Abstract
Angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande vaten, omvat endotheelcellen, pericyten, gladde spiercellen, immuuncellen en de coördinatie met lymfevaten en zenuwen. De meercellige, multi-gebruikersinvoer noodzakelijk het onderzoek naar angiogenese in een fysiologisch relevante omgeving. Terwijl dus het gebruik van in vitro celcultuur modellen mechanistische inzichten verschaft een gemeenschappelijke kritiek is dat ze niet de complexiteit geassocieerd met microvasculaire netwerk recapituleren. Het doel van dit protocol is de mogelijkheid om time-lapse vergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken voor en na angiogenese stimuleren in gekweekte rat mesenterium weefsels aangetoond. Gekweekte weefsels bevatten microvasculaire netwerken die hun hiërarchie te handhaven. Immunohistochemische labeling bevestigt de aanwezigheid van endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, bloedvaten en lymfevaten. In eenddition, het labelen van weefsels met BSI-lectine maakt time-lapse vergelijking van lokale netwerk regio's voor en na het serum of groeifactor stimulatie gekenmerkt door verhoogde capillaire kiemen en vaatdichtheid. In vergelijking met gewone celcultuur modellen, deze methode biedt een instrument voor endotheelcellen lineage studies en weefsel specifieke angiogene evaluatie drug in fysiologisch relevante microvasculaire netwerken.
Introduction
Microvasculaire netwerk groei en hermodellering gemeenschappelijke kenmerken voor weefselfunctie, wondgenezing en meerdere pathologieën en een sleutelproces is angiogenese, gedefinieerd als de groei van nieuwe bloedvaten uit bestaande 1, 2. Voor tissue engineering van nieuwe vaten of ontwerpen angiogene therapieën, het begrijpen van het belang van de cellulaire dynamiek betrokken bij angiogenese cruciaal. Dit proces is complex. Het kan variëren op specifieke locaties binnen een microvasculaire netwerk en omvat meerdere celtypen (bijvoorbeeld endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, macrofagen, stamcellen) en meerdere systemen (lymfatische netwerken en neurale netwerken). Hoewel in vitro modellen enorm hebben bijgedragen aan onderzoek naar het verband tussen de verschillende cellen die betrokken zijn bij angiogenese 3, kunnen hun fysiologische relevantie worden ondermijnd als gevolg van thei r beperkte complexiteit en het feit dat zij niet nauw weerspiegelen een in vivo scenario. Om deze beperkingen driedimensionale kweek te overwinnen 3, ex vivo weefselmodellen 4, microfluïdische systemen 5, 6 en 7 rekenmodellen ontwikkeld en in de afgelopen jaren. Er is echter nog steeds behoefte aan een model met time-lapse vermogen om angiogenese in intacte microvasculaire netwerken ex vivo te onderzoeken. De oprichting van de nieuwe time-lapse modellen voor angiogenese studies met dat niveau van complexiteit zal een waardevol instrument om de onderliggende mechanismen tot regeling van angiogenese te begrijpen en om therapieën te verbeteren.
Een potentiële model dat de ex vivo onderzoek naar angiogenese over een intacte microvasculaire netwerk mogelijk maakt is de rat mesenterium cultuur model> 8. In recent werk, hebben we aangetoond dat bloed en lymfestelsel microvasculaire netwerken levensvatbaar na cultuur blijven. Wat nog belangrijker is, kan de rat mesenterium cultuur model gebruikt worden om functionele pericyte-endotheliale cel interacties, het bloed en lymfatische endotheelcellen verbindingen, en time-lapse imaging onderzoeken. Het doel van dit document is ons protocol voor de time-lapse imaging werkwijze. De representatieve resultaten documenteren de verschillende celtypen die levensvatbaar blijft na stimulatie van angiogenese met serum en bieden voorbeelden van deze methode voor het kwantificeren weefselspecifieke angiogene responsen en endotheelcel tracking studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven en procedures werden goedgekeurd door de Tulane University Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1. Chirurgische Procedure Setup
- Autoclaaf instrumenten, chirurgische benodigdheden, en cultuur levert voorafgaand aan de operatie. Chirurgische benodigdheden voor elke rat omvatten: 1 laken, 1 laken met voorgesneden gaten (0,5 in x 1,5 in) in het midden, gaasjes, en 1 absorberende onderlegger. Chirurgische instrumenten omvatten: 1 scalpel met een aantal 10 mes 2 paar pincetten en een paar fijne schaar. Cultuur leveringen omvatten: 1 laken, 1 pincet en bereid 6-wells plaat inzetstukken met polycarbonaat filters.
- Steriliseren een plexiglas-platform, een chirurgische podium en een chirurgische benchtop ruimte met 70% ethanol. Houd de chirurgische fase in een steriele kom tot gebruik.
- Een chirurgische fase door het boren van een ongeveer 2 door 1 in het gat in het midden van een 100 mm kweekschaal. Vervolgens gebruikt schuurpapier te gladscherpe randen en voeg een laag siliconen lijm randen het gat om een verhoogd oppervlak van het weefsel creëren.
- Alternatief ontwerp van de chirurgische fase CAD software en maak met 3-D afdrukken (figuur 1).
- Plaats een steriele absorberende onderlegger beneden en leggen een plexiglas platform op de top van het. Leg het laken, zonder pre-cut gat, over een verwarmde pad naast het absorberende onderlegger.
- Voorverwarmen steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), media en zoutoplossing tot 37 ° C. Plaats media en PBS in aparte cultuur gerechten boven op de verwarming pad en plaats zoutoplossing in een 50 ml conische buis naast de chirurgische setup.
- Controleer alle pakketten voorafgaand aan het begin van de operatie geopende steriele afhandeling van alle materialen garanderen. Een volledige lijst van de gemeenschappelijke instrumenten die in deze procedure zijn opgenomen in de Tabel van specifieke chirurgische materialen en gereedschappen.
2. Mesentery Tissue Oogsten
- mannelijke Wistar ratten gebruikt volwassene (350 ± 25 g; 6-8 weken oud). Andere stammen en leeftijden ratten kan worden vervangen.
- Verdoven de rat via een intramusculaire injectie van ketamine (80 mg / kg lichaamsgewicht) en xylazine (8 mg / kg lichaamsgewicht). Bevestig de rat onder verdoving door knijpen tussen de tenen om te controleren of een reflex reactie; moet er niet zijn. Preventieve analgesie voor deze terminal procedure is niet noodzakelijk.
- Scheer de buikstreek en verwijder de resterende haar met behulp van ontharingscrème. Veeg buikhuid tweemaal met 70% isopropylalcohol, gevolgd door povidonjood. Voor de doekjes moet de chirurg vanaf het midden van de operatieplaats en naar de buitenkant van de geprepareerde zone in een cirkelvormige wijze dat geen gebieden die eerder geschrobd met hetzelfde stuk steriel gaas of steriel wattenstaafje overlappen. Vervolgens transfer dier naar een steriele chirurgische opstart en plaats boven het plexiglas platformulier.
- Met behulp van een scalpel, maken in 0,75 - 1,25 in incisie in de darm vanaf 1 hieronder het borstbeen. Zorg ervoor dat u de darm of mesenterium (1 laag van de huid, 1 laag van bindweefsel, en 1 laag van de spier) doorprikken.
- Plaats een laken met een voorgesneden gat over de incisie en plaats een steriele chirurgische fase boven het doek. Zorg ervoor dat de opening is uitgelijnd met de incisie. Gebruik steriele wattenstaafje applicators te vinden en trek de dunne darm door de chirurgische fase opening.
- Trek 6-8 mesenteriale ramen door middel van het podium met behulp van wattenstaafje applicators, en wees voorzichtig niet om de ramen (figuur 1) te raken. Weefsels worden typisch geoogst uit het ileum gebied van de dunne darm te beginnen bij de blindedarm. Houd blootgestelde weefsels vochtig opgewarmd steriele zoutoplossing behoefte behulp van een steriele injectiespuit aan de oplossing druppelen.
- Euthanaseren de rat via intracardiale injectie van pentobarbital natrium (0,2 ml per rat). Voordat u mijsenteric ramen, zorgen voor de rat wordt gedood door palpatie van het hart; Er mag geen puls.
- Verwijder gewenste mesenterium weefsels met behulp van een pincet om het vet pad en fijne schaar om het venster te snijden te grijpen. Reactie rand vet (2 mm) rondom het venster. Was weefsels eenmaal in verwarmde steriele PBS en een keer in de media.
- Terug geëxterioriseerde ileum naar de buikholte en afvoeren van dieren volgens de institutionele richtlijnen.
3. Mesenterium Tissue Culture voor Time-Lapse Studies
- Transfer geautoclaveerd cultuur supplies (zie paragraaf 1.1) en weefsels in een steriele laminaire stroming kap.
- Gebruik een pincet om elk weefsel over te dragen bovenop een polycarbonaat filter membraan. Grab weefsels door het vet pad om te voorkomen dat schade aan de bloedvaten.
- Verspreidde zich snel het weefsel met behulp van het vet pad, zorg dat het raam niet aan te raken. Inverteer het inzetstuk met het weefsel in de bodem van een 6-wells plaat en dek af met 3 ml medium (figuur 1
- Herhaal stap 3,2-3,3 voor elk weefsel en kweek incubator in standaard condities (5% CO2, 37 ° C) gedurende 5 dagen.
4. Time-lapse beeldvorming van Mesenterium Tissue
- Op de dag van imaging vult deze media in elk putje met geconjugeerde BSI-lectine en incubeer onder standaard kweekomstandigheden gedurende 30 min. Was weefsels tweemaal met lectine-vrije media. BSI-lectine vlek zichtbaar blijven op het mesenterium weefsel tot 3 dagen in kweek.
- Breng de plaat naar een microscoop podium. Identificeer bloed- en lymfevaten basis van hun morfologie en netwerkstructuur.
- Zoek een gewenste netwerk gebied op elk weefsel en foto's te nemen. Let op de imagingplaats naar dezelfde regio te waarborgen zullen worden vastgelegd voor de volgende beelden. Bij gebruik van een gemotoriseerde podium, het document van de coördinaten.
- Terug weefsels naar de incubator en blijven om de cultuur tot de gewenste eindpunt. Herhaal stap 4,1-4,3 indien nodig afhankelijk van de gewenste experimentele tijdstippen.
5. Tissue immunokleuring
- BSI-lectine Labeling
- Incubeer weefsels gedurende 30 min bij 37 ° C met 1:40 FITC-geconjugeerd lectine in media (2,5 ml antilichaamoplossing per putje in 6-well plaat) gevolgd door twee spoelingen met media. Voor spoelingen, voeg media en dan meteen vervangen.
- Live / Dead Labeling
- Incubeer weefsels gedurende 10 min bij 37 ° C met 1: 500 2 mM ethidium homodimeer-1 en 1: 500 1 mM calceïne AM in media (2,5 ml antilichaamoplossing per putje in 6-well plaat) gevolgd door twee spoelingen met media.
- BSI-lectine / NG2 Labeling
- Spread weefsels op een microscoop gleede (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden.
- Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min).
- Voor primaire antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 konijn polyklonaal antilichaam NG2 en 5% normaal geit serum (NGS). Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min).
- Voor secundair antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 geit anti-konijn CY2-geconjugeerd antilichaam (GAR-CY2) en 5% NGS. Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min).
- Incubeer weefsels gedurende 30 min bij kamertemperatuur met FITC-geconjugeerd 01:40 lectine in PBS, gevolgd door twee spoelingen met PBS. Voor spoelen, voeg PBS en dan meteen vervangen.
- Om de dia's te monteren, te dekken weefsels met 50:50 PBS en glycerol-oplossing en plaats dekglaasje op de top. Dicht de dia randen met behulp van nagellak.
- LYVE-1 / PECAM Labeling
- Verspreid weefsels op een microscoopglaasje (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden.
- Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Voor primaire antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 200 monoklonaal gebiotinyleerd CD31 antilichaam en 1: 100 konijn polyklonaal LYVE-1 antilichaam in PBS + 0,1% saponine + 2% runderserumalbumine (BSA) + 5% NGS . Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Voor secundair antilichaam labeling, incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 500 Cy3 geconjugeerd streptavidine antilichaam en 1: 100 GAR-CY2 in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Als u dia's, cover weefsels monteren met 50:50 PBS en glycerol oplossing en plaats een dekglaasje op de top. Dicht de dia randen met behulp van nagellak.
- BrdU / BSI-lectine Labeling
- Voeg 1 mg / ml BrdU media en vervang weefsel media met BrdU oplossing. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
- Verspreid weefsels op een microscoopglaasje (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden.
- Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS (3 x 10 min).
- Denatureren weefsel DNA in 2 M HCl gedurende 1 uur bij 37 ° C. Wassen weefsels in PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Voor primaire antilichaam labeling, incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 monoklonale muizen anti-BrdU in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Voor secundair antilichaam labeling, incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 geit anti-muis Cy3-geconjugeerd antilichaam (GAM-Cy3) in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Als u dia's, cover weefsels met 50:50 PBS en glycerol-oplossing en plaats dekglaasje op de top te monteren. Dicht de dia randen met behulp van nagellak.
- BSI-lectine / CD11b etikettering
- Verspreid weefsels op een microscoopglaasje (1-2 weefsels / dia) en laten drogen. Verwijder overtollig vet met een scalpel door te drukken stevig omlaag om het vet te snijden.
- Fix weefsels in koude methanol gedurende 30 minuten bij -20 ° C. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Voor primaire antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 muizen anti-rat CD11b in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen weefsels met PBS + 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Voor secundair antilichaam labeling incubeer weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met 1: 100 GAM-Cy3 in PBS + 0,1% saponine + 2% BSA + 5% NGS. Wassen met PBS weefsels+ 0,1% saponine (3 x 10 min).
- Incubeer weefsels gedurende 30 min bij kamertemperatuur met FITC-geconjugeerd 01:40 lectine in PBS, gevolgd door twee spoelingen met PBS.
- Als u dia's, cover weefsels met 50:50 PBS en glycerol-oplossing en plaats dekglaasje op de top te monteren. Dicht de dia randen met behulp van nagellak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 3 dagen kweek werden weefsels gelabeld met een levende / dode levensvatbaarheid / cytotoxiciteit kit om de levensvatbaarheid van de microvasculatuur in de rat mesenterium cultuurmodel (Figuur 2A) tonen. De meeste cellen aanwezig in het mesenterium stand bleef in de cultuur waar endotheelcellen werden geïdentificeerd op basis van hun locatie in microvasculaire segmenten. Endotheliale celproliferatie werd ook bevestigd door lectine / BrdU labeling (Figuur 2D). Gladde spiercel en aanwezigheid pericyte langs vaartuigen werd bevestigd NG2 labeling (Figuur 2B). Labeling voor LYVE1 en PECAM geïdentificeerd vertakkende lymfatische en bloed microvasculaire netwerken en bevestigde het onderhouden lymfatische versus bloed endotheliale cellen fenotype (figuur 2C).
De time-lapse functie van dit model werd gebruikt door het labelen van de microvascular netwerken met BSI-lectine op verschillende tijdstippen en beeldvorming van de dezelfde regio binnen het netwerk in de tijd; Deze mogelijkheid is vooral waardevol voor het onderzoeken weefselspecifieke angiogene responsen. De aanvulling van media met 10% serum veroorzaakt een sterke angiogene respons na 3 dagen stimulering. Bovendien worden nieuwe vaatsegmenten en capillaire spruiten werden geïdentificeerd op dag 5 van de stimulatie (figuur 3). De time-lapse imaging methode termijn voor de kwantitatieve vergelijking van netwerk- gebieden vóór en na stimuleren (Figuur 4). Voor dit representatieve onderzoek, dat onze eerdere resultaten 9 bevestigt, het aantal vaartuigen per vasculaire gebied en het aantal capillaire spruiten per vasculaire gebied werden gekwantificeerd één 4X beeld per weefsel uit. Bloedvat segmenten werden gedefinieerd als lectine-positieve bloed endotheelcellen segmenten aanwezig zijn tussen twee tak punten en capillaire spruiten werden gedefinieerd als blind eindigend segmenten afkomstig van een groot vat. Time-lapse vergelijking netwerk regio ook mogelijk volgen van endotheelcellen segmenten (Figuur 5) en identificatie van bloed / lymfevat mis-patronen (figuur 6). Labeling van gekweekte weefsels van lectine en CD11b bovendien bevestigde de aanwezigheid van interstitiële macrofagen (figuur 7) hermodellering netwerken.
Figuur 1. Mesenteriale ramen waren gevestigd door het uittrekken van de dunne darm door middel van een chirurgische podium. De chirurgische podium is ontworpen en gemaakt door 3-D printing. Het elliptisch gat in het midden ongeveer 2 door 1 in (A). De mesenteriale ramen werden daarna uitgespreid op een membraan insert en het insert werd omgekeerd en in een put (B) gebracht. Schaal bar = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Bloedvaten levensvatbaar te blijven in de rat mesenterium cultuur model. Live / dead assay uitgevoerd na het kweken vertoonden een hoge verhouding van levende cellen (groen) om dode cellen (rood) bepaald langs de bloedvaten (A). Mesenterium weefsels werden gelabeld met lectine en anti-NG2, om pericyten (rood) naast vaten (groen) identificeren en te bevestigen dat verschillende soorten cellen aanwezig in de kweek na weefsels (B) zijn. Weefsels werden ook het label tegen PECAM / LYVE-1 tot en bloed (rood) schepen identificeren lymfatische (groen) vaten (C). Om te onderzoeken of microvasculaire cellen proliferatie in kweek ondergaan, werden mesenterium weefsels gelabeld met lectine / anti-BrdU . Op capillaire segmenten gelabeld met lectine (groen), werden meerdere cellen bevestigd proliferatieve (rood) (D) zijn. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Time-lapse beeldvorming van de rat mesenterium maakt het observeren van microvasculaire verbouwing in de loop van de cultuur. Een robuuste angiogene respons werd waargenomen na 3 (B) en 5 dagen (C) van de cultuur met 10% serum stimulatie. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
bestanden / ftp_upload / 55183 / 55183fig4.jpg "/>
Figuur 4. microvasculaire netwerken in de rat mesenterium cultuur model werden in beeld gebracht voor en na de angiogenese. Vergelijking van hetzelfde netwerk gelabeld met lectine op dag 0 en dag 3 (A, B) na stimulatie met 10% serum worden nieuwe vaten. Lectine labels ook een populatie van niet-geïdentificeerde interstitiële cellen. Kwantificering van bloedvatdichtheid (C, D) en het aantal capillaire spruiten per vasculaire gebied (E, F) bevestigt een toename van zowel statistieken voor elk weefsel. C, E) vóór (dag 0) en na (dag 3) een vergelijking per weefsel. D, F) Vergelijking tussen dag 0 en dag 3 Gemiddelden met een gepaarde t-toets bevestigde een significant verschil in zowel het gemiddelde aantal vaatsegmenten (p <0,0001) en het gemiddelde aantal kiemen (p <0,00001) per vaatgebied . Witte balken vertegenwoordigen dag 0, en zwarte balken vertegenwoordigen dag 3. Values zijn gemiddelden ± SEM. Hiervoor representatieve analyse werden weefsels geoogst uit 13 2 ratten. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. De rat mesenterium cultuur model kan worden gebruikt voor het onderzoeken van vasculaire eiland lot en de opname in netwerken in de buurt. Met behulp van time-lapse imaging, vasculaire eilanden, gedefinieerd als verbroken endotheliale segmenten, werden geïdentificeerd op dag 0 en hun verbinding met het netwerk in de buurt werd bevestigd door dag 3 post-angiogene stimulatie. Mesenterium weefsels werden gestimuleerd met bFGF (A, B) en VEGF / PDFG-BB (C, D). Hollow pijlen geven verbroken segmenten op dag 0 en solide pijlen geven eiland aansluiting op het netwerk. Pijlpunten geven de locatie van verbindingen tussen een vasculaire eiland en de nabijgelegen netwerk. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Time-lapse beelden tonen het vermogen om lymfatische en bloedvaten patronen observeren. Lymfatische (l) vaartuigen kunnen worden onderscheiden van arteriolen (a) en venulen (v) op basis van etikettering morfologie op dag 0 (A). Op dag 5 na stimulatie met 10% serum, lymfe morfologie wordt verloren en vaartuigen lijken te zijn geïntegreerd met het nabijgelegen angiogene bloedvaten (B). Schaal bar = 100 urn. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.
Figuur 7. macrofagen aanwezig in gekweekte rat mesenteriale weefsels blijven. Lectine / CD11b co-labeling weefsels gekweekt gedurende 3 dagen met 10% serum suggereren dat lectine positieve interstitiële cellen zijn een deelverzameling van macrofagen. (A) een representatief beeld van BSI-lectine labeling. (B) CD11b etikettering in hetzelfde gezichtsveld. (C) De samengevoegde afbeelding. De pijlen identificeren voorbeelden van co-labeling. Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol documenteert een methode voor het gebruik van de rat mesenterium cultuur model als een ex vivo tool voor time-lapse beeldvorming van de groei microvasculaire netwerk. Contract in ons laboratorium is het gebruik van onze model 1) angiogenese 8, 2) lymfangiogenese 8, 3) pericyte-endotheelcelinteracties 8 en 4) anti-angiogene drug testen 9 ingesteld. De mogelijkheid voor het afbeelden gekweekte rat mesenterium weefsels op verschillende tijdstippen biedt een kwantitatief assay voor het evalueren weefselspecifieke groeiresponsies en het volgen van cel-cel interacties in verschillende angiogene stimuli. De verhoogde proliferatie van endotheelcellen in de angiogenese en de aanwezigheid van pericyten zijn consistent met onze eerdere werk 8 en bevestig de dynamische interacties tussen verschillende celtypen tijdens angiogenese in gekweekte ratten mesenteriale weefsels.
in vitro celkweek systemen, de rat mesenterium cultuur model is uniek omdat de groei plaatsvindt binnen een intacte, echte microvasculaire netwerk. Beschouw in tegenstelling tot de aorta ring test, die is opgericht om angiogene ontspruit uit de aorta segmenten studeren in een collageen gel 10. Terwijl kiemen in de aorta ring bestaat uit meerdere celtypes, capillaire spruiten groeien uit de uitgesneden delen van de aorta, die sterk verschilt van de in vivo scenario. De hersenen slice model is een andere ex vivo model, maar het is leegte van lymfevaten. Bovendien heeft de hersenen slice model niet aangetoond dat deze kan time-lapse imaging te zijn voor en na angiogene stimulatie 11. Een andere ex vivo model dat onlangs is geïntroduceerd is het netvlies cultuur model. Het voordeel van het netvlies model is dat angiogenese optreedt uit intacte microvascular netwerken in het weefsel 12, 13. Voor deze modellen kunnen GFP-transgene muizenstammen gebruikt kunnen capillaire kiemen mettertijd, maar helaas de muis mesenterium is avasculaire 14, waardoor de GFP-transgene muizen mesenterium vervanging rat mesenterium, zoals gebruikt in ons model. Verder laten we zien dat een eenvoudige lectine etikettering van rat mesenterium weefsels in kweek voldoende om netwerkgroei bepalen op verschillende tijdstippen en in vergelijking met de andere ex vivo modellen ons model maakt gelijktijdige waarneming van zowel bloed en lymfatische endotheelcellen.
BSI-lectine werd gebruikt in dit document om microvasculaire netwerken te visualiseren en te ontdekken angiogene reacties. Lectine is een eiwitstructuur die bindt aan glycoproteïnen op endotheelcellen en werd geselecteerd voor dit protocol vanwege de korte incubatietijd opzichte endotheliale ANTIBody markers. Lectine is minder duur dan antilichamen en het niet nodig de vaststelling; het kan ook eenvoudig worden gemengd in het kweekmedium en vervangen door vers medium na de incubatieperiode eindigt. Terwijl toekomstige studies nodig om de potentiële effecten van het lectine labeling techniek op het angiogene proces te helderen, onze representatieve resultaten (Figuur 4) laten zien dat robuuste angiogenese geïnduceerd kan worden en eerder werk 9 blijkt dat angiogenese in lectine gemerkt netwerken kan worden geremd via targeting vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF). Antilichaam markers kan mogelijk worden gebruikt als alternatief etikettering benadering als er behoefte is aan meer specifieke markers, of wanneer er een noodzaak om andere celtypen die in de microvasculaire netwerken zoals gladde spiercellen, pericyten en zenuwen onderzoeken. Een andere mogelijke werkwijze voor het visualiseren van cellen zou gentransfectie zijn.
Het voordeel van het gebruik van de time-lapse rat mesenterium model is gemarkeerd in de representatieve resultaten voor dit protocol. Het vergelijken van beelden voor en na behandeling vermindert kwesties van variabiliteit die niet-gepaarde statistische analyse beïnvloeden. Het explantaat specifieke responsen varieerde van 20% tot 233% toename in dichtheid vat en van 40% tot 3500% toename sprout dichtheid. De specifieke oorzaken voor deze variatie blijft onbekend, maar het meten van de groei in hetzelfde weefsel in de tijd weer de mogelijkheid om weefselspecifieke respons bevestigen.
Vergelijkende analyse van beelden op verschillende tijdstippen tijdens microvasculaire groei maakt ook bijhouden endotheelcellen. Zo heeft ons labo vasculaire endotheelcel eilanden segmenten in de buurt van microvasculaire netwerken die zijn losgekoppeld van nabijgelegen netwerken 15, 16 geïdentificeerd. Om te bevestigen dat deze eilanden aan te sluiten op de nabijgelegen network in reactie op angiogene stimuli, werd de rat mesenterium cultuur model gebruikt. Zoals getoond in figuur 5, werden vasculaire eilanden gevolgd na stimulatie met weefsel basische fibroblastgroeifactor (bFGF) of VEGF plus-bloedplaatjes afkomstige groeifactor (PDGF). We hebben ook aangetoond soortgelijke resultaten na stimulatie serum (gegevens niet afgebeeld). Na de stimulatie van angiogenese, kan de oorspronkelijk losgekoppeld vasculaire eilanden gevonden worden aangesloten op netwerken in de buurt.
Andere mogelijke toepassingen van de rat mesenterium cultuurmodel zou de mogelijkheid om de relatie tussen lymfe- en bloedvaten en hun endotheliale cellen en het volgen van interstitiële cel lot onderzoeken benutten. Time-lapse beelden van dezelfde microvasculaire netwerken voor en na stimulatie met 10% serum in dit model voorbeelden van mogelijke integratie lymfatische naar bloedvat (figuur 6). Vóór stimulatie, lymfe en bloed Vessels werden onderscheiden op basis van vaatmorfologie. Na stimulatie, lymfatische versus bloedvat identiteit werd minder duidelijk. Het potentieel voor lymfatische / bloed endotheelcelinteracties wordt ondersteund door de waarneming van PECAM + / LYVE-1- bloed endotheelcellen verbinden met PECAM + / LYVE-1 + lymfatische endotheelcellen (gegevens niet afgebeeld). Deze waarnemingen ondersteunen het gebruik van de rat mesenterium cultuur model voor het onderzoeken van lymfatische / bloed endotheelcellen plasticiteit. Figuur 6A wijst ook op de lectine etikettering van schijnbare interstitiële cellen. Hoewel deze etikettering is inconsistent en heterogeen uit weefsel aan weefsel, het doet benadrukken de aanwezigheid van endogene weefsel inwoner cellen. CD11b etikettering van gekweekte weefsels (figuur 7) suggereert dat deze lectine-positieve interstitiële cellen van een sub-set van macrofagen zou kunnen zijn. Gezien de opkomende belangstelling macrofagen betrokken bij angiogenese 20 een extra kracht van demodel zou het gebruik macrofaag dynamiek te volgen in de tijd.
Net als andere ex vivo modellen, een stroombegrenzing bestuderen angiogenese bij ratten mesenterium cultuurmodel is het gebrek aan bloedtoevoer. Dwarskracht door bloedstroom is aangetoond dat het een rol in endotheelcellen morfologie en proliferatie en angiogenese 17, 18, 19 spelen. Voor de representatieve resultaten weergegeven in figuur 4, de afwezigheid van schuifspanning alleen kunnen volstaan om een angiogene reactie in de gekweekte netwerken induceren geweest. Maar we weten dat op basis van onze eerste publicatie karakteriseren van de rat mesenterium cultuur model 8, dat de media suppletie veroorzaakt verhoogde angiogenese versus alleen media. Toekomstige studies waarin stroming binnen de gekweekte microvasculaire netwerken ongetwijfeld nodig om beter na te bootsen dein vivo scenario. Potentiële benaderingen voor het opnemen van stroom kunnen zijn infusen van het netwerk van het voeden arteriolen of zelfs infusen van verder stroomopwaarts slagaders binnen de dikke rand van mesenteriale ramen. Ondanks het ontbreken van stroming, de levensvatbaarheid van meerdere celtypes, het behoud van bloed en lymfatische microvasculaire netwerken en celproliferatie tijdens angiogenese ondersteunt de rat mesenterium cultuurmodel relatieve verhoogde complexiteit in vergelijking met op cellen gebaseerde in vitro modellen.
Samenvattend, dit protocol beschrijft een eenvoudige, reproduceerbare werkwijze ex vivo voor beeldvorming angiogene responsen in intacte microvasculaire netwerken. Een dergelijke werkwijze biedt een alternatief voor celgebaseerde in vitro modellen voor het beoordelen angiogene celdynamiek op specifieke locaties binnen een netwerkomgeving. De methode biedt ook een nieuw instrument voor het onderzoeken van angiogenese, lymfangiogenese en bloed / lymfatische mis-gekletsning tegelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60 mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/mL |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/mL |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
