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Bioengineering

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

Published: February 8, 2017 doi: 10.3791/55181
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1, 1
1Center for Biomolecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2Optical Sciences Division, Naval Research Laboratory, 3Sotera Defense Solutions

Summary

Una nanopartícula de cristal líquido (LCNP) nanotransportador es explotado como un vehículo para la administración controlada de una carga hidrofóbica en la membrana plasmática de las células vivas.

Abstract

La entrega controlada de agentes de fármaco / de formación de imágenes a las células es crítico para el desarrollo de agentes terapéuticos y para el estudio de los procesos de señalización celular. Recientemente, nanopartículas (NP) han mostrado una promesa significativa en el desarrollo de tales sistemas de administración. Aquí, un NP (LCNP) sistema de entrega basado en cristal líquido se ha empleado para el suministro controlado de un colorante insoluble en agua, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), desde dentro del núcleo NP de la región hidrófoba de un plasma bicapa de la membrana. Durante la síntesis de los PN, el colorante se incorporó de manera eficiente en el núcleo hidrófobo LCNP, según lo confirmado por análisis espectroscópico múltiple. La conjugación de un derivado de colesterol PEGilado a la superficie de NP (DIO-LCNP-PEG-Chol) activar la unión de los NPs colorante cargado a la membrana plasmática en células HEK 293T / 17 células. Resuelta en el tiempo de escaneo láser confocal de microscopía y la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de imágenes confirmó el paseive flujo de salida de DiO desde el núcleo LCNP y su inserción en la bicapa de la membrana de plasma. Por último, la entrega de DiO como LCNP-PEG-Chol atenúa la citotoxicidad de DiO; la forma de Dio NP exhibió ~ 30-40% menor toxicidad en comparación con DiO libre liberado de solución a granel. Este enfoque demuestra la utilidad de la plataforma LCNP como una modalidad eficaz para la entrega de membrana específico de modulación y de cargas moleculares hidrófobas.

Introduction

Desde el advenimiento de la interfaz nanomateriales (materiales ≤100 nm en al menos una dimensión) con células vivas, un objetivo continuo ha sido tomar ventaja de las propiedades únicas dependientes del tamaño de las nanopartículas (NP) para diversas aplicaciones. Estas aplicaciones incluyen células y tejidos etiquetado / formación de imágenes (tanto in vitro como in vivo), la detección en tiempo real, y la administración controlada de fármacos y otros cargos 1. Ejemplos de tales propiedades relevantes NP incluyen la emisión dependiente del tamaño de los nanocristales semiconductores (puntos cuánticos, los puntos cuánticos); fototermales las propiedades de las nanopartículas de oro; la gran capacidad de carga del núcleo acuoso de liposomas; y la conductividad balístico de alótropos de carbono, tales como nanotubos de carbono de pared simple y grafeno.

Más recientemente, ha surgido un interés significativo en el uso de los PN para la modulación controlada de fármacos y otras cargas, como contraste / imagen de unacaballeros. Aquí, la razón es para mejorar significativamente / optimizar la solubilidad en general, la dosis administrada, el tiempo de circulación, y el aclaramiento eventual de la carga de drogas mediante la entrega como una formulación NP. Esto ha llegado a ser conocido como la administración de fármacos mediada NP (NMDD), y actualmente hay siete formulaciones de fármacos NP aprobados por la FDA para su uso en la clínica para el tratamiento de varios tipos de cáncer y cientos más en distintas fases de ensayos clínicos. En esencia, el objetivo es "lograr más con menos"; es decir, utilizar el NP como un andamio para entregar más fármaco con un menor número de administraciones de dosificación mediante el aprovechamiento de la gran área superficial: volumen (por ejemplo, partículas duras, tales como puntos cuánticos y óxidos metálicos) de PN o de su gran volumen interior para la carga grandes cargas útiles de carga (por ejemplo, liposomas o micelas). El objetivo aquí es reducir la necesidad de múltiples regímenes de dosificación sistémicamente entregadas mientras que al mismo tiempo la promoción de la estabilidad acuosa y una mayor circulación, en particular paradesafiantes cargamentos de drogas hidrofóbicas que, aunque muy eficaz, son poco solubles en medios acuosos.

Por lo tanto, el objetivo del trabajo descrito en la presente memoria fue determinar la viabilidad del uso de una novela NP andamio para la entrega específica y controlada de cargas hidrófobas a la bicapa de la membrana de plasma lipófilo. La motivación para el trabajo era la solubilidad limitada inherente y la dificultad en la entrega de moléculas hidrófobas a las células a partir de medios acuosos. Típicamente, la entrega de dichas moléculas hidrófobas requiere el uso de disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO) o tensioactivos anfifílicos (por ejemplo, poloxámeros), que pueden ser tóxicos y compromiso de células y tejidos viabilidad 2, o portadores de micelas, que puede tener la carga interna limitada capacidades. El soporte elegido NP NP aquí fue una formulación (LCNP) novela de cristal líquido desarrollado previamente 3 y que se había demostrado previamente para lograr un ~ 40 veces mejora en la eficacia de la doxorubicina medicamento contra el cáncer en células cultivadas 4.

En el trabajo descrito en este documento, la carga representante seleccionado fue el colorante de membrana potenciométrica, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO es un colorante insoluble en agua que se ha utilizado para anterógrada y rastreo retrógrado en neuronas fijos de estar y, las mediciones de potencial de membrana, y para el etiquetado general de membrana 5, 6, 7, 8, 9. Debido a su naturaleza hidrófoba, DiO típicamente se añade directamente a las monocapas de células o tejidos en una forma cristalina 10, o se incubó a concentraciones muy altas (~ 1-20 mM) después de la dilución de una solución de concentración madre 11, 12.

contenido "> Aquí, el enfoque fue el uso de la plataforma LCNP, un NP multifuncional cuyo núcleo interno es completamente hidrófoba y cuya superficie es a la vez hidrófila y susceptibles de bioconjugación, como vehículo de administración para DiO. DiO se incorpora en el núcleo LCNP durante la síntesis , y la superficie de NP es entonces funcionalizado con una fracción de colesterol PEGilado para promover la unión del conjunto dio-LCNP a la membrana plasmática de la membrana. Este enfoque dio como resultado un sistema de entrega que se repartió la diO en la membrana de plasma con mayor fidelidad y residencia membrana el tiempo y la forma libre de DiO entrega de la solución a granel (DiO libre). Además, este método mostró que la entrega LCNP mediada de DiO modula sustancialmente y acciona la tasa de partición específica del colorante en la bicapa de la membrana plasmática lipófilo. esto es alcanzado mientras que de forma concomitante reducción de la citotoxicidad del fármaco libre por ~ 40% mediante la entrega como una formulación LCNP.

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Protocol

1. Preparación de Dio-LCNP y dio-LCNP-PEG-Chol

  1. Disolver diacrilato cristalino líquido agente de reticulación (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiO, 2 mg), y un iniciador de radical libre (azobisisobutironitrilo, 1 mg) para la polimerización en 2 ml de cloroformo. Añadir esto a una solución acuosa de tensioactivo funcionalizado con acrilato (AC10COONa, 13 mg en 7 ml).
  2. Se agita la mezcla durante 1 hr y se somete a ultrasonidos a 80% de amplitud durante 5 minutos para producir una miniemulsión que consiste de pequeñas gotitas de la materia orgánica rodeado de tensioactivo polimerizable en agua.
  3. Se calienta la mezcla a 64 ° C en un baño de aceite para iniciar la polimerización de tanto el agente y el agente tensioactivo de reticulación como el cloroformo se evapora lentamente, dejando una suspensión NP DiO que contiene que se estabiliza por el tensioactivo.
  4. Filtrar la suspensión NP (3 veces) a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras para eliminar cualquier agregación. store la solución NP filtrada a 4 ° C hasta su uso posterior.
  5. La conjugación de PEG-Chol que dio-LCNP a través de acoplamiento EDC.
    1. Disolver Chol-PEG-NH 2 · HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) en tampón HEPES 25 mM (pH 7,0).
    2. Preparar una solución de trabajo que contiene sal de N-hidroxi-sulfosuccinimida de sodio (NHSS, 40 mM) y 1-etil-3- (3- (dimetilamino) propil) carbodiimida (EDC, 400 mM) en tampón HEPES a partir de soluciones madre concentradas.
    3. Inmediatamente se añaden 20 l de la solución de trabajo recién preparada de NHSS / EDC a 1,0 ml de DiO-LCNP en tampón HEPES y se agita durante 5 min.
    4. Añadir 20 l de solución madre de Chol-PEG-NH 2 · HCl a esta mezcla y se agita durante 2 hr.
    5. Centrifugar brevemente la mezcla de reacción a la velocidad máxima (~ 2.000 xg) durante 30 segundos usando una mini centrífuga de mesa y pasar el sobrenadante a través de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño PD-10 equilibrada con 13de solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 0,1x).

2. Caracterización de Dio-LCNP y dio-LCNP-PEG-Chol

  1. Para confirmar el éxito de la conjugación covalente de PEG-Chol a la superficie dio-LCNP por electroforesis en gel.
    1. Disolver 0,5 g de agarosa en 50 ml (1x) de electroforesis tris-borato (TBE; mM Tris 89 (pH 7,6), 89 mM de ácido bórico y 2 mM EDTA) buffer. Calentar la solución en un horno de microondas para disolver la agarosa. Deje que la solución se enfríe un poco y verter el contenido en una placa de gel de electroforesis en el cuadro. Insertar un peine de gel para crear pocillos de muestra.
    2. Una vez que el gel se ha solidificado, añadir la cantidad requerida (suficiente para sumergir el gel en la cámara) de tampón de TBE a la cámara.
    3. Añadir 35 l de muestra dio-LCNP (modificada con glicerol, 5% v / v) a los pocillos del gel y una duración de 20 min a una tensión de 110 V.
    4. La imagen del gel usando un sistema de imágenes de gel wifiltros de excitación y emisión th a 488 nm y 500 a 550 nm, respectivamente.
  2. Evaluar el tamaño de partícula y la distribución por dispersión de luz dinámica (DLS) por dilución de la solución dio-LCNP (dilución ~ 200 veces) en PBS (pH ~ 8, 0,1x) y la medición en un instrumento DLS 14. Medir el potencial zeta de la DIO-LCNPs utilizando un instrumento de medición del potencial zeta apropiado.

3. Preparación del cultivo celular platos para experimentos de envío e Imaging

NOTA: etiquetado dio-LCNP se realiza en HEK 293T / 17 células de riñón embrionario humano (entre pasajes 5 y 15) que se cultivan como se describió anteriormente 4. Realizar los experimentos de entrega y la imagen de células subsiguientes como se describe a continuación.

  1. Preparar placas de cultivo de tejido de diámetro 35 mm (14 mm equipados con insertos No. 1 cubreobjetos) recubriéndolos con fibronectina bovina (~ 100 l a una concentración de 20 mg/ Ml) en DPBS durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Eliminar la solución de revestimiento de la fibronectina de la placa de cultivo. Cosecha HEK 293 T1 / 7 células del matraz T-25 por primera lavado de la monocapa celular con 3 ml de DPBS y luego mediante la adición de 2 ml de tripsina-EDTA (0,5% de tripsina-0,25% de EDTA).
  3. Incubar el matraz a 37 ° C durante ~ 3 min. Retire la tripsina-EDTA y devolver el frasco a la incubadora. Una vez que las células se separaron del matraz, neutralizar la tripsina mediante la adición de 4 ml de medio completo (medio Eagle modificado de Dulbecco; DMEM; modificado para contener 10% de suero fetal bovino, piruvato de sodio 5%, y 5% de antibiótico / antimicótico) al matraz . Determinar la concentración de células en la suspensión mediante el recuento en un contador de células.
  4. Ajustar la concentración de células a ~ 8 x 10 4 células / ml con medio de crecimiento. Añadir 3 ml de la suspensión celular a la antena y la cultura en la incubadora durante la noche; Al día siguiente, las células deben estar en ~ 70% de confluencia y deben estar listos para su uso. Adecuadodensidad celular es crítica para robusto y eficiente etiquetado de un alto porcentaje de células.

4. Entrega celular de Dio y Dio-LCNPs e Imagen de células fijadas

  1. Preparar 1 ml de soluciones de Dio, Dio-LCNP, y dio-LCNP-PEG-Chol en medio de distribución (HEPES-DMEM; DMEM que contenía HEPES 25 mM) mediante la dilución de las soluciones madre de DiO libre y dio-LCNPs; concentraciones DiO apropiadas para la incubación de células serán ~ 1-10 mM (expresado como ya sea la concentración de DiO libre o DiO en forma de DiO-LCNP).
  2. Quitar el medio de crecimiento de las placas de cultivo utilizando una pipeta serológica y lavar las monocapas de células (véase la etapa 3) dos veces con HEPES-DMEM (2 ml cada lavado). Realizar los lavados añadiendo y eliminando HEPES-DMEM con una pipeta a / desde el borde de los platos con cuidado.
  3. Añadir 0,2 ml de las soluciones preparadas de entrega libre o DIO-LCNP Dio el centro de las placas de cultivo y devolver los platos a la incubator durante un período adecuado de tiempo (típicamente 15 o 30 min, dependiendo de las necesidades del experimento). Tiempos de incubación más largos se suman a más de etiquetado celular no específica de las zonas no membranosas (por ejemplo, citosol).
  4. Después del período de incubación, retirar las soluciones de entrega utilizando una pipeta serológica. Se lavan las monocapas de células dos veces con DPBS (2 ml cada lavado). Realizar los lavados añadiendo con cuidado y quitando DPBS a / desde el borde del plato.
  5. Fijar las monocapas celulares usando 4% de paraformaldehído (preparado en DPBS) durante 15 min a temperatura ambiente.
    PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es inflamable, un irritante respiratorio, y un posible carcinógeno.
  6. Eliminar la solución de paraformaldehído usando una pipeta y lavar suavemente las células 1 vez con DPBS (2 ml) mediante la adición y la eliminación de DPBS usa la pipeta para / desde el borde de los platos.
  7. Las células fijadas están listas para ser reflejado por la presencia de una señal de fluorescencia membranosa utilizando láser confocal de barridoLa microscopía (CLSM). Realice la imagen inmediatamente o, en su defecto, sustituir el medio con DPBS que contenía 0,05% de NaN3 y almacenar los platos a 4 ° C.
    PRECAUCIÓN: NaN 3 es tóxico; extremar la precaución al utilizar NaN3.
    NOTA: Se ha corregido muestras almacenadas de esta manera deben ser reflejados dentro de 48 horas para obtener resultados óptimos.

5. celular Entrega de Dio y Dio-LCNPs y FRET Imaging en células vivas

NOTA: En este método, las células se colabeled con 6 M cada DiO-LCNP-PEG-Chol (donde DiO es un donante FRET) y 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetrametilindocarbocianina perclorato (DII libre, donde DII es un aceptor de FRET). La liberación de DiO de Dio-LCNP-PEG-Chol y su incorporación en la membrana plasmática es confirmado por un aumento observado en la transferencia de energía desde el donante al aceptor DiO Dil.

  1. Las células de la etiqueta secuencialmente con Dio-LCNP-PEG-Chol y Dil frecorreo utilizando el método descrito en el paso 4.
  2. Después de la tinción, se lavan las células 1 vez con DPBS (2 ml) usando una pipeta serológica y reemplazar el tampón de lavado con 2 ml de solución de imágenes de células vivas (CLIS).
  3. En un escenario microscopio equipado con una cámara de incubación climatizada, la imagen de muestra de células vivas usando un microscopio confocal (objetivo 60X) con una configuración de formación de imágenes FRET a intervalos de 30 min durante un período de 4 horas por la excitación del donante DiO a 488 nm y recogida de emisión completa espectros tanto del donante y el aceptor DiO DiI 490-700 nm con un detector espectral de 32 canales.
  4. NOTA: Para obtener más información sobre las imágenes de FRET, por favor, véase la referencia 15.
  5. Determinar la intensidad de las emisiones de resolución temporal tanto del donante y el aceptor DiO Dil de células teñidas con Dio-LCNP-PEG-Chol y Dil. Calcula el aceptor / donador de FRET resuelta en el tiempo ratio (DiI emi / DiO EMI) para las imágenes, lo que aumentará de manera constante y, finalmente, la placaau una vez que la cantidad de donante de DiO con particiones en la membrana ha alcanzado un máximo 16.

6. Ensayo de citotoxicidad de Dio y Dio-LCNPs a las células HEK 293T / 17 células

NOTA: La citotoxicidad de los materiales DiO-LCNP se evaluó mediante un ensayo de proliferación a base de colorante de tetrazolio 17. Las células se cultivan en una placa de múltiples pocillos en presencia de concentraciones variables de los materiales bajo condiciones que emulan la entrega / etiquetado. Las células se cultivaron luego durante 72 horas para permitir la proliferación. Un colorante (MTS, (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil se añade a continuación) -2- (4-sulfofenil) 2H-tetrazolio) a los pocillos, y metabólicamente activo células convierten el colorante en un producto de formazán azul. la cantidad de formación de color es directamente proporcional al número de células viables.

  1. Cosecha HEK 293 T1 / 7 células del matraz T-25 siguiendo el procedimiento descrito en la etapa 3.2.Seed/ 17 células HEK 293T (5.000 células / 100 l / pocillo) a los pocillos de una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos tratados y la cultura durante 24 horas.
  2. Eliminar por completo los medios de cultivo de los pocillos utilizando una micropipeta y añadir 50 l de HEPES-DMEM que contenía DiO libre, dio-LCNPs, o Dio-LCNP-PEG-Chol a concentraciones crecientes de replicar pozos. Incubar en las células a 37 ° C durante 30 min.
    NOTA: Por lo general, repeticiones hecho triplicado o cuadruplicado son suficientes para obtener datos estadísticamente fiables.
    1. Después de la incubación, se elimina el medio de suministro que contiene los materiales utilizando una micropipeta y reemplazarla con 100 l de medio de crecimiento. Cultivar las células durante 72 horas.
  3. Añadir 20 l de sustrato a cada pocillo de tetrazolio, devuelva la placa de la incubadora, y permitir la formación de color para proceder a 37 ° C durante 4 h. Leer la absorbancia (abs) del producto formazan a 570 nm (mínimos de absorción para los dio-LCNPs utilizados en este Study) y 650 nm (para la sustracción de fondo no específica de absorbancia) usando un lector de placas de microtitulación.
  4. Trazar el valor diferencial de absorbancia (abs 570 - abs 650) frente a la concentración de material y reportar los resultados como porcentaje de la proliferación de células control (grado de proliferación de las células en medio de cultivo de células solamente).

Análisis 7. Datos

  1. Analizar estadísticamente los datos con un análisis univariado de la varianza (ANOVA). Para comparaciones múltiples, aplicar el test post hoc de Bonferroni. Proporcionar a todos los valores medios ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique lo contrario.
    NOTA: La probabilidad aceptable de significación fue de p <0,05.

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Representative Results

LCNPs se prepararon en la que el núcleo hidrofóbico de la NP se cargó con una sonda de membrana de etiquetado representante para demostrar la utilidad de la LCNP como un vehículo de suministro eficiente para cargas hidrófobas. Para este propósito, la carga elegido fue el potenciométrica colorante membrana de etiquetado altamente insoluble en agua, DiO. LCNPs cargadas con DiO (DIO-LCNPs) se sintetizaron utilizando una técnica de mini-emulsión de dos fases con los componentes químicos DACTP11, AC10COONa, y DiO, como se muestra en la Figura 1 18. En este sistema NP, la red polimérica unida covalentemente del agente de reticulación cristalino DACTP11 proporciona un núcleo hidrofóbico estable en el que el DiO reside dentro de los espacios intersticiales en la red reticulada. Los grupos carboxilato en la superficie de NP proporcionan estabilidad coloidal a la partícula en un medio acuoso mientras que también sirve como un grupo funcional "mango" para la unión de ligandos de la orientación de células(Y otros productos biológicos). Para atar los dio-LCNPs a la membrana plasmática, una fracción de colesterol PEGilado terminado en amina (PEG-Chol) se une covalentemente a la superficie LCNP a través de acoplamiento EDC (Figura 1). Después de la síntesis NP y la confirmación de bioconjugación éxito, la capacidad de los DIO-LCNPs para etiquetar la membrana plasmática de las células vivas y para entregar la carga DiO incorporado a la porción lipófila de la bicapa de la membrana de plasma con la mejora de la especificidad y la cinética en comparación con la libre se evaluó la forma (DIO libre) liberado de solución a granel.

Como se muestra en la Figura 2 A, libre de DiO (6,0 M) manchada con firmeza la membrana plasmática con una alta eficiencia (casi el 100% de células marcadas) después de 15 min de incubación con HEK 293T / 17 células. Sin embargo, se observó una significativa internalización celular de Dio gratuito bajo sólo un modesto aumento en eltiempo de incubación a 30 minutos (Figura 2 A y C). El grado de DiO internalización libre se determinó por medio de experimentos de colocalización con resolución temporal en la que las células se incubaron primero con 6,0 M DiO libre (30 min). Después se retiró el medio de incubación -Con libre DiO, y las células se cultivaron posteriormente durante un máximo de 4 hr. Las membranas plasmáticas de las células se contratiñeron con un fosfolípido marcado con colorante de membrana (fosfoetanolamina conjugado con rodamina B; PE-Rhoda). Como se muestra en la Figura 2 C, tras 15 min de incubación, casi 100% de DiO libre se colocalized con el marcador PE-Rhoda (coeficiente de colocalización de Pearson; PCC = 0,99 ± 0,01). Sin embargo, después de 30 min de incubación ~ 80% de DiO libre se mantuvo unido a la membrana (~ 20% internalizado). El grado de internalización DiO libre aumentó de manera constante como THtiempo e incubación se extendió a todo el tiempo que 4 horas, y esto se refleja en la disminución concomitante en el PCC entre la DiO y Rhoda-PE (Figura 2 C). Un ajuste de los datos a una ecuación de decaimiento exponencial de una fase reveló que la internalización libre DiO alcanzó un máximo de 50 ~% a 1 hr, con una tasa de internalización (k = 0,045 min -1) y la vida media (15 min) que refleja la captación celular rápida y eficiente de Dio libre. Estos datos demuestran la transición dependiente del tiempo rápido de DiO libre de la membrana plasmática al citosol, donde se mantuvo en gran medida excluido del núcleo durante el período de tiempo de 4 hr examinado.

Dada la captación celular incontrolada de DiO libre, se convirtió en el objetivo de modular este comportamiento a través de la entrega de Dio como una formulación LCNP-PEG-NP Chol. Cuando se entrega como un bioconjugado LCNP-PEG-Chol, un residuo de membrana más persistentetiempo cia de la DiO en comparación con DiO libre se observó (Figura 2 B). Después de 15 min de incubación de la DIO-LCNP-PEG-Chol con las células, casi el 100% de la señal de audio se encuentra en la membrana plasmática, donde se colocalized con el marcador de membrana de PE-Rhoda, un resultado que era comparable a la observada para DiO libre. Se observó, sin embargo, que mientras que la etiqueta libre DiO de la membrana era bastante uniforme y contiguo, el patrón de tinción de la DIO-LCNP-PEG-Chol después de 15 min de incubación fue más punteada y no es tan uniforme en la naturaleza (Figura 2 B). Este resultado indica que los dio-LCNP-PEG-Chol PN estaban recogiendo en regiones discretas dentro de la membrana plasmática. Cuando el tiempo de incubación se aumentó a 30 min, ~ 94% de la señal de audio se mantuvo en la membrana (en comparación con ~ 80% para DiO gratis en este mismo punto de tiempo) (Figura 2 B y 2 C). Esta tendencia se hizo aún más pronunciado a medida que las células se cultivaron con los NPs dio-LCNP-PEG-Chol para tiempos cada vez más largos después de la 30 min de incubación inicial. Por ejemplo, después del cultivo durante 1 hora después de la incubación inicial, casi el 80% de la señal dio-LCNP-PEG-Chol NP permaneció membranosa y colocalized con el marcador PE-Rhoda (en comparación con ~ 55% para DiO libre). En particular, la internalización celular de la DIO-LCNP-PEG-Chol NPs alcanzó un máximo de 30% a 2 hr (70% de retención de la membrana). Esto corresponde a una tasa de captación celular (k = 0,024 min -1; vida media = 29 min) que es exactamente la mitad de la observada para la internalización de DiO libre.

A continuación, la capacidad de la carga DiO incrustado-NP a flujo de salida de manera eficiente fuera del núcleo LCNP y entrar en el medio ambiente lipófilo de la bicapa de membrana de plasma de una manera controlada y dependiente del tiempo se determinó. Aevaluar esto, una estrategia basada en FRET fue ideado en el que el DiO sirve como un donante FRET participan en la transferencia de energía al tinte aceptor, DiI. Como era de esperar, al etiquetado inicial (t = 0 min), la señal de emisión fue dominado por el donante DiO contenida dentro de los PN membrana anclada (Figura 3 B). FRET de formación de imágenes de este mismo campo 4 horas más tarde (t = 240 min), sin embargo, reveló un aumento significativo en la señal de emisión del aceptor de DiI, proporcionando una fuerte evidencia de la transición del donante DiO desde el núcleo LCNP en la bicapa de la membrana plasmática (Figura 3 C). El examen de la naturaleza resuelta en el tiempo de esta transición mostró una disminución constante de DiO emisión del donante junto con un aumento correspondiente en la emisión de aceptor DiI sobre la ventana experimental 4 hr (Figura 3 D). En particular, la eficiencia de FRET durante esta transición alcanzó su maximamá a ~ 180 min etiquetado post-inicial, lo que sugiere que el flujo de salida y la membrana de partición del donante DiO había alcanzado su máximo en este punto de tiempo (figura 3 E). Estos datos proporcionan una fuerte evidencia de la partición de resolución temporal de la DiO del NP a la bicapa de la membrana plasmática, que alcanzó su etiquetado post inicial máxima ~ 3 horas con los dio-LCNP-PEG-Chol PN.

Por último, se realizó un análisis comparativo de la citotoxicidad DiO libre versus dio-LCNP-PEG-Chol. Cuando se incubaron con células HEK 293T / 17 células (a una concentración de 6 M DiO en ambos casos), estaba claro que la encapsulación de la DiO dentro del núcleo LCNP atenúa su citotoxicidad. Mientras DiO libre suscitó viabilidades celulares de ~ 50%, las células incubadas con Dio-LCNP-PEG-Chol exhibió viabilidades celulares ~ 90%. (Figura 4). En conjunto, los datos de etiquetado de células acopladas con la toxi celulardatos de la ciudad demuestran mejoras tanto en la eficiencia del etiquetado de membrana a base de DiO y la modulación de la citotoxicidad de DiO.

Figura 1
Figura 1: Representación esquemática de unión a la membrana dio-LCNP-PEG-Chol. DiO-LCNP se compone de un cristal líquido agente reticulante de acrilato (DACTP11); un tensioactivo polimerizable terminado en carboxilo (AC10COONa); y un colorante lipófilo, Dio. El colesterol terminado en poli (etilenglicol) (PEG-Chol) se conjugó con DiO-LCNP a través de acoplamiento EDC. La adición de Chol a la superficie dio-LCNP media la unión preferencial de la NP a la membrana plasmática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 2: captación celular resuelta en el tiempo libre de Dio en células HEK 293 células T / 17. DiO libre (6,0 M, panel (A) o DiO-LCNP-PEG-Chol ([DiO] = 6,0 M, panel (B) se incubó en las monocapas de células durante 15 min, quitan, y se sustituye con medio de crecimiento; las células se cultivaron durante los tiempos indicados (hasta 4 horas). las células se tiñeron posteriormente con PE-Rhoda (2,0 M) y se fija. las muestras se obtuvieron imágenes de Dio (verde) y unida a la membrana PE-Rhoda (rojo) utilizando CLSM. ( C) Gráfico de tiempo-resuelto del porcentaje de la señal libre o DiO-LCNP-PEG-Chol DiO unido a la membrana como una función de aumentar el tiempo de incubación. los datos se obtuvieron a partir de coeficiente de colocalización de Pearson (PCC, n = 3 & #177; desviación estándar) de la verde (DIO) y canales rojo (PE-Rhoda), y se expresa como un porcentaje (± SEM) después de la normalización de la PCC correspondiente a 15 min de incubación. Barra de escala = 20 micras. Reproducido con permiso del 18 de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: resuelto en tiempo FRET confirma el flujo de salida de DiO de DiO-LCNP-PEG-Chol a la membrana plasmática. 17 células / HEK293T fueron costained con Dio-LCNP-PEG-Chol y Dil, donde (que emite verde) del Dio y Dil colorantes (rojo) que emiten actúan como donante FRET y aceptor, respectivamente. (A) Imagen DIC de las células vivas costained con Dio-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 M) y Dil (6,0 M). los sSe obtuvieron imágenes de amplio para supervisar el cambio en la señal de FRET durante el período de 4 horas. (B) y (C) son las imágenes traste de la célula viva en el mismo plano focal en t = 0 min y t = 240 min, respectivamente. (D), la intensidad de emisión de resolución temporal normalizada de la donante y aceptor DiO DiI de células teñidas con DiO-LCNP-PEG-Chol y DiI y la imagen en el modo de excitación FRET. Relación de FRET (E) resuelta en el tiempo (DII emi / DiO EMI) de las células marcadas con DiO-LCNP-PEG-Chol y Dil y la imagen en la configuración de FRET. Barra de escala = 20 micras. Reproducido con permiso del 18 de referencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4 Cuantificación de la citotoxicidad. DiO libre, LCNP, dio-LCNPs, o DiO-LCNP-PEG-Chol se incubaron en HEK 293T / 17 monocapas de células durante 15 min y luego se retira. Las células se lavaron y se cultivaron en medio de crecimiento durante 72 horas antes del ensayo MTS. El gráfico de barras representa una comparación de la viabilidad celular (n = 5 ± SEM) de Dio libre, LCNP, dio-LCNP, y dio-LCNP-PEG-Chol en [DIO] = 6,0 mM. La diferencia entre DiO libre y LCNP, dio-LCNP, o Dio-LCNP-PEG-Chol son significativas (p <0,001) a las 72 h de incubación. Reproducido con permiso del 18 de referencia. Los datos fueron analizados utilizando el análisis univariado de la varianza (ANOVA); Se utilizó el test post hoc de Bonferroni para comparaciones múltiples. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Un objetivo continuo de NMDD es la orientación controlada y entrega de formulaciones de fármacos a células y tejidos, en combinación con la eficacia del fármaco mejorada simultánea. Una clase específica de moléculas de fármacos para los que esto ha supuesto un importante reto es agentes drogas / imagen hidrófobos que tienen con moderación para ninguna solubilidad en medios acuosos. Este problema ha plagado la transición de fármacos potentes de en sistemas de cultivo celular in vitro para el entorno clínico y ha resultado en un número de moléculas de fármaco prometedores ser "archivado" o abandonado y no prosigue en el entorno clínico. Wortmanina (Wtmn), por ejemplo, es un potente inhibidor de la fosfatidilinositol 3 'quinasas y fosfatidilinositol 3' quinasas relacionadas con quinasa y tiene un gran potencial como un agente contra el cáncer, pero su falta de solubilidad en agua ha obstaculizado su progresión en los ensayos clínicos.

Recientemente, Karve et al. mostró sol de agua mejoradaubility de Wtmn cuando se formula como un conjunto NP lípido-polímero 19. Una arena que podría beneficiarse en gran medida de este tipo de mejoramiento de la ejecución, controlado como una formulación NP es la entrega de fármacos hidrófobos y agentes de formación de imágenes a la membrana plasmática. Por lo tanto, el objetivo aquí era hacer frente a este obstáculo técnico y desarrollar una metodología para superar este obstáculo tecnológico.

En el desarrollo de esta metodología, un tinte de dirección de membrana modelo, dio, fue seleccionado que históricamente se ha visto afectada por una mala solubilidad en medios acuosos. Esto imparte retos significativos en la entrega específica del colorante a la membrana plasmática. Entre ellos se incluye la necesidad de añadir la forma cristalina del colorante directamente a las células o tejidos de 10 o incubar las células con concentraciones muy altas de Dio después de la dilución de las soluciones madre que contienen disolventes tales como DMSO 11, 12.El enfoque aquí es doble: 1) incorporar el DiO en el núcleo hidrofóbico de LCNPs durante la síntesis de NP y 2) modificar covalentemente los dio-LCNPs tal como se sintetiza con un colesterol conjugado pegilado (DIO-LCNP-PEG-Chol) para facilitar la interacción directa de los NPs cargadas con DiO con la membrana plasmática. De hecho, este enfoque mejorado efectivamente una serie de aspectos de la entrega de DiO a la membrana plasmática.

En primer lugar, el tiempo de residencia de membrana DiO se duplicó con eficacia cuando se administra como una formulación LCNP en comparación a cuando DiO fue entregado libre de solución a granel. Este tiempo de residencia prolongado membrana se atribuyó a la localización de la DIO-LCNP-PEG-Chol conjuga a los microdominios balsa de lípidos de la membrana plasmática, como se confirmó por experimentos de co-tinción. En segundo lugar, la partición de la carga DiO en la bicapa lipídica se confirmó por experimentos de FRET en el que el DiO sirve como donador a un aceptor DiI membrana residente. Finalmente, elde lenta liberación, sostenida de la carga DiO en la bicapa de membrana atenúa eficazmente la citotoxicidad de la DiO por ~ 40%.

Es importante destacar varios puntos en el protocolo que son críticos para el éxito. En primer lugar, la carga de la DiO por ciento en el núcleo LCNP debe ser empíricamente optimizado en la síntesis de corridas de prueba para obtener un equilibrio entre la generación de alta calidad DiO-LCNP-PEG-Chol NPs y el nivel deseado de la señal de fluorescencia en experimentos de entrega celulares . Del mismo modo, la bioconjugación del resto Chol-PEG-NH2 a la superficie dio-LCNP debe ser optimizado para obtener el nivel deseado de etiquetado celular. Por último, el número de células aplicadas a las placas de cultivo recubiertas de fibronectina es crítica para el éxito, y se debe tener cuidado para sembrar las células a una densidad de ~ 8 x 10 4 células / ml (~ 2,4 x 10 5 células por placa) . Cuando las células se siembran demasiado escasa, resulta en etiquetado membrana ineficaz, mientras que la siembra de la cells resultados demasiado densamente en la adquisición de imágenes pobres que no lo hacen muestran claramente etiquetado membranosa.

Una limitación potencial del protocolo como se ha descrito, es que la eficiencia de incorporación de diversos otros colorantes y fármacos membrana de orientación puede variar dependiendo de la hidrofobicidad de la carga de colorante / de drogas. En estos casos, el protocolo de síntesis LCNP tendrá que ser probado empíricamente para determinar las condiciones de síntesis óptimas para incorporación ideales de carga de colorante / de drogas.

En resumen, un método ha sido desarrollado para el suministro controlado a base de LCNP de una carga colorante hidrófobo en la membrana plasmática de las células vivas que supera muchos de los desafíos técnicos asociados con la entrega celular de cargas insolubles en agua. La importancia global del método es que mejora claramente la entrega específica de la carga a la membrana plasmática, mientras que la atenuación simultáneamente la citotoxicidad concomitante que es Associated con la entrega de cargas hidrofóbicas a altas concentraciones de solución a granel. Este enfoque debería encontrar una amplia utilidad en la entrega de desafío similares cargas de agente colorante / hidrofóbicas de imagen y probablemente ayudará a facilitar la transición de efectivo, sin embargo, poco soluble en agua, cargas de régimen experimental de la relación clínica.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Fondos Base NRL (Unidad de Trabajo MA041-06-41-4943). EN está soportado por un miembro asociado de investigación postdoctoral del Consejo Superior de Investigaciones Científicas.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

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References

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Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

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