthält DiO hinzuzufügen. Inkubieren auf die Zellen bei 37 ° C für 30 min.
HINWEIS: In der Regel Replikaten in dreifacher Ausfertigung oder vierfacher Ausfertigung durchgeführt sind ausreichend statistisch zuverlässige Daten zu erhalten.- Nach der Inkubation, entfernen Sie das Fördermedium die Materialien mit einer Mikropipette und ersetzen Sie es mit 100 ul Wachstumsmedium enthält. Kultur die Zellen für 72 Stunden.
- In 20 ul des Tetrazolium-Substrat in jede Vertiefung, kehren die Platte in den Inkubator und lassen die Farbbildung bei 37 ° C für 4 Stunden, um fortzufahren. Die optische Dichte (abs) des Formazanprodukts bei 570 nm (Absorptionsminima für die OVI-LCNPs in diesem stu verwendetdy) und 650 nm (für die Subtraktion der unspezifischen Hintergrundabsorption) eines Mikrotiterplatten-Lesegerät verwenden.
- Plotten des Differenzabsorptionswert (abs 570 - abs 650) gegenüber der Materialkonzentration und berichten die Ergebnisse als Prozent der Kontrolle der Zellproliferation (Grad der Proliferation von Zellen in Zellkulturmedium only).
7. Datenanalyse
- Statistisch gesehen, die Daten mit einer univariaten Varianzanalyse (ANOVA) analysiert werden. Für multiple Vergleiche gelten die post-hoc-Test nach Bonferroni. Geben Sie alle Mittelwerte als ± Standardabweichung vom Mittelwert (SEM), sofern nicht anders angegeben.
HINWEIS: Die akzeptable Wahrscheinlichkeit für Signifikanz war p <0,05.
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Representative Results
LCNPs wurden, in denen der hydrophobe Kern des NP, hergestellt mit einem repräsentativen membranMarkierungsSonde geladen wurde die Nützlichkeit des LCNP als effizientes Abgabevehikel für hydrophobe Frachten zu demonstrieren. Zu diesem Zweck gewählte Ladung war sehr wasserunlöslichen potentiometrische membranMarkierungsFarbstoff, DiO. DiO belasteten LCNPs (DIO-LCNPs) wurden unter Verwendung synthetisiert ein zweiphasiges Miniemulsionstechnik mit der chemischen Komponenten DACTP11, AC10COONa und DiO, wie in Abbildung 18 1 aufgeführt. In diesem NP-System, die kovalent gebundene polymere Netzwerk des kristallinen Vernetzungsmittel DACTP11 liefert einen stabilen hydrophoben Kern, wo der DiO innerhalb der Zwischenräume in dem vernetzten Netzwerk befindet. Die Carboxylat-Gruppen an der Oberfläche NP liefern kolloidale Stabilität der Teilchen in wässrigen Medien, während auch als funktionelle Gruppe "Griff" für die Befestigung von zellZielLigaNden dien(Und anderen Biologika). Um die DiO-LCNPs an die Plasmamembran anbinden, ein Amin-terminiertes PEGylierten Cholesterinrest (PEG-Chol) wurde kovalent an die Oberfläche gebunden LCNP via EDC - Kupplung (Abbildung 1). Nach NP-Synthese und die Bestätigung der erfolgreichen Biokonjugation, die Fähigkeit der DiO-LCNPs die Plasmamembran lebender Zellen zu kennzeichnen und die eingebettete DiO Fracht an den lipophilen Teil der Plasmamembrandoppelschicht mit einer verbesserten Spezifität und Kinetiken im Vergleich zu der freien zu liefern Form (DIO kostenlos) von Bulk - Lösung geliefert wurde bewertet.
Wie in Figur 2 A dargestellt ist , DiO freie (6,0 uM) robust die Plasmamembran mit hoher Effizienz (annähernd 100% der Zellen markiert) gefärbt nach 15 min Inkubation mit HEK 293T / 17 - Zellen. Allerdings signifikante zelluläre Internalisierung der OVI frei wurde auf nur eine bescheidene Zunahme der beobachtetenInkubationszeit 30 min (Figur 2 A und C). Das Ausmaß der OVI frei Internalisierung wurde durch zeitaufgelöste Kolokalisationsexperimenten bestimmt , in denen Zellen wurden zunächst frei (30 min) mit 6,0 uM DiO inkubiert. Dio kostenlos -haltigen Inkubationsmedium wurde dann entfernt, und die Zellen wurden anschließend für bis zu 4 Std. Die Plasmamembranen der Zellen wurden mit einem Farbstoff-markiertes Membran-Phospholipid (; PE-Rhoda phosphoethanolamin konjugiert Rhodamine B) gegengefärbt. Wie in Abbildung 2 C gezeigt, nach 15 min Inkubation wurde fast 100% der OVI kostenlos mit dem PE-Rhoda Marker (Pearson Kolokalisierung Koeffizient; PCC = 0,99 ± 0,01) kolokalisiert. Jedoch nach 30 min Inkubation ~ 80% der DiO frei blieb an der Membran gebunden (~ 20% internalisiert). Der Grad der OVI frei Internalisierung stetig als the Inkubationszeit wurde so lange wie 4 Stunden verlängert, und dies wurde bei der gleichzeitigen Abnahme der PCC zwischen dem DIO und Rhoda-PE (Abbildung 2 C) reflektiert. Eine Anpassung der Daten zu einem einphasigen exponentiellen Abfall Gleichung ergab , dass Dio frei Internalisierung 50% bei 1 h, mit einer Internalisierung Rate (k = 0,045 min -1) und Halbwertszeit maximal ~ erreicht (15 min) dass spiegelte die schnelle und effiziente zelluläre Aufnahme von DiO frei. Diese Daten zeigen die rasche zeitabhängigen Übergang von DiO frei von der Plasmamembran in das Cytosol, wo sie weitgehend aus dem Kern über die 4 Stunden Zeitraum untersucht ausgeschlossen blieben.
In Anbetracht der unkontrollierten zellulären Aufnahme von DiO frei, wurde das Ziel dieses Verhalten durch die Bereitstellung von DiO als LCNP-PEG-Chol NP - Formulierung zu modulieren. Wenn sie als LCNP-PEG-Chol Biokonjugat geliefert, ein hartnäckiger Membran residrenz Zeit der OVI im Vergleich zu DiO frei festgestellt wurde (Abbildung 2 B). Nach 15 min Inkubation der OVI-LCNP-PEG-Chol mit den Zellen, fast 100% der OVI-Signal wurde an der Plasmamembran, wo es mit dem PE-Rhoda Membranmarker colocalized wurde, ein Ergebnis, das zu vergleichbar dass beobachtet Dio kostenlos. Es wurde jedoch darauf hingewiesen, dass , während die DiO freie Kennzeichnung der Membran recht einheitlich und zusammenhängend war, das Färbungsmuster der OVI-LCNP-PEG-Chol nach 15 min Inkubation mehr punctata und nicht annähernd so geartet war (Abbildung 2 B). Dieses Ergebnis zeigte, dass die OVI-LCNP-PEG-Chol-Nanopartikel wurden in getrennten Bereichen innerhalb der Plasmamembran zu sammeln. Wenn die Inkubationszeit auf 30 Minuten erhöht wurde, ~ 94% der OVI - Signal an der Membran blieb ( im Vergleich zu ~ 80% Dio kostenlos an diesem gleichen Zeitpunkt) (Abbildung 2 B und 2C). Dieser Trend wurde noch ausgeprägter, wenn die Zellen mit den für zunehmend längere Zeiten nach der ersten 30 min Inkubation DiO-LCNP-PEG-Chol NPs kultiviert. Zum Beispiel, nach Kultur für 1 Stunde nach der ersten Inkubation, fast 80% der OVI-LCNP-PEG-Chol NP Signal blieb membranöse und mit dem PE-Rhoda Marker colocalized ( im Vergleich zu ~ 55% Dio kostenlos). Bemerkenswert ist, erreicht die zelluläre Internalisierung der OVI-LCNP-PEG-Chol NPs maximal 30% bei 2 h (70% Membran Retention). Dies entspricht einer zellulären Aufnahmerate (k = 0.024 min -1; Halbwertszeit = 29 min) , die genau eine Hälfte davon für die Internalisierung der OVI frei zu beobachten ist.
Als nächstes wurde die Fähigkeit der NP-eingebetteten DiO Ladung effizient Efflux aus dem LCNP Kern und geben die lipophilen Umgebung der Plasmamembran-Doppelschicht in einer kontrollierten und zeitabhängigen Weise bestimmt. Nachbeurteilen dies eine FRET-basierten Strategie entwickelt wurde, bei Dio als FRET-Donor in Energieübertragung auf den Akzeptor-Farbstoff, Dil Eingriff dient. Wie zu erwarten, bei der anfänglichen Kennzeichnung (t = 0 min) wurde das Emissionssignal durch den DIO - Spender dominiert innerhalb der Membran-gebundenen NPs enthalten (Abbildung 3 B). FRET Abbildungs dieses gleichen Feld 4 Stunden später (t = 240 min) zeigte jedoch eine signifikante Erhöhung des Emissionssignals des DiI-Akzeptor, ein starker Beweis für den Übergang des DiO Donor von dem LCNP Kern in die Plasmamembran bilayer Bereitstellen (Figur 3 C). Untersuchung der zeitaufgelöster Art dieser Übergang zeigte eine stetige Abnahme der Emissions DiO Spender gekoppelt mit einem entsprechenden Anstieg in DiI Akzeptoremission über 4 h Versuchsfenster (Figur 3 D). Bemerkenswert ist, erreichte die FRET-Effizienz während dieses Übergangs seine maxiMama bei ~ 180 min nach der anfänglichen Kennzeichnung, was darauf hindeutet , dass der Ausstrom und Membranunterteilung des DiO Spender sein Maximum zu diesem Zeitpunkt (Abbildung 3 E) erreicht hatte. Diese Daten lieferten starke Beweise für die zeitaufgelöste Aufteilung der OVI aus der NP an die Plasmamembran-Doppelschicht, die ihr Maximum ~ 3 Stunden nach der anfänglichen Kennzeichnung mit DIO-LCNP-PEG-Chol NPs erreicht.
Frei im Vergleich zu DiO-LCNP-PEG-Chol Schließlich wurde vergleichende Zytotoxizität Analyse Dio durchgeführt. Wenn mit HEK 293T / 17-Zellen inkubiert (bei einer DiO Konzentration von 6 & mgr; M in beiden Fällen), war es klar, dass die Verkapselung der OVI im LCNP Kern seiner Zytotoxizität gedämpft. Während DiO zelluläre Bewohnbarkeit von ~ 50% frei ausgelöst, zeigte mit DiO-LCNP-PEG-Chol inkubiert Zellen zelluläre Bewohnbarkeit ~ 90%. (Abbildung 4). Kumulativ gekoppelt, um die Markierung von Zellen Daten mit dem zellulären toxiStadt Daten zeigen Verbesserungen sowohl in der Effizienz der DiO-basierte Membrankennzeichnung und der Modulation der Zytotoxizität von DiO.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Membran-bindenden DiO-LCNP-PEG-Chol. DIO LCNP besteht aus einem Acrylat-Flüssigkristallvernetzungsmittel (DACTP11); eine Carboxyl-terminierten polymerisierbares Tensid (AC10COONa); und einen lipophilen Farbstoff, OVI. Cholesterol-terminierten Poly (ethylenglykol) (PEG-Chol) wurde zu DiO-LCNP via EDC Kopplung konjugiert ist. Zugabe von Chol zum DiO-LCNP Oberfläche vermittelt bevorzugte Bindung des NP an die Plasmamembran. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Zeitaufgelöste zelluläre Aufnahme von DiO frei in HEK 293 T / 17 - Zellen. DiO frei (6,0 & mgr; M, Platte (A) oder DiO-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 uM, Platte (B) wurde für 15 min auf Zellmonolayern inkubiert, entfernt und durch Wachstumsmedium ersetzt, wurden die Zellen anschließend gefärbten Zellen wurden mit PE-Rhoda kultiviert für die (bis zu 4 h) angegebenen Zeiten. (2,0 uM) und fixiert. Die Proben wurden DiO (grün) und abzubildenden membrangebundenen PE-Rhoda (rot) CLSM verwenden. ( C) Zeitaufgelöste aufgelöste~~POS=HEADCOMP Auftragung der Prozent membrangebundenen DiO frei oder DiO-LCNP-PEG-Chol - Signal als Funktion der Inkubationszeit zu erhöhen. die Daten wurden von der Pearson-Kolokalisation Koeffizient (PCC erhalten, n = 3 & #177; Standardabweichung) des grünen (DIO) und Rot (PE-Rhoda) -Kanäle, und wird als Prozentsatz (± SEM) nach Normierung auf die PCC entsprechend 15 min Inkubation ausgedrückt. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 18. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3: Zeitaufgelöste FRET bestätigt den Efflux von DiO von DiO-LCNP-PEG-Chol an der Plasmamembran. HEK293T / 17-Zellen wurden costained mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil, wo die OVI (grün emittierenden) und Dil (rot emittierende) Farbstoffe wirken als FRET-Donor und Akzeptor sind. (A) DIC Bild der lebenden Zellen costained mit DiO-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 uM) und Dil (6,0 uM). Die sreichlich wurde bebildert die Änderung des FRET-Signals über den Zeitraum von 4 Stunden zu überwachen. (B) und (C) sind die FRET - Bilder der lebenden Zellen auf der gleichen Brennebene bei t = 0 min und t = 240 min, respectively. (D) Normalized, zeitaufgelöste Emissionsintensität der OVI - Donor und Dil Akzeptor von Zellen gefärbt mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil und in FRET - Erregungsmodus abgebildet. (E) Zeitaufgelöste FRET - Verhältnis (Dil emi / DiO emi) für markierten Zellen mit DiO-LCNP-PEG-Chol und Dil und in FRET - Konfiguration abgebildet. Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung aus Lit. 18. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4
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Discussion
Ein ständiges Ziel der NMDD ist die kontrollierte Ausrichtung und Abgabe von Arzneimittelformulierungen an Zellen und Geweben, bei gleichzeitiger Verbesserung der Wirksamkeit von Medikamenten kombiniert. Eine spezielle Klasse von Arzneimittelmolekülen, für die dies eine große Herausforderung gestellt hat, hydrophobe Arzneimittel / Abbildungsmittel, die schwer bis gar keine Löslichkeit in wäßrigen Medien aufweisen. Dieses Problem ist der Übergang von wirksamen Arzneimitteln aus in vitro - Zellkultursysteme zur klinischen geplagt und hat in einer Reihe von vielversprechenden Wirkstoffmoleküle zu sein " auf Eis gelegt" oder aufgegeben und nicht weiter verfolgt im klinischen Umfeld geführt. Wortmannin (Wtmn), zum Beispiel, ist ein potenter Inhibitor der Phosphatidylinosit-3 'Kinasen und Phosphatidylinositol 3'-Kinase-verwandten Kinasen und hat ein großes Potenzial als Antikrebsmittel, aber ihr Mangel an Wasserlöslichkeit hat ihr Fortschreiten in klinischen Studien behindert.
Vor kurzem Karve et al. zeigte eine verbesserte Wasser solubility von Wtmn wenn sie als Lipid-Polymer - NP Anordnung 19 formuliert. Eine Arena, die sich stark von dieser Art verbessert, kontrollierte Abgabe als NP Formulierung profitieren könnte, ist die Bereitstellung von hydrophoben Arzneimitteln und Abbildungsmittel zur Plasmamembran. Somit war das Ziel hier, um diese technische Hürde zu wenden und eine Methode zur Überwindung dieser technologische Hürde zu entwickeln.
Bei der Entwicklung dieser Methode, eine Modellmembran-Targeting-Farbstoff wurde Dio ausgewählt, die historisch durch eine schlechte Löslichkeit in wässrigen Medien geplagt hat. Dies verleiht erhebliche Herausforderungen in der spezifischen Abgabe des Farbstoffs an der Plasmamembran. Unter diesen Herausforderungen sind die Notwendigkeit der kristallinen Form des Farbstoffes direkt in Zellen oder Gewebe 10 zu addieren oder zu den Zellen inkubiert mit sehr hohen Konzentrationen von DiO nach Verdünnen von Stammlösungen Lösungsmitteln wie DMSO , enthaltend 11, 12.Der Ansatz hier war zweifach: 1) übernehmen die OVI in den hydrophoben Kern von LCNPs während NP-Synthese und 2), die kovalent der synthetisierten DiO-LCNPs mit pegyliertem Cholesterin-Konjugat (DIO-LCNP-PEG-Chol) ändern zu erleichtern die direkte Interaktion der OVI belasteten NPs mit der Plasmamembran. Tatsächlich verbessert dieser Ansatz effektiv eine Reihe von Aspekten der Lieferung von DiO an der Plasmamembran.
Zunächst wurde die Membran Verweilzeit von DiO effektiv verdoppelt, wenn sie als LCNP Formulierung im Vergleich zu geliefert wird, wenn DiO wurde aus bulk Lösung frei ausgeliefert. Diese verlängerte Membran Verweilzeit wurde auf die Lokalisation des DiO-LCNP-PEG-Chol Konjugate an den Lipidfloß Mikrodomänen der Plasmamembran zugeschrieben werden, wie durch Co-Färbungsexperimente bestätigt. Zweitens wurde die Aufteilung der OVI Ladung in die Lipid-Doppelschicht durch FRET-Experimente bestätigt, in dem Dio als Spender auf eine Membran-resident Dil Akzeptor diente. Endlich, daslangsam, mit verzögerter Freisetzung der OVI Ladung in die Membran-Doppelschicht abgeschwächt wirksam die Zytotoxizität der OVI von ~ 40%.
Es ist wichtig, einige Punkte in dem Protokoll hervorheben, die für den Erfolg entscheidend sind. Erstens muss die prozentuale Belastung der OVI in den LCNP Kern empirisch in Versuchs Synthese optimiert werden läuft, ein Gleichgewicht zwischen der Erzeugung von qualitativ hochwertigen in zellulären Lieferung Experimente DiO-LCNP-PEG-Chol NPs und dem gewünschten Grad der Fluoreszenzsignal zu erhalten . Ebenso muss die Biokonjugation des Chol-PEG-NH2-Einheit an Dio-LCNP Oberfläche optimiert werden, um den gewünschten Grad der zellulären Kennzeichnung zu erhalten. Schließlich ist die Anzahl der Zellen an die Fibronektin-beschichteten Kulturschalen aufgebracht kritisch für den Erfolg, und darauf geachtet werden , müssen die Zellen in einer Dichte von ~ 8 × 10 4 Zellen / ml (~ 2,4 x 10 5 Zellen pro Schale) zu impfen . Wenn die Zellen zu dünn gesät sind, führt dies zu einer ineffizienten Membran Kennzeichnung, während die ce Impfenlls zu dicht Ergebnisse in den Erwerb von schlechten Bilder, die nicht eindeutig zeigen membranartige Kennzeichnung.
Eine mögliche Einschränkung der wie beschriebenen Protokoll ist, dass die Effizienz des Einbaus von verschiedenen anderen Membran-Targeting-Farbstoffe und Medikamente werden auf der Hydrophobizität des Farbstoffes / Arzneimittel Ladung variieren. In diesen Fällen wird die LCNP Syntheseprotokoll haben empirisch die optimale Synthesebedingungen für optimale Farbstoff / Arzneimittel cargo Inkorporation zu bestimmen, getestet werden.
Zusammenfassend ist für die LCNP Basis gesteuerten Abgabe eines hydrophoben Farbstoffes Ladung an die Plasmamembran lebender Zellen, die viele der technischen Probleme überwindet, die mit der zellulären Abgabe von wasserunlöslichen cargos Verfahren entwickelt. Die Gesamtbedeutung des Verfahrens ist, dass es eindeutig die spezifische Abgabe von Ladung an die Plasmamembran verbessert, während gleichzeitig die gleichzeitige Zytotoxizität Abschwächen die Assoc istverbundes mit der Lieferung von hydrophoben Cargos bei hohen Konzentrationen von Rohlösung. Dieser Ansatz sollte eine breite Anwendung bei der Lieferung von ähnlich anspruchsvolle hydrophobe Farbstoff / Abbildungsmittel cargos finden und hilft wahrscheinlich den Übergang von wirksamen, aber schlecht wasserlösliche, cargos aus dem experimentellen Regime der klinischen Einstellung zu erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der NRL Basis Förderprogramm (Arbeitseinheit MA041-06-41-4943) unterstützt. ON wird von einem National Research Council Postdoctoral Forschung Associateship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
