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Genetics

QTL मैपिंग और सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 में एक ड्रग प्रतिरोध जीन को पहचानने के लिए संपादन Published: June 22, 2017 doi: 10.3791/55185
Automatic Translation
1, 2, 2
1State Key Laboratory of Agricultural Microbiology, College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, 2Pathobiological Sciences, School of Veterinary Medicine, Louisiana State University

Summary

विवरण कैसे प्रस्तुत किया जाता है कि कैसे संपूर्ण जीनोम अनुक्रम आधारित आनुवंशिक मानचित्र के साथ QTL मैपिंग का प्रयोग टोक्सोप्लाज्मा गोंडी में एक दवा प्रतिरोध जीन की पहचान के लिए किया जा सकता है और यह कैसे CRISPR / Cas9 प्रणाली से सत्यापित किया जा सकता है, जो इस मामले में कुशलता से जीनोमिक लक्ष्य का संपादन करता है दवा प्रतिरोध जीन

Abstract

वैज्ञानिक ज्ञान आंतरिक रूप से उपलब्ध तकनीकों और तरीकों से जुड़ा हुआ है। यह आलेख दो तरीके पेश करेगी जो अपिकॉम्पलेक्सान परजीवी टोक्सोप्लाज्मा गोंडी में एक प्रतिरोधी जीवाणु की पहचान और सत्यापन के लिए अनुमति प्रदान करते हैं, एक संपूर्ण जीनोम अनुक्रम (डब्लूजीएस) आधारित आनुवंशिक मानचित्र और पद्धति का उपयोग करते हुए मात्रात्मक विशेषता लोकस (QTL) मैपिंग की विधि क्लस्टर किए गए नियमित नियमित अंतर्सपेड लघु पालिंड्रोमिक दोहराव (सीआरआईएसपीआर) / कैस 9-आधारित जीन एडिटिंग का क्यू एल एल मैपिंग के दृष्टिकोण से एक जांच हो सकती है कि जीनोमिक क्षेत्र (एस) और एक फेनोटाइप के बीच कोई संबंध है या नहीं। एक क्यूटीएल स्कैन चलाने के लिए दो डेटासेट की आवश्यकता होती है, एक रीकॉम्बनेंट क्रॉस की संतान पर आधारित एक आनुवांशिक नक्शा और उस क्रॉस के प्रत्येक संतान में मूल्यांकन किया जाने वाला एक क्वांटिफेएबल फेनोटाइप। ये डेटासेट फिर आर / qtl सॉफ़्टवेयर के साथ संगत होने के लिए स्वरूपित किए जाते हैं जो कि फेनोटाइप से संबंधित महत्वपूर्ण लोकी की पहचान करने के लिए एक क्यूटीएल स्कैन उत्पन्न करता है। यद्यपि यह बहुत खोज w को संकुचित कर सकता हैसंभव उम्मीदवारों की कंडोम, क्यूटीएल के कई क्षेत्रों में जिन जीनों से युक्त जीन को पहचानने की जरूरत होती है। संतान के डब्ल्यूजीएस होने के कारण जीन स्तर पर कारण तंत्रिका प्रतिरोध प्रतिरोध को पहचानना महत्वपूर्ण था। एक बार पहचाने जाने पर, उम्मीदवार के उत्परिवर्तन की जांच नशीली दवाओं के परजीवी आनुवांशिक हेरफेर द्वारा की जा सकती है। आनुवांशिक रूप से टी गोंडी को संशोधित करने के लिए सबसे आसान और कुशल तरीका है सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली। इस प्रणाली में केवल 2 घटक शामिल होते हैं, जो एक एकल प्लाज्मिड, एक एकल गाइड आरएनए (जीआरएनए) में जीनोमिक लक्ष्य के पूरक 20 बीपी अनुक्रम युक्त होते हैं और कैस 9 एंडोन्यूक्लेज़ जो लक्ष्य पर एक डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक (डीएसबी) उत्पन्न करता है, मरम्मत जिसमें ब्रेक साइट के आसपास दृश्यों को सम्मिलन या हटाने की अनुमति मिलती है। इस लेख में सीरीएसपीआर / कास 9 आधारित जीनोम संपादन उपकरण का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है ताकि ये साबुन के लिए जिम्मेदार जीन को सत्यापित कर सके और ट्रांसजेनिक परजीवी का निर्माण कर सके।

Introduction

होस्ट श्रेणी परजीवी के प्रसार की सीमा निर्धारित करती है। कुछ परजीवियों के पास बहुत विशिष्ट मेजबान आवश्यकताएं होती हैं जो उस क्षेत्र को सीमित करती हैं जहां से वे पाए जाते हैं, अन्य सामान्य हैं ऐसा एक सामान्य व्यक्ति टोक्सोप्लाज्मा गोंडी ( टी गोंडी) है । यह परजीवी दुनिया भर में पाया जाता है क्योंकि यह सभी स्तनधारियों और कई पक्षियों को संक्रमित कर सकता है। मनुष्य भी अतिसंवेदनशील होते हैं और अनुमान है कि लगभग 1/3 वैश्विक आबादी संक्रमित हो चुकी है। सौभाग्य से, एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया परजीवी की वृद्धि को आम तौर पर नियंत्रित करती है, लेकिन उन स्थितियों में जहां प्रतिरक्षा प्रणाली से समझौता किया जाता है परजीवी अनियंत्रित हो सकता है और रोगों का कारण बन सकता है, अक्सर एन्सेफेलिक इसके अलावा, यह परजीवी जन्मजात बीमारियों का कारण बन सकता है यदि पूर्व में अप्रभावित महिलाएं गर्भावस्था के दौरान संक्रमित होती हैं क्योंकि उन्हें परजीवी के प्रसार को सीमित करने के लिए प्रतिरक्षा स्मृति की कमी होती है। इसके अतिरिक्त, ओकुलर टोक्सोप्लास्मोसिस का एक बोझ है जिसके परिणामस्वरूप दृष्टि हानि 1 हो सकती है । इन रिसाओं के लिएएनएस टी। गोंडिया अध्ययन का एक फोकस बन गया है, और इसके अध्ययन के लिए विकसित कई आणविक विधियों के कारण, अपिकोप्लेक्सन परजीवी के लिए एक मॉडल। यहां दो तरीकों पर विचार-विमर्श किया जाएगा, क्वांटिटेटिव ट्रैक्ट लोकस (क्यूटीएल) मैपिंग और क्लस्टर किया गया नियमित रूप से इनर्सपेस्ड लघु पिलिन्ड्रोमिक रेप्टाइसेस (सीआरआईएसपीआर) / कैस 9 जीन एडिटिंग। क्यू एल एल मैपिंग और सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 संपादन अनुक्रम क्रमशः, आनुवंशिक दृष्टिकोणों को आगे और पीछे कर देते हैं जो पिछले अध्ययनों में टी। गोंडी विषाणु जीन को पहचानने और / या चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहां, इन विधियों को एक sinefungin प्रतिरोध (एसएनएफ आर ) जीन, टीजीएमई 94_290860, और इसके orthologs ( एसएनआर 1 के रूप में एनोटेट) के कार्य की पहचान और पुष्टि करने के लिए जोड़ा जाता है।

यद्यपि टी। गोंडी इंटरमीडिएट मेजबानों की एक विस्तृत विविधता को संक्रमित कर सकते हैं, यह जीवन चक्र को पूरा करने के लिए एक गुमशु के आंतों के उपकला कोशिकाओं के माध्यम से गुजरना पड़ता है और उसे संक्रमित कर सकता है। बिल्लियों परजीवी के निश्चित मेजबान हैं जहां एसबाह्य चरणों का उत्पादन होता है और अर्धसूत्रीविभाजन के माध्यम से आनुवांशिक पुनर्संयोजन होता है। एक क्यूटीएल अध्ययन करने के लिए, एक आनुवंशिक क्रॉस बनाना चाहिए, और टोक्सोप्लाज्मा के मामले में इसका मतलब है कि दो अलग-अलग परजीवी तनाव जो कि फेनोटाइपिक विशेषता में भिन्न हैं, माता-पिता के दाग, एक बिल्ली के माध्यम से पुनः संयोजक संतान 3 का निर्माण करने के लिए। बिल्लियों को खिलाए जाने से पहले, पैतृक नस्लों को अलग-अलग दवाओं के प्रति प्रतिरोधक बना दिया जाता है ताकि उन्हें पुन: संयोजक की अधिक कुशल पहचान के लिए संतान 4 की दोहरी दवाओं का चयन किया जा सके। इस प्रयोजन के लिए टी। गोंदी में तीन दवाओं का इस्तेमाल किया गया है; फ्लोरोडाइक्सीरिबोज़ ( एफयूडीआर ) जिसके लिए यूरैसिल फॉस्फोर्बिस्सिल ट्रांसपेरेज़ ( यूपीआरटी ) प्रतिरोध जीन 5 , एडेनोसिन अरबीनोसाइड (एआरए) है जिसके लिए एडेनोसिन किनेस ( एके ) प्रतिरोध जीन 6 और साइनेफिंगिन (एसएनएफ) है जिसके लिए प्रतिरोध जीन अज्ञात है 7 । कई आनुवंशिक पार किया गया हैटी गोंडी के लिए बनाया गया था, लेकिन ME49-FUDR r एक्स VAND-SNF r क्रॉस के केवल 24 संतान पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्लूजीएस) 8 का इस्तेमाल करते थे। इसने मैपिंग की संभावना खो दी और इस क्रॉस का इस्तेमाल करते हुए एसएनएफ प्रतिरोध जीन की पहचान की, क्योंकि वंद माता-पिता को ड्रग असेंबली VAND (VAND-SNF s ) तनाव के रासायनिक mutagenesis के द्वारा प्रतिरोधी प्रतिरोधी बनाया गया था, और VAND संदर्भ जीनोम को VAND- एसएनएफ का तनाव इस प्रकार संप्रतीन डब्ल्यूजीएस और VAND-SNF के संदर्भ जीनोम के बीच सभी बहुरूपताओं की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, जिसमें वंशानुक्रमित पैतृक VAND-SNF R उत्परिवर्तन भी शामिल है, जो कुछ संतान sinefungin प्रतिरोधी प्रदान करता है।

एसएनएफ आर संतान में कारक एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) की पहचान करने के लिए, डेटा के विश्लेषण के लिए कई कम्प्यूटेशनल आधारित ओपन सोर्स संसाधनों का उपयोग किया जा सकता है। ME49- के लिए आनुवंशिक मानचित्र बनाने के लिएFUDR r एक्स VAND-SNF r रेडहोर्स सॉफ्टवेयर सुइट 9 को विकसित किया गया था जो माता-पिता और वंश के डब्ल्यूजीएस संरेखण का उपयोग करता है जो आनुवंशिक क्रोससोवर्स के जीनोमिक पदों को सही ढंग से पहचानते हैं। इस मैपिंग जानकारी को फिर से आरटी सांख्यिकीय प्रोग्रामिंग सॉफ़्टवेयर में 'qtl' ​​पैकेज 10 के साथ संगत डेटसेट को प्रारूपित करने के लिए प्रोन्यटीपिक डेटा (एसएनएफ आर में संतान) के साथ जोड़ दिया जा सकता है, जहां एक क्यूटीएल स्कैन महत्वपूर्ण लोकी के साथ सहसंबंधित महत्वपूर्ण पता चलता है। फेनोटाइप। QTL लोकस के भीतर स्थित कारण एसएनपी की पहचान करने के लिए, डब्ल्यूजीएस पढ़ता है कि संतान को बोटी 2 संरेखण कार्यक्रम 11 का इस्तेमाल करते हुए अलग-अलग साइनेफुंगिन संवेदनशील वंड जीनोम के साथ गठबंधन किया जा सकता है, जिसमें से एसएनपी को वारसैन mpileup2snp संस्करण कॉलर प्रोग्राम 12 का उपयोग कर कहा जा सकता है। इन एसएनपी का प्रयोग करते हुए, क्यूटीएल लोकस को बहुरूपता के लिए स्कैन किया जा सकता है जो एसएनएफ आर में मौजूद हैं लेकिन नहींएसएनएफ एस संतान में एक जीन के कोडिंग क्षेत्र में पहचान के कारण एसएनपी के कारण, एसएनएफ आर जीन उम्मीदवार एसएनएफ के जीन को संशोधित करने के लिए दवा प्रतिरोध समारोह को सत्यापित करने के लिए एसएनएफ के तनाव में किया जा सकता है।

सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 जीनोम संपादन सिस्टम हाल ही में टोक्सोप्लाज्मा 13 में स्थापित किया गया था, जिसने इस परजीवी के जटिल जीवविज्ञान की अन्वेषण के लिए विशेष रूप से गैर-प्रयोगशाला अनुकूलन वाले उपभेदों में आनुवांशिक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण जोड़े। डब्ल्यूटीटी टोक्सोप्लाज्मा कोशिकाओं में अत्यधिक सक्रिय गैर-घरानुक्रमिक अंत में शामिल होने (एनएचईजे) की गतिविधि के कारण, लक्षित जीनोम संशोधन को हासिल करना मुश्किल है क्योंकि एक्सएनजेने डीएनए को बेहद उच्च आवृत्ति 14 पर बेतरतीब ढंग से जीनोम से एकीकृत किया गया है। विशिष्ट विशिष्ट संशोधन के सफलता दर को बढ़ाने के लिए, मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दक्षता बढ़ाने के लिए और / या कमी करने के लिए विभिन्न तरीकों को नियोजित किया गया हैएनएचएचईजे गतिविधि 15 , 16 इनमें से एक दृष्टिकोण CRISPR / Cas9 प्रणाली है। अन्य तरीकों की तुलना में, सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली साइट-विशिष्ट संशोधनों को शुरू करने में सक्षम है और 13 , 17 , 18 की डिजाइन करने में आसान है। इसके अलावा, यह परजीवी 13 , 1 9 के अतिरिक्त संशोधन के बिना किसी भी टोक्सोप्लाज्मा तनाव में इस्तेमाल किया जा सकता है।

सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली स्ट्रैपटोकोकस पायोजनेज की अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली से उत्पन्न होती है, जो इसे 20 , 21 , 22 के चरण जैसे मोबाइल आनुवंशिक तत्वों के आक्रमण का बचाव करने के लिए उपयोग करती है। इस प्रणाली ने आरएनए द्वारा निर्देशित डीएनए एंडोन्यूक्लाइज़ एंजाइम सीएस 9 को लक्ष्य में डबल-स्ट्रैंड डीएनए ब्रेक (डीएसबी) का परिचय दिया, जो बाद में रिपक्षुधा-प्रवण एनएचईजेई द्वारा लघु इंडल म्यूटेशनों के माध्यम से लक्षित जीनों को निष्क्रिय करने के लिए, या समरूपता द्वारा निर्देशित पुनर्संयोजन द्वारा लक्षित लक्ष्य को ठीक से 23 , 24 के रूप में बदल दिया गया। लक्ष्य विशिष्टता एकल आरएनए (जीआरएनए) नामक छोटे आरएनए अणु द्वारा निर्धारित की जाती है, जिसमें एक व्यक्तिगत रूप से डिजाइन 20 एनटी अनुक्रम होता है जो लक्ष्य डीएनए 22 में 100% समरूपता है। जीआरएनए अणु में सीसी 9 द्वारा मान्यता प्राप्त हस्ताक्षर भी शामिल हैं, जो लक्ष्य साइट पर न्युकले को मार्गदर्शन करते हैं, जिसमें एक विशेष प्रोटॉस्पायर एडजेसेंट मोटीफ (पीएएम, अनुक्रम 'एनजीजी') 25 , 26 शामिल है । इसलिए, जीआरएनए अणु और पीएएम अनुक्रम जीनोम में कैस 9 क्लेविज साइट को निर्धारित करने के लिए मिलकर काम करते हैं। दरार के लिए विभिन्न साइटों को लक्षित करने के लिए जीआरएनए अनुक्रम आसानी से बदल सकता है।

जब CRISPR / Cas9 प्रणाली को पहली बार Toxop में विकसित किया गया थालैज़मा, कैस 9 न्यूकाईज को व्यक्त करने वाला एकल प्लाज्मिड और जीआरएनए अणु का लक्ष्य लक्ष्यीकरण साइट 13 , 17 में डीएसबी को पेश करने के लिए किया गया था। यह दिखाया गया है कि सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली साइट-विशिष्ट जीनोम संशोधन की दक्षता को बढ़ाती है, न केवल मुताबिक़ पुनर्संयोजन के कारण, बल्कि बाहरी डीएनए 13 के गैर-मुताबिक़ एकीकरण भी। यह ऐसा wildtype उपभेदों में होता है जिसमें NHEJ गतिविधि शामिल होती है। इसलिए, इस प्रणाली का उपयोग प्रभावी जीनोम संपादन के लिए अनिवार्य रूप से किसी भी टॉक्सोप्लाज्मा तनाव में किया जा सकता है। एक विशिष्ट प्रयोग में, लक्ष्य विशिष्ट क्रिस्प्र प्लाज्मिड और डीएनए टुकड़ा लक्ष्य को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जाता है परजीवी में सह-ट्रांसफ़ेक्ट होता है। यदि लक्ष्य को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले डीएनए टुकड़ा में लक्ष्यिक बिंदुओं के मुताबिक़ अनुक्रम होते हैं, तो मुताबिक़ पुनर्संयोजन का इस्तेमाल सीआरआईएसपीआर / कास 9 द्वारा शुरू की गई डीएसबी की मरम्मत के लिए किया जा सकता है ताकि लक्ष्य को सटीक संशोधित किया जा सके। दूसरी ओर, यदि intप्रजनित डीएनए टुकड़ा में मुताबिक़ अनुक्रम शामिल नहीं है, फिर भी यह CRISPR / Cas9 लक्ष्यीकरण साइट में एकीकृत किया जा सकता है। बाद का चयन अक्सर चयनकर्ता मार्करों को सम्मिलित करके या स्थानीय में उत्परिवर्तकों को भरने के लिए जीन को बाधित करने के लिए किया जाता है जो नकारात्मक चयन 13 की अनुमति देता है। यहां एसएनआर 1 स्थान एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है कि सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 का उपयोग जीन के व्यवधान के लिए और ट्रांसजेनिक परजीवी जनरेशन के लिए कैसे किया जा सकता है।

Protocol

1. ME49-FUDR r x VAND-SNF r क्रॉस की प्रजनन में एसएनएफ आर का आकलन करें

नोट: टी। गोंडी एक बाध्यता इंट्रासेल्युलर परजीवी है और टाईजोजोइट चरण टिशू कल्चर में आसानी से बढ़ता है।

  1. टी गोन्डी परजीवी को विकसित करने के लिए, डूबेबेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) मीडिया में 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) (डी 10 मीडिया) के साथ पूरक 37 ° पर पूरक के साथ मिला हुआ मानव फॉस्क्साइन फाइबोब्लास्ट (एचएफएफ) मोनोलेयर संस्कृति में उन्हें बनाए रखने के लिए सी और 5% सीओ 2
    नोट: 1.1 प्रोटोकॉल देखें नोट 1 में पूरक फ़ाइल 1 ।
  2. साइनेफांगिन प्रतिरोध के लिए अलग-अलग संतानों के क्लोन का परीक्षण करने के लिए, प्रत्येक क्लोन को टी -5 एचएफएफ कल्चर फ्लास्क में 2-3 डी के लिए उच्च परजीवी घनत्व में विकसित करना, जब तक कि ज्यादातर परजीवी मेजबान कोशिकाओं को बोलना शुरू नहीं करते।
  3. एक सेल खुरचनी के साथ monolayer परिमार्जन और एक 10 एमएल सिरिंज / 22 जी मुर्गा सुई 2-3x टी के माध्यम से परजीवी समाधान पासO मेजबान कोशिकाओं को परजीवी छोड़ने के बारे में चिंतन करना। समाधान को कई सुई मार्गों के लिए सिरिंज में वापस खींच लिया जा सकता है।
  4. परजीवी समाधान को एचएफएफ कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 3 सुक्ष्ममापी के आकार के साथ एक झिल्ली के माध्यम से एक नई शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें।
  5. परमाणुओं को एक हीमोसाइटोमीटर पर गणना करें और प्रति एमएल प्रति परजीवी की संख्या निर्धारित करें।
  6. एक पिपेटर का उपयोग करना, 2.5 एक्स 10 5 परजीवी को एक नए टी -25 एचएफएफ कल्चर फ्लास्क के पास देना है जिसमें D10 मीडिया युक्त 0.3 माइक्रोन कामकाजी सेंनेफिंगिन दवा की एकाग्रता होती है।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर परजीवी बढ़ो और 7-10 डी के लिए 5% सीओ 2 बढ़ाएं।
  8. साइनफ़ागिन दवा में वृद्धि के फेनोटाइप के लिए संतान को स्कोर करें एक उल्टे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत मोनोलायर का निरीक्षण करें और बिना किसी विकास के लिए स्कोर (साइननेफिनिन संवेदनशील), विकास के लिए 1 अंक और मोनोलायर (सिनफांगिन प्रतिरोधी) का विश्लेषण।
    नोट: प्रोटोकॉल 1.8 देखें पूरक फ़ाइल 1 में ध्यान दें।

2. आरआर / qtl में एसएनएफ आर फीनोटाइप का एक क्यू एल एल स्कैन

नोट: अनुपूरक फ़ाइल 1 में प्रोटोकॉल 2 नोट देखें

  1. स्थानीय कंप्यूटर पर आर प्रोग्रामिंग भाषा सॉफ्टवेयर स्थापित करें। 27 देखें
  2. रन आर और पैकेज 'qtl' ​​स्थापित करें या तो आर जीयूआई इंटरफ़ेस विकल्प से यह करें 'संकुल-> पैकेज स्थापित करें', या आर कमांड लाइन से निम्न कमांड चलाएं (प्रत्येक उदाहरण में पहला ">" प्रतीक कमांड की शुरुआत को दर्शाता है, न कि नकल की):
    > Install.packages ( "क्विंटल")
    नोट: एक बार आर और 'qtl' ​​पैकेज स्थापित किया गया है, आर कमांड लाइन से आर / qtl को चलाने के दो तरीके हैं या जे / qtl नामक एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) प्रोग्राम का उपयोग करते हुए 28 : देखें 29 को डाउनलोड करने के लिए J / क्विंटल। यह प्रोटोकॉल जम्मू / क्यूटीएल में समान फ़ंक्शन के लिए कभी-कभी संदर्भ के साथ आर / qtl कमांड लाइन सिंटैक्स प्रदान करेगा।
  3. 'Qtl' पैकेज लोड करें:
    > पुस्तकालय (qtl)
    नोट: डेटासेट प्रारूप और डाउनलोड के लिए पूरक फ़ाइल 1 में प्रोटोकॉल 2.3 नोट करें ।
  4. डेटासेट फ़ाइल को आर / qtl में लोड करें
    1. "सीएसवी" प्रारूप के लिए (देखें: डेटा फ़ाइल 1):
      > एसएनएफआर <- वाचकक्रॉस (प्रारूप = "सीएसवी", फ़ाइल = "$ पैट / आरक्यूएल-एसएनएफआर सीएसवी", जीनोटाइप्स = सी ("0", "1"), ना.स्ट्रिंग = सी ("-") , परिवर्तित Xdata = FALSE)
    2. या "गैरी" प्रारूप के लिए (देखें: डेटा फ़ाइल 2):
      > SNFR <- read.cross (format = "gary", dir = "$ path", chridfile = "chrid.txt", mnamesfile = "mname.txt", mapfile = "markerpos.txt", जीनफ़ाइल = "जीनोटाइप। Txt ", phefile =" phenos.txt ", pnamesfile =" phenonames.txt ", convertXdata = FALSE)
      जहां $ PATH फाइल (एस) के लिए पथ है जिसमें qtl डेटासेट होता है उदाहरण के लिए: / Users / HotDiggityDog / QTLfiles
      नोट: फ़ाइलें लोड भी हो सकती हैं'कमांड या कमांड' विकल्प का उपयोग करके पिछले आज्ञाओं के साथ जम्मू / क्यूटीएल में एड या जीयूआई फ़ाइल-> लोड क्रॉस डेटा 'विकल्प के साथ डेटा लोड करें।
  5. मानचित्र के लिए संभावनाओं की गणना करें:
    > एसएनएफआर <- सीएलएफआरआर (एसएनएफआर, चरण = 2.0, ऑफ.एंड = 0.0, एरर.प्रोब = 1.0 ई -4, मैप। फ़ंक्शन = "हलडे", स्टेपविड्थ = "फिक्स्ड")
  6. सभी गुणसूत्रों में साइनऑफिनिन प्रतिरोध फ़िनोटाइप के द्विआधारी वितरण का उपयोग करके एक स्कैन चलाएं:
    > SNFR.scan <- scanone (cross = SNFR, chr = c ("Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa", "VIIb "," आठवीं "," आईएक्स "," एक्स "," इलेवन "," बारहवीं "), pheno.col = c (1), मॉडल =" बाइनरी ", विधि =" एम ")
    नोट: यदि वीआईआर फेनटाइप चल रहा है तो 'मॉडल =' सामान्य "'वितरण विकल्प का उपयोग करें।
  7. महत्त्व थ्रेसहोल्ड की गणना करने के लिए और फिर एट्रर की गणना करने के लिए 1000 क्रमबद्धता चलाएंSNFR.scan चर में क्रमांतरों को बंटाना:
    > एसएनएफआर.scan.permutations <- scanone (cross = SNFR, chr = c ("Ia", "आईबी", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa" "VIIb", "VIII", "IX", "X", "XI", "XII"), pheno.col = c (1), मॉडल = "बाइनरी", विधि = "em", n.perm = 1000, perm.Xsp = FALSE, वर्बोज = FALSE)
    > एट्रर (एसएनएफआर। केन, "फिनोओओओओएल") <- सी (1)
    नोट: 'विश्लेषण-> मुख्य स्कैन-> रन वन क्यूटीएल जेनोम स्कैन' विकल्प के साथ जम्मू / क्यू एल एल में 2.5 से 2.7 चलाए जा सकते हैं।
  8. स्कैन परिणाम स्कॉट करें:
    > भूखंड (एसएनएफआर.कैनन, अंतर = 0, बैंडकॉल = "ग्रे")
    नोट: J / qtl में निर्मित साजिश इंटरैक्टिव है।
    1. केवल क्रोमोसोम IX के लिए स्कैन परिणाम को चोटी, उच्चतम शिखर के साथ गुणसूत्र:
      > भूखंड (एसएनएफआर। स्कैन, सीआरआर = सी ("IX"), अंतर = 0, बैंडकॉल = "ग्रे", show.marker.names = TRUE)
    2. एक ही स्कैन से सभी मार्कर पदों और एलओडी स्कोर दिखाएं:
      > SNFR.scan
    3. क्रमचय परीक्षा के थ्रेशोल्ड परिणाम दिखाएं:
      > सारांश (SNFR.scan.permutations)
    4. केवल अल्फा = .05 थ्रेशोल्ड मान (पिछले आउटपुट से ली गई) से अधिक उन मार्करों को दिखाएं:
      > एसएनएफआर। केन [एसएनएफआर। डालर डालर> 2.68,]
    5. प्रत्येक गुणसूत्र पर उच्चतम LOD स्कोर वाले मार्करों को दिखाएं:
      > सारांश (SNFR.scan)
    6. उन मार्करों को दिखाएं जिनमें अधिकतम लोद स्कोर मूल्य (पिछले आउटपुट से लिया गया):
      > एसएनएफआर। स्कैन [एसएनएफआर.केकेन $ दर्ज> = 6.57,]
      नोट: प्रोटोकॉल 2.13 देखें पूरक फ़ाइल 1 में ध्यान दें।

    3. प्रजनन से डब्लूजीएस रीड का इस्तेमाल करते हुए क्यूंसल एसएनएफ आर इटेशन की पहचान करें

    नोट: अनुपूरक फ़ाइल 1 में प्रोटोकॉल 3 नोट देखें

    1. संरेखित करें डब्ल्यूजीएस साइनेफुंगिन संवेदनशील VAND को व्यक्तिगत संतान के बारे में पढ़ता है(VAND-SNF s ) पैतृक जीनोम
      नोट: एनसीबीआई एसोसिएशन से वेंडी रेफरेंस जीनोम (एसएनएफ एस ) एईजेजेडी 200000000.2 डाउनलोड करें और एनसीबीआई एसआरए PRJNA258152 से 24 संतानों के लिए डब्ल्यूजीएस (.sra फाइलें) पढ़ता है। साथ ही, निम्नलिखित कार्यक्रमों को डाउनलोड करें: Bowtie2 11 , एनसीबीआई एसआरए टूलकिट, सैमटोल्स 30 , वारसैन 12 , और मुमर 31
      1. वंड रेफरेंस जीनोम फास्टा फ़ाइल से Bowtie 2 संगत सूचकांक बनाएँ, जो "वेंड" सूचकांक का नाम देकर यहां बोनेट 2-बिल्ड प्रोग्राम का उपयोग कर रहा है:
        > Bowtie2-build जीसीए_000224845.2_TGVAND_V2_genomic.fna VAND
      2. एसआरए प्रारूपित डब्ल्यूजीएस फास्ट फाइल को फास्टैक फाइल्स में कन्वर्ट करें फास्टक-डंप के साथ -split-files विकल्प के साथ युग्मित पढ़ने के लिए (संतान पी 1_14 वीबी के एसआरआर 1555372 एसआरआई फाइल को एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाएगा):
        > फास्टक-डंप - एसप्लीट-फाइल एसआरआर 1555372.sra
        नोट: सभी 24 के लिए प्रोटोकॉल 3.1 में इसे और सभी निम्न कमांड चलाएंसंतान।
      3. संरेखित करें डब्लूजीएस संदर्भ जीनोम को बोनाटाई 2 का इस्तेमाल करते हुए एक एसएएम (। एसएएम) फ़ाइल और आउट-टू-एंड विकल्प के आउटपुट के साथ पढ़ता है:
        > बोनेटि 2-एक्स वंद -1 एसआरआर155372_1.फ़्स्टक -2 एसआरआर 1555372_2.फास्टक -एस एसआरआर 155372 एसएएम -एन्ड-टू-एंड
      4. .am फ़ाइल को एक बैम (.bam) फ़ाइल में कनवर्ट करें:
        > सैमोटोल देखें- बीएस एसआरआर155372 एसएएम> एसआरआर155372.बैम
      5. .bam फ़ाइल सॉर्ट करें:
        > सैमटोल्स सॉर्ट एसआरआर 155372.बीम एसआरआर155372.sort
      6. सॉर्ट किया गया बम फ़ाइल इंडेक्स:
        > समतोल इंडेक्स SRR155372.sort.bam
    2. VarScan का उपयोग कर संतान के लिए एसएनपी कॉल करें
      नोट: अनुपूरक फ़ाइल 1 में नोट प्रोटोकॉल 3.2 देखें।
      1. सभी अनुक्रमित बेम (.sort.bam) फाइलों को एक पीलेुप फ़ॉर्मेटेड फ़ाइल में कनवर्ट करें, जो कि वैंड जीनोम रेफरेंस फाइल के साथ सैंटोओल्स एमपीलुउप का उपयोग कर रहा है, सभी संतान .sort.bam फाइलें, और ऑलपीग्रॉनी-एमपीलीप।
        > सैंटोओल्स एमपीइल्यूप -एफ जीसीए_000224845.2_TGVAND_V2_जनोमिक.फना एसआरआर15155 9 9Sort.bam SRR1555372.sort.bam SRR1555660.sort.bam SRR1555672.sort.bam SRR1556052.sort.bam SRR1556122.sort.bam SRR1556192.sort.bam SRR1556194.sort.bam SRR1556195.sort.bam SRR1556199.sort.bam SRR1556200 Sort.bam SRR1556202.sort.bam SRR1556203.sort.bam SRR1556274.sort.bam SRR1556276.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556395.sort.bam SRR1556396.sort.bam SRR1556397.sort.bam SRR1556398.sort.bam SRR1556399। Sort.bam SRR1556400.sort.bam SRR1556401.sort.bam SRR1556402.sort.bam> AllProgeny-mpileup.txt
      2. AllProgeny-mpileup.txt फ़ाइल का उपयोग करके VarScan mpileup2snp प्रोग्राम का उपयोग करके सभी एसएनपी को कॉल करें, न्यूनतम 5 का कवरेज, न्यूनतम संस्करण फ़्रीक्वेंसी में .8 का पढ़ा जाता है, .01 का पी-वैल्यू, और ऑलप्रोजेजी-एसएनपी फाइल नाम के लिए आउटपुट। टेक्स्ट:
        > जावा- वर्गा VarScan.jar mpileup2snp AllProgeny-mpileup.txt --min- कवरेज 5 --min- var- freq .8 - पी-वैल्यू .01> ऑलप्रोजेजी-एसएनपीएस.txt
        नोट: AllProgeny-SNPs.txt फ़ाइल एक टैब सीमांकित पाठ फ़ाइल है जो पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल 3.4 में उपयोग की जाएगीकारण एसएनपी
    3. वेंड जीनोम निर्देशांक खोजें जो कि ME49 आधारित क्यूटीएल लोकस के निर्देशांक के अनुरूप है
      नोट: अनुपूरक फ़ाइल 1 में नोट प्रोटोकॉल 3.3 देखें।
      1. एमई 44 जीनोम को संक्रमित करने के लिए मुमर न्यूकेर प्रोग्राम का उपयोग करें ( 32 टूक्साओडबॉर्ग 32 से डाउनलोड करने के लिए उपलब्ध है) और वीएडी संदर्भ जीनोम फ़ाइल (आउटपुट डेल्टा फाइल में जाती है):
        > न्यूकेर टोक्सोडीबी -28_TgondiiME49_Genome.fasta जीसीए_000224845.2_TGVAND_V2_जनोमिक.फना
      2. दो जीनोम संरेखण के निर्देशांक प्राप्त करने के लिए MIMmer show-coords प्रोग्राम का उपयोग करें, ME49vsVAND-coords.txt नामक फ़ाइल में आउटपुट:
        > शो-कोर्स आउट डेलटा> ME49vsVAND-coords.txt
        नोट: ME49vsVAND-coords.txt फ़ाइल का उपयोग VAND contigs और स्थिति को QTL स्थान के अनुरूप करने के लिए किया जा सकता है; मार्कर एमवी 35 9 से एमवी 366 ME49 क्रोमोसोम IX पर 3,187,537 से 4,202,258 बीपी के बीच स्थित है। वहाँ दो VAND contigs है कि भ्रष्टाचार अवधिQDL स्थान पर चढ़ा; KN044604.1: 657,441-1 बीपी और केएन042501.1: 430,910-41,870 बीपी (दोनों contigs ME49 क्रोमोसोम के लिए उल्टा संरेखित करें)।
    4. केवल एसएनएफ आर संतान में विरासत में मिली एसएनपी के लिए क्यू एल एल लोकस के भीतर स्थित संतान एसएनपी का आकलन करें
      नोट: प्रोटोकॉल 3.4 देखें। पूरक फ़ाइल 1 में ध्यान दें।
      1. क्यूएलएल लोकस के भीतर स्थित कारण उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए डेटा फ़ाइल 3 की समीक्षा करें। एक पैटर्न के लिए डेटा को स्कैन करें जहां एसएनएफ आर संतान के पास एक एसएनपी और एसएनएफ है (संभावित नहीं क्योंकि वंश-एसएनएफ के संदर्भ जीनोम की तुलना में संतान एसएनपी प्राप्त किए गए थे)। इसका नतीजा इस पैटर्न के साथ एक स्थिति में होना चाहिए, VAND contig KN042501.1 पर स्थिति 348130।
      2. डेटा फ़ाइल 3 में पंक्ति 6604 देखें ( चित्रा 3 )।
        नोट: प्रोटोकॉल 3.4.2 देखें पूरक फ़ाइल 1 में नोट करें

    4. सीआरआईएसपीआर / सीएस-9 द्वारा पहचानित हिट का सत्यापनमध्यस्थ जीन निष्क्रियता

    नोट: क्यूटीएल मैपिंग और डब्ल्यूजीएस एसएनपी विश्लेषण द्वारा पहचाने जाने वाले कारण एसएनपी की पुष्टि करने के लिए, संबंधित आनुवंशिक परिवर्तनों को एक डब्ल्यूटी एसएनएफ की पृष्ठभूमि में बनाया जाना चाहिए और परिणामस्वरूप फ़निकोटा की जांच की जाएगी। साइनेफांगिन प्रतिरोध के मामले में, जिम्मेदार उत्परिवर्तन एसएनआर 1 जीन को जल्दी समाप्ति 2 द्वारा निष्क्रिय कर देता है। इसलिए, पुष्टि के लिए एसएनआर 1 के विघटन का इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ एक विस्तृत प्रोटोकॉल SNR1 को बाधित करने के लिए, सीनेफगिन प्रतिरोध ( चित्रा 4 ) में अपनी भागीदारी को प्रदर्शित करने के लिए, CRISPR / Cas9 प्रेरित इंडल म्यूटेशनों का उपयोग करने के लिए प्रदान किया गया है।

    1. एसएनआर 1 विशिष्ट क्रिस्प्र प्लास्मिड निर्माण
      नोट: प्रोटोकॉल 4.1 देखें प्लैमिड और नक्शे प्राप्त करने के लिए पूरक फ़ाइल 1 में नोट करें ।
      1. ToxoDB 32 से लक्ष्य जीन ( एसएनआर 1 , टीजीएमई 94_290860) के जीनोमिक अनुक्रम प्राप्त करें।
      2. ई-क्रिस्प 33 जैसे ऑनलाइन टूल का इस्तेमाल लक्ष्य विशिष्ट जीआरएनए को डिजाइन करने के लिए करें। जीआरएनए में पीएएम अनुक्रम (एनजीजी) को शामिल न करें
        नोट: प्रोटोकॉल 4.1.2 देखें पूरक फ़ाइल 1 में ध्यान दें।
      3. प्राइमरों को संश्लेषित करने के लिए लक्ष्य विशिष्ट क्रिस्प्र प्लास्मिड का निर्माण
        1. चरण 4.1.2 से डिजाइन के मुताबिक, मूल प्राइवेट प्लेटिसड में यूपीआरटी लक्ष्यीकरण जीआरएनए को साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन से चयनित जीआरएनए अनुक्रम में बदलने के लिए दो प्राइमरों को संश्लेषित करें।
          नोट: इन दो प्राइमरों के अनुक्रम निम्नानुसार हैं: gRNA-Fw: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC (N20 लक्ष्य विशिष्ट जीआरएनए अनुक्रम है) और जीआरएनए-आरवी: एएटीटीटीएसीसीटीसीसीसीसीटीटीएसी 2 ।
      4. साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन प्रतिक्रियाएं करें
        1. यूपीआरटी लक्ष्यीकरण सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड (पीएसएजी 1 :: सीएएस 9-यू 6 :: एसजीयूपीआरटी) का इस्तेमाल करते हुए टेम्पलेट और उपर्युक्त दो प्राइमरों के रूप में, साइट-निर्देशित उत्परिवर्तजन प्रतिक्रियाएं करेंनिर्माता के निर्देशों के मुताबिक
          नोट: पीसीआर के लिए निम्नलिखित साइक्लिंग की शर्तों का प्रयोग करें: 1 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के बाद, 2 मिनट के लिए अंतिम एक्सटेंशन के बाद 72 डिग्री सेल्सियस पर
      5. आपूर्तिकर्ता के प्रोटोकॉल ( सामग्रियों की टेबल्स देखें) के अनुसार रासायनिक रूपांतरण के द्वारा ईओ कोइ को सक्षम करने वाले उत्परिवर्तजन उत्पादों को ई-कोलाई को सक्षम करने वाले कॉरली सक्षम कोशिकाओं को बदलना। 37 डिग्री सेल्सियस पर एम्पीसिलीन (100 माइक्रोग्राम / एमएल) वाले लियोसोनीय शोरबा (एलबी) प्लेटेट्स पर ट्रांसमेंटमेंट्स बढ़ाएं इसके बाद, 2-4 क्लोन लेने और 12-16 घंटे के लिए 100 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन से पूरक 5 एमएल एलबी माध्यम में व्यक्तिगत रूप से उन्हें बढ़ाना।
        1. एक डीएनए अलगाव किट का उपयोग करके संस्कृतियों से प्लास्मिड निकालें और डीएनए जेल वैद्युतकणसंच द्वारा प्लास्मिड के आकार की जांच करने के लिए (अपेक्षित प्लाज्मिड आकार 9674 बीपी है, मूल सीआरएसआरपी प्लाज्मिड का उपयोग सी के रूप में करेंontrol)। लक्ष्य विशिष्ट जीआरएनए अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए प्लास्मिड के अनुक्रम के लिए एम 13-आरआर प्राइमर (5'-कैगGAएएसीएसीएसीएसीएसीएसीएसीएसीसीसी) का प्रयोग करें।
          1. सकारात्मक क्लोन की पहचान के बाद, -20 डिग्री सेल्सियस पर दोनों प्लाज्मिड डीएनए और भविष्य में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संबंधित बैक्टीरिया संस्कृति का भंडारण करें।
            नोट: अभिकर्मक के लिए उपयोग किए जाने वाले क्रिस्प्र प्लाज्मिड विआयनीकृत जल में भंग किया जाना चाहिए और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री या वैकल्पिक विधि द्वारा निर्धारित एकाग्रता को भंग किया जाना चाहिए।
    2. परजीवी अभिकर्मक
      नोट: डी 10 माध्यम के एचएफएफ कोशिकाओं में टी गोन्डी के संवर्धन के लिए सामान्य तरीके पहले 34 वर्णित हैं।
      1. अभिकर्मक से दो से तीन दिन पहले, एक टी -25 फ्लास्क के लिए पर्याप्त परजीवी जोड़ने के लिए एक मिला हुआ एचएफएफ सेल मॉलायर (0.5-1 x 10 6 प्रकार 1 उपभेद, 1-2 एक्स 10 6 अन्य उपभेदों के लिए) को 70-80% एचएफएफ सेल प्राप्त करने के लिए 2-3 घ के भीतर विश्लेषण
      2. Examiएक उल्टे चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति, जब परजीवी द्वारा एचएफएफ मोनोलेयर 70-80% lysed है। धीरे से एक विंदुक के साथ माध्यम को हटा दें और 5 एमएल साइटोमिक्स बफर (120 मिमी केएलएल, 0.15 मिमी CaCl 2 , 10 मिमी के 2 एचपीओ 4 / केएच 2 पीओ 4 पीएच = 7.6, 25 मिमी HEPES, 2 के साथ फ्लास्क सतह से कोशिकाओं को धो लें एमएम EDTA, 5 मिमी एमजीसी 2 , पीएच = 7.6)। इसके बाद, परजीवी समाधान को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
        नोट: प्रोटोकॉल 4.2.2 देखें पूरक फ़ाइल 1 में ध्यान दें।
      3. 10 एमएल सिरिंज / 22 जी मुर्गा सुई 2-3x के माध्यम से परजीवी समाधान को पास करें।
      4. परजीवी समाधान को एचएफएफ कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को हटाने के लिए 3 सुक्ष्ममापी के आकार के साथ एक झिल्ली के माध्यम से एक नई शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें।
      5. फ़िल्टर्ड परजीवी सेंटीफ्यूगेशन द्वारा 400 मिनट में 10 मिनट के लिए गोली मारो
      6. सतह पर तैरनेवाला बंद करें और 10 एमएल साइटोमिक्स बफर के साथ पेलेटेड परजीवी को फिर से खोलें, 10 μL विभाज्य ले लोएक हेमोसाइटेटोमीटर के साथ परजीवी एकाग्रता की जांच करें और शेष को सेंटीफ्यूगेशन द्वारा 400 × जी पर 10 मिनट तक रखें
      7. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 4 x 10 7 परजीवी / एमएल की घनत्व को प्राप्त करने के लिए साइटोमिक्स बफर में गोली को फिर से खोलें।
      8. 4 मिमी अंतर क्युवेट में, 7.5 μg क्रोसाइड, 6 μL एटीपी (100 एमएम) और 6 μL ग्लूटाथियोन (जीएसएच) (250 मिमी) के साथ 250-300 μL परजीवी समाधान (1-1.3 एक्स 10 7 परजीवी) मिलाएं।
      9. परजीवी का औचित्य 35 एक अलग इलेक्ट्रोपोरेशन को एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल करें जिसमें एक सीआरएसपीआर प्लाज्मिड अन्यत्र लक्ष्य करता है, जैसे कि यूपीआरटी सीआरआईपीएसआर प्लाज्मिड को लक्षित करता है।
        नोट: इलेक्ट्रोप्रोरेज सेटिंग्स डिवाइस पर निर्भर करते हैं। सामग्री में सूचीबद्ध इलेक्ट्रोप्रोटर के लिए 4 मिमी अंतर क्यूवेट्स का उपयोग करें। निम्नलिखित प्रोटोकॉल की सिफारिश की गई है: 1,700 वी, 176 μs की पल्स लंबाई, 2 दालों से 100 एमएस अंतराल।
    3. साइनफुंगिन प्रतिरोध की आवृत्ति निर्धारित करेंसीआरआईएसपीआर लक्ष्यीकरण के बाद
      1. बीज एचएफएफ कोशिकाओं को 24-अच्छी तरह प्लेटों में रखी coverslips को electroporation से पहले 3-4 डी ताकि वे 4.2 में अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए समय से मिला हुआ है।
        1. एचएफएफ कोशिकाओं को एक मिला हुआ टी -25 फ्लास्क से ट्रिशन करें और बाद में 12 एमएल डी 10 मध्यम जोड़ें और अच्छी तरह मिक्स करें।
        2. प्रत्येक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से प्लेट और विभाज्य 500 μL एचएफएफ सेल समाधान के प्रत्येक कूल्हे में एक कंसलिप जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 4 डी के लिए थाली को सेते हुए कोशिकाओं को मिला हुआ तक बढ़ने दें।
          नोट: एक टी 25 फ्लास्क से कोशिकाओं को एक 24-अच्छी तरह से थाली के बीज के लिए पर्याप्त है।
        3. चरण 4.2.9 से 50 μL electroporated परजीवी समाधान में एक अच्छी तरह से 24-अच्छी तरह से थाली में एक कंसोलिपी युक्त कन्स्पिलिपी एचएफएफ कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त। मिला हुआ एचएफएफ कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त T25 फ्लास्क में बाकी इलेक्ट्रोप्रोटेड परजीवी समाधान को हस्तांतरित करें।
      2. अभिकर्मक की दक्षता का आकलन करें।
        1. 24 घंटे के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट में कोशिकाओं को बढ़ाएंऔर बाद में इम्यूनोफ्लोरोसेंट परख (आईएफए) द्वारा कैस 9-जीएफपी की अभिव्यक्ति की जांच के लिए 500 μl 4% फॉर्मलाडेहाइड के साथ कोशिकाओं (मेजबान कोशिकाओं और परजीवी) ठीक करें।
        2. एक एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी और टोक्सोप्लाज्मा विशिष्ट एंटीबॉडी (जैसे कि एंटी-टीजीएलएडी) के साथ कोशिकाओं की जांच करें, कुल परजीवी लेबल करने के लिए। अनुशंसित कमजोर पड़ने के लिए एंटीबॉडी उत्पाद पत्र देखें (आमतौर पर, 1: 1,000 आईएफए के लिए पर्याप्त है) अगर एंटीबॉडी असंबद्ध होते हैं, प्राथमिक एंटीबॉडी लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट रंजियों के साथ संयुग्मित दो अलग-अलग माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें।
        3. माध्यमिक फ्लोरोसेंट रंजियों के लिए उपयुक्त फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर लेबल वाली कोशिकाओं को देखें। कुल परजीवी की संख्या से जीएफपी सकारात्मक परजीवी की संख्या को विभाजित करके अभिकर्मक दक्षता प्राप्त करें।
          नोट: आईएएफए के लिए इस्तेमाल की जाने वाली दो एंटीबॉडी दो अलग-अलग मेजबान प्रजातियों से आनी चाहिए, उदाहरण के लिए माउस एंटी-जीएफपी और खरगोश विरोधी-टीजीएलडी के संयोजन का उपयोग करना।
      3. एफ निर्धारित करेंट्रांसफ़ेक्टेड परजीवी में sinefungin प्रतिरोध की आवश्यकता।
        1. ट्रांसफ़ेक्टेड परजीवी के लिए T25 फ्लास्क में सुसंस्कृत, उन्हें प्राकृतिक निकास तक 2-3 डी तक बढ़ने के लिए। फिर परजीवी, कुंद सुई लीज होस्ट कोशिकाओं को इंट्रासेल्युलर परजीवी छोड़ने के लिए इकट्ठा करें, और 3 माइक्रोन के ताक के आकार के साथ झिल्ली के माध्यम से छानने के द्वारा उन्हें शुद्ध करें। घनत्व का अनुमान लगाने के लिए एक हेमोसाइटेटोमीटर के साथ परजीवीओं की गणना करें।
        2. संयोजित एचएफएफ कोशिकाओं के साथ वरीकृत 6-अच्छी प्लेटों में शुद्ध परजीवी जोड़ें: पहली पंक्ति (3 कुएं) के लिए, 200 परजीवी / अच्छी तरह से जोड़ें और नियमित डी 10 माध्यम (2 एमएल / अच्छी तरह) में उन्हें बढ़ाना; दूसरी पंक्ति के लिए, 5000 परजीवी / अच्छी तरह से जोड़ें और उन्हें D10 माध्यम युक्त होते हैं जिसमें 0.3 माइक्रोन साइनेफांगिन होते हैं।
        3. प्लेट्स को 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें और परजीवी को 37 डिग्री सेल्सियस 8-10 डी पर बिना किसी अशांति के लिए विकसित करें जिससे प्लाक्स को फॉर्मेट करने की अनुमति मिल सके। 70% इथेनॉल (2 एमएल / अच्छी तरह से) के साथ नमूनों को ठीक करें और 0.1% क्रिस्टल वायलेट (2 एमएल / वेल) के साथ मोनोलायर को दाग दें। कल्पना के लिए पानी के साथ कुओं को धो लेंपरजीवी विकास द्वारा बनाई गई सजीले टुकड़े (स्पष्ट क्षेत्र)।
          नोट: नकारात्मक नियंत्रण को उसी तरफ से संसाधित किया जाना चाहिए।
      4. सीआरआईएसपीआर प्रेरित सीनेफांगिन प्रतिरोध की दर की गणना करें।
        1. औसत संख्या (एक्स) की सजीले टुकड़ों में कोई दवा नहीं होती है और एक्स / 200 के रूप में परजीवी व्यवहार्यता की गणना करते हैं। सीआरआईएसपीआर प्रेरित सीनेफांगिन प्रतिरोध की दर की गणना करने के लिए साइनऑफिन युक्त कुओं की औसत संख्या (वाई) सजीले टुकड़े प्राप्त करें:
          सीआरएसएसआर प्रेरित प्रतिरोध = 200 × वाई / (5000 × एक्स अभिकर्मक दक्षता) की दर
          नोट: अभिकर्मक दक्षता 4.3.2 से प्राप्त की है।
    4. CRISPR / Cas9 द्वारा प्रेरित इंडल म्यूटेशन की जांच करें
      1. एचडीएफ कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त टी 25 फ्लास्क में खंड 4.2.9 से electroporated परजीवी बढ़ो 2 डी 37 डिग्री सेल्सियस के लिए फिर, मध्यम के साथ 5 एमएल डी 10 मध्यम युक्त होते हैं जिसमें 0.3 माइक्रोन साइनफ़ागिन (चयन माध्यम)।
        1. परजीवी को कम से कम 3 मार्गों के लिए चयन माध्यम में रखें जब तक कि प्रतिरोधक पूल स्थिर न हो (नकारात्मक नियंत्रण समूह में परजीवी विकास के अभाव के कारण, लेकिन प्रयोगात्मक समूह में मजबूत परजीवी विकास के कारण)।
      2. क्लोनल उपभेदों को प्राप्त करने के लिए साइनऑनगिन प्रतिरोधी पूल को अवगत कराएं।
        1. 150 μL D10 मध्यम में मिला हुआ एचएफएफ कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त 96-अच्छी तरह प्लेटों में 3 माइक्रोन झिल्ली निस्पंदन और सब्लिकोन से ताजे निकास परजीवी लीजिए। सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 7-10 डी प्लेटों को परेशान किए बिना सबक्लोनिंग संस्कृतियां बढ़ाएं।
          नोट: प्रोटोकॉल 4.4.2.1 देखें एस अपरिप्रेंटरी फ़ाइल 1 में नोट करें
      3. केवल एक पट्टिका वाले कुओं की तलाश के लिए उल्टे चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत 96 अच्छी तरह प्लेटें देखें। इस तरह के कुओं को चिह्नित करें और बाद में हर अच्छी तरह से कोशिकाओं को एक विंदुक के साथ एचएफएफ कोशिकाओं के साथ वरीयता के 24-अच्छी तरह प्लेटों में स्थानांतरित करें।
        4. <Li> जब एक अच्छी तरह से एचएफएफ कोशिकाओं का 80-90% एलिस किया जाता है, तो परजीवी (लगभग 500 μL) काटा जाता है और तनाव को बनाए रखने के लिए एक नए कुंड में 50 μL परजीवी समाधान को पारित करता है। PCR प्रवर्धन के लिए जीनोमिक डीएनए को निकालने के लिए शेष (≈450 μL) का उपयोग करें।
        1. एसएनएफ आर क्लोन से जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए, परजीवी (एचएफएफ कोशिका के प्रदूषण की थोड़ी मात्रा में संतोषजनक है) 10 मिनट के लिए 1000 xg पर गोली एक बार फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस) के साथ पेलेटेड परजीवी धोएं और उन्हें फिर से पैलेट करें। एक व्यावसायिक किट या उबलते द्वारा पेलेटेड कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए अलग करें। 50-100 μL पीबीएस में रिसासपेंड परजीवी
          नोट: अनुक्रमण के लिए एसएनआर 1 जीन का एक टुकड़ा प्राप्त करने के लिए पीसीआर करें। एसएनआर 1 लोकस 2 : एसएनआर 1-एएमपी-एफड: 5 'सीसीजीएसीसीएसीएएए सीएटीटीटीसी और एसएनआर 1-एमपी-आरवी: 5'जीएसीजीटीटीएसीटीटीटीटीटीटीएसीएजीएएजीएएसी को बढ़ाने के लिए निम्नलिखित प्राइमरों का उपयोग करें। उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का प्रयोग करें नियंत्रण उद्देश्यों के लिए WT ठिकानों को बढ़ाएं
      4. टी प्रदर्शनवह 20 μL प्रतिक्रिया मात्रा के साथ पीसीआर और इसे निम्नलिखित प्रोग्राम के साथ चलाता है: 1 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, 10 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 30 चक्र, 30 डिग्री सेल्सियस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस और 2.5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के बाद, उसके बाद 2 मिनट के लिए अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस पर
        नोट: पीसीआर उत्पादों को निम्नलिखित प्राइमरों का इस्तेमाल करते हुए अनुक्रम: एसएनआर 1-सीक 1: 5 'जीसीसी एसीए टीजीसी टीटीटी एजीसी जीटीजी, एसएनआर 1-सीक 2: 5' टीसीसी टीसीटी सीसीए टीसीए सीजीजी जीटीटी जीजी, एसएनआर 1-सीक 3: 5 जीसीए एजीए जीसीसी जीसीजी टीजीए सीजी , एसएनआर 1-सीक 4: 5 'सीटीसी टीसीसी सीजीसी जीजीटी सीजीए जी, एसएनआर 1-सीईसी 5: 5' जीसीए सीसीजी टीसीसी जीसीए एजीसी और एसएनआर 1-सीक्र 6: 5 'सीसीजी जीएजी जीजीटी जीएटी टीसीजी टीटीसी टीटीसी
      5. एसएनआर 1 जीन के सीनिनफुंगिन प्रतिरोधी म्यूटेंट से क्रमशः संरेखण उपकरण का उपयोग करते हुए डब्ल्यूटी तनाव की तुलना करें।
        नोट: आनुवंशिक पूरक या ट्रांसजेनिक तनाव निर्माण के लिए एसएनआर 1 स्थान पर नकारात्मक चयन के उपयोग पर विवरण के लिए अनुपूरक फ़ाइल 2 प्रोटोकॉल 5 देखें।

Representative Results

इस लेख में कई तरीकों का विस्तार किया गया है जिनका इस्तेमाल दवा प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान के लिए उत्तराधिकार में किया जा सकता है ( चित्रा 1 )। प्रोटोकॉल 1 में बताया गया है कि ME49-FUDR r एक्स VAND-SNF r क्रॉस की 24 संतानों को ड्रग साइनइनफिन के प्रतिरोध के लिए मूल्यांकन किया गया था। आनुवंशिक नक्शा और संतान के एसएनएफ आर फेनोटाइप का प्रयोग करते हुए, एक क्यूटीएल स्कैन आर / Qtl - प्रोटोकॉल 2 ( चित्रा 2 )। इसके परिणामस्वरूप क्रोमोसोम आईएक्स पर लगभग 1 एमबीपी फैला हुआ एक महत्वपूर्ण पीक है। यह इस क्षेत्र में है कि कारण उत्परिवर्तन स्थित है।

कारण उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए, डब्ल्यूजीएस ने पढ़ा है कि संतान से बोन्डि 2 - प्रोटोकॉल 3.1 का उपयोग करते हुए VAND-SNF के संदर्भ जीनोम के साथ गठबंधन किया गया था, SNPs को वारसैन mpileup2snp - प्रोटोकॉल 3.2 का उपयोग करते हुए कहा गया था, और वैंड जीनोम में क्यूटीएल लोकस मममार का उपयोग करके पहचान की गई थी - ProtocOl 3.3। क्यूटीएल लोकस के अंदर प्रोजेनी एसएनपी निकाले और स्कैन किए गए थे, जहां एसएनएफ आर संतान में एक एसएनपी और एसएनएफ है, जो संभव नहीं है, क्योंकि संतान एसएनपी VAND-SNF के संदर्भ जीनोम ( चित्रा 3 ) के मुकाबले प्राप्त किए गए थे । केवल एक ही एसएनपी ने इस पैटर्न से मेल खाया है जो एसएएनआर 1 नामित एक पुसी अमीनो एसिड ट्रांसपोर्टर जीन में प्रारंभिक स्टॉप कोडन में परिणाम देता है।

पुष्टि है कि एसएनआर 1 एसएनएफ आर प्रतिरोध जीन को सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रणाली का उपयोग कर किया गया है। टी। गौंडी जीन संपादन के लिए इंजीनियर एक नया क्रिस्प / कैस 9 प्लाज्मिड बनाया गया था जिसमें जीआरएनए युक्त एसएनआर 1 जीन को एसएनएफ आर उत्परिवर्तन के पास लक्षित किया गया था जो प्रोटैली 4 ( चित्रा 4 ए ) में दिखाया गया था। सीआरआईएसआरआर / कैस 9 प्लाज्मिड को लक्षित एसएनआर 1 को एसएनएफ के डब्ल्यूटीटी परजीवी तनाव में प्रतिरोध किया गया और प्रतिरोधी म्यूटेंट प्राप्त हुए जब पंथ0.3 सुक्ष्ममापी sinefungin में इलाज सीआरआईएसपी / कैस 9 प्लाज्मिड को लक्षित करने के लिए यूपीआरटी के साथ electroporated जब कोई एसएनएफ आर परजीवी प्राप्त नहीं थे। कई एसएनएफ आर क्रिस्प्र म्यूटेंट क्लोन किए गए थे और एसएनआर 1 जीआरएनए लक्ष्य के आसपास का क्षेत्र अनुक्रमित था। प्रत्येक उत्परिवर्ती व्यक्ति में एक इंडेल था जो एसएनआर 1 जीन ( चित्रा 4 बी ) के कोडन अनुक्रम को बाधित करता था। इस पद्धति का उपयोग एनएचईजे ( चित्रा 5) के माध्यम से या एचआर ( चित्रा 6 ) - पूरक फाइल 2 के माध्यम से एसएनआर 1 स्थान में तैयार लक्ष्यीकरण को सम्मिलित करने के लिए भी किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रयोगों के लिए योजनाबद्ध कार्यप्रवाह। ME49-FUDR r एक्स VAND-SNF r क्रॉस का उपयोग करते हुए एसएनएफ आर जीन की पहचान और पुष्टि करने में मुख्य कदम उपयुक्त प्रोटोकॉल के संदर्भ में दिखाए गए हैं।उनके लेख इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: आर / क्यूटीएल एसएनएफ आर फीनोटाइप पर क्यूएलएल स्कैन चलाने के लिए कमान। आज्ञा के अनुसार प्रोटोकॉल 2 में उल्लिखित किए गए थे जो qtl पैकेज का उपयोग करते हुए आर में चलाए गए थे। प्रतिनिधि आदेश और साजिश दिखाए जाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: कारण एसएनपी का स्थान प्रोजेनी डब्लूजीएस पढ़ता है, वेंड-एसएनएफ के सन्दर्भ जीनोम को बोटी 2 के साथ गठबंधन किया गया था, एसएनपी को वारस्केन के साथ बुलाया गया था, और इसके अनुरूप मममार के साथ पहचाने गए VAND QTL स्थल क्यूएलएल लोकस के भीतर स्थित एसएनपी एक स्प्रेडशीट में आयात किया गया था और कारण एसएनपी की पहचान की गई थी। एसएनएफ आर संतान (पीला), एसएनएफ एस संतान (हरा), एसएनएफ आर एसएनपी (लाल) ( डेटा फाइल देखें 3 )। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: एसआरआईआर एसएनआर 1 के रूप में एसआरएनआर आर जीआरआई का उपयोग करके सीआरआईएसपीआर / कास 9 की पुष्टि करना । ( ए ) सीआरआईएसपीआर / सीएएसआर 1 लोकस में सीएएसएसआर प्रेरित इंडेल म्यूटेशन (हरा)। ( बी ) एसएनआर 1 में प्रतिनिधि इंडेल्स के कारण दो अलग-अलग एसएनआर 1 विशिष्ट सीआरआईएसपीआर प्लास्मिड (सी 5 और सी 6 क्रमशः) के कारण होता है। आरएच डब्ल्यूटी तनाव है और सी 5 और सी 6 एसएनएफ आर म्यूटेंट हैं। (बी संदर्भ से लिया गया हैS = "xref"> 2)। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5. सीआरआईएसपीआर / कास्ड 9 का उपयोग करके सम्मिलितिक उत्परिवर्तन। ( ए ) सीआरआईएसआर / कैस 9 मध्यस्थता वाले साइट-विशिष्ट एकीकरण द्वारा एसएनआर 1 स्थान में पूरक या ट्रांसजेनिक जीनों को सम्मिलित करना । सम्मिलित डीएचएफआर * मिनी जीन और पहचान के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमरों के दो संभावित अभिविन्यास, एफ 1/2 और आर 1/2 डायग्नोस्टिक पीसीआर में उपयोग किए गए ऑलिगोस की भड़काने वाली जगहों का प्रतिनिधित्व करते हैं। ( बी ) एक snr1 :: डीएचएफआर * क्लोन के डायग्नोस्टिक पीसीआर, आरएच को एक WT नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है जीआरए 1 पी के पीसीआर को नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया है जो टेम्प्लेट के रूप में जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता की जांच कर रहा है। तारांकन से अनिश्चित बैंड के साथ गलियों का संकेत मिलता है (चित्रा 5 बी संदर्भ से लिया जाता हैसीई 2 ) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6: जीआईएन नॉकआउट सीआरआईएसपीआर / कास 9 का प्रयोग कर रहा है। टी । गोन्डी में क्रिस्टीज़ / सीएस 9 मध्यस्थता वाले मौखिक जीन प्रतिस्थापन के लिए एक क्लासिक डिजाइन। इस मामले में सम्मिलित ट्रांसजीन की स्थिति तय हो गई है। एफ 1 / आर 1, एफ 2 / आर 2 और एफ 3 / आर 3 डायग्नोस्टिक पीसीआर में इस्तेमाल किए गए ऑलिगोस की भड़काने की जगहों का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

डेटा फ़ाइल 1: ME49-FUDR r एक्स VAND-SNF r क्रॉस फ़ाइल चया आर / qtl, "csv" प्रारूप में उपयोग करें। एक। Csv फ़ाइल जिसे प्रारूप = "csv" विकल्प के साथ आर / qtl में लोड किया जा सकता है। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

डेटा फ़ाइल 2: (chrid txt, जीनोटाइप txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt, और phenos.txt)। एमई 4 9-एफयूडीआर आर एक्स वैंड-एसएनएफ़ आर क्रॉस फाइल आर / क्यूटीएल, "गैरी" प्रारूप में उपयोग के लिए। छह .txt फ़ाइलें जो प्रारूप = "गैरी" विकल्प के साथ आर / qtl में लोड हो सकती हैं कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

डेटा फ़ाइल 3. एसएनएफ आर के पार प्रोजी SNPs के साथ स्प्रेडशीट कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: अतिरिक्त प्रोटोकॉल विवरण। कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: प्रोटोकॉल 5 - जेनेटिक कॉम्प्लेमेंटेशन या ट्रांसजेनिक तनाव निर्माण के लिए एसएनआर 1 लोकस में नकारात्मक चयन का उपयोग । कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

ये प्रोटोकॉल कई तरीकों से पेश करते हैं, जब संयुक्त रूप से टी। गोंडी में ड्रग प्रतिरोधी जीन की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। दो विशेष रूप से परियोजना के अभिन्न अंग हैं, QTL मानचित्रण की अपेक्षाकृत अनुभवी पद्धति और सीआरआईएसपीआर / कैस 9 जीन संपादन की हाल ही में विकसित विधि। लैंडर और बोटस्टीन ने अपने प्रभावशाली पत्र को 1989 में प्रकाशित किया था जिसमें क्यूएलएल मैपिंग का प्रदर्शन किया गया था जो आनुवंशिक लोकी के साथ फेनोटाइप 36 के साथ जुड़ा हुआ था। 2012 में हाल ही में, दांडा और चार्पेन्टेयर ने स्ट्रिपोकोकस प्यूजेंस में क्रिस्टीप / कैस 9 संपादन प्रणाली को वर्णित किया 22 जो कि टी गौंडी 13 , 17 सहित कई अलग-अलग मॉडलों में जल्दी आनुवंशिक उपकरण के रूप में अनुकूलित किया गया था। दोनों तरीकों यहाँ उपयोगी थे, जहां QTL मैपिंग ने ड्रग प्रतिरोधी उत्परिवर्तन युक्त उस स्थान को परिभाषित किया जिसे अंततः डब्ल्यूजीएस आधारित एसएनपी पहचान का उपयोग करने की पहचान की गई थी, और सीआरआईएसपी / सीएस 9 संपादन ने मुझे प्रदान किया एसएनआर 1 की पुष्टि करने के लिए ans sinefungin दवा प्रतिरोध जीन है।

एमई 4 9-एफयूडीआर आर एक्स वैंड-एसएनएफ आर क्रॉस 8 को मूल रूप से एक विषाणु फेनोटाइप 1 9 से पूछताछ करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन अभिभावकीय तनाव भी एक अतिरिक्त फेनोटाइपिक अंतर होता है जिसके लिए कारण जीन ज्ञात नहीं था, वैंड माता-पिता में साइनइनफिनिन प्रतिरोध। इससे पार के एक लाभ पर प्रकाश डाला गया है, जब माता-पिता में अतिरिक्त फेनोटाइपिक मतभेद मनाए जाते हैं तब उनका पुनर्मुद्रण किया जा सकता है। यह एक और टोक्सोप्लाज्मा क्रॉस के लिए मामला था, प्रकार 2 एक्स 3 टाइप करें, जहां अनेक जीन कई फीनोटाइप्स 37 , 38 , 39 , 40 मानचित्रण के द्वारा पाया गया। तिथि करने के लिए, चार अलग-अलग टी। गोंडी पार को वर्णित किया गया है और फेनोटाइप के लिए जिम्मेदार जीन को मैप करने के लिए उपयोग किया गया हैएसएस = "एक्सएएफ"> 8 , 37 , 41 , 42 , जिनमें से सभी के पास नए फ़िनोटीप्स को मैप करने का पुन: उपयोग करने की क्षमता है जिसके लिए आनुवांशिक आधार अज्ञात है। इन पंक्तियों के साथ, ज्ञात वैश्विक आनुवांशिक विविधता का प्रतिनिधित्व करते हुए 62 टी। गोंडी उपभेदों के लिए जीनोम क्रमश: 43 से क्रमबद्ध हैं। इस पुल से नई क्रॉस को ऐसे तनावों के लिए बनाया जा सकता है जो दिलचस्प फ़िनोटीप्स में भिन्न हैं। क्यू एल एल मैपिंग के फायदों का विस्तार करने के बाद, यह कहा जाना चाहिए कि क्रॉस पैदा करना एक लघु उपक्रम नहीं है वहाँ अन्य तरीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है जो कारण जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। एक शक्तिशाली तकनीक म्यूटेंट बनाने के लिए रासायनिक mutagenesis का उपयोग करता है जिसे फ़िनोटाइप्स के लिए दिखाया जा सकता है। कारण जीन को खोजने के लिए, म्यूटेंट या तो कॉस्ममिड लाइब्रेरीज़ 44 या जेनोम शोधक तरीके से पूरक हो सकते हैं, कारण उत्परिवर्तन 45 को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। मो के लिएफिर से, कोलमेन एट अल द्वारा दो जॉव लेख देखें और वाल्विन एट अल इन तरीकों की रूपरेखा 46 , 47

कारण एसएनएफ आर उत्परिवर्तन (प्रोटोकॉल 2 और 3) की पहचान करने के लिए कई कदम ऐसे सॉफ्टवेयर के साथ आयोजित कम्प्यूटेशनल विधियों पर भरोसा करते हैं जो शैक्षणिक उपयोग के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है। प्रत्येक चरण के लिए विस्तृत आदेश प्रदान किए जाते हैं और जब उचित फाइलों के साथ चलते हैं तो उपयोगकर्ता को एसएएनएफ एसएनपी कारण खोजने के लिए आवश्यक डेटासेट को फिर से बनाने की अनुमति होगी। ध्यान रखें कि आदेशों में से कुछ सिंटैक्स फ़ाइल नाम या निर्देशिका संरचना ($ PATH) को संदर्भित करता है जिसे उपयोगकर्ता वरीयता में संशोधित किया जा सकता है। यद्यपि यहां दिए गए आदेश निश्चित रूप से क्वालिटी विश्लेषण और डब्ल्यूजीएस आधारित एसएनपी पहचान के साथ क्रॉस का विश्लेषण करने के तरीकों को नहीं निकालेगा, लेकिन वे इस आलेख में वर्णित प्रयोग को दोहराने के लिए पर्याप्त हैं और यूजर को एम कैसे इन तरीकों से कदम फैशन के एक कदम में उपयोग किया जाता है के साथ परिचित अयस्क

यद्यपि QTL मैपिंग और डब्ल्यूजीएस अनुक्रम आधारित एसएनपी पहचान एक उम्मीदवार एसएनएफ आर जीन की पहचान के लिए पर्याप्त थे, लेकिन ड्रग प्रतिरोध में इसकी भूमिका की पुष्टि के लिए अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता है। यह स्पष्ट रूप से जीन व्यवधान या पीटकर तकनीक के माध्यम से दिखाया जा सकता है, जिनमें से दोनों सीआरआईएसपीआर / कास 9 जीन एडिटिंग का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 का प्रयोग करने के लिए विस्तृत तरीके से इंडल म्यूटेशन बनाने या ट्रांसजेनिक संरचनाएं टी। गोंडी में लक्ष्य जीन में डाली जाती हैं। लक्ष्यीकरण विशिष्टता जो सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 प्रदान करता है पारंपरिक तरीकों से जीन संपादन की दक्षता को बढ़ाती है। साथ ही, इसने कुशलता से बढ़कर जेनेटिक अध्ययन के लिए गैर-प्रयोगशाला अनुकूलित तनाव का उपयोग करना संभव बना दिया है जो कि पहले 13 को संशोधित करना मुश्किल था। भले ही अपनी प्रारंभिक अवस्था में, सीआरआईएसपीआर / कैस 9 पहले से ही जीन बाधाओं को बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा चुका हैटीज गोंडी में जीन नॉकआउट 16 , 1 9 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 बनाने के लिए, एक उपयोगी उपकरण बनने का वादा करने के लिए, 2 , 13 , 17 , 18 , 48 , 49 , टैग जीन 17 भविष्य में कई अन्य अध्ययनों के लिए

खोज कि एसएनआर 1 निष्क्रियता से साइनफ़िंगिन प्रतिरोध की ओर जाता है एसएनआर 1 स्थलीय ट्रांसजेन प्रविष्टि या आनुवंशिक पूरक के लिए एक होनहार साइट बनाता है। एसआरआईआर 1 स्थान में ट्रांसजीने के एकीकरण को निर्देशित करने के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 मध्यस्थता वाले जीन का उपयोग करने की सफलता को अधिकतम करने के लिए निम्नलिखित पहलुओं का ध्यान रखना चाहिएप्रायोगिक डिजाइन के दौरान लाल। सबसे पहले, एक चयन मार्कर को तनाव निर्माण की दक्षता बढ़ाने के लिए ट्रांसजेनिक निर्माण में शामिल करने की सिफारिश की गई है। अगर कोई चयन मार्कर शामिल है, तो दोनों सकारात्मक और नकारात्मक चयन का उपयोग किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप दोगुनी चयनित परजीवी के 100% एसएनआर 1 लोकस पर GOI एकीकृत के साथ ट्रांसजेनिक होने का परिणाम है। इसके विपरीत, यदि ट्रांसजेनिक निर्माण में अतिरिक्त चयन योग्य लक्षण नहीं होते हैं और एसएनआर 1 लोकस पर नकारात्मक चयन पर निर्भर करते हैं, सफल ट्रांसजेनेसिस की दक्षता सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड और ट्रांसजेनिक संरचना के कोर्टरिसेंसिविटी की दक्षता पर निर्भर करती है।

दूसरा, हालांकि सीआरआईएसपीआर / कैस 9 मध्यस्थता वाले साइट-विशिष्ट एकीकरण गैर-मुताबिक डीएनए टुकड़ा का उपयोग अक्सर पूरक और ट्रांसजेनेसिस के लिए किया जाता है, लेकिन यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन मामलों में प्रविष्टि की गारंटी नहीं दी जा सकती है क्योंकि दिशा संभव है। यह समस्या पैदा हो सकती हैकुछ अनुप्रयोगों के लिए एमएस उदाहरण के लिए, अलग-अलग जीन एलील्स के साथ उत्परिवर्तक के पूरक के लिए, यह सुनिश्चित करना मुश्किल है कि सभी alleles उसी अभिविन्यास में डाली जाती हैं, और ओरिएंटेशन में अंतर अभिव्यक्ति अंतर पैदा कर सकता है। इस प्रकार के आवेदन के लिए, डीएनए एसएनआर 1 लोकस के अनुरुप अनुक्रमों के साथ तैयार करता है, जो उचित एकीकरण अभिविन्यास ( चित्रा 6 ) को चलाएगा ।

तीसरा, अभिकर्मक के दौरान, क्रिस्प्र प्लाज्मिड और ट्रांसजेनिक डीएनए अणु के बीच का अनुपात सफल ट्रांसजेनिक तनाव निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है। चयन रणनीतियों के अनुसार इस अनुपात को समायोजित करने की आवश्यकता है। निम्नलिखित दिशानिर्देशों की सिफारिश की जाती है: 1) यदि ट्रांसजेनिक निर्माण में एक दवा प्रतिरोधी मार्कर होता है और इसी दवा ट्रांसजेनिक परजीवी उत्पन्न करने के लिए केवल एकमात्र चयन होती है, अर्थात् sinefungin का प्रयोग नहीं किया जाता है, ट्रांसजेनिक निर्माण और सीआरआईएसपीआर प्लाज़म के बीच सुझाए गए दाढ़ अनुपातआईडी 1: 5 है इस मामले में अधिक क्रिस्प्र प्लाज्मिड का प्रयोग संभवतः ट्रांसजेनिक निर्माण प्राप्त परजीवीओं को भी सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड प्राप्त होगा, इसलिए दवा प्रतिरोधी परजीवी को सीआरआईएसपीआर लक्ष्यीकरण साइट पर मार्कर डालने की अधिक संभावना है। यदि अनुपात उलट हो जाता है, ट्रांसजेनिक निर्माण प्राप्त करने वाले अधिकांश परजीवी को सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड नहीं मिलेगा। नतीजतन, दवा प्रतिरोधी परजीवी के विशाल बहुमत, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 मध्यस्थता वाले साइट-विशिष्ट सम्मिलन से जुड़े नहीं होने वाले यादृच्छिक एकीकरण के माध्यम से ट्रांसजेनिक निर्माण प्राप्त करते हैं। 2) ट्रांसजेनिक निर्माण में एक दवा प्रतिरोधी मार्कर होता है और ट्रांस्जेनिक परजीवी का चयन करने के लिए इसी दवा का इस्तेमाल साइनइनफिनिन के साथ किया जाता है, ट्रांसजेनिक निर्माण और सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड के बीच सुझाए गए दाढ़ अनुपात 1: 1 है। यह रणनीति ट्रांसजेनिक तनाव निर्माण की उच्च दक्षता प्रदान करती है। 3) यदि ट्रांसजेनिक निर्माण में कोई चयन निर्माता शामिल नहीं है, तो नकारात्मक चयन पर निर्भरट्रांसजेनिक परजीवी प्राप्त करने के लिए अकेले साइनफिंगिन द्वारा, ट्रांसजेनिक निर्माण और सीआरएसपीआर प्लाज्मिड के बीच सुझाए गए दाढ़ अनुपात 5: 1 है। इस डिजाइन के लिए तर्क ऊपर के पहले दिशानिर्देश के समान है। चूंकि प्रोटोकॉल 5 में चयन के लिए दोनों पाइरीमेथामाइन और साइनफ़ागिन का उपयोग किया गया था, डीआरएचआरआर * मिनी जीन और एसआरआईआर 1 के बीच का अनुपात सीआरआईएसपीआर प्लाज्मिड को 1: 1 के रूप में निर्धारित किया गया था।

एक साथ उठाए गए तरीके, यहां दिए गए तरीकों पर एक विस्तृत विवरण दिया गया है जो मूल प्रकाशन में व्यक्त करना संभव नहीं था जो कि एसएनआर 1 2 की पहचान करता है ये प्रोटोकॉल; विशेष रूप से, कमांड लाइन सिंटैक्स, उपयोग किए जाने वाले कार्यक्रमों का अनुक्रमिक लेआउट, और क्रिस्पीआर / कास 9 के इस्तेमाल से फ़िनोटीप्स के लिए जिम्मेदार नए जीनों की पहचान करने के लिए भविष्य के प्रयासों को सहायता करनी चाहिए।

Acknowledgments

हम एल। डेविड सिबली और असीस खान को मूल प्रकाशन में उनके योगदान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, जिस पर ये प्रोटोकॉल आधारित हैं। यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट AI108721 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T25 flasks Corning 430639
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) ATCC SCRC-1041
T. gondii ME49 strain ATCC 50840
T. gondiiVAND strain ATCC PRA-344
DMEM (No Sodium Bicarbonate) Life Sciences 12800017
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
Fetal Bovine Serum (FBS) Premium Grade VWR International 97068-085
L-Glutamine  200 mM Sigma Aldrich G7513
Gentamicin (10 mg/mL) Life Technologies  15710064
Cell Scraper for Flasks VWR International 10062-904
Syringe 10 mL BD 309604
Blunt needles 22 G x 1" BRICO Products BN2210
Nuclepore Filter 3.0 µm, 25 mm GE Healthcare 110612
Swin-Lok Filter Holder 25 mm GE Healthcare 420200
Hemacytometer Propper MFG 90001
Sinefungin Enzo Life Sciences 380-070-M001
R  The R Foundation https://www.r-project.org/
J/qtl The Churchill Group http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml
Bowtie2 John Hopkins University http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
NCBI SRA Toolkit NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc
SAMtools Wellcome Trust Sanger Institute http://www.htslib.org/
VarScan Washington University, St Louis http://varscan.sourceforge.net/
MUMmer JCVI & Univ Hamburg http://mummer.sourceforge.net/
pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT Addgene Plasmid #54467 T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene
pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 Addgene Plasmid #59855 T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene
pUPRT::DHFR-D Addgene Plasmid #58528 Template for DHFR* mini gene
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit  New England Biolabs E0552S
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
LB Broth Fisher Scientific DF0446-07-5
Potassium chloride Sigma Aldrich P9541
Calcium chloride Sigma Aldrich 746495
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P5504
EDTA Sigma Aldrich E5134
Magnesium chloride Sigma Aldrich M1028
Adenosine triposhpate (ATP) Sigma Aldrich A6419
L-glutathione (GSH) Sigma Aldrich G4251
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0002
Electroporation Cuvette  4 mm Harvard Apparatus 45-0126
Crytal Violet Alfa Aesar B21932-14
6-well TC plate Corning 353046
24-well TC plate Corning 353935
Cover glass 12 mm round VWR International 89015-724
96-well TC plate Corning 353075
Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) New England Biolabs E5510S
Q5 High-Fidelity Polymerase  New England Biolabs M0491S
Pyrimethamine TCI AMERICA P2037-1G Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites - see Protocol

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References

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QTL मैपिंग और सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 में एक ड्रग प्रतिरोध जीन को पहचानने के लिए संपादन<em&gt; टोक्सोप्लाज्मा गोंडी</em
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Shen, B., Powell, R. H., Behnke, M.… More

Shen, B., Powell, R. H., Behnke, M. S. QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (124), e55185, doi:10.3791/55185 (2017).

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