Abstract
Angiogenese, definert som veksten av nye blodkar fra pre-eksisterende fartøy, omfatter endotelceller, pericytes, glatte muskelceller, immunceller og samordning med lymfekar og nerver. Den multi-celle, multi-system interaksjoner nødvendig etterforskningen av angiogenese i en fysiologisk relevant miljø. Mens således anvendelse av in vitro cellekultur modeller har gitt mekanistiske innsikt, er en vanlig kritikk at de ikke rekapitulere kompleksiteten forbundet med en mikrovaskulær nettverk. Målet med denne protokollen er å vise evne til å gjøre time-lapse sammenligninger av intakte mikrovaskulære nettverk før og etter angiogenese stimulering i dyrkede rotte mesenteriet vev. Helstøpt vev inneholder mikrovaskulære nettverk som opprettholder deres hierarki. Immunhistokjemisk merking bekrefter tilstedeværelsen av endotelceller, glatte muskelceller, pericytes, blodkar og lymfekar. I enapparat.Foruten, merking vev med BSI-lektin muliggjør time-lapse sammenligning av lokale nettverks regioner før og etter serum eller vekstfaktor stimulering preget av økt kapillær spirende og fartøy tetthet. I forhold til vanlige cellekultur modeller, gir denne metoden et verktøy for endoteliale celle avstamning studier og vevsspesifikk angiogen medikament evaluering i fysiologisk relevante mikrovaskulære nettverk.
Introduction
Mikrovaskulær nettverk vekst og remodellering er fellesnevneren for vev funksjon, sårheling og flere patologier og en nøkkel prosess er angiogenese, definert som veksten av nye blodkar fra eksisterende 1, 2. For tissue engineering nye skip eller designe angiogene basert terapi, forstå betydningen av mobiltelefon dynamikk involvert i angiogenese er kritisk. Imidlertid er denne fremgangsmåte komplisert. Det kan variere på bestemte steder innenfor en mikrovaskulær nettverk og involverer flere celletyper (dvs. endotelceller, glatte muskelceller, pericytes, makrofager, stamceller) og flere systemer (lymfatisk nettverk og nevrale nettverk). Selv om in vitro-modeller har bidratt enormt til å undersøke sammenhengen mellom ulike celler involvert i angiogenese 3, kan deres fysiologiske relevans undergraves på grunn av thei r begrenset kompleksitet, og det faktum at de ikke gjenspeile en in vivo-situasjon. For å overvinne disse begrensningene, tredimensjonal kultur systemer 3, ex vivo vevsmodeller 4, microfluidic systemer 5, 6, og beregningsmodeller 7 er utviklet og innført de siste årene. Det er imidlertid fremdeles et behov for en modell med tidsintervall evne til å undersøke angiogenese i intakte mikrovaskulære nettverk ex vivo. Etablering av nye time-lapse modeller for angiogenese studier med at nivået av kompleksitet vil gi et uvurderlig verktøy for å forstå de underliggende mekanismene som regulerer angiogenese og bedre behandling.
En potensiell modell som gjør det mulig for ex vivo undersøkelser av angiogenese over en intakt microvascular nettverk er rotte mesentery kulturmodell> 8. I siste arbeid, har vi vist at blod og lymfatiske mikrovaskulære nettverk forbli levedyktig etter kultur. Enda viktigere, kan rotte mesentery kulturmodell brukes til å undersøke funksjonelle pericyte-endothelial celleinteraksjoner, blod og lymfatiske endotelcelle tilkoblinger, og time-lapse imaging. Målet med denne artikkelen er å gi vår protokoll for time-lapse imaging metode. Våre representative resultater dokumentere flere celletyper som forblir levedyktig etter stimulering av angiogenese med serum og tilbyr eksempler på bruk av denne metoden for å kvantifisere vev spesifikke angiogene responser samt endothelial celle sporing studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk og prosedyrer ble godkjent av Tulane University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).
1. Kirurgisk prosedyre Setup
- Autoclave instrumenter, kirurgisk utstyr og kultur forsyninger før operasjonen. Kirurgiske råmaterialer for hver rotte inkluderer: 1 drapere, en drape med pre-cut hull (0,5 x 1,5 tommer) i sentrum, gasbind pads, og en absorberende underlags. Kirurgiske instrumenter omfatter: en skalpell med et antall 10 blad, 2 par av pinsetter, og et par av fine sakser. Kultur forsyninger inkluderer: 1 drapere, en pinsett, og forberedt seks-brønns plate innsatser med polykarbonat filtre.
- Sterilisere en plexiglass-plattform, en kirurgisk scene og en kirurgisk benkeplate Bøk plass med 70% etanol. Hold den kirurgiske trinn i en steril skål inntil bruk.
- Skape en kirurgisk trinn ved boring av en ca 2 i av en i hull i sentrum av en 100 mm kulturskål. Deretter bruker sandpapir for å jevnenoen skarpe kanter og legge et lag av silikon lim til hullets kanter for å skape en hevet overflate for vev.
- Alternativt designe kirurgisk stadium ved hjelp av CAD-programvare og gjøre med 3-D utskrift (figur 1).
- Plasser en steril absorberende underlags ned og legge et plexiglass plattform på toppen av det. Plasser overtrekket, uten en pre-cut hull, over en oppvarmet pute ved siden av det absorberende underlags.
- Pre-varm steril fosfatbufret saltløsning (PBS), media og saltoppløsning til 37 ° C. Plasser media og PBS i egne kultur retter oppå varmeputen og sted saltvann i en 50 ml konisk rør ved siden av den kirurgiske oppsettet.
- Sørg for at alle pakkene er åpnet før i begynnelsen av operasjonen for å sikre steril håndtering av alle materialer. En fullstendig liste over de vanligste verktøyene som brukes i denne prosedyren er oppført i Tabell over spesifikke kirurgiske materialer og verktøy.
2. Mesentery Tissue Høsting
- Bruk voksne Wistar hannrotter (350 ± 25 g, 6 - 8 ukers alder). Andre stammer og alder på rotter kan erstattes.
- Bedøve rotte via en intramuskulær injeksjon av ketamin (80 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (8 mg / kg kroppsvekt). Bekreft rotte er under anestesi ved å knipe mellom tærne for å se etter en refleks respons; det bør være ingen. Forkjøpsrett analgesi for denne terminalen prosedyren er ikke nødvendig.
- Barbere mageregionen og fjerne gjenværende hår ved hjelp av hårfjerning krem. Tørk abdominal huden to ganger med 70% isopropylalkohol etterfulgt av povidon-jod. For tørken kirurgen skal starte i sentrum for det kirurgiske området, og beveger seg til utsiden av det preparerte område på en sirkulær måte at den ikke overlapper områder som tidligere er blitt skrubbet med samme stykke sterilt gasbind eller steril vattpinne. Deretter overføre dyret til sterile kirurgiske oppsett og legg på toppen av plexiglass platform.
- Ved hjelp av en skalpell blad, lage en 0,75 i - 1,25 i snitt i tarmen starter en i under brystbenet. Vær forsiktig med å punktere tarm eller mesentery (1 lag av huden, en lag av bindevev, og en lag av muskler).
- Plasser en drape med en pre-cut hull over snittet, og legg en steril kirurgisk scene oppå drapere. Sørg for åpningen på linje med snittet. Bruk sterile bomull-tipped applikatorer for å finne og trekke ut ileum gjennom kirurgisk sceneåpningen.
- Trekk 6 - 8 mesenteriets vinduer gjennom scenen ved hjelp av bomull-tipped applikatorer, og vær forsiktig så du ikke berører vinduene (figur 1). Vev er typisk høstet fra ileum region av tynntarmen begynner nær cecum. Hold eksponerte vev fuktig med varmet sterilt saltvann etter behov ved bruk av en steril sprøyte å dryppe oppløsningen.
- Avlive rotta via intrakardiell injeksjon av pentobarbital natrium (0,2 ml per rotte). Før du tar megsenteric vinduer, sikre rotta avlives ved palpating hjertet; det skal ikke være noen puls.
- Fjern ønskede mesentery vev ved hjelp av pinsett til å ta tak i fett puten og fine saks til å klippe vinduet. La en kant av fett (2 mm) rundt vinduet. Vask vev gang varmet steril PBS og en gang i media.
- Returner exteriorized ileum til bukhulen og kast dyr i henhold til institusjonelle retningslinjer.
3. mesentery Tissue Culture til Time-Lapse Studies
- Overfør autoklaveres kultur forsyninger (se avsnitt 1.1) og vev til en steril laminær hette.
- Bruk pinsett til å overføre hvert vev på toppen av en polykarbonat filter membran. Grab vev av fettpute for å unngå skade på blodkar.
- Raskt spre vev ved hjelp av fettpute, være forsiktig med å berøre vinduet. Invertere innsatsen med vevet inn i bunnen av en 6-brønns plate og dekkes med 3 ml av media (figur 1
- Gjenta trinn 3.2 til 3.3 for hver vev og kultur i standard inkubatorforhold (5% CO 2, 37 ° C) i inntil 5 dager.
4. Time-Lapse Imaging av mesentery Tissue
- På dagen for bildebehandling, supplerer medier i hver brønn med konjugert BSI-lektin og ruge under standard kultur forhold i 30 min. Vask vev to ganger med lektin-frie medier. BSI-lektin flekken forblir synlig på mesentery vev i inntil 3 dager i kultur.
- Overføre platen til en objektbord. Identifisere blod- og lymfekar basert på deres morfologi og nettstruktur.
- Finn en ønsket nettverks region på hver vev og ta bilder. Legg merke til bildebehandlingplassering for å sikre samme region vil bli tatt for etterfølgende bilder. Hvis du bruker en motorisert stadium, dokumentere koordinatene.
- Returner vev til inkubatoren og fortsette til kultur til ønsket sluttpunkt. Gjenta trinn 04.01 til 04.03 etter behov, avhengig av ønsket eksperimentelle tidspunkter.
5. Tissue Immunolabeling
- BSI-lektin Merking
- Inkuberes vevene i 30 minutter ved 37 ° C med 1:40 FITC-konjugert lektin i media (2,5 ml antistoffoppløsning per brønn i 6-brønns plate), fulgt av to skyllinger med media. For skyllinger, legge til media og deretter umiddelbart erstatte.
- Levende / Døde Merking
- Inkuberes vevene i 10 minutter ved 37 ° C med 1: 500 2 mM etidium homodimer-1 og 1: 500 1 mM kalsein AM i media (2,5 ml antistoffoppløsning per brønn i 6-brønns plate), fulgt av to skyllinger med media.
- BSI-lektin / NG2 Merking
- Spre vev på et mikroskop glede (1 - 2 vev / lysbilde) og la tørke. Fjern overflødig fett med en skalpell ved å trykke hardt ned til skjære fettet.
- Fiks vev i kald metanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask vev med PBS (3 x 10 min).
- For primære antistoff merkingen inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 100 kaninpolyklonalt antistoff NG2 og 5% normalt geiteserum (NGS). Vask vev med PBS (3 x 10 min).
- For sekundære antistoff merkingen inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 100 geite-anti-kanin-CY2-konjugert antistoff (GAR-CY2) og 5% NGS. Vask vev med PBS (3 x 10 min).
- Inkuber vevene i 30 minutter ved romtemperatur med 01:40 FITC-konjugert lektin i PBS, fulgt av to skyllinger med PBS. For skyllinger, legge PBS og deretter umiddelbart erstatte.
- For å montere lysbildene, dekke vev med 50:50 PBS og glyserol løsning og sted dekkglass på toppen. Tett glide kantene med neglelakk.
- LYVE-1 / PECAM Merking
- Spre vev på et objektglass (1 - 2 vev / lysbilde) og la tørke. Fjern overflødig fett med en skalpell ved å trykke hardt ned til skjære fettet.
- Fiks vev i kald metanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask vev med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For primære antistoff merkingen inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 200 mus monoklonalt biotinylert CD31 antistoff og 1: 100 kaninpolyklonalt LYVE-1-antistoff i PBS + 0,1% saponin + 2% bovint serumalbumin (BSA) + 5% NGS . Vask vev med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For sekundært antistoff merking, inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 500 Cy3-konjugert streptavidin-antistoff og 1: 100 GAR-CY2 i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask vev med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For å montere lysbilder, dekke vev med 50:50 PBS og glyserol løsning og plassere en dekkglass på toppen. Tett glide kantene med neglelakk.
- BrdU / BSI-lektin Merking
- Tilsett 1 mg / ml BrdU til media og erstatte vev media med BrdU løsning. Inkuber i 2 timer ved 37 ° C.
- Spre vev på et objektglass (1 - 2 vev / lysbilde) og la tørke. Fjern overflødig fett med en skalpell ved å trykke hardt ned til skjære fettet.
- Fiks vev i kald metanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask vev med PBS (3 x 10 min).
- Denaturere DNA vev i 2 M HCl i 1 time ved 37 ° C. Vask vev i PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For primært antistoff merking, inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 100 monoklonalt mus anti-BrdU i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask vev med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For sekundært antistoff merking, inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 100 geite-anti-muse-Cy3-konjugert antistoff (GAM-Cy3) i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask vev med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For å montere lysbilder, dekke vev med 50:50 PBS og glyserol løsning og sted dekkglass på toppen. Tett glide kantene med neglelakk.
- BSI-lektin / CD11b merking
- Spre vev på et objektglass (1 - 2 vev / lysbilde) og la tørke. Fjern overflødig fett med en skalpell ved å trykke hardt ned til skjære fettet.
- Fiks vev i kald metanol i 30 minutter ved -20 ° C. Vask vev med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For primære antistoff merkingen inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 100 muse-anti-rotte CD11b i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask vev med PBS + 0,1% saponin (3 x 10 min).
- For sekundære antistoff merkingen inkuberes vevene i 1 time ved romtemperatur med 1: 100 GAM-Cy3 i PBS + 0,1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. Vask vev med PBS+ 0,1% saponin (3 x 10 min).
- Inkuber vevene i 30 minutter ved romtemperatur med 01:40 FITC-konjugert lektin i PBS, fulgt av to skyllinger med PBS.
- For å montere lysbilder, dekke vev med 50:50 PBS og glyserol løsning og sted dekkglass på toppen. Tett glide kantene med neglelakk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter 3 dager i kultur, ble vev merket med en levende / død levedyktighet / cytotoksisitet kit for å demonstrere gjennomførbarheten av microvasculature i rotte mesenteriet kulturmodell (figur 2A). Størstedelen av celler som er tilstede i mesenteriet forble levedyktige i kultur der endotelceller ble identifisert på grunnlag av deres plassering i mikrovaskulære segmenter. Endotelcelle proliferasjon ble også bekreftet av lektin / BrdU-merking (figur 2D). Glatte muskelceller og pericyte tilstedeværelse langs fartøy ble bekreftet med NG2 merking (figur 2B). Merking for LYVE1 og PECAM identifiserte forgrening lymfatisk og blod mikrovaskulære nettverk og bekreftet opprettholdt lymfatiske versus blod endotelceller fenotype (figur 2C).
Time-lapse funksjon i denne modellen ble brukt av merking av microvascular nettverk med BSI-lektin ved ulike tidspunkt og bildebehandling i samme region innenfor nettverket over tid; denne evnen er spesielt verdifullt for å undersøke vev spesifikke angiogene svar. Tilskudd av media med 10% serum forårsaket en robust angiogen respons etter 3 dager med stimulering. I tillegg ble nye fartøy segmenter og kapillære spirer identifisert av dag 5 av stimulering (figur 3). Time-lapse avbildningsmetode er tillatt for kvantitativ sammenligning av nettverks regioner før og etter stimuleringen (figur 4). For denne representative studien, som bekrefter våre tidligere resultater 9, ble antall skip per vaskulær område og antall kapillære spirer per vaskulær område kvantifisert fra en 4X bilde per vev. Blod fartøy segmenter ble definert som lektin-positivt blod endotelcelle segmenter stede mellom to avdelings poeng og kapillære spirer ble definert som blind endte segmenter som stammer fra en rekke fartøy. Time-lapse sammenligning av nettverks regioner også aktivere sporing av endotelcelle segmenter (figur 5) og identifisering av blod / lymfekar mis-mønster (figur 6). Merking av dyrkede vev for lectin og CD11b tillegg bekreftet tilstedeværelsen av interstitiell resident makrofager (figur 7) i remodeling nettverk.
Figur 1. Mesenteric vinduene ble plassert ved å trekke ut tynntarmen gjennom en kirurgisk stadium. Den kirurgiske scenen er designet og laget av 3-D utskrift. Den elliptiske hull i midten er ca 2 i av en i (A). Mesenteric vinduer ble deretter spredt ut på toppen av en membran sette inn, og innsatsen ble snudd og satt i en brønn (B). Scale bar = 2 cm.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Blodårene være levedyktig i rotte mesenteriet kulturmodell. Levende / dead analyse utført etter kultur viste en høy andel av levende celler (grønn) til døde celler (røde) spesielt langs blodkar (A). Mesenterium vev ble merket lektin og anti-NG2, for å identifisere pericytes (røde) sammen fartøy (grønn) og for å bekrefte at forskjellige typer av celler som er tilstede i post-kultur vev (B). Vev ble også merket mot PECAM / LYVE-en for å identifisere blod (rød) fartøy fra lymfesystemet (grønn) fartøy (C). For å undersøke om mikrovaskulære cellene gjennomgå proliferasjon i kultur, ble mesenteriet vev merket med lektin / anti-BrdU . På kapillær segmenter merket med lectin (grønt), ble flere celler bekreftet å være proliferativ (red) (D). Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. tidsforsinkelse avbildning av rotte-mesenteriet gjør det mulig å observere mikrovaskulær remodellering i løpet av kulturen. En robust angiogene respons ble observert etter 3 (B) og 5 dager (C) med kultur med 10% serum stimulering. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
filer / ftp_upload / 55183 / 55183fig4.jpg "/>
Figur 4. mikrovaskulære nettverk i rotte mesentery kulturmodell ble fotografert før og etter angiogenese. Sammenligning av det samme nettverket som er merket med lektin på dag 0 og dag 3 (A, B) etter stimulering med 10% serum identifiserer nye skip. Lektiner etiketter også en populasjon av uidentifiserte interstitiell celler. Kvantifisering av fartøy tetthet (C, D) og antall kapillære spirer per vaskulær område (E, F) bekreftet en økning i både beregninger for hvert vev. C, E) før (dag 0) og etter (dag 3) sammenligninger pr vev. D, F) Sammenligning mellom dag 0 og dag 3 gjennomsnitt bruker en paret t-test bekreftet en signifikant forskjell i både gjennomsnittlig antall fartøy segmenter (p <0,0001) og gjennomsnittlig antall spirer (p <0,00001) per vaskulær område . Hvite linjer representerer dag 0, og svarte striper representere dag 3. Values er gjennomsnitt ± SEM. For dette representant analysen ble 13 vev høstet fra 2 rotter. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. rotte mesenteriet kulturmodell kan benyttes for undersøkelse av vaskulær øy skjebne og inkorporering inn i nettverk i nærheten. Ved hjelp av time-lapse imaging, vaskulære øyer, definert som frakoblet endotelceller segmenter, ble identifisert på dag 0 og deres tilknytning til den nærliggende nettverk ble bekreftet etter dag 3 post-angiogen stimulering. Mesenterium Vevene ble stimulert med bFGF (A, B) og VEGF / PDFG-BB (C, D). Hollow pilene viser løsrevne segmenter på dag 0 og solide piler representerer øya tilkobling til nettverk. Pilspisser indikerer plasseringen av sammenhenger mellom en vaskulær øya og nettverk i nærheten. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. time-lapse bilder vise evne til å observere lymfesystemet og blodkar mønster. Lymfatisk (l) fartøy kan skilles fra arterioler (A) og venules (v) basert på merking morfologi på dag 0 (A). På dag 5 etter stimulering med 10% serum, er lymfatisk morfologi tapt og fartøy synes å ha integrert med de nærliggende angiogene blodårer (B). Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.
Figur 7. Makrofager er fortsatt til stede i dyrkede rotte mesenteric vev. Lektin / CD11b ko-merking av vev dyrket i 3 dager med 10% serum tyder på at lektin positive interstitielle celler er en undergruppe av makrofager. (A) En representant bilde av BSI-lektin merking. (B) CD11b merking i samme synsfelt. (C) Den sammenslåtte bildet. Pilene identifisere eksempler på co-merking. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen dokumenterer en metode for å bruke rotte mesentery kulturmodell som en ex vivo verktøy for time-lapse avbildning av mikrovaskulær nettverk vekst. Tidligere arbeid i vårt laboratorium har etablert ved bruk av vår modell for 1) angiogenese 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) pericyte-endotel-celleinteraksjoner 8, og 4) anti-angiogen drug testing 9. Muligheten for avbilding av dyrkede rotte-mesenteriet vev ved flere tidspunkter gir en kvantitativ analyse for vurdering av vevs-spesifikke vekstresponser og sporing av celle-celle interaksjoner under ulike angiogene stimuli. Den økte proliferasjon av endotelceller under angiogenese og tilstedeværelsen av pericytes er i samsvar med vårt tidligere arbeid 8 og validere dynamisk interaksjon mellom flere celletyper under angiogenese i dyrkede rotte mesenteriale vev.
in vitro cellekultursystemer, er rotte mesentery kulturmodell unik fordi veksten skjer innenfor en intakt, ekte mikrovaskulær nettverk. Tenk i motsetning aorta ring analysen, som ble etablert for å studere angiogenic spirende fra aorta segmenter i en kollagen gel 10. Mens spirende i aorta-ring omfatter flere celletyper, kapillære spirer vokse ut av det utskårede segmenter av aorta, som er svært forskjellig fra in vivo-scenario. Hjernen slice-modellen er en annen ex vivo modell, men det er blottet for lymfekar. Videre har hjernen skive modellen ikke vist seg å være istand til time-lapse avbildning før og etter stimulering angiogenic 11. En annen ex vivo modell som har nylig blitt introdusert er netthinnen kulturmodell. Fordelen med retina modellen er at angiogenese oppstår intakt microvascuLar nettverk i vevet 12, 13. For disse modellene kan GFP-transgen musestammer brukes for å kunne observere kapillær spirende over tid, men dessverre, er musen mesentery avascular 14, eliminerer GFP-transgene mus mesentery erstatning for rotte mesentery, som benyttes i vår modell. Videre viser vi at en enkel lectin merking av rotte-mesenteriet vev i kultur er tilstrekkelig for å bestemme nettverksvekst ved forskjellige tidspunkter og i forhold til den annen ex vivo-modeller, tillater vår modell for samtidig observasjon av både blod og lymfatisk endotel-celler.
BSI-lektin ble brukt i denne artikkelen for å visualisere mikrovaskulære nettverk og detektere angiogene responser. Lektin er en proteinstruktur som binder seg til glykoproteiner på endotelceller, og ble valgt for denne protokollen grunn av sin korte inkubasjonstid i forhold til endotelial AntibODY markører. Lektin er rimeligere enn antistoffer og det krever ikke å fikse; det kan også lett blandes i kulturmediet og erstattes med friskt medium etter inkubasjonsperioden ender. Mens fremtidige studier er nødvendig for å belyse de potensielle effektene av lektin merking teknikk på angiogene prosess, våre representative resultater (figur 4) viser at robuste angiogenese kan induseres og tidligere arbeid 9 viser at angiogenese i lektin merket nettverk kan bli hemmet via målretting vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF). Antistoff markører kan potensielt brukes som et alternativ merking tilnærming når det er behov for mer spesifikke markører, eller når det er behov for å undersøke andre celletyper som er tilstede i de mikrovaskulære nettverk slik som glattmuskelceller, pericytes og nerver. En annen mulig metode for visualisering av cellene ville være gen transfeksjon.
Fordelen med å bruke time-lapse rotte mesentery modellen har blitt fremhevet i de representative resultater for denne protokollen. Sammenligningen av bilder før og etter behandling reduserer problemer av variasjon som påvirker ikke-sammenkoblet statistisk analyse. Eksplantatet spesifikke responser varierte fra 20% til 233% økning i kar tetthet og fra 40% til 3500% økning i spire tetthet. De spesifikke årsaker til denne varianten er imidlertid ukjent, men måling av veksten i samme vev over tid, frem evnen til å bekrefte vev spesifikke responser.
Komparativ analyse av bilder på ulike tidspunkter i løpet av mikrovaskulær vekst gir også mulighet for sporing av endotelceller. For eksempel har vår lab identifisert vaskulære øyene som endotelceller segmenter i nærheten av mikrovaskulære nettverk som er koblet fra nærliggende nettverk 15, 16. For å bekrefte at disse øyene koble til den nærliggende nettverk i respons til angiogene stimuli, ble rotte-mesenteriet kulturmodell brukt. Som vist i figur 5, ble vaskulære øyer sporet etter vev stimulering med basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) eller VEGF pluss platederivert vekstfaktor (PDGF). Vi har også vist lignende resultater post serum stimulering (data ikke vist her). Etter stimulering av angiogenese, kan de opprinnelig løsrevne vaskulære øyer funnet koblet til nettverk i nærheten.
Andre mulige anvendelser av rotte mesentery kulturmodell kunne utnytte muligheten til å undersøke forholdet mellom lymfesystemet og blodårer og deres respektive endotelceller og sporing av interstitiell celle skjebne. Time-lapse bilder av de samme mikrovaskulære nettverk før og etter stimulering med 10% serum i denne modellen gitt eksempler på potensielle lymfatisk til blodkar integrering (figur 6). Før stimulering, lymfesystemet og blod Vessels ble preget basert på fartøy morfologi. Etter stimulering, lymfatisk versus blodåre identitet ble mindre tydelig. Potensialet for lymfatiske / blod endotel-cellereaksjoner er støttet av den observasjon av PECAM + / LYVE-1- blod endotelceller forbinder med PECAM + / LYVE-1 + lymfatisk endotel-celler (data ikke vist her). Disse observasjoner støtter bruk av rotte mesenteriet kulturmodell for undersøkelse av lymfesystemet / blod endotelcelle plastisitet. Figur 6A viser også lektin merking av åpen interstitiell celler. Selv om denne merkingen er inkonsekvent og heterogene fra vev til vev, gjør det understreker tilstedeværelsen av endogene vev bosatt celler. CD11b merking av dyrkede vev (figur 7) viser at disse lectin-positive interstitielle celler kan være et sub-sett av makrofager. Gitt den voksende interesse i makrofag engasjement i angiogenese 20, en ekstra styrkeModellen kan være bruk for å spore makro dynamikk over tid.
Mye som andre ex vivo-modeller, en strømbegrensning studere angiogenese i rotte mesenteriet kulturmodell er mangel på blod flyte. Skjærspenning forårsaket av blodstrømmen er blitt vist å spille en rolle i endotelcelle morfologi og spredning, så vel som angiogenese 17, 18, 19. For de representative resultatene som presenteres på figur 4, fravær av skjærspenning alene kan ha vært tilstrekkelig til å indusere en angiogen respons i dyrkede nettverk. Vi vet imidlertid at basert på vår første utgivelse karakteriserer rotte mesentery kultur modell 8, at media tilskudd fører til økt angiogenese versus media alene. Fremtidige studier som omfatter flyt i de dyrkede mikrovaskulære nettverk er utvilsomt behov for å nærmere etterlignein vivo scenario. Potensielle tilnærminger for å innlemme flyt kan omfatte kanylering av nettverk fôring arterioler eller kanylering av ytterligere oppstrøms arterier innenfor fettet grensen av mesenteriale vinduer. Men til tross for mangel på strømning, levedyktigheten av flere celletyper, opprettholdelse av blod og lymfatiske mikrovaskulære nettverk, og celle-proliferasjon i løpet av angiogenese støtter rotte-mesenteriet kulturmodell relative økning i grad av kompleksitet i forhold til cellebasert in vitro modeller.
Som konklusjon, beskriver denne protokollen en enkel, reproduserbar ex vivo metode for avbildning angiogenic responser i intakte mikrovaskulære nettverk. En slik metode tilbyr et alternativ til celle basert in vitro modeller for å vurdere angiogenic celle dynamikk på bestemte steder i et nettverksmiljø. Metoden gir også en roman verktøy for å undersøke angiogenese, lymphangiogenesis og blod / lymfekar mis-patterning samtidig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drape | Cardinal Health | 4012 | 12” x 12” Bio-Shield Regular Sterilization Wraps |
| Scalpel Handle | Roboz Surgical Instrument | RS-9843 | Scalpel Handle, #3; Solid; 4" Length |
| Sterile Surgical Blade | Cincinnati Surgical | 0110 | Stainless Steel; Size 10 |
| Culture Dish (60 mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (curved tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Graefe Forcep (straight tweezers) | Roboz Surgical Instrument | RS-5130 | Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8 mm Tip Width; 4" Length |
| Noyes Micro Scissor | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; Straight, Sharp-Blunt Points; 13 mm Cutting Edge; 0.25 mm Tip Width, 4 1/2" Overall Length |
| Gauze Pads | FisherBrand | 13-761-52 | Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4" x 4" 12-Ply |
| Cotton-Tippled Applicators | FisherBrand | 23-400-124 | 6" Length; Wooden Shaft; Single Use Only |
| 6-Well Plate | Fisher Scientific | 08-772-49 | Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic |
| Sterile Syring 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | Luer-Lok Tip |
| Sterile Bowl | Medical Action Industries Inc. | 01232 | 32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use |
| 6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts) | SIGMA | Z681792-3EA | 6-Well Plate Inserts; Non-Sterile |
| Polycarbonate Filter Membrane | SIGMA | TMTP04700 | Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0 µm, 47 mm, White Plain |
| Name | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 011168 | Active Ingredient: Per 100 mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50 mg phenytoin sodium |
| Ketamine | Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Kateset 100 mg/mL |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply) | MWI #: 000680 | Anased 100 mg/mL |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin | SIGMA | S7900-100G | |
| Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | S25372 | |
| Povidone-Iodine | Operand | 82-226 | |
| Hydrochloric Acid | SIGMA | 320331 | |
| Methanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC-conjugated Lectin | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody | SIGMA | AB5320 | |
| PECAM (CD31) Antibody | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Antibody | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Streptavidin Cy3-conjugated Antibody | Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine Clone Bu20a | Dako | M074401-8 | |
| Mouse Anti-Rat CD11b | AbD Serotec | MCA275R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress. Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).
- Chan, J. M., et al. Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting. PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).
- Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis. Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).
- Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).
- Azimi, M. S., et al. An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks. PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).
- Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels. Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).
- Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks. Front Physiol. 4, 108 (2013).
- Kelly-Goss, M. R., et al. Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth. BMC Physiol. 12, 7 (2012).
- Skalak, T. C., Price, R. J. The role of mechanical stresses in microvascular remodeling. Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).
- Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival. J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).
- Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo. Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).
- Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis. Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).
