Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier

doi: 10.3791/55181 Published: February 8, 2017

Summary

Жидкокристаллический наночастицами (LCNP) nanocarrier эксплуатируется в качестве носителя для контролируемой доставки гидрофобного груза к плазматической мембране живых клеток.

Abstract

Контролируемая поставка агентов лекарственного средства / визуализации для клеток имеет решающее значение для развития терапевтических средств и для изучения процессов клеточной сигнализации. В последнее время наночастицы (NPS) показали значительные перспективы в развитии таких систем доставки. Здесь жидкокристаллическая НП (LCNP) система доставки основанное была использована для контролируемой доставки нерастворимого в воде краситель, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO), внутри ядра НП в гидрофобной области плазмы мембранный бислой. Во время синтеза наночастиц, краситель эффективно включен в гидрофобное ядро ​​LCNP, как это было подтверждено с несколькими спектроскопических анализов. Конъюгирование производное холестерина пегилированного к поверхности NP (DIO-LCNP-ПЭГ-Хол) позволило связывание красителя загруженным NPs к плазматической мембране в клетках НЕК 293T / 17. Времяразрешенная лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) томография подтвердила пропускив оттоку Диу из ядра LCNP и его введения в плазму мембранный бислой. И, наконец, поставка DiO как LCNP-PEG-Чхоль ослабляется цитотоксичность DiO; НП форма DiO выставлены ~ 30-40% меньшую токсичность по сравнению с DiO свободным избавлены от массы раствора. Такой подход демонстрирует полезность LCNP платформы в качестве эффективного механизма для доставки мембраны специфических и модуляции гидрофобных молекул грузах.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

С момента появления взаимодействия наноматериалов (материалов ≤ 100 нм, по меньшей мере, в одном измерении) с живыми клетками, постоянная цель состояла в том, чтобы воспользоваться уникальными размерами зависящих от свойств наночастиц (NPS) для различных областей применения. Эти приложения включают клеток и тканей маркировки / обработки изображений (как в пробирке и в естественных условиях), в режиме реального времени зондирования, и контролируемой доставки лекарств и других грузов 1. Примерами таких соответствующих свойств NP включают в себя зависящее от размера эмиссии полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек, квантовых точек); в фототермические свойства наночастиц золота; большая несущая способность водной сердцевины липосом; и баллистическая проводимость углерода аллотропов, такие как одностенных углеродных нанотрубок и графена.

В последнее время значительный интерес возник в использовании NPs для контролируемой модуляции лекарственных средств и других грузов, таких как контраст / построения изображенияджентльмены. Здесь суть заключается в существенно повысить / оптимизировать общую растворимость, обеспеченную дозу, время циркуляции, и в конечном итоге оформление груза наркотиков, поставляя его в качестве препарата NP. Это стало известно как NP-опосредованной доставки лекарств (NMDD), и в настоящее время имеется семь FDA утвержденных лекарственные NP для использования в клинике для лечения различных видов рака и сотни больше на различных стадиях клинических испытаний. По сути, цель состоит в том, чтобы "достичь большего с меньшими затратами;" то есть, чтобы использовать NP как строительные леса , чтобы доставить больше лекарства с меньшим количеством дозирующих администраций, пользуясь большой площади поверхности: объем (например, твердые частицы, такие как КТ и оксидов металлов) ЯЭУ или их большой внутренний объем для загрузки большие грузовые полезных нагрузок (например, липосомы или мицеллы). Целью здесь является снижение необходимости в нескольких системно доставленных режимов дозирования в то время как в то же время продвижения водной стабильности и улучшения циркуляции, в частности, длясложные гидрофобные грузов наркотиков, что, в то время как высокоэффективна, плохо растворимы в водных средах.

Таким образом, цель работы, описанной здесь в том, чтобы определить жизнеспособность с помощью нового NP помост для специфической и контролируемой доставки гидрофобных грузов к липофильной плазматической мембраны бислой. Мотивация для работы была присуща ограниченная растворимость и трудности в доставке гидрофобных молекул в клетки из водной среды. Как правило, доставка таких гидрофобных молекул требует использования органических растворителей (например, ДМСО) или амфифильных поверхностно -активных веществ (например, полоксамеры), которые могут быть токсичными и компромиссом клеток и тканей жизнеспособность 2 или мицеллы носители, которые могут иметь ограниченную внутреннюю нагрузку производственные мощности. NP - носитель выбран здесь был роман жидкокристаллический NP (LCNP) препарат разработан ранее 3 и что было показано ранее для достижения ~ 40 раз Улучшение эффективности противоопухолевого препарата доксорубицина в культивируемых клетках 4.

В работе, описанной в данном документе, представитель грузовой выбранный был потенциометрического мембранного красителя, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO). DiO представляет собой нерастворимый в воде краситель , который использовался для Антероградный и ретроградной трассировку в живых и фиксированных нейронах, мембранного потенциала измерений, а также для общей мембраны маркировки 5, 6, 7, 8, 9. Благодаря своей гидрофобной природы, DIO , как правило , добавляют непосредственно к монослоев клеток или тканей , в кристаллической форме 10, или его инкубируют при очень высоких концентрациях (~ 1-20 мкМ) после разбавления от концентрации исходного раствора 11, 12.

Содержание "> Здесь подход был применение к LCNP платформе, многофункциональная НП которого внутреннее ядро ​​полностью гидрофобными и поверхность которого одновременно гидрофильными и поддается биоконъюгации, как средство доставки для DiO. DiO встроен в ядро ​​LCNP в процессе синтеза , а поверхность НП затем функционализированные с холестерином фрагментом пегилированного для продвижения мембраны связывания с DIO-LCNP ансамбля к плазматической мембране. Такой подход привел к системе доставки, которая размечены DIO в плазматической мембране с большей точностью и мембранным жительства времени , чем свободная форма Диу избавлены от массы раствора (DIO бесплатно). кроме того, этот метод показал , что LCNP-опосредованной доставки Диу существенно модулирует и гонит скорость конкретного разделения красителя в липофильной плазматической мембраны бислой. Это достигается при одновременном снижении цитотоксичность свободного препарата на ~ 40%, обеспечивая его в качестве препарата LCNP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Получение DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль

  1. Разведите жидкий кристаллический диакрилат сшивающий агент (DACTP11, 45 мг), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO, 2 мг), и инициатор свободных радикалов (азобисизобутиронитрил, 1 мг) в течение полимеризации в 2 мл хлороформа. Добавьте к этому водному раствору акрилата-функционализированного поверхностно-активного вещества (AC10COONa, 13 мг в 7 мл).
  2. Смесь перемешивают в течение 1 ч и гомогенат, при амплитуде 80% в течение 5 мин для получения miniemulsion, состоящий из мелких капель органического материала, окруженного полимеризуемого поверхностно-активного вещества в воде.
  3. Нагревают смесь до 64 ° C на масляной бане в чтобы инициировать полимеризацию как сшивающего агента и поверхностно-активного вещества, как хлороформ медленно испаряется, оставляя DIO-содержащий NP подвеску, которая стабилизирована поверхностно-активным веществом.
  4. Суспензию фильтруют NP (3 раза) через шприц-фильтр 0,2 мкм для удаления какой-либо агрегации. Stoповторно отфильтрованного раствора NP при 4 ° С до дальнейшего использования.
  5. Конъюгирование PEG-Чхоль к DIO-LCNP через EDC муфты.
    1. Растворите Чхоль-ПЭГ-NH2 & bull ; HCl (ПЭГ-Хол, 0,9 мМ) в 25 мМ HEPES - буфера (рН 7,0).
    2. Приготовить рабочий раствор , содержащий N - гидрокси-sulfosuccinimide натриевой соли (НГС, 40 мМ) и 1-этил-3- (3- (диметиламино) пропил) карбодиимида (EDC, 400 мМ) в буфере HEPES от концентрированных маточных растворов.
    3. Немедленно добавьте 20 мкл свежеприготовленного рабочего раствора НГС / EDC до 1,0 мл DIO-LCNP в буфере HEPES и перемешивают в течение 5 мин.
    4. Добавьте 20 мкл исходного раствора Хол-ПЭГ-NH 2 · HCl , к этой смеси и перемешивают в течение 2 часов.
    5. Кратко центрифугировать реакционную смесь при максимальной скорости (~ 2000 XG) в течение 30 сек с помощью столообразного мини центрифугу и передать супернатант через PD-10 , размер колонки гель -проникающей хроматографии , уравновешенной 13Дульбекко фосфатный буферный солевой раствор (DPBS, 0,1 x).

2. Характеристика DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль

  1. Подтвердите успешную ковалентной конъюгации ПЭГ-Чхоль к поверхности DIO-LCNP с помощью гель - электрофореза.
    1. Растворить 0,5 г агарозы в 50 мл (1x) трис-борат-электрофореза (КЭ; 89 мМ Трис (рН 7,6), 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА) буфере. Раствор нагревают в микроволновой печи для растворения агарозы. Дайте раствору немного остыть и вылить содержимое в гелевой пластине в поле электрофорез. Вставьте гель гребень для создания образцов скважин.
    2. После того, как гель затвердеет, добавьте необходимое количество (достаточно, чтобы погрузить гель в камере) КЭ рабочего буфера в камеру.
    3. Добавьте 35 мкл DIO-LCNP образца (с поправками с глицерином, 5% об / об) в лунки геля и работать в течение 20 мин при напряжении 110 В.
    4. Изображение геля с использованием системы визуализации геля Wiго возбуждения и эмиссии фильтров при длине волны 488 нм и 500-550 нм соответственно.
  2. Оценить размер частиц и распределение с помощью динамического рассеяния света (DLS) путем разбавления DIO-LCNP раствор (~ 200-кратное разведение) в PBS (рН ~ 8, 0.1x) и измерения на DLS инструмента 14. Мера дзета-потенциал DIO-LCNPs с помощью соответствующего дзета-потенциала, измерительный прибор.

3. Получение клеточных культуральных чашках для экспериментов Доставка и обработка изображений

Примечание: маркировка DIO-LCNP выполняется на НЕК 293T / 17 эмбриональные клетки почки человека (между проходами 5 и 15), которые культивировали , как описано ранее 4. Выполните эксперименты доставки и последующую ячейки изображения, как описано ниже.

  1. Готовят 35 мм чашках культуры ткани диаметром (оснащенную 14 мм № 1 покровного стекла вкладышами) путем нанесения на них с бычьим фибронектином (~ 100 мкл при концентрации 20 мкг/ Мл) в DPBS в течение еще 2 ч при 37 ° С.
  2. Удалите раствор фибронектина покрытия от культуральной чашки. Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы первой промывки монослой клеток с 3 мл ДЗФР и затем путем добавления 2 мл трипсин-ЭДТА (0,5% трипсина-0,25% ЭДТА).
  3. Выдержите в колбу при температуре 37 ° С в течение ~ 3 мин. Удалите трипсин-ЭДТА и возвращают колбу в инкубаторе. После того, как клетки отделяют от колбы, нейтрализовать трипсина путем добавления 4 мл полной среды (среда Игла в модификации Дульбекко; DMEM; внесены поправки содержат 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% пирувата натрия и 5% антибиотик / противогрибковым) в колбу , Определить концентрацию клеток в суспензии путем подсчета их в счетчике клеток.
  4. Отрегулируйте концентрацию клеток до ~ 8 × 10 4 клеток / мл среды роста. Добавьте 3 мл суспензии клеток к блюду и культуры в инкубаторе в течение ночи; На следующий день, клетки должны быть ~ 70% сплошности и должен быть готов к использованию. адекватныйплотность клеток имеет решающее значение для надежной и эффективной маркировки высоким процентом клеток.

4. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и визуализации фиксированных клеток

  1. Подготовить 1 мл растворов Dio, DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль в доставочной среде (HEPES-DMEM; DMEM , содержащей 25 мМ HEPES) путем разбавления исходных растворов Диу свободной и DIO-LCNPs; соответствующие концентрации DIO для инкубации на клетках будет ~ 1-10 мкМ (выраженное в любой концентрации Диу свободной или DiO в виде DIO-LCNP).
  2. Удалите среду для роста из чашек для культивирования с использованием серологических пипетки и промыть монослоев клеток (см шаг 3) два раза HEPES-DMEM (2 мл каждого мытья). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя HEPES-DMEM с помощью пипетки к / от края посуды.
  3. Добавить 0,2 мл приготовленных растворов Dio бесплатно или DIO-LCNP доставки в центре блюда культуры и возвращают блюда в Incubator в течение соответствующего периода времени (как правило, 15 или 30 мин, в зависимости от потребностей эксперимента). Более длительное время инкубации добавить к более неспецифической клеточной маркировки не-мембранными областей (например, цитозольных).
  4. После периода инкубации, удалите растворы доставки с помощью серологических пипетки. Промыть клеточные монослои два раза с ДЗФР (2 мл каждой промывки). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя DPBS к / от края тарелки.
  5. Закрепить монослоев клеток с использованием 4% параформальдегида (полученного в ДЗФР) в течение 15 мин при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: параформальдегид является горючим, раздражает дыхательные и канцероген.
  6. Удалите раствор параформальдегида с помощью пипетки и осторожно промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл), добавляя и удаляя DPBS с помощью пипетки / от края посуды.
  7. Фиксированные клетки готовы быть отображены на наличие мембранном флуоресцентного сигнала с помощью конфокальной лазерной сканирующеймикроскопии (CLSM). Выполнить визуализацию немедленно или, в качестве альтернативы, замените носитель с ДЗФР , содержащим 0,05% NaN 3 и хранить посуду при температуре 4 ° С.
    ВНИМАНИЕ: NaN 3 является токсичным; проявлять крайнюю осторожность при использовании NaN 3.
    Примечание: Фиксированные образцы, хранящиеся таким образом, должны быть отображены в течение 48 часов для достижения оптимальных результатов.

5. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и FRET изображений в живых клетках

Примечание: В этом методе клетки colabeled с 6 мкМ каждого DIO-LCNP-ПЭГ-ХОЛ (где DiO является донором FRET) и 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (DII свободный, где DiI является FRET акцептором). Освобождение DiO от DIO-LCNP-PEG-Чхоль и его включения в мембрану плазмы подтверждается наблюдаемым увеличением передачи энергии от донора к DiO DiI акцептора.

  1. Этикетка клетки последовательно с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI Freе используя метод , описанный на этапе 4.
  2. После окрашивания промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл) с использованием серологических пипетки и замените промывочный буфер с 2 мл раствора изображений живых клеток (LCIS).
  3. На стадии микроскопа, снабженного инкубационной камеры с подогревом, изображение образце живой клетки с помощью конфокальной микроскопии (60X цель) с конфигурацией FRET изображений с интервалом в 30 мин в течение 4 ч при возбуждении донора DiO при длине волны 488 нм и собирают полный выброс спектры как донора DiO и DiI акцептора от 490-700 нм с 32-канального детектора спектральной.
  4. Примечание: Для получения дополнительной информации о визуализации FRET см ссылке 15.
  5. Определить с временным разрешением интенсивности излучения как донора DiO и DiI акцептора из клеток, окрашенных с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI. Рассчитайте с временным разрешением акцептор / донор FRET соотношение (DiI ЭМИ / DiO ЭМП) для изображений, который будет неуклонно возрастать и в конце концов пластиныAu раз сумму DiO донора разбито на мембрану достигла максимального 16.

6. цитотоксичности Диу и DIO-LCNPs к НЕК 293T / 17 клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность материалов DIO-LCNP оценивается с использованием анализа 17 пролиферации тетразолиевую на основе красителя. Клетки культивируют в многоямного пластины в присутствии различных концентраций веществ в условиях, которые имитируют доставки / маркировки. Клетки затем культивировали в течение 72 ч, чтобы обеспечить пролиферации. Краситель (МТС, (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолия) затем добавляют в лунки, и метаболически активными клетки превращают краситель в синий формазана. количество образуемого цвета прямо пропорционально числу жизнеспособных клеток.

  1. Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы, следуя процедуре, описанной в стадии 3.2.SeedНЕК 293T 17 клеток / (5000 клеток / 100 мкл / лунку) в лунки для культуры ткани обработанной пластины 96-луночного и культуры в течение 24 часов.
  2. Полное удаление культуральной среды из скважин с помощью микропипетки и добавить 50 мкл HEPES-DMEM , содержащие Dio бесплатно, DIO-LCNPs или DIO-LCNP-PEG-Чхоль при увеличении концентрации реплицировать скважин. Инкубируют на клетки при 37 ° С в течение 30 мин.
    Примечание: Как правило, реплицируется сделано в трех экземплярах или четырех повторностях достаточны для получения статистически достоверных данных.
    1. После инкубации удалите среду доставки, содержащей материалы, используя микропипетку и заменить его на 100 мкл ростовой среды. Культуры клеток в течение 72 ч.
  3. Добавьте 20 мкл тетразолия субстрата в каждую лунку, вернуть пластину в инкубаторе, и позволить образование цвета протекать при температуре 37 ° С в течение 4 часов. Измерить оптическую плотность (ABS) формазана продукта при 570 нм (поглощение минимумов для DIO-LCNPs, используемых в этом СТЮду) и 650 нм (для вычитания неспецифического фона оптической плотности) с использованием ридере.
  4. Участок значение дифференциальной оптической плотности (ABS 570 - ABS 650) в зависимости от материала концентрации и сообщить о результатах в процентах пролиферации клеток (контроль степени пролиферации клеток в среде для культивирования клеток только).

7. Анализ данных

  1. Статистически анализировать данные с однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для множественных сравнений, применяются после испытания специальной в Бонферрони. Обеспечить все средние значения, как ± стандартная ошибка среднего (SEM), если не указано иное.
    Примечание: Приемлемая вероятность значение имело р <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LCNPs были подготовлены, в котором был загружен гидрофобное ядро ​​NP с репрезентативной мембраной мечения зонда, чтобы продемонстрировать полезность LCNP как эффективное средство доставки для гидрофобных грузов. С этой целью груз был выбран весьма растворимым в воде потенциометрический мембрана мечение краситель, DIO. DIO-нагруженные LCNPs (DIO-LCNPs) были синтезированы с использованием двухфазной техники мини-эмульсии с химическими компонентами DACTP11, AC10COONa и Dio, как показано на рисунке 1 18. В этой системе НП, ковалентно связанный полимерную сеть кристаллического сшивающего агента DACTP11 обеспечивает стабильную гидрофобную сердцевину, где DiO проживает в пределах интерстициальные пространства в сшитом сети. Карбоксилатные группы на поверхности NP обеспечивают стабильность коллоидного частицы в водной среде в то же время, выступающей в качестве функциональной группы «ручкой» для прикрепления клеток нацеливания лигандов(И других биологических препаратов). Привязанный к DIO-LCNPs к плазматической мембране, амин с концевыми ПЭГилированное холестерина фрагмент (PEG-Чхоль) был ковалентно присоединен к поверхности LCNP через EDC муфты (рисунок 1). После синтеза NP и подтверждения успешного биоконъюгации, способность к DIO-LCNPs маркировать плазматической мембраны живых клеток и доставить встроенный Dio груз к липофильной части плазмы мембранного бислоя с улучшенной специфичностью и кинетики по сравнению со свободным форма (DIO бесплатно) избавлены от массы раствора оценивали.

Как показано на рисунке 2 A, DIO бесплатно (6,0 мкМ) робастно окрашивали плазматическую мембрану с высокой эффективностью (почти 100% клеток маркированы) после 15 - минутной инкубации с клетками НЕК 293T / 17. Тем не менее, наблюдается при лишь незначительное увеличение значительная клеточная интернализация DiO бесплатноВремя инкубации до 30 мин (рис 2 A и C). Степень Диу свободного интернализации определялась Эксперименты с временным разрешением колокализации , в которых клетки сначала инкубировали с 6,0 мкМ DiO бесплатно (30 мин). DiO свободный -содержащие инкубационную среду удаляли и клетки были впоследствии культивировали в течение до 4 часов. Плазматической мембраны клетки подвергали контрастному окрашиванию красителем меченных мембранного фосфолипида (фосфоэтаноламин, конъюгированного с родамина B; РЕ-Rhoda). Как показано на рисунке 2 С, после 15 - минутной инкубации, почти 100% Диу бесплатно был локализуется с маркером PE-Рода (коэффициент колокализация Пирсона; PCC = 0,99 ± 0,01). Тем не менее, после 30 - минутной инкубации ~ 80% Диу бесплатно оставалась св занного с мембраной (~ 20%) усвоены. Степень DiO свободного интернализации неуклонно растет , как гоВремя инкубации е был продлен до тех пор , как 4 часа, и это нашло свое отражение в сопутствующим снижением PCC между Дио и Рода-PE (Рисунок 2 C). Подгонка данных к уравнению экспоненциального распада однофазной показало , что DiO свободный интернализации достиг максимума ~ 50% на 1 час, при скорости интернализации (к = 0,045 мин -1) и период полураспада (15 мин) что отражает быстрое и эффективное клеточное поглощение Диу свободной. Эти данные демонстрируют быстрое зависимое от времени перехода Диу свободного от плазматической мембраны в цитозоль, где он оставался в значительной степени исключены из ядра через 4 ч периода времени исследованы.

Учитывая неконтролируемый клеточный захват Диу свободный, цель стала модулировать это поведение путем поставки DiO в качестве препарата LCNP-PEG-Чхоль NP. При поставке в качестве биоконъюгата LCNP-PEG-Хол, более стойкие мембраны Residвремя симость DiO по сравнению с DiO бесплатно было отмечено (рисунок 2 B). После 15 мин инкубации DIO-LCNP-PEG-Чхором с клетками, почти 100% сигнала DiO располагался на плазматической мембране, где он локализуется с мембранным маркером РЕ-Rhoda, в результате, что было сравнимо с что наблюдается для DiO свободной. Было отмечено, однако, что в то время как DiO свободная маркировка мембраны была довольно однородным и непрерывным, окрашивание картина DIO-LCNP-PEG-Чхором после 15 мин инкубации была более точечное и не столь однородными по природе (рис 2 В). Этот результат показал, что DIO-LCNP-PEG чоль NPs собирали в дискретных областях в плазматической мембране. Когда время инкубации был увеличен до 30 мин, ~ 94% сигнала DiO осталась на мембране ( по сравнению с ~ 80% в течение DiO свободного в это же момент времени) (рис 2 В и 2С). Эта тенденция становится еще более заметным, как клетки культивировали с DIO-LCNP-ПЭГ-ХОЛ NPs для все более и более длительное время после первоначального 30-минутной инкубации. Например, после того, как культуры в течение 1 ч после начальной инкубации около 80% от сигнала DIO-LCNP-ПЭГ-Хол NP остался мембранозной и локализуется с маркером РЕ-Rhoda ( по сравнению с ~ 55% DiO бесплатно). Примечательно, что клеточная интернализация DIO-LCNP-PEG-холь NPs достиг максимума в 30% в 2 часа (70% удержания мембраны). Это соответствует ячеистой скорости поглощения (к = 0,024 мин -1; Период полураспада = 29 мин) , что ровно половина , что наблюдается для интернализации DiO свободной.

Далее, способность НП-внедренного DiO груза эффективно оттоке из ядра LCNP и ввести липофильный среду плазматической мембраны бислой контролируемым и зависимым от времени образом была определена. коценить это, стратегия FRET на основе была разработана, в котором DiO служит донором FRET занимается передачей энергии акцепторного красителя, DiI. Как и следовало ожидать, при первоначальной маркировки (т = 0 мин), эмиссионный сигнал доминировала донора DiO , содержащегося в мембране-привязи NPs (рисунок 3 В). FRET изображений этого же поля 4 ч позже (т = 240 мин), тем не менее, показал значительное увеличение эмиссионного сигнала от DiI акцептора, убедительное доказательство перехода донора DiO из ядра LCNP в плазму мембранный бислой (Рисунок 3 С). Рассмотрение времяразрешенного природы этого перехода показали стабильное снижение DiO излучения донора в сочетании с соответствующим увеличением DiI эмиссии акцепторного над экспериментальным окном 4 ч (рис 3 D). Следует отметить, что эффективность FRET во время этого перехода достиг своего максимама при ~ 180 мин после первоначальной маркировки, предполагая , что отлив и мембранные перегородки донора DiO достигла своего максимума в этот момент времени (рисунок 3 E). Эти данные предоставляются убедительные доказательства времяразрешенного разбиения DiO из НП в плазму мембранный бислой, который достиг своего максимального ~ 3 ч после первоначальная маркировка с DIO-LCNP-PEG-Чхоль NPs.

Наконец, сравнительный анализ цитотоксичности проводили для DiO свободного по сравнению с DIO-LCNP-PEG-Чол. Когда инкубировали с клетками НЕК 293T / 17 (при концентрации DiO 6 мкМ в обоих случаях), было ясно, что инкапсуляция DiO в пределах ядра LCNP ослабляется его цитотоксичность. В то время как DiO свободный вызвал клеточные viabilities из ~ 50%, клетки , инкубированные с DIO-LCNP-PEG-Чхоль выставлены клеточные viabilities ~ 90%. (Рисунок 4). Кумулятивно, данные мечения клеток в сочетании с сотовым ТОКСИгородские данные показывают улучшения в обоих эффективности DIO-основанной маркировки мембран и модуляции цитотоксичности Диу.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схематическое изображение мембранного связывания DIO-LCNP-PEG-Чол. DIO-LCNP состоит из акрилата жидкого кристалла сшивающего агента (DACTP11); карбоксильную концевыми полимеризуемый поверхностно-активное вещество (AC10COONa); и липофильный краситель, DIO. Холестерин-поли (этиленгликоль) (ПЭГ-Хол) конъюгировали с DIO-LCNP с помощью EDC муфты. Добавление Чхором к поверхности DIO-LCNP опосредует предпочтительное связывание НП к плазматической мембране. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2: Времяразрешенная клеточное поглощение Диу бесплатно в НЕК 293 T / 17 клеток. DiO свободный (6,0 мкМ, панель (А) или DIO-LCNP-ПЭГ-Хол ([DiO] = 6,0 мкМ, панель (В) , инкубировали на монослоев клеток в течение 15 мин, удаляют и заменяют средой роста; клетки культивировали в течение времени, указанных (до 4 ч). Клетки затем окрашивают РЕ-Rhoda (2,0 мкМ) и фиксировали. образцы были обследованы для DiO (зеленый) и связанный с мембраной PE-Рода (красный) с помощью КЛСМ. ( с) с разрешением по времени график процента мембраносвязанных DiO свободной или DIO-LCNP-ПЭГ-Хол сигнала в зависимости от увеличения продолжительности времени инкубации. данные были получены от коэффициента колокализационные Пирсона (PCC, N = 3 & #177; стандартное отклонение) зеленого цвета (DIO) и красный () каналов ПЭ-Рода, и выражается в процентах (± SEM) после нормализации к PCC, соответствующей 15-минутной инкубации. Шкала бар = 20 мкм. Печатается с разрешения автора из ссылки 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Времяразрешенная FRET подтверждает оттоку Диу от DIO-LCNP-PEG-Чхоль к плазматической мембране. HEK293T / 17 Клетки costained с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI, где DiO (зеленый) и излучающего DiI (красные красители, излучающие) выступать в качестве донора FRET и акцептор соответственно. (А) DIC образ живых клеток costained с DIO-LCNP-PEG-Чхоль ([DiO] = 6,0 мкМ) и DiI (6,0 мкМ). В sдостаточно изображался контролировать изменение сигнала FRET в течение периода 4 ч. (В) и (С) являются лада изображения живых клеток на той же фокальной плоскости при Т = 0 мин и Т = 240 мин, соответственно. (D) Нормализованная, с разрешением по времени интенсивность излучения донора Дио и DiI акцептора из клеток , окрашенных с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI и отображенных в режиме возбуждения ладу. (E) с временным разрешением отношение FRET (DiI ЭМИ / DiO ЭМИ) для клеток , меченных DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI и отображенных в конфигурации ладу. Шкала бар = 20 мкм. Печатается с разрешения автора из ссылки 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4 Количественное цитотоксичности. DiO бесплатно, LCNP, DIO-LCNPs, или DIO-LCNP-ПЭГ-Хол, инкубировали на НЕК 293T / 17 монослоев клеток в течение 15 мин , а затем удаляется. Клетки отмывали и культивировали в среде для выращивания в течение 72 ч до анализа MTS. Гистограмма представляет собой сравнение жизнеспособности клеток (п = 5 ± SEM) Диу свободной, LCNP, DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чол на [DiO] = 6,0 мкМ. Разница между DiO свободной и LCNP, DIO-LCNP или DIO-LCNP-PEG-Чхоль являются значимыми (р <0,001) при 72 ч инкубации. Печатается с разрешения автора из ссылки 18. Данные были проанализированы с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA); Постфактум испытатель Бонферрони использовался для множественных сравнений. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Продолжающееся цель NMDD является контролируемое нацеливание и доставку лекарственных средств для клеток и тканей, в сочетании с одновременным улучшением эффективности лекарственного средства. Один конкретный класс молекул лекарственного средства, для которых это представляет серьезную проблему является гидрофобные агенты лекарства / обработки изображений, которые экономно не растворяются в водной среде. Эта проблема преследует переход сильнодействующих препаратов из ин витро системах клеточных культур в клинических условиях , и привело к ряду перспективных молекул лекарственных средств, " под сукно" или отказались и не дополнительно рассмотрен клинических условиях. Вортманнин (Wtmn), например, является мощным ингибитором фосфатидилинозитол 3 'киназ и фосфатидилинозитол 3' киназ киназ, связанных с и имеет большой потенциал в качестве противоопухолевого агента, но его отсутствие растворимости в воде препятствует ее прогрессии в клинических испытаниях.

В последнее время , Karve и др. показали улучшение золь водыubility из Wtmn , когда приготовлена в виде липидно-полимера NP узла 19. Одна арена, которые могли бы извлечь большую пользу из такого рода улучшения, контролируемой поставки в качестве композиции NP является поставка гидрофобных лекарственных средств и агентов визуализации к плазматической мембране. Таким образом, целью было решить эту техническую и препятствие разработать методологию, чтобы преодолеть этот технологический барьер.

При разработке этой методики, модель мембранной ориентации краситель, DIO, был выбран, который исторически страдает от плохой растворимости в водных средах. Это придает значительные трудности в специфической доставки красителя к плазматической мембране. Среди этих проблем необходимо добавить кристаллическую форму красителя непосредственно в клетки или ткани 10 или на инкубацию клеток с очень высокой концентрацией DiO после разбавления из маточных растворов , содержащих растворители , такие как ДМСО , 11, 12.Подход здесь был два раза: 1) включить DIO в гидрофобную сердцевину LCNPs в процессе синтеза NP и 2), ковалентно модифицировать синтезированного DIO-LCNPs с холестеринового конъюгата ПЭГ (DIO-LCNP-PEG-Хол), чтобы облегчить прямое взаимодействие DIO-нагруженных Соседства с плазматической мембраной. В самом деле, этот подход эффективно улучшить ряд аспектов доставки DiO к плазматической мембране.

Во-первых, время пребывания мембраны DiO был удвоены при поставке в виде препарата LCNP по сравнению с тем, когда DiO был доставлен свободной от массы раствора. Это длительное время мембраны жительства было связано с локализацией DIO-LCNP-PEG-Чхоль сопрягает к липидные рафты микродоменных мембраны плазмы, что подтверждается совместным окрашиванием экспериментов. Во-вторых, разделение груза DiO в липидный бислой было подтверждено экспериментами FRET, в которых DiO служил в качестве донора к мембранным резидентные DiI акцептора. И, наконец,медленное, пролонгированное высвобождение груза DiO в мембранный бислой эффективно ослабляется цитотоксичность DiO на ~ 40%.

Важно, чтобы выделить несколько пунктов в протоколе, которые имеют решающее значение для успеха. Во-первых, процент нагрузка DiO в ядро ​​LCNP должны быть эмпирически оптимизировано в синтезе пробных опытов, чтобы получить баланс между генерацией высокого качества DIO-LCNP-PEG-Хол NPs и желаемым уровнем сигнала флуоресценции в экспериментах клеточных доставки , Аналогично, биоконъюгации из фрагмента Чхор-ПЭГ-NH2 на поверхности DIO-LCNP должны быть оптимизированы, чтобы получить желаемый уровень клеточной маркировки. Наконец, количество клеток , применяемых к покрытой фибронектином культуральных чашках имеет решающее значение для успеха, и необходимо соблюдать осторожность , чтобы семя клеток при плотности ~ 8 × 10 4 клеток / мл (~ 2,4 · 10 5 клеток на чашку) , Когда клетки высевают слишком редко, это приводит к неэффективному мечения мембраны, в то время как засева CELLS слишком плотно приводит к приобретению бедных образов, которые явно не показывают мембранную маркировку.

Одним из возможных ограничение как писано протокола является то, что эффективность включения различных других мембранных нацеливания красителей и препаратов будет варьироваться в зависимости от гидрофобности груза краситель / лекарственный препарат. В этих случаях протокол синтеза LCNP должны быть проверены эмпирически определить оптимальные условия синтеза для идеального груза включения красителя / наркотиков.

Таким образом, метод был разработан для LCNP основе контролируемой доставки груза гидрофобного красителя к плазматической мембране живых клеток, которые преодолевают многие из технических проблем, связанных с клеточной доставки нерастворимых в воде грузах. Общая значимость метода заключается в том, что он явно улучшает специфическую доставку груза к плазматической мембране, одновременно ослабляя сопутствующую цитотоксичность, которое ассоциативныйзанного с поставкой гидрофобных грузов при высоких концентрациях от массы раствора. Такой подход должен найти широкое применение в доставке аналогично сложных гидрофобных грузов агента красителя / визуализации и, вероятно, поможет облегчить переход эффективной, но плохо растворимые в воде, грузы из экспериментального режима в клинических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Программой финансирования NRL (Base Unit MA041-06-41-4943 работа). ON поддерживается Национальным исследовательским советом докторант Research Associateship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7, (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28, (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3, (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8, (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208, (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11, (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62, (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12, (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93, (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101, (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97, (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274, (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27, (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (21), 8230-8235 (2012).
Целенаправленное плазматической мембраны Поставка гидрофобной Cargo инкапсулированы в жидком кристалле наночастицы Carrier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).More

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter