Summary
Жидкокристаллический наночастицами (LCNP) nanocarrier эксплуатируется в качестве носителя для контролируемой доставки гидрофобного груза к плазматической мембране живых клеток.
Abstract
Контролируемая поставка агентов лекарственного средства / визуализации для клеток имеет решающее значение для развития терапевтических средств и для изучения процессов клеточной сигнализации. В последнее время наночастицы (NPS) показали значительные перспективы в развитии таких систем доставки. Здесь жидкокристаллическая НП (LCNP) система доставки основанное была использована для контролируемой доставки нерастворимого в воде краситель, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO), внутри ядра НП в гидрофобной области плазмы мембранный бислой. Во время синтеза наночастиц, краситель эффективно включен в гидрофобное ядро LCNP, как это было подтверждено с несколькими спектроскопических анализов. Конъюгирование производное холестерина пегилированного к поверхности NP (DIO-LCNP-ПЭГ-Хол) позволило связывание красителя загруженным NPs к плазматической мембране в клетках НЕК 293T / 17. Времяразрешенная лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) томография подтвердила пропускив оттоку Диу из ядра LCNP и его введения в плазму мембранный бислой. И, наконец, поставка DiO как LCNP-PEG-Чхоль ослабляется цитотоксичность DiO; НП форма DiO выставлены ~ 30-40% меньшую токсичность по сравнению с DiO свободным избавлены от массы раствора. Такой подход демонстрирует полезность LCNP платформы в качестве эффективного механизма для доставки мембраны специфических и модуляции гидрофобных молекул грузах.
Introduction
С момента появления взаимодействия наноматериалов (материалов ≤ 100 нм, по меньшей мере, в одном измерении) с живыми клетками, постоянная цель состояла в том, чтобы воспользоваться уникальными размерами зависящих от свойств наночастиц (NPS) для различных областей применения. Эти приложения включают клеток и тканей маркировки / обработки изображений (как в пробирке и в естественных условиях), в режиме реального времени зондирования, и контролируемой доставки лекарств и других грузов 1. Примерами таких соответствующих свойств NP включают в себя зависящее от размера эмиссии полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек, квантовых точек); в фототермические свойства наночастиц золота; большая несущая способность водной сердцевины липосом; и баллистическая проводимость углерода аллотропов, такие как одностенных углеродных нанотрубок и графена.
В последнее время значительный интерес возник в использовании NPs для контролируемой модуляции лекарственных средств и других грузов, таких как контраст / построения изображенияджентльмены. Здесь суть заключается в существенно повысить / оптимизировать общую растворимость, обеспеченную дозу, время циркуляции, и в конечном итоге оформление груза наркотиков, поставляя его в качестве препарата NP. Это стало известно как NP-опосредованной доставки лекарств (NMDD), и в настоящее время имеется семь FDA утвержденных лекарственные NP для использования в клинике для лечения различных видов рака и сотни больше на различных стадиях клинических испытаний. По сути, цель состоит в том, чтобы "достичь большего с меньшими затратами;" то есть, чтобы использовать NP как строительные леса , чтобы доставить больше лекарства с меньшим количеством дозирующих администраций, пользуясь большой площади поверхности: объем (например, твердые частицы, такие как КТ и оксидов металлов) ЯЭУ или их большой внутренний объем для загрузки большие грузовые полезных нагрузок (например, липосомы или мицеллы). Целью здесь является снижение необходимости в нескольких системно доставленных режимов дозирования в то время как в то же время продвижения водной стабильности и улучшения циркуляции, в частности, длясложные гидрофобные грузов наркотиков, что, в то время как высокоэффективна, плохо растворимы в водных средах.
Таким образом, цель работы, описанной здесь в том, чтобы определить жизнеспособность с помощью нового NP помост для специфической и контролируемой доставки гидрофобных грузов к липофильной плазматической мембраны бислой. Мотивация для работы была присуща ограниченная растворимость и трудности в доставке гидрофобных молекул в клетки из водной среды. Как правило, доставка таких гидрофобных молекул требует использования органических растворителей (например, ДМСО) или амфифильных поверхностно -активных веществ (например, полоксамеры), которые могут быть токсичными и компромиссом клеток и тканей жизнеспособность 2 или мицеллы носители, которые могут иметь ограниченную внутреннюю нагрузку производственные мощности. NP - носитель выбран здесь был роман жидкокристаллический NP (LCNP) препарат разработан ранее 3 и что было показано ранее для достижения ~ 40 раз Улучшение эффективности противоопухолевого препарата доксорубицина в культивируемых клетках 4.
В работе, описанной в данном документе, представитель грузовой выбранный был потенциометрического мембранного красителя, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO). DiO представляет собой нерастворимый в воде краситель , который использовался для Антероградный и ретроградной трассировку в живых и фиксированных нейронах, мембранного потенциала измерений, а также для общей мембраны маркировки 5, 6, 7, 8, 9. Благодаря своей гидрофобной природы, DIO , как правило , добавляют непосредственно к монослоев клеток или тканей , в кристаллической форме 10, или его инкубируют при очень высоких концентрациях (~ 1-20 мкМ) после разбавления от концентрации исходного раствора 11, 12.
Содержание "> Здесь подход был применение к LCNP платформе, многофункциональная НП которого внутреннее ядро полностью гидрофобными и поверхность которого одновременно гидрофильными и поддается биоконъюгации, как средство доставки для DiO. DiO встроен в ядро LCNP в процессе синтеза , а поверхность НП затем функционализированные с холестерином фрагментом пегилированного для продвижения мембраны связывания с DIO-LCNP ансамбля к плазматической мембране. Такой подход привел к системе доставки, которая размечены DIO в плазматической мембране с большей точностью и мембранным жительства времени , чем свободная форма Диу избавлены от массы раствора (DIO бесплатно). кроме того, этот метод показал , что LCNP-опосредованной доставки Диу существенно модулирует и гонит скорость конкретного разделения красителя в липофильной плазматической мембраны бислой. Это достигается при одновременном снижении цитотоксичность свободного препарата на ~ 40%, обеспечивая его в качестве препарата LCNP.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль
- Разведите жидкий кристаллический диакрилат сшивающий агент (DACTP11, 45 мг), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine перхлорат (DIO, 2 мг), и инициатор свободных радикалов (азобисизобутиронитрил, 1 мг) в течение полимеризации в 2 мл хлороформа. Добавьте к этому водному раствору акрилата-функционализированного поверхностно-активного вещества (AC10COONa, 13 мг в 7 мл).
- Смесь перемешивают в течение 1 ч и гомогенат, при амплитуде 80% в течение 5 мин для получения miniemulsion, состоящий из мелких капель органического материала, окруженного полимеризуемого поверхностно-активного вещества в воде.
- Нагревают смесь до 64 ° C на масляной бане в чтобы инициировать полимеризацию как сшивающего агента и поверхностно-активного вещества, как хлороформ медленно испаряется, оставляя DIO-содержащий NP подвеску, которая стабилизирована поверхностно-активным веществом.
- Суспензию фильтруют NP (3 раза) через шприц-фильтр 0,2 мкм для удаления какой-либо агрегации. Stoповторно отфильтрованного раствора NP при 4 ° С до дальнейшего использования.
- Конъюгирование PEG-Чхоль к DIO-LCNP через EDC муфты.
- Растворите Чхоль-ПЭГ-NH2 & bull ; HCl (ПЭГ-Хол, 0,9 мМ) в 25 мМ HEPES - буфера (рН 7,0).
- Приготовить рабочий раствор , содержащий N - гидрокси-sulfosuccinimide натриевой соли (НГС, 40 мМ) и 1-этил-3- (3- (диметиламино) пропил) карбодиимида (EDC, 400 мМ) в буфере HEPES от концентрированных маточных растворов.
- Немедленно добавьте 20 мкл свежеприготовленного рабочего раствора НГС / EDC до 1,0 мл DIO-LCNP в буфере HEPES и перемешивают в течение 5 мин.
- Добавьте 20 мкл исходного раствора Хол-ПЭГ-NH 2 · HCl , к этой смеси и перемешивают в течение 2 часов.
- Кратко центрифугировать реакционную смесь при максимальной скорости (~ 2000 XG) в течение 30 сек с помощью столообразного мини центрифугу и передать супернатант через PD-10 , размер колонки гель -проникающей хроматографии , уравновешенной 13Дульбекко фосфатный буферный солевой раствор (DPBS, 0,1 x).
2. Характеристика DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль
- Подтвердите успешную ковалентной конъюгации ПЭГ-Чхоль к поверхности DIO-LCNP с помощью гель - электрофореза.
- Растворить 0,5 г агарозы в 50 мл (1x) трис-борат-электрофореза (КЭ; 89 мМ Трис (рН 7,6), 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА) буфере. Раствор нагревают в микроволновой печи для растворения агарозы. Дайте раствору немного остыть и вылить содержимое в гелевой пластине в поле электрофорез. Вставьте гель гребень для создания образцов скважин.
- После того, как гель затвердеет, добавьте необходимое количество (достаточно, чтобы погрузить гель в камере) КЭ рабочего буфера в камеру.
- Добавьте 35 мкл DIO-LCNP образца (с поправками с глицерином, 5% об / об) в лунки геля и работать в течение 20 мин при напряжении 110 В.
- Изображение геля с использованием системы визуализации геля Wiго возбуждения и эмиссии фильтров при длине волны 488 нм и 500-550 нм соответственно.
- Оценить размер частиц и распределение с помощью динамического рассеяния света (DLS) путем разбавления DIO-LCNP раствор (~ 200-кратное разведение) в PBS (рН ~ 8, 0.1x) и измерения на DLS инструмента 14. Мера дзета-потенциал DIO-LCNPs с помощью соответствующего дзета-потенциала, измерительный прибор.
3. Получение клеточных культуральных чашках для экспериментов Доставка и обработка изображений
Примечание: маркировка DIO-LCNP выполняется на НЕК 293T / 17 эмбриональные клетки почки человека (между проходами 5 и 15), которые культивировали , как описано ранее 4. Выполните эксперименты доставки и последующую ячейки изображения, как описано ниже.
- Готовят 35 мм чашках культуры ткани диаметром (оснащенную 14 мм № 1 покровного стекла вкладышами) путем нанесения на них с бычьим фибронектином (~ 100 мкл при концентрации 20 мкг/ Мл) в DPBS в течение еще 2 ч при 37 ° С.
- Удалите раствор фибронектина покрытия от культуральной чашки. Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы первой промывки монослой клеток с 3 мл ДЗФР и затем путем добавления 2 мл трипсин-ЭДТА (0,5% трипсина-0,25% ЭДТА).
- Выдержите в колбу при температуре 37 ° С в течение ~ 3 мин. Удалите трипсин-ЭДТА и возвращают колбу в инкубаторе. После того, как клетки отделяют от колбы, нейтрализовать трипсина путем добавления 4 мл полной среды (среда Игла в модификации Дульбекко; DMEM; внесены поправки содержат 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% пирувата натрия и 5% антибиотик / противогрибковым) в колбу , Определить концентрацию клеток в суспензии путем подсчета их в счетчике клеток.
- Отрегулируйте концентрацию клеток до ~ 8 × 10 4 клеток / мл среды роста. Добавьте 3 мл суспензии клеток к блюду и культуры в инкубаторе в течение ночи; На следующий день, клетки должны быть ~ 70% сплошности и должен быть готов к использованию. адекватныйплотность клеток имеет решающее значение для надежной и эффективной маркировки высоким процентом клеток.
4. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и визуализации фиксированных клеток
- Подготовить 1 мл растворов Dio, DIO-LCNP и DIO-LCNP-PEG-Чхоль в доставочной среде (HEPES-DMEM; DMEM , содержащей 25 мМ HEPES) путем разбавления исходных растворов Диу свободной и DIO-LCNPs; соответствующие концентрации DIO для инкубации на клетках будет ~ 1-10 мкМ (выраженное в любой концентрации Диу свободной или DiO в виде DIO-LCNP).
- Удалите среду для роста из чашек для культивирования с использованием серологических пипетки и промыть монослоев клеток (см шаг 3) два раза HEPES-DMEM (2 мл каждого мытья). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя HEPES-DMEM с помощью пипетки к / от края посуды.
- Добавить 0,2 мл приготовленных растворов Dio бесплатно или DIO-LCNP доставки в центре блюда культуры и возвращают блюда в Incubator в течение соответствующего периода времени (как правило, 15 или 30 мин, в зависимости от потребностей эксперимента). Более длительное время инкубации добавить к более неспецифической клеточной маркировки не-мембранными областей (например, цитозольных).
- После периода инкубации, удалите растворы доставки с помощью серологических пипетки. Промыть клеточные монослои два раза с ДЗФР (2 мл каждой промывки). Выполните промывок, осторожно добавляя и удаляя DPBS к / от края тарелки.
- Закрепить монослоев клеток с использованием 4% параформальдегида (полученного в ДЗФР) в течение 15 мин при комнатной температуре.
ВНИМАНИЕ: параформальдегид является горючим, раздражает дыхательные и канцероген. - Удалите раствор параформальдегида с помощью пипетки и осторожно промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл), добавляя и удаляя DPBS с помощью пипетки / от края посуды.
- Фиксированные клетки готовы быть отображены на наличие мембранном флуоресцентного сигнала с помощью конфокальной лазерной сканирующеймикроскопии (CLSM). Выполнить визуализацию немедленно или, в качестве альтернативы, замените носитель с ДЗФР , содержащим 0,05% NaN 3 и хранить посуду при температуре 4 ° С.
ВНИМАНИЕ: NaN 3 является токсичным; проявлять крайнюю осторожность при использовании NaN 3.
Примечание: Фиксированные образцы, хранящиеся таким образом, должны быть отображены в течение 48 часов для достижения оптимальных результатов.
5. Клеточная Поставка Дио и DIO-LCNPs и FRET изображений в живых клетках
Примечание: В этом методе клетки colabeled с 6 мкМ каждого DIO-LCNP-ПЭГ-ХОЛ (где DiO является донором FRET) и 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine перхлорат (DII свободный, где DiI является FRET акцептором). Освобождение DiO от DIO-LCNP-PEG-Чхоль и его включения в мембрану плазмы подтверждается наблюдаемым увеличением передачи энергии от донора к DiO DiI акцептора.
- Этикетка клетки последовательно с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI Freе используя метод , описанный на этапе 4.
- После окрашивания промыть клетки 1 раз с ДЗФР (2 мл) с использованием серологических пипетки и замените промывочный буфер с 2 мл раствора изображений живых клеток (LCIS).
- На стадии микроскопа, снабженного инкубационной камеры с подогревом, изображение образце живой клетки с помощью конфокальной микроскопии (60X цель) с конфигурацией FRET изображений с интервалом в 30 мин в течение 4 ч при возбуждении донора DiO при длине волны 488 нм и собирают полный выброс спектры как донора DiO и DiI акцептора от 490-700 нм с 32-канального детектора спектральной.
- Примечание: Для получения дополнительной информации о визуализации FRET см ссылке 15.
- Определить с временным разрешением интенсивности излучения как донора DiO и DiI акцептора из клеток, окрашенных с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI. Рассчитайте с временным разрешением акцептор / донор FRET соотношение (DiI ЭМИ / DiO ЭМП) для изображений, который будет неуклонно возрастать и в конце концов пластиныAu раз сумму DiO донора разбито на мембрану достигла максимального 16.
6. цитотоксичности Диу и DIO-LCNPs к НЕК 293T / 17 клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность материалов DIO-LCNP оценивается с использованием анализа 17 пролиферации тетразолиевую на основе красителя. Клетки культивируют в многоямного пластины в присутствии различных концентраций веществ в условиях, которые имитируют доставки / маркировки. Клетки затем культивировали в течение 72 ч, чтобы обеспечить пролиферации. Краситель (МТС, (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -5- (3-карбоксиметоксифенил) -2- (4-сульфофенил) -2H-тетразолия) затем добавляют в лунки, и метаболически активными клетки превращают краситель в синий формазана. количество образуемого цвета прямо пропорционально числу жизнеспособных клеток.
- Урожай НЕК 293 Т1 / 7 клеток, отобранных из Т-25 колбы, следуя процедуре, описанной в стадии 3.2.SeedНЕК 293T 17 клеток / (5000 клеток / 100 мкл / лунку) в лунки для культуры ткани обработанной пластины 96-луночного и культуры в течение 24 часов.
- Полное удаление культуральной среды из скважин с помощью микропипетки и добавить 50 мкл HEPES-DMEM , содержащие Dio бесплатно, DIO-LCNPs или DIO-LCNP-PEG-Чхоль при увеличении концентрации реплицировать скважин. Инкубируют на клетки при 37 ° С в течение 30 мин.
Примечание: Как правило, реплицируется сделано в трех экземплярах или четырех повторностях достаточны для получения статистически достоверных данных.- После инкубации удалите среду доставки, содержащей материалы, используя микропипетку и заменить его на 100 мкл ростовой среды. Культуры клеток в течение 72 ч.
- Добавьте 20 мкл тетразолия субстрата в каждую лунку, вернуть пластину в инкубаторе, и позволить образование цвета протекать при температуре 37 ° С в течение 4 часов. Измерить оптическую плотность (ABS) формазана продукта при 570 нм (поглощение минимумов для DIO-LCNPs, используемых в этом СТЮду) и 650 нм (для вычитания неспецифического фона оптической плотности) с использованием ридере.
- Участок значение дифференциальной оптической плотности (ABS 570 - ABS 650) в зависимости от материала концентрации и сообщить о результатах в процентах пролиферации клеток (контроль степени пролиферации клеток в среде для культивирования клеток только).
7. Анализ данных
- Статистически анализировать данные с однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для множественных сравнений, применяются после испытания специальной в Бонферрони. Обеспечить все средние значения, как ± стандартная ошибка среднего (SEM), если не указано иное.
Примечание: Приемлемая вероятность значение имело р <0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LCNPs были подготовлены, в котором был загружен гидрофобное ядро NP с репрезентативной мембраной мечения зонда, чтобы продемонстрировать полезность LCNP как эффективное средство доставки для гидрофобных грузов. С этой целью груз был выбран весьма растворимым в воде потенциометрический мембрана мечение краситель, DIO. DIO-нагруженные LCNPs (DIO-LCNPs) были синтезированы с использованием двухфазной техники мини-эмульсии с химическими компонентами DACTP11, AC10COONa и Dio, как показано на рисунке 1 18. В этой системе НП, ковалентно связанный полимерную сеть кристаллического сшивающего агента DACTP11 обеспечивает стабильную гидрофобную сердцевину, где DiO проживает в пределах интерстициальные пространства в сшитом сети. Карбоксилатные группы на поверхности NP обеспечивают стабильность коллоидного частицы в водной среде в то же время, выступающей в качестве функциональной группы «ручкой» для прикрепления клеток нацеливания лигандов(И других биологических препаратов). Привязанный к DIO-LCNPs к плазматической мембране, амин с концевыми ПЭГилированное холестерина фрагмент (PEG-Чхоль) был ковалентно присоединен к поверхности LCNP через EDC муфты (рисунок 1). После синтеза NP и подтверждения успешного биоконъюгации, способность к DIO-LCNPs маркировать плазматической мембраны живых клеток и доставить встроенный Dio груз к липофильной части плазмы мембранного бислоя с улучшенной специфичностью и кинетики по сравнению со свободным форма (DIO бесплатно) избавлены от массы раствора оценивали.
Как показано на рисунке 2 A, DIO бесплатно (6,0 мкМ) робастно окрашивали плазматическую мембрану с высокой эффективностью (почти 100% клеток маркированы) после 15 - минутной инкубации с клетками НЕК 293T / 17. Тем не менее, наблюдается при лишь незначительное увеличение значительная клеточная интернализация DiO бесплатноВремя инкубации до 30 мин (рис 2 A и C). Степень Диу свободного интернализации определялась Эксперименты с временным разрешением колокализации , в которых клетки сначала инкубировали с 6,0 мкМ DiO бесплатно (30 мин). DiO свободный -содержащие инкубационную среду удаляли и клетки были впоследствии культивировали в течение до 4 часов. Плазматической мембраны клетки подвергали контрастному окрашиванию красителем меченных мембранного фосфолипида (фосфоэтаноламин, конъюгированного с родамина B; РЕ-Rhoda). Как показано на рисунке 2 С, после 15 - минутной инкубации, почти 100% Диу бесплатно был локализуется с маркером PE-Рода (коэффициент колокализация Пирсона; PCC = 0,99 ± 0,01). Тем не менее, после 30 - минутной инкубации ~ 80% Диу бесплатно оставалась св занного с мембраной (~ 20%) усвоены. Степень DiO свободного интернализации неуклонно растет , как гоВремя инкубации е был продлен до тех пор , как 4 часа, и это нашло свое отражение в сопутствующим снижением PCC между Дио и Рода-PE (Рисунок 2 C). Подгонка данных к уравнению экспоненциального распада однофазной показало , что DiO свободный интернализации достиг максимума ~ 50% на 1 час, при скорости интернализации (к = 0,045 мин -1) и период полураспада (15 мин) что отражает быстрое и эффективное клеточное поглощение Диу свободной. Эти данные демонстрируют быстрое зависимое от времени перехода Диу свободного от плазматической мембраны в цитозоль, где он оставался в значительной степени исключены из ядра через 4 ч периода времени исследованы.
Учитывая неконтролируемый клеточный захват Диу свободный, цель стала модулировать это поведение путем поставки DiO в качестве препарата LCNP-PEG-Чхоль NP. При поставке в качестве биоконъюгата LCNP-PEG-Хол, более стойкие мембраны Residвремя симость DiO по сравнению с DiO бесплатно было отмечено (рисунок 2 B). После 15 мин инкубации DIO-LCNP-PEG-Чхором с клетками, почти 100% сигнала DiO располагался на плазматической мембране, где он локализуется с мембранным маркером РЕ-Rhoda, в результате, что было сравнимо с что наблюдается для DiO свободной. Было отмечено, однако, что в то время как DiO свободная маркировка мембраны была довольно однородным и непрерывным, окрашивание картина DIO-LCNP-PEG-Чхором после 15 мин инкубации была более точечное и не столь однородными по природе (рис 2 В). Этот результат показал, что DIO-LCNP-PEG чоль NPs собирали в дискретных областях в плазматической мембране. Когда время инкубации был увеличен до 30 мин, ~ 94% сигнала DiO осталась на мембране ( по сравнению с ~ 80% в течение DiO свободного в это же момент времени) (рис 2 В и 2С). Эта тенденция становится еще более заметным, как клетки культивировали с DIO-LCNP-ПЭГ-ХОЛ NPs для все более и более длительное время после первоначального 30-минутной инкубации. Например, после того, как культуры в течение 1 ч после начальной инкубации около 80% от сигнала DIO-LCNP-ПЭГ-Хол NP остался мембранозной и локализуется с маркером РЕ-Rhoda ( по сравнению с ~ 55% DiO бесплатно). Примечательно, что клеточная интернализация DIO-LCNP-PEG-холь NPs достиг максимума в 30% в 2 часа (70% удержания мембраны). Это соответствует ячеистой скорости поглощения (к = 0,024 мин -1; Период полураспада = 29 мин) , что ровно половина , что наблюдается для интернализации DiO свободной.
Далее, способность НП-внедренного DiO груза эффективно оттоке из ядра LCNP и ввести липофильный среду плазматической мембраны бислой контролируемым и зависимым от времени образом была определена. коценить это, стратегия FRET на основе была разработана, в котором DiO служит донором FRET занимается передачей энергии акцепторного красителя, DiI. Как и следовало ожидать, при первоначальной маркировки (т = 0 мин), эмиссионный сигнал доминировала донора DiO , содержащегося в мембране-привязи NPs (рисунок 3 В). FRET изображений этого же поля 4 ч позже (т = 240 мин), тем не менее, показал значительное увеличение эмиссионного сигнала от DiI акцептора, убедительное доказательство перехода донора DiO из ядра LCNP в плазму мембранный бислой (Рисунок 3 С). Рассмотрение времяразрешенного природы этого перехода показали стабильное снижение DiO излучения донора в сочетании с соответствующим увеличением DiI эмиссии акцепторного над экспериментальным окном 4 ч (рис 3 D). Следует отметить, что эффективность FRET во время этого перехода достиг своего максимама при ~ 180 мин после первоначальной маркировки, предполагая , что отлив и мембранные перегородки донора DiO достигла своего максимума в этот момент времени (рисунок 3 E). Эти данные предоставляются убедительные доказательства времяразрешенного разбиения DiO из НП в плазму мембранный бислой, который достиг своего максимального ~ 3 ч после первоначальная маркировка с DIO-LCNP-PEG-Чхоль NPs.
Наконец, сравнительный анализ цитотоксичности проводили для DiO свободного по сравнению с DIO-LCNP-PEG-Чол. Когда инкубировали с клетками НЕК 293T / 17 (при концентрации DiO 6 мкМ в обоих случаях), было ясно, что инкапсуляция DiO в пределах ядра LCNP ослабляется его цитотоксичность. В то время как DiO свободный вызвал клеточные viabilities из ~ 50%, клетки , инкубированные с DIO-LCNP-PEG-Чхоль выставлены клеточные viabilities ~ 90%. (Рисунок 4). Кумулятивно, данные мечения клеток в сочетании с сотовым ТОКСИгородские данные показывают улучшения в обоих эффективности DIO-основанной маркировки мембран и модуляции цитотоксичности Диу.
Рисунок 1: Схематическое изображение мембранного связывания DIO-LCNP-PEG-Чол. DIO-LCNP состоит из акрилата жидкого кристалла сшивающего агента (DACTP11); карбоксильную концевыми полимеризуемый поверхностно-активное вещество (AC10COONa); и липофильный краситель, DIO. Холестерин-поли (этиленгликоль) (ПЭГ-Хол) конъюгировали с DIO-LCNP с помощью EDC муфты. Добавление Чхором к поверхности DIO-LCNP опосредует предпочтительное связывание НП к плазматической мембране. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Времяразрешенная клеточное поглощение Диу бесплатно в НЕК 293 T / 17 клеток. DiO свободный (6,0 мкМ, панель (А) или DIO-LCNP-ПЭГ-Хол ([DiO] = 6,0 мкМ, панель (В) , инкубировали на монослоев клеток в течение 15 мин, удаляют и заменяют средой роста; клетки культивировали в течение времени, указанных (до 4 ч). Клетки затем окрашивают РЕ-Rhoda (2,0 мкМ) и фиксировали. образцы были обследованы для DiO (зеленый) и связанный с мембраной PE-Рода (красный) с помощью КЛСМ. ( с) с разрешением по времени график процента мембраносвязанных DiO свободной или DIO-LCNP-ПЭГ-Хол сигнала в зависимости от увеличения продолжительности времени инкубации. данные были получены от коэффициента колокализационные Пирсона (PCC, N = 3 & #177; стандартное отклонение) зеленого цвета (DIO) и красный () каналов ПЭ-Рода, и выражается в процентах (± SEM) после нормализации к PCC, соответствующей 15-минутной инкубации. Шкала бар = 20 мкм. Печатается с разрешения автора из ссылки 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Времяразрешенная FRET подтверждает оттоку Диу от DIO-LCNP-PEG-Чхоль к плазматической мембране. HEK293T / 17 Клетки costained с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI, где DiO (зеленый) и излучающего DiI (красные красители, излучающие) выступать в качестве донора FRET и акцептор соответственно. (А) DIC образ живых клеток costained с DIO-LCNP-PEG-Чхоль ([DiO] = 6,0 мкМ) и DiI (6,0 мкМ). В sдостаточно изображался контролировать изменение сигнала FRET в течение периода 4 ч. (В) и (С) являются лада изображения живых клеток на той же фокальной плоскости при Т = 0 мин и Т = 240 мин, соответственно. (D) Нормализованная, с разрешением по времени интенсивность излучения донора Дио и DiI акцептора из клеток , окрашенных с DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI и отображенных в режиме возбуждения ладу. (E) с временным разрешением отношение FRET (DiI ЭМИ / DiO ЭМИ) для клеток , меченных DIO-LCNP-PEG-Чхоль и DiI и отображенных в конфигурации ладу. Шкала бар = 20 мкм. Печатается с разрешения автора из ссылки 18. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Продолжающееся цель NMDD является контролируемое нацеливание и доставку лекарственных средств для клеток и тканей, в сочетании с одновременным улучшением эффективности лекарственного средства. Один конкретный класс молекул лекарственного средства, для которых это представляет серьезную проблему является гидрофобные агенты лекарства / обработки изображений, которые экономно не растворяются в водной среде. Эта проблема преследует переход сильнодействующих препаратов из ин витро системах клеточных культур в клинических условиях , и привело к ряду перспективных молекул лекарственных средств, " под сукно" или отказались и не дополнительно рассмотрен клинических условиях. Вортманнин (Wtmn), например, является мощным ингибитором фосфатидилинозитол 3 'киназ и фосфатидилинозитол 3' киназ киназ, связанных с и имеет большой потенциал в качестве противоопухолевого агента, но его отсутствие растворимости в воде препятствует ее прогрессии в клинических испытаниях.
В последнее время , Karve и др. показали улучшение золь водыubility из Wtmn , когда приготовлена в виде липидно-полимера NP узла 19. Одна арена, которые могли бы извлечь большую пользу из такого рода улучшения, контролируемой поставки в качестве композиции NP является поставка гидрофобных лекарственных средств и агентов визуализации к плазматической мембране. Таким образом, целью было решить эту техническую и препятствие разработать методологию, чтобы преодолеть этот технологический барьер.
При разработке этой методики, модель мембранной ориентации краситель, DIO, был выбран, который исторически страдает от плохой растворимости в водных средах. Это придает значительные трудности в специфической доставки красителя к плазматической мембране. Среди этих проблем необходимо добавить кристаллическую форму красителя непосредственно в клетки или ткани 10 или на инкубацию клеток с очень высокой концентрацией DiO после разбавления из маточных растворов , содержащих растворители , такие как ДМСО , 11, 12.Подход здесь был два раза: 1) включить DIO в гидрофобную сердцевину LCNPs в процессе синтеза NP и 2), ковалентно модифицировать синтезированного DIO-LCNPs с холестеринового конъюгата ПЭГ (DIO-LCNP-PEG-Хол), чтобы облегчить прямое взаимодействие DIO-нагруженных Соседства с плазматической мембраной. В самом деле, этот подход эффективно улучшить ряд аспектов доставки DiO к плазматической мембране.
Во-первых, время пребывания мембраны DiO был удвоены при поставке в виде препарата LCNP по сравнению с тем, когда DiO был доставлен свободной от массы раствора. Это длительное время мембраны жительства было связано с локализацией DIO-LCNP-PEG-Чхоль сопрягает к липидные рафты микродоменных мембраны плазмы, что подтверждается совместным окрашиванием экспериментов. Во-вторых, разделение груза DiO в липидный бислой было подтверждено экспериментами FRET, в которых DiO служил в качестве донора к мембранным резидентные DiI акцептора. И, наконец,медленное, пролонгированное высвобождение груза DiO в мембранный бислой эффективно ослабляется цитотоксичность DiO на ~ 40%.
Важно, чтобы выделить несколько пунктов в протоколе, которые имеют решающее значение для успеха. Во-первых, процент нагрузка DiO в ядро LCNP должны быть эмпирически оптимизировано в синтезе пробных опытов, чтобы получить баланс между генерацией высокого качества DIO-LCNP-PEG-Хол NPs и желаемым уровнем сигнала флуоресценции в экспериментах клеточных доставки , Аналогично, биоконъюгации из фрагмента Чхор-ПЭГ-NH2 на поверхности DIO-LCNP должны быть оптимизированы, чтобы получить желаемый уровень клеточной маркировки. Наконец, количество клеток , применяемых к покрытой фибронектином культуральных чашках имеет решающее значение для успеха, и необходимо соблюдать осторожность , чтобы семя клеток при плотности ~ 8 × 10 4 клеток / мл (~ 2,4 · 10 5 клеток на чашку) , Когда клетки высевают слишком редко, это приводит к неэффективному мечения мембраны, в то время как засева CELLS слишком плотно приводит к приобретению бедных образов, которые явно не показывают мембранную маркировку.
Одним из возможных ограничение как писано протокола является то, что эффективность включения различных других мембранных нацеливания красителей и препаратов будет варьироваться в зависимости от гидрофобности груза краситель / лекарственный препарат. В этих случаях протокол синтеза LCNP должны быть проверены эмпирически определить оптимальные условия синтеза для идеального груза включения красителя / наркотиков.
Таким образом, метод был разработан для LCNP основе контролируемой доставки груза гидрофобного красителя к плазматической мембране живых клеток, которые преодолевают многие из технических проблем, связанных с клеточной доставки нерастворимых в воде грузах. Общая значимость метода заключается в том, что он явно улучшает специфическую доставку груза к плазматической мембране, одновременно ослабляя сопутствующую цитотоксичность, которое ассоциативныйзанного с поставкой гидрофобных грузов при высоких концентрациях от массы раствора. Такой подход должен найти широкое применение в доставке аналогично сложных гидрофобных грузов агента красителя / визуализации и, вероятно, поможет облегчить переход эффективной, но плохо растворимые в воде, грузы из экспериментального режима в клинических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Программой финансирования NRL (Base Unit MA041-06-41-4943 работа). ON поддерживается Национальным исследовательским советом докторант Research Associateship.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. , 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. , Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. , http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).