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Bioengineering

एक लिक्विड क्रिस्टल Nanoparticle कैरियर में एक हाइड्रोफोबिक कार्गो समझाया की लक्षित प्लाज्मा झिल्ली प्रसव

doi: 10.3791/55181 Published: February 8, 2017

Summary

एक लिक्विड क्रिस्टल nanoparticle (LCNP) nanocarrier जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली को एक हाइड्रोफोबिक माल की नियंत्रित डिलीवरी के लिए एक वाहन के रूप में शोषण किया जाता है।

Abstract

कोशिकाओं को दवा / इमेजिंग एजेंट के नियंत्रित वितरण चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए और सेलुलर संकेत प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। हाल ही में, नैनोकणों (एनपीएस) में इस तरह के वितरण प्रणाली के विकास में महत्वपूर्ण वादा दिखाया है। इधर, एक लिक्विड क्रिस्टल एनपी (LCNP) आधारित वितरण प्रणाली एक पानी में अघुलनशील डाई, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio) की नियंत्रित प्रसव के लिए, एनपी कोर के भीतर से एक प्लाज्मा के हाइड्रोफोबिक क्षेत्र के लिए नियोजित किया गया है झिल्ली bilayer। एनपीएस के संश्लेषण के दौरान डाई कुशलता हाइड्रोफोबिक LCNP कोर में शामिल किया गया था, इस बात की पुष्टि के रूप में कई स्पेक्ट्रोस्कोपी का विश्लेषण करती है। एनपी सतह (डियो-LCNP खूंटी चोल) के लिए एक PEGylated कोलेस्ट्रॉल व्युत्पन्न के विकार HEK 293T / 17 कोशिकाओं में प्लाज्मा झिल्ली डाई लोड एनपीएस के बंधन सक्षम होना चाहिए। समय हल लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी और Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) इमेजिंग पास इस बात की पुष्टिLCNP कोर और प्लाज्मा झिल्ली bilayer में अपनी प्रविष्टि से डियो की तपका ive। अंत में, एक LCNP खूंटी चोल के रूप में डियो की डिलीवरी डियो की cytotoxicity तनु; डियो की एनपी प्रपत्र को डियो मुक्त थोक समाधान से बचाया तुलना ~ 30-40% कम विषाक्तता का प्रदर्शन किया। यह दृष्टिकोण झिल्ली विशेष वितरण और हाइड्रोफोबिक आणविक cargos के मॉडुलन के लिए एक साधन के रूप में कुशल LCNP मंच की उपयोगिता को दर्शाता है।

Introduction

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जीवित कोशिकाओं के साथ (कम से कम एक आयाम में सामग्री ≤100 एनएम) interfacing nanomaterials के आगमन के बाद से, एक सतत लक्ष्य नैनोकणों (एनपीएस) विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए की अनूठी आकार पर निर्भर गुणों का लाभ लेने के लिए किया गया है। इन आवेदनों सेल और ऊतक लेबलिंग / इमेजिंग (दोनों इन विट्रो में और vivo), वास्तविक समय संवेदन, और दवाओं और अन्य cargos 1 के नियंत्रित वितरण शामिल है। इस तरह प्रासंगिक एनपी गुण के उदाहरण अर्धचालक nanocrystals के आकार पर निर्भर उत्सर्जन (क्वांटम डॉट्स, QDs) शामिल हैं; सोने के नैनोकणों photothermal गुण; liposomes की जलीय कोर के बड़े लदान क्षमता; और इस तरह के एकल दीवार कार्बन नैनोट्यूब और ग्राफीन के रूप में कार्बन allotropes, की बैलिस्टिक चालकता।

अभी हाल ही में महत्वपूर्ण हित में इस तरह के विपरीत / इमेजिंग के लिए एक के रूप में दवाओं और अन्य cargos, की नियंत्रित मॉडुलन के लिए एनपीएस के उपयोग में उत्पन्न हो गई हैमर्द। इधर, तर्क काफी बढ़ाने / एक एनपी तैयार करने के रूप में यह देने से समग्र घुलनशीलता दिया खुराक, रक्त परिसंचरण में समय है, और अंतिम मंजूरी के दवा माल का अनुकूलन करने के लिए है। इस एनपी की मध्यस्थता दवा वितरण (NMDD) के रूप में जाना जा आ गया है, और वर्तमान में क्लिनिक में उपयोग विभिन्न तरह के कैंसर और सैकड़ों क्लिनिकल परीक्षण के विभिन्न चरणों में और अधिक का इलाज करने के लिए सात एफडीए को मंजूरी दी एनपी दवा फार्मूलों देखते हैं। संक्षेप में, लक्ष्य "कम से अधिक प्राप्त करने," करने के लिए है वह यह है कि बड़े सतह क्षेत्र का लाभ लेने से कम खुराक प्रशासन के साथ और अधिक दवा वितरित करने के लिए एक पाड़ के रूप में उपयोग करने के एनपी: मात्रा (जैसे, इस तरह के QDs और धातु आक्साइड के रूप में मुश्किल कणों) एनपीएस के या लोड करने के लिए उनके बड़े आंतरिक मात्रा बड़ी कार्गो पेलोड (जैसे, liposomes या micelles)। उद्देश्य विशेष रूप से यहाँ के लिए, जबकि एक ही समय में जलीय स्थिरता और बढ़ाया परिसंचरण को बढ़ावा देने के लिए कई प्रणालीबद्ध वितरित की खुराक परहेजों के लिए आवश्यकता को कम करने के लिए हैचुनौतीपूर्ण हाइड्रोफोबिक दवा cargos कि, अत्यधिक प्रभावी है, जबकि जलीय मीडिया में संयम से घुलनशील हैं।

इस प्रकार, काम के साथ साथ वर्णित के लक्ष्य lipophilic प्लाज्मा झिल्ली bilayer को हाइड्रोफोबिक cargos के विशिष्ट और नियंत्रित वितरण के लिए एक उपन्यास एनपी पाड़ के उपयोग की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए किया गया था। काम के लिए प्रेरणा निहित सीमित घुलनशीलता और जलीय मीडिया से कोशिकाओं को हाइड्रोफोबिक अणुओं के वितरण में कठिनाई था। आमतौर पर, ऐसे हाइड्रोफोबिक अणुओं के वितरण कार्बनिक विलायकों (जैसे, DMSO) या amphiphilic surfactants (जैसे, Poloxamers) है, जो विषाक्त और समझौता सेल और ऊतक व्यवहार्यता 2, या मिसेल वाहक हो सकते हैं, जो आंतरिक लोड हो रहा है सीमित है सकते हैं के उपयोग की आवश्यकता क्षमता। एनपी वाहक यहाँ चुना एक उपन्यास लिक्विड क्रिस्टल एनपी (LCNP) पहले से विकसित 3 सूत्रीकरण था और कहा कि पहले से दिखाया गया था कि एक ~ 40 गुना प्राप्त करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं 4 में कैंसर विरोधी दवा डॉक्सोरूबिसिन की प्रभावकारिता में सुधार।

काम के साथ साथ वर्णित में, प्रतिनिधि चुने गए माल potentiometric झिल्ली डाई, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (Dio) था। डियो एक पानी में अघुलनशील डाई कि अग्रगामी और रहने और तय न्यूरॉन्स, झिल्ली क्षमता माप में प्रतिगामी ट्रेसिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है, और सामान्य झिल्ली के लिए लेबलिंग 5, 6, 7, 8, 9। इसकी हाइड्रोफोबिक प्रकृति के कारण, डियो आम तौर पर सीधे सेल monolayers या ऊतकों को एक क्रिस्टलीय फार्म 10 में जोड़ा जाता है, या यह बहुत ही उच्च सांद्रता में incubated है (~ 1-20 माइक्रोन) के एक एकाग्रता के शेयर समाधान 11, 12 से कमजोर पड़ने के बाद।

सामग्री "> LCNP मंच करने के लिए उपयोग यहाँ, दृष्टिकोण था, एक multifunctional एनपी जिसका भीतरी कोर पूरी तरह से हाइड्रोफोबिक है और जिसकी सतह एक साथ हाइड्रोफिलिक और bioconjugation के लिए उत्तरदायी है, डियो। डियो के लिए एक डिलीवरी वाहन के रूप में संश्लेषण के दौरान LCNP कोर में शामिल किया है और एनपी सतह तो झिल्ली प्लाज्मा झिल्ली डियो-LCNP पहनावा के बंधन को बढ़ावा देने के लिए एक PEGylated कोलेस्ट्रॉल आधा भाग के साथ क्रियाशील है। यह दृष्टिकोण एक वितरण प्रणाली है कि अधिक से अधिक निष्ठा और झिल्ली निवास के साथ प्लाज्मा झिल्ली में डियो विभाजित में हुई समय की तुलना में डियो की नि: शुल्क फार्म थोक समाधान से बचाया (डियो मुक्त)। इसके अलावा, इस विधि से पता चला है कि डियो के LCNP की मध्यस्थता वितरण में काफी modulates और lipophilic प्लाज्मा झिल्ली bilayer में डाई के विशिष्ट विभाजन की दर चलाता है। यह वह जगह है जबकि समन्वित रूप से एक LCNP तैयार करने के रूप में यह देने से ~ 40% नि: शुल्क दवा का cytotoxicity कम करने हासिल की।

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Protocol

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1. डियो-LCNP और डियो-LCNP खूंटी चोल की तैयारी

  1. तरल क्रिस्टलीय diacrylate पार से जोड़ने एजेंट (DACTP11, 45 मिलीग्राम) भंग, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (डियो, 2 मिलीग्राम), और क्लोरोफॉर्म के 2 मिलीलीटर में एक नि: शुल्क कट्टरपंथी सर्जक (azobisisobutyronitrile, 1 मिलीग्राम) polymerization के लिए। acrylate-क्रियाशील surfactant के एक जलीय घोल (AC10COONa, 7 मिलीलीटर में 13 मिलीग्राम) के लिए इस जोड़ें।
  2. 5 मिनट के लिए 80% आयाम पर 1 घंटे के लिए मिश्रण और sonicate हिलाओ पानी में polymerizable surfactant से घिरा हुआ कार्बनिक पदार्थ की छोटी बूंदों से मिलकर एक miniemulsion उत्पादन करने के लिए।
  3. एक तेल स्नान में 64 डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण गर्मी दोनों पार से जोड़ने एजेंट और surfactant के polymerization आरंभ करने के लिए के रूप में क्लोरोफॉर्म धीरे-धीरे, उड एक डियो युक्त एनपी निलंबन कि surfactant द्वारा स्थिर है छोड़कर।
  4. एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से एनपी निलंबन (3 बार) फ़िल्टर किसी भी एकत्रीकरण हटा दें। एसटूफिर आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर छान एनपी समाधान।
  5. ईडीसी युग्मन के माध्यम से डियो-LCNP को खूंटी चोल के विकार।
    1. चोल खूंटी राष्ट्रीय राजमार्ग 2 भंग · एचसीएल (खूंटी चोल, 0.9 मिमी), 25 मिमी HEPES बफर (7.0 पीएच) में।
    2. एक काम एन -hydroxy-sulfosuccinimide सोडियम नमक (NHSS, 40 मिमी) और 1-इथाइल-3- (3- (dimethylamino) -propyl) carbodiimide हाइड्रोक्लोराइड (ईडीसी, 400 मिमी) केंद्रित शेयर समाधान से HEPES बफर में युक्त समाधान तैयार है।
    3. इसके तत्काल बाद HEPES बफर में डियो-LCNP के 1.0 मिलीलीटर NHSS / ईडीसी के हौसले से तैयार काम कर समाधान के 20 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए हलचल।
    4. इस मिश्रण को चोल खूंटी राष्ट्रीय राजमार्ग 2 · एचसीएल के शेयर समाधान के 20 μl जोड़ें और 2 घंटे के लिए हलचल।
    5. संक्षेप में एक टेबलटॉप मिनी सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर और एक पीडी -10 आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ 13 के साथ equilibrated के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला पारित 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति (~ 2,000 XG) पर प्रतिक्रिया मिश्रण अपकेंद्रित्रDulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS, 0.1x)।

2. डियो-LCNP और डियो-LCNP खूंटी चोल की विशेषता

  1. सफल सहसंयोजक जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा डियो-LCNP सतह के लिए खूंटी चोल के विकार की पुष्टि करें।
    1. (; 89 मिमी Tris (7.6 पीएच), 89 मिमी बोरिक एसिड, और 2 मिमी EDTA TBE) बफर Tris-borate वैद्युतकणसंचलन की 50 मिलीलीटर (1x) में agarose की 0.5 ग्राम भंग। एक माइक्रोवेव ओवन में समाधान हीट agarose भंग करने के लिए। समाधान थोड़ा शांत और वैद्युतकणसंचलन बॉक्स में एक जेल की थाली में सामग्री डाल करने की अनुमति दें। नमूना कुओं बनाने के लिए एक जेल कंघी डालें।
    2. एक बार जेल जम गया है, आवश्यक राशि TBE के चैम्बर के लिए चल बफर (चैम्बर में जेल डूब के लिए पर्याप्त) जोड़ें।
    3. डियो-LCNP नमूना के 35 μl जोड़ें (ग्लिसरॉल के साथ में संशोधन, 5% वी / वी) जेल के कुओं के लिए और 110 वी के एक वोल्टेज पर 20 मिनट के लिए चला
    4. छवि जेल एक जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए वाई488 एनएम और 500-550 एनएम क्रमश वें उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर।
  2. डियो-LCNP समाधान (~ 200 गुना कमजोर पड़ने) पीबीएस में (पीएच ~ 8, 0.1x) गिराए और एक डीएलएस साधन 14 पर मापने के द्वारा कण आकार और गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) द्वारा वितरण का आकलन करें। मापने के लिए एक उपयुक्त जीटा संभावित माप उपकरण का उपयोग कर डियो-LCNPs जीटा-क्षमता।

प्रसव के प्रयोगों और इमेजिंग के लिए सेल संस्कृति व्यंजन की तैयारी 3.

नोट: Dio-LCNP लेबलिंग HEK 293T / 17 मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (मार्ग 5 और 15 के बीच) है कि सभ्य रूप में पहले 4 वर्णित हैं पर किया जाता है। प्रसव के प्रयोगों और बाद में सेल इमेजिंग के रूप में नीचे वर्णित प्रदर्शन करना।

  1. 20 माइक्रोग्राम की एकाग्रता में 100 μl उन्हें गोजातीय फ़ाइब्रोनेक्टिन (साथ कोटिंग से 35 मिमी व्यास टिशू कल्चर व्यंजन (14 मिमी नंबर 1 coverglass आवेषण के साथ सज्जित) तैयार करें ~/ 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए DPBS में एमएल)।
  2. संस्कृति पकवान से फ़ाइब्रोनेक्टिन कोटिंग समाधान निकालें। हार्वेस्ट HEK 293 टी -25 कुप्पी से T1 / 7 कोशिकाओं पहले धोने से DPBS के 3 मिलीलीटर के साथ और फिर trypsin EDTA (0.5% trypsin 0.25% EDTA) के 2 मिलीलीटर जोड़कर सेल monolayer।
  3. ~ 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं। trypsin-EDTA निकालें और इनक्यूबेटर कुप्पी वापसी। एक बार कोशिकाओं कुप्पी से अलग कर रहे हैं, पूरा मध्यम के 4 मिलीलीटर जोड़कर trypsin बेअसर फ्लास्क (; DMEM Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 5% सोडियम पाइरूवेट, और 5% एंटीबायोटिक / कवकनाशी को रोकने के लिए संशोधन) । उन्हें एक सेल काउंटर में गणना के द्वारा निलंबन में सेल एकाग्रता का निर्धारण।
  4. ~ 8 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल मध्यम विकास के साथ करने के लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें। इनक्यूबेटर रात भर में पकवान और संस्कृति के लिए सेल निलंबन के 3 मिलीलीटर जोड़ें; अगले दिन, कोशिकाओं ~ 70% confluency पर होना चाहिए और उपयोग के लिए तैयार हो जाना चाहिए। पर्याप्तसेल घनत्व कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत की मजबूत और कुशल लेबलिंग के लिए महत्वपूर्ण है।

4. डियो और डियो-LCNPs सेल्युलर डिलिवरी और तय कोशिकाओं की इमेजिंग

  1. प्रसव के माध्यम में डियो, डियो-LCNP, और डियो-LCNP खूंटी चोल के 1 मिलीलीटर समाधान तैयार (HEPES-DMEM; DMEM युक्त 25 मिमी HEPES) डियो और डियो मुक्त-LCNPs के शेयर समाधान गिराए द्वारा; कोशिकाओं पर ऊष्मायन के लिए उचित डियो सांद्रता ~ 1-10 माइक्रोन के (या तो डियो मुफ्त या डियो-LCNP के रूप में डियो की एकाग्रता के रूप में व्यक्त) हो जाएगा।
  2. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग संस्कृति व्यंजन से विकास के माध्यम से निकालें और सेल monolayers धो (3 कदम देखें) HEPES-DMEM (2 मिलीलीटर प्रत्येक धोने) के साथ दो बार। धीरे जोड़ने और व्यंजन के किनारे से करने के लिए / एक पिपेट का उपयोग HEPES-DMEM हटाने के द्वारा washes प्रदर्शन करना।
  3. संस्कृति व्यंजन के केंद्र के लिए तैयार डियो मुफ्त या डियो-LCNP वितरण समाधान के 0.2 मिलीलीटर जोड़ें और मैं करने के लिए व्यंजन लौटने केncubator समय का एक उचित अवधि (आमतौर पर 15 या 30 मिनट, प्रयोग की जरूरतों पर निर्भर करता है) के लिए। अब ऊष्मायन बार गैर झिल्लीदार क्षेत्रों के और अधिक अविशिष्ट सेलुलर लेबलिंग (जैसे, cytosol) में जोड़ें।
  4. ऊष्मायन अवधि के बाद, एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग वितरण समाधान निकाल दें। सेल monolayers DPBS (2 मिलीलीटर प्रत्येक धोने) के साथ दो बार धोएं। धीरे पकवान के किनारे से / को जोड़ने और हटाने के द्वारा DPBS washes प्रदर्शन करना।
  5. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (DPBS में तैयार) का उपयोग सेल monolayers को ठीक करें।
    चेतावनी: Paraformaldehyde ज्वलनशील है, एक सांस की अड़चन, और एक संदिग्ध कैसरजन।
  6. paraformaldehyde समाधान के लिए एक पिपेट का उपयोग निकालें और धीरे कोशिकाओं को जोड़ने के लिए और / पिपेट का उपयोग व्यंजन के किनारे से DPBS को हटाने के द्वारा DPBS के साथ 1 समय (2 मिलीलीटर) धो लें।
  7. तय कोशिकाओं confocal लेजर स्कैनिंग का उपयोग कर एक झिल्लीदार प्रतिदीप्ति संकेत की उपस्थिति के लिए imaged किया जा करने के लिए तैयार हैंमाइक्रोस्कोपी (CLSM)। इमेजिंग तुरंत प्रदर्शन या, वैकल्पिक रूप से, 0.05% युक्त NaN 3 DPBS के साथ मध्यम जगह और 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन की दुकान।
    चेतावनी: NaN 3 विषैला होता है; अत्यधिक सावधानी बरतें जब NaN 3 का उपयोग।
    नोट: फिक्स्ड इस तरीके से संग्रहीत नमूनों इष्टतम परिणामों के लिए 48 घंटे के भीतर imaged किया जाना चाहिए।

जीवित कोशिकाओं में डियो और डियो-LCNPs और झल्लाहट इमेजिंग के 5. सेलुलर प्रसव

नोट: इस विधि में, कोशिकाओं 6 माइक्रोन प्रत्येक डियो-LCNP खूंटी चोल (जहां डियो एक झल्लाहट दाता है) और 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI साथ colabeled रहे हैं मुक्त, जहां DiI एक झल्लाहट स्वीकर्ता) है। डियो-LCNP खूंटी चोल और अपने शामिल करने से डियो की रिहाई के प्लाज्मा झिल्ली में DiI स्वीकर्ता को डियो दाता से ऊर्जा हस्तांतरण में मनाया वृद्धि की पुष्टि की है।

  1. डियो-LCNP खूंटी चोल और DiI fre के साथ लेबल कोशिकाओं क्रमिकई विधि चरण 4 में वर्णित का उपयोग कर।
  2. धुंधला के बाद, कोशिकाओं DPBS के साथ 1 समय (2 मिलीलीटर) एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग धोने और (LCIS) लाइव सेल इमेजिंग समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ धोने बफर जगह।
  3. एक खुर्दबीन के एक गर्म ऊष्मायन कक्ष, छवि जीवित कोशिका पूर्ण उत्सर्जन 488 एनएम पर रोमांचक डियो दाता द्वारा एक 4 घंटा अवधि में 30 मिनट के अंतराल पर एक झल्लाहट इमेजिंग विन्यास के साथ एक confocal खुर्दबीन (60x उद्देश्य) का उपयोग और एकत्रित नमूने के साथ सुसज्जित मंच पर दोनों डियो दाता और एक 32-चैनल वर्णक्रमीय डिटेक्टर के साथ 490-700 एनएम से DiI स्वीकर्ता के स्पेक्ट्रा।
  4. नोट: झल्लाहट इमेजिंग के बारे में अधिक जानकारी के लिए कृपया संदर्भ के 15 देखें।
  5. दोनों डियो और डियो दाता-LCNP खूंटी चोल और DiI के साथ दाग कोशिकाओं से DiI स्वीकर्ता का समय हल उत्सर्जन तीव्रता का निर्धारण करते हैं। गणना समय हल स्वीकर्ता / दाता अनुपात (DiI ईएमआई / डियो ईएमआई) छवियों के लिए है, जो तेजी से वृद्धि होगी और अंत में प्लेट झल्लाहटAu डियो दाता की राशि झिल्ली में विभाजित एक बार में अधिकतम 16 तक पहुंच गई है।

6. डियो की cytotoxicity परख और डियो-LCNPs HEK 293T / 17 प्रकोष्ठों को

नोट: Dio-LCNP सामग्री के cytotoxicity एक tetrazolium डाई आधारित प्रसार परख 17 का उपयोग कर मूल्यांकन किया है। प्रकोष्ठों की स्थिति है कि अनुकरण वितरण / लेबलिंग के तहत सामग्री की सांद्रता अलग-अलग की उपस्थिति में एक multiwell थाली में सुसंस्कृत हैं। कोशिकाओं तो 72 घंटे के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए। एक डाई (एमटीएस (3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) -5 (3-carboxymethoxyphenyl) -2 (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) तो कुओं में जोड़ा जाता है, और पाचन सक्रिय कोशिकाओं को एक नीले formazan उत्पाद में डाई परिवर्तित। रंग गठन की राशि सीधे व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या के अनुपात में होती है।

  1. हार्वेस्ट HEK 293 टी -25 कुप्पी से T1 / 7 कोशिकाओं प्रक्रिया कदम 3.2.Seed में वर्णित का पालन करते हुएHEK 293T / 17 24 घंटे के लिए एक 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर इलाज थाली और संस्कृति के कुओं के लिए कोशिकाओं (5000 कोशिकाओं / 100 μl / अच्छी तरह से)।
  2. पूरी तरह से एक micropipette का उपयोग कुओं से संस्कृति मीडिया को दूर और डियो मुक्त युक्त HEPES DMEM के 50 μl जोड़ने, डियो-LCNPs या बढ़ रही सांद्रता कुओं को दोहराने के लिए पर डियो-LCNP खूंटी चोल। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं पर सेते हैं।
    नोट: आमतौर पर, तीन प्रतियों या चार प्रतियों में किया replicates सांख्यिकीय रूप से विश्वसनीय डेटा उपज के लिए पर्याप्त हैं।
    1. ऊष्मायन के बाद, सामग्री एक micropipette का उपयोग युक्त वितरण मध्यम हटाने और मध्यम विकास के 100 μl के साथ बदलें। संस्कृति 72 घंटे के लिए कोशिकाओं।
  3. प्रत्येक के लिए अच्छी तरह से, tetrazolium सब्सट्रेट के 20 μl जोड़े इनक्यूबेटर थाली लौटें, और रंग गठन के 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ने के लिए अनुमति देते हैं। 570 एनएम (इस अध्ययन में इस्तेमाल डियो-LCNPs के लिए अवशोषण minima पर formazan उत्पाद के absorbance (एबीएस) और पढ़ेंवि) और 650 एनएम (अविशिष्ट पृष्ठभूमि absorbance के घटाव के लिए) एक microtiter प्लेट रीडर का उपयोग।
  4. अंतर absorbance के मूल्य (एबीएस 570 - ABS 650) प्लॉट बनाम सामग्री एकाग्रता और नियंत्रण सेल प्रसार (सेल संस्कृति के माध्यम से ही में कोशिकाओं के प्रसार की डिग्री) के प्रतिशत के रूप में परिणाम की रिपोर्ट।

7. डेटा विश्लेषण

  1. सांख्यिकीय विचरण का एक univariate विश्लेषण (एनोवा) के आंकड़ों का विश्लेषण। एकाधिक तुलना के लिए, Bonferroni के पोस्ट अस्थायी परीक्षण लागू होते हैं। मतलब की ± मानक त्रुटि (SEM) जब तक अन्यथा उल्लेख के रूप में सभी औसत मूल्यों प्रदान करें।
    नोट: महत्व के लिए स्वीकार्य संभावना पी <0.05 था।

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Representative Results

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LCNPs तैयार किए गए थे, जिसमें एनपी के हाइड्रोफोबिक कोर एक प्रतिनिधि झिल्ली लेबलिंग जांच हाइड्रोफोबिक cargos के लिए एक कुशल प्रसव के वाहन के रूप में LCNP की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के साथ भरी हुई थी। इस उद्देश्य के लिए, कार्गो चुना अत्यधिक जल अघुलनशील potentiometric झिल्ली लेबलिंग डाई, डियो था। के रूप में चित्रा 1 18 में दिखाया गया डियो से भरी हुई LCNPs (Dio-LCNPs), रासायनिक घटकों DACTP11, AC10COONa, और डियो के साथ एक दो चरण मिनी पायस तकनीक का उपयोग कर संश्लेषित थे। इस एनपी प्रणाली में, क्रिस्टलीय पार से जोड़ने एजेंट DACTP11 की covalently जुड़े बहुलक नेटवर्क एक स्थिर हाइड्रोफोबिक कोर जहां डियो crosslinked नेटवर्क में मध्य रिक्त स्थान के भीतर रहता है। एनपी सतह पर कार्बोक्सिलेट समूहों जलीय मीडिया में कण को ​​कोलाइडयन स्थिरता प्रदान करते हुए भी सेल को निशाना ligands की कुर्की के लिए एक कार्यात्मक समूह के रूप में सेवारत "संभाल"(और अन्य बायोलॉजिकल)। प्लाज्मा झिल्ली डियो-LCNPs तार करने के लिए, एक अमाइन समाप्त PEGylated कोलेस्ट्रॉल आधा भाग (खूंटी-चोल) covalently ईडीसी युग्मन के माध्यम से LCNP सतह (चित्रा 1) से जुड़ा था। एनपी संश्लेषण और सफल bioconjugation की पुष्टि के बाद, डियो-LCNPs की क्षमता को जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली लेबल करने के लिए और नि: शुल्क की तुलना में सुधार विशिष्टता और कैनेटीक्स के साथ प्लाज्मा झिल्ली bilayer के lipophilic हिस्से को एम्बेडेड डियो माल देने के लिए फॉर्म (डियो मुक्त) थोक समाधान से बचाया मूल्यांकन किया गया था।

चित्रा 2 में दिखाया गया, डियो मुक्त (6.0 माइक्रोन) के मजबूती के साथ उच्च क्षमता के साथ प्लाज्मा झिल्ली दाग (कोशिकाओं के लगभग 100% लेबल) HEK 293T / 17 कोशिकाओं के साथ ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद। हालांकि, डियो मुक्त की महत्वपूर्ण सेलुलर internalization ही में एक मामूली वृद्धि पर मनाया गया30 मिनट (चित्रा 2 ए और सी) के लिए ऊष्मायन समय। डियो मुक्त internalization की हद समय हल colocalization प्रयोगों में जो कोशिकाओं पहले 6.0 माइक्रोन के डियो मुक्त (30 मिनट) के साथ incubated रहे थे द्वारा निर्धारित किया गया था। डियो मुक्त युक्त ऊष्मायन मध्यम तो हटा दिया गया था, और बाद में कोशिकाओं 4 घंटा तक के लिए सुसंस्कृत थे। कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली एक डाई लेबल झिल्ली फॉस्फोलिपिड (; पीई Rhoda phosphoethanolamine Rhodamine बी संयुग्मित) के साथ counterstained थे। चित्रा 2 सी में दिखाया गया है, ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद, डियो मुक्त के लगभग 100% पीई Rhoda मार्कर (; पीसीसी = 0.99 ± 0.01 पियर्सन की colocalization गुणांक) के साथ colocalized था। हालांकि, ऊष्मायन के 30 मिनट के बाद ~ डियो मुक्त का 80% झिल्ली (~ भाँति 20%) के लिए बाध्य बने रहे। डियो मुक्त internalization की डिग्री वें के रूप में तेजी से वृद्धि हुईई ऊष्मायन समय के रूप में लंबे समय के रूप में 4 घंटा के लिए बढ़ा दिया गया था, और इस डियो और Rhoda पीई (चित्रा 2 सी) के बीच प्रदेश कांग्रेस में सहवर्ती कमी में परिलक्षित किया गया था। एक एक चरण घातीय क्षय समीकरण करने के लिए डेटा का एक फिट से पता चला है कि डियो मुक्त internalization की एक अधिकतम तक पहुँच ~ 1 घंटा 50%, एक internalization दर (कश्मीर = 0.045 मिनट -1) और आधा जीवन (15 मिनट) के साथ कि डियो मुक्त के तेजी से और कुशल सेलुलर तेज परिलक्षित। इन आंकड़ों cytosol, जहां यह काफी हद तक 4 घंटा समय की जांच की अवधि में नाभिक से बाहर रखा बनी प्लाज्मा झिल्ली से मुक्त डियो के तेजी से समय पर निर्भर संक्रमण प्रदर्शित करता है।

डियो के अनियंत्रित सेलुलर तेज देखते हुए मुक्त, लक्ष्य के लिए एक LCNP खूंटी चोल एनपी तैयार करने के रूप में डियो के वितरण के माध्यम से इस व्यवहार को व्यवस्थित करना बन गया। जब एक LCNP खूंटी चोल bioconjugate के रूप में दिया, एक और अधिक लगातार झिल्ली Residडियो मुक्त करने के लिए की तुलना में डियो के खिलाडि़यों समय (चित्रा 2 बी) का उल्लेख किया गया था। कोशिकाओं के साथ डियो-LCNP खूंटी चोल के ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद, डियो संकेत के लगभग 100% प्लाज्मा झिल्ली, जहां यह पीई Rhoda झिल्ली मार्कर के साथ colocalized किया गया था, एक परिणाम के बराबर था पर स्थित था कि डियो मुक्त करने के लिए मनाया। यह नोट किया गया था, हालांकि, कि जब झिल्ली के डियो मुक्त लेबलिंग काफी वर्दी और सन्निहित था, ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद डियो-LCNP खूंटी चोल के धुंधला पैटर्न अधिक कबरा था और लगभग नहीं प्रकृति में समान रूप में (चित्रा 2 बी)। इस परिणाम से संकेत दिया कि डियो-LCNP खूंटी चोल एनपीएस प्लाज्मा झिल्ली के भीतर असतत क्षेत्रों में एकत्रित किए गए थे। ऊष्मायन समय 30 मिनट के लिए बढ़ा दिया गया था जब, ~ डियो संकेत के 94% झिल्ली (चित्रा (डियो इस एक ही समय बिंदु पर मुक्त करने के लिए ~ 80% की तुलना में) पर बने रहे 2 बी और 2 सी)। के रूप में कोशिकाओं प्रारंभिक 30 मिनट ऊष्मायन के बाद तेजी से अब समय के लिए डियो-LCNP खूंटी चोल एनपीएस के साथ सुसंस्कृत थे इस प्रवृत्ति को और भी स्पष्ट हो गया। उदाहरण के लिए, प्रारंभिक ऊष्मायन के बाद 1 घंटे के लिए संस्कृति के बाद, डियो-LCNP खूंटी चोल एनपी संकेत का लगभग 80% झिल्लीदार और पीई Rhoda मार्कर (~ के लिए डियो मुक्त करने के लिए 55% की तुलना में) के साथ colocalized बने रहे। विशेष रूप से, डियो-LCNP खूंटी चोल एनपीएस के सेलुलर internalization 2 घंटा (70% झिल्ली प्रतिधारण) में 30% की एक अधिकतम पर पहुंच गया। यह एक सेलुलर तेज दर से मेल खाती (कश्मीर = 0.024 मिनट -1, आधा जीवन = 29 मिनट) है कि डियो मुक्त के internalization के लिए मनाया है कि ठीक एक आधा।

अगले, एनपी एम्बेडेड डियो माल की क्षमता को कुशलता से LCNP कोर के बाहर तपका और एक नियंत्रित और समय पर निर्भर ढंग से प्लाज्मा झिल्ली bilayer के lipophilic पर्यावरण निर्धारित किया गया था दर्ज करें। सेवा मेरेइस आकलन, एक झल्लाहट आधारित रणनीति तैयार कर लिया गया था जिसमें डियो एक झल्लाहट स्वीकर्ता डाई, DiI करने के लिए ऊर्जा हस्तांतरण में लगे दाता के रूप में कार्य करता है। जैसी कि उम्मीद थी, प्रारंभिक लेबलिंग (टी = 0 मिनट) पर, उत्सर्जन संकेत डियो दाता झिल्ली सीमित एनपीएस (चित्रा 3 बी) के भीतर निहित का वर्चस्व था। झल्लाहट इस एक ही क्षेत्र 4 घंटा बाद में (टी = 240 मिनट) की इमेजिंग, तथापि, DiI स्वीकर्ता के उत्सर्जन को संकेत में उल्लेखनीय वृद्धि का पता चला प्लाज्मा झिल्ली bilayer में LCNP कोर से डियो दाता के संक्रमण के पुख्ता सबूत उपलब्ध कराने (चित्रा 3 सी)। इस संक्रमण का समय हल प्रकृति की परीक्षा डियो दाता एक इसी 4 घंटा प्रयोगात्मक खिड़की पर DiI स्वीकर्ता उत्सर्जन में वृद्धि (चित्रा 3 डी) के साथ मिलकर उत्सर्जन में लगातार कमी देखी गई। विशेष रूप से, इस संक्रमण के दौरान झल्लाहट दक्षता अपनी मैक्सी पहुँच~ 180 मिनट के बाद प्रारंभिक लेबलिंग में मां, सुझाव है कि डियो दाता की तपका और झिल्ली विभाजन (चित्रा 3 ई) इस समय बिंदु पर इसकी अधिकतम पर पहुंच गया था। इन आंकड़ों प्लाज्मा झिल्ली bilayer कि डियो-LCNP खूंटी चोल एनपीएस के साथ इसकी अधिकतम ~ 3 घंटा के बाद प्रारंभिक लेबलिंग पहुंच गया एनपी से डियो का समय हल विभाजन के पुख्ता सबूत प्रदान की है।

अंत में, तुलनात्मक विश्लेषण cytotoxicity डियो मुक्त बनाम डियो-LCNP खूंटी चोल के लिए प्रदर्शन किया था। जब (दोनों ही मामलों में 6 माइक्रोन की डियो एकाग्रता में) HEK 293T / 17 कोशिकाओं के साथ incubated, यह स्पष्ट था कि LCNP कोर के भीतर डियो के encapsulation अपनी cytotoxicity तनु। डियो मुक्त ~ के सेलुलर viabilities हासिल करते हुए 50%, डियो-LCNP खूंटी चोल के साथ incubated कोशिकाओं सेलुलर viabilities ~ 90% का प्रदर्शन किया। (चित्रा 4)। कुल मिलाकर, सेल लेबलिंग डेटा सेलुलर toxi के साथ युग्मितशहर डेटा दोनों डियो आधारित झिल्ली लेबलिंग की दक्षता और डियो की cytotoxicity के मॉडुलन में संवर्द्धन प्रदर्शित करता है।

आकृति 1
चित्रा 1: झिल्ली बाध्यकारी डियो-LCNP खूंटी चोल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। डियो-LCNP एक acrylate लिक्विड क्रिस्टल पार से जोड़ने एजेंट (DACTP11) से बना है; एक carboxyl समाप्त polymerizable surfactant (AC10COONa); और एक lipophilic डाई, डियो। कोलेस्ट्रॉल समाप्त पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) (खूंटी चोल) ईडीसी युग्मन के माध्यम से डियो-LCNP संयुग्मित था। डियो-LCNP सतह के लिए चोल के अलावा तरजीही प्लाज्मा झिल्ली एनपी के बंधन मध्यस्थता करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2: डियो का समय हल सेलुलर तेज HEK 293 टी / 17 कोशिकाओं में मुक्त। डियो मुक्त (6.0 सुक्ष्ममापी, पैनल (ए) या डियो-LCNP खूंटी चोल ([डियो] = 6.0 माइक्रोन के, पैनल (बी), 15 मिनट के लिए सेल monolayers पर incubated हटा दिया, और मध्यम विकास के साथ बदल दिया गया था; कोशिकाओं थे कई बार संकेत दिया है (ऊपर 4 घंटा के लिए)। प्रकोष्ठों के लिए सभ्य बाद में पीई Rhoda (2.0 माइक्रोन) के साथ दाग और तय किया गया। नमूनों डियो (हरा) और के लिए imaged थे झिल्ली ही सीमित पीई Rhoda (लाल) CLSM का उपयोग कर। ( सी) ऊष्मायन समय बढ़ाने के एक समारोह के रूप में झिल्ली ही सीमित डियो मुफ्त या डियो-LCNP खूंटी चोल संकेत के प्रतिशत का समय हल साजिश है। डेटा पियर्सन की colocalization गुणांक (पीसीसी से = 3 & # प्राप्त हुई थी, एन177; ग्रीन (डियो) और लाल (पीई Rhoda) चैनलों के मानक विचलन), और एक प्रतिशत (± SEM के रूप में व्यक्त किया जाता है) पीसीसी को सामान्य बनाने ऊष्मायन के 15 मिनट के लिए इसी के बाद। स्केल बार = 20 माइक्रोन। संदर्भ 18 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: समय हल झल्लाहट प्लाज्मा झिल्ली डियो-LCNP खूंटी चोल से डियो की तपका पुष्टि करता है। HEK293T / 17 कोशिकाओं डियो-LCNP खूंटी चोल और DiI, जहां डियो (हरी उत्सर्जन) और DiI (लाल उत्सर्जन) रंगों झल्लाहट दाता और स्वीकर्ता, क्रमशः के रूप में कार्य के साथ costained थे। डियो-LCNP खूंटी चोल ([डियो] = 6.0 माइक्रोन) के और DiI (6.0 माइक्रोन) के साथ costained जीवित कोशिकाओं के (ए) डीआईसी छवि। रोंपर्याप्त 4 घंटा की अवधि में संकेत झल्लाहट में परिवर्तन की निगरानी के लिए imaged किया गया था। (बी) और (सी) में टी = 0 मिनट और टी = 240 मिनट ही फोकल हवाई जहाज़ पर जीवित कोशिका की झल्लाहट छवियों, क्रमशः रहे हैं। (डी) सामान्यीकृत, समय हल डियो और डियो दाता-LCNP खूंटी चोल और DiI के साथ दाग और झल्लाहट उत्तेजना मोड में imaged कोशिकाओं से DiI स्वीकर्ता की उत्सर्जन तीव्रता। (ई) समय हल झल्लाहट अनुपात डियो-LCNP खूंटी चोल और DiI के साथ लेबल और झल्लाहट विन्यास में imaged कोशिकाओं के लिए (DiI ईएमआई / डियो ईएमआई)। स्केल बार = 20 माइक्रोन। संदर्भ 18 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4 cytotoxicity की मात्रा। डियो मुक्त, LCNP, डियो-LCNPs, या डियो-LCNP खूंटी चोल 15 मिनट के लिए HEK 293T / 17 सेल monolayers पर incubated रहे थे और फिर हटा दिया। प्रकोष्ठों धोया और 72 घंटा एमटीएस परख करने से पहले के लिए मध्यम विकास में सुसंस्कृत थे। बार ग्राफ [डियो] = 6.0 सुक्ष्ममापी पर सेल व्यवहार्यता डियो मुक्त, LCNP, डियो-LCNP, और डियो-LCNP खूंटी चोल के (एन = 5 ± SEM) की तुलना प्रतिनिधित्व करता है। डियो स्वतंत्र और LCNP, डियो-LCNP, या डियो-LCNP खूंटी चोल के बीच अंतर महत्वपूर्ण (पी <0.001) ऊष्मायन के 72 घंटा पर हैं। संदर्भ 18 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। डेटा (एनोवा) विचरण के univariate विश्लेषण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था; Bonferroni के पोस्ट अस्थायी परीक्षण एकाधिक तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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NMDD की एक सतत लक्ष्य नियंत्रित लक्ष्यीकरण और कोशिकाओं और ऊतकों को दवा फार्मूलों का वितरण, एक साथ सुधार दवा प्रभावकारिता के साथ संयुक्त है। जिसके लिए यह एक महत्वपूर्ण चुनौती समक्ष रखी गई दवा अणुओं में से एक विशिष्ट वर्ग हाइड्रोफोबिक दवाओं / इमेजिंग एजेंट जलीय मीडिया में कोई घुलनशीलता को संयम से किया है। यह समस्या नैदानिक स्थापित करने के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों में से शक्तिशाली दवाओं के संक्रमण से ग्रस्त है और होनहार दवा अणुओं की संख्या में हुई है जा रहा है "हटाया" या त्याग दिया और नैदानिक सेटिंग में आगे कार्य नहीं। Wortmannin (Wtmn), उदाहरण के लिए, phosphatidylinositol 3 'kinases और phosphatidylinositol 3' काइनेज से संबंधित kinases का एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला है और एक कैंसर विरोधी एजेंट के रूप में काफी क्षमता है, लेकिन पानी की कमी के घुलनशीलता क्लिनिकल परीक्षण में इसकी प्रगति में बाधा उत्पन्न हो गया है।

हाल ही में, कर्वे एट अल। पता चला है बेहतर जल पWtmn की ubility जब एक लिपिड बहुलक एनपी विधानसभा 19 के रूप में तैयार की है। एक अखाड़ा है कि बहुत एक एनपी तैयार करने के रूप में सुधार, नियंत्रित वितरण के इस प्रकार से फायदा हो सकता है प्लाज्मा झिल्ली हाइड्रोफोबिक दवाओं और इमेजिंग एजेंट का वितरण है। इस प्रकार, यहाँ लक्ष्य इस तकनीकी बाधा को संबोधित करने और एक पद्धति इस तकनीकी बाधा को दूर करने के लिए विकसित किया गया था।

इस पद्धति विकसित करने में, एक मॉडल झिल्ली को निशाना डाई, डियो, का चयन किया गया है कि ऐतिहासिक जलीय मीडिया में गरीब घुलनशीलता से ग्रस्त हो गया है। यह प्लाज्मा झिल्ली को डाई की विशिष्ट वितरण में महत्वपूर्ण चुनौतियों प्रदान करता है। इन चुनौतियों के अलावा क्रिस्टलीय फार्म डाई की सीधे कोशिकाओं या ऊतकों 10 डियो के बहुत उच्च सांद्रता के साथ कमजोर पड़ने के बाद शेयर ऐसे DMSO के 11, 12 के रूप में सॉल्वैंट्स युक्त समाधान से जोड़ सकते हैं या कोशिकाओं सेते हैं की जरूरत है।दृष्टिकोण यहाँ दो गुना था: 1) एनपी संश्लेषण के दौरान LCNPs के हाइड्रोफोबिक कोर में शामिल करने और डियो 2) covalently एक PEGylated कोलेस्ट्रॉल साधना (Dio-LCNP खूंटी चोल के साथ के रूप में संश्लेषित डियो-LCNPs संशोधित) की सुविधा के लिए प्लाज्मा झिल्ली के साथ डियो से भरी हुई एनपीएस के सीधी बातचीत। दरअसल, इस दृष्टिकोण को प्रभावी ढंग से प्लाज्मा झिल्ली डियो की डिलीवरी के पहलुओं की संख्या में सुधार हुआ।

सबसे पहले, डियो की झिल्ली निवास समय प्रभावी ढंग से दोगुनी जब जब डियो थोक समाधान से मुक्त दिया गया था की तुलना में एक LCNP तैयार करने के रूप में दिया गया था। के रूप में सह-धुंधला प्रयोगों से इसकी पुष्टि इस विस्तारित झिल्ली निवास समय डियो-LCNP खूंटी चोल के स्थानीयकरण करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, प्लाज्मा झिल्ली के लिपिड बेड़ा microdomains को conjugates। दूसरा, लिपिड bilayer में डियो माल के विभाजन की झल्लाहट प्रयोगों में जो डियो एक झिल्ली निवासी DiI स्वीकर्ता को दाता के रूप में सेवा द्वारा पुष्टि की गई। अंततःधीमी गति से, झिल्ली bilayer में डियो माल की निरंतर जारी प्रभावी ढंग ~ से 40% डियो की cytotoxicity तनु।

यह प्रोटोकॉल है कि सफलता के लिए महत्वपूर्ण हैं में कई बिंदुओं पर प्रकाश डाला करने के लिए महत्वपूर्ण है। सबसे पहले, LCNP कोर में डियो का प्रतिशत लोडिंग अनुभव से परीक्षण संश्लेषण में अनुकूलित किया जाना चाहिए उच्च गुणवत्ता वाले डियो-LCNP खूंटी चोल एनपीएस की पीढ़ी और सेलुलर वितरण प्रयोगों में प्रतिदीप्ति संकेत के वांछित स्तर के बीच एक संतुलन प्राप्त करने के लिए चलाता है । इसी तरह, डियो-LCNP सतह के लिए चोल खूंटी NH2 आधा भाग के bioconjugation सेलुलर लेबलिंग के वांछित स्तर प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। अंत में, fibronectin लेपित संस्कृति व्यंजन के लिए लागू कोशिकाओं की संख्या में सफलता के लिए महत्वपूर्ण है, और देखभाल ~ 8 x 10 4 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर कोशिकाओं बीज के लिए लिया जाना चाहिए (~ पकवान प्रति 2.4 x 10 5 कोशिकाओं) । कोशिकाओं वरीयता प्राप्त हैं जब भी कम, यह अक्षम झिल्ली लेबलिंग में परिणाम है, जबकि सीई बोनेlls गरीब छवियों है कि स्पष्ट रूप से नहीं कर के अधिग्रहण में भी घनी परिणाम झिल्लीदार लेबलिंग दिखा।

के रूप में वर्णित प्रोटोकॉल का एक संभावित सीमा यह है कि विभिन्न अन्य झिल्ली को निशाना रंगों और दवाओं को शामिल करने की दक्षता डाई / दवा माल की hydrophobicity के आधार पर बदलती जाएगा। इन उदाहरणों में, LCNP संश्लेषण प्रोटोकॉल अनुभव से परीक्षण किया जा करने के लिए आदर्श डाई / दवा माल शामिल करने के लिए इष्टतम संश्लेषण शर्तों का निर्धारण करना होगा।

सारांश में, एक विधि जीवित कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली को एक हाइड्रोफोबिक डाई माल की LCNP आधारित नियंत्रित वितरण कि तकनीकी जल अघुलनशील cargos के सेलुलर वितरण के साथ जुड़े चुनौतियों में से कई पर काबू के लिए विकसित किया गया है। विधि के समग्र महत्व यह है कि यह स्पष्ट रूप से, जबकि एक साथ सहवर्ती cytotoxicity कि एसोसिएटेड है attenuating प्लाज्मा झिल्ली के लिए माल की विशिष्ट वितरण में सुधार हैथोक समाधान से उच्च सांद्रता में हाइड्रोफोबिक cargos के वितरण के साथ iated। यह दृष्टिकोण इसी तरह चुनौतीपूर्ण हाइड्रोफोबिक डाई / इमेजिंग एजेंट cargos के वितरण में व्यापक उपयोगिता का पता लगाना चाहिए और संभावना प्रभावी के संक्रमण की सुविधा के लिए मदद मिलेगी, अभी तक खराब पानी में घुलनशील, नैदानिक ​​सेटिंग करने के लिए प्रयोगात्मक शासन से cargos।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम के एनआरएल बेस अनुदान कार्यक्रम (काम इकाई MA041-06-41-4943) द्वारा समर्थित किया गया। पर एक राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद Postdoctoral रिसर्च एसोसिएटशिप द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

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References

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7, (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28, (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3, (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8, (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208, (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11, (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62, (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12, (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93, (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101, (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97, (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274, (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27, (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (21), 8230-8235 (2012).
एक लिक्विड क्रिस्टल Nanoparticle कैरियर में एक हाइड्रोफोबिक कार्गो समझाया की लक्षित प्लाज्मा झिल्ली प्रसव
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Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).More

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

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