Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집 Published: June 22, 2017 doi: 10.3791/55185

Summary

Toxoplasma gondii 에서 약물 내성 유전자를 확인하는 데 유전지도를 기반으로하는 QTL 매핑을 사용하는 방법과 게놈 타겟을 효율적으로 편집하는 CRISPR / Cas9 시스템으로 어떻게 검증 할 수 있는지에 대한 세부 정보가 제공됩니다. 약물 내성 유전자.

Abstract

과학적 지식은 본질적으로 사용 가능한 기술과 방법에 연결됩니다. 이 기사에서는 Apicomplexan 기생충 Toxoplasma gondii 에서 약물 내성 유전자를 확인하고 검증 할 수있는 두 가지 방법, 즉 Whole Genome Sequence (WGS) 기반 유전지도를 사용한 Quantitative Trace Locus (QTL) 매핑 방법과 그 방법 (CRISPR) / Cas9 기반 유전자 편집. QTL 매핑의 접근법은 게놈 영역 (들)과 표현형 사이에 상관 관계가 있는지를 테스트 할 수있게합니다. 재조합 십자가의 자손을 기반으로 한 유전지도 인 QTL 스캔을 수행하기 위해서는 두 가지 데이터 세트가 필요하며 그 십자가의 자손 각각에서 평가 가능한 정량화 가능한 표현형이 필요합니다. 이러한 데이터 세트는 표현형과 관련된 중요한 유전자좌를 확인하기 위해 QTL 스캔을 생성하는 R / qtl 소프트웨어와 호환되도록 포맷됩니다. 검색을 크게 줄일 수 있지만가능성있는 후보자의 후보자 인 QTL은 인과 관계 유전자를 식별 할 필요가있는 다수의 유전자를 포함하는 영역에 걸쳐있다. 자손의 WGS를 갖는 것은 유전자 수준에서 원인 약 저항성 돌연변이를 확인하는 데 중요했습니다. 일단 확인되면, 후보 돌연변이는 약물에 민감한 기생충의 유전자 조작에 의해 확인 될 수 있습니다. T. gondii 를 유 전적으로 수정하는 가장 쉽고 효율적인 방법은 CRISPR / Cas9 시스템입니다. 이 시스템은 단일 플라스미드로 암호화 된 단지 2 가지 구성 요소, 게놈 타겟에 상보적인 20bp 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA (gRNA) 및 표적에서 이중 가닥 DNA 브레이크 (DSB)를 생성하는 Cas9 엔도 뉴 클레아 제로 구성되며, 수리는 브레이크 사이트 주변의 서열의 삽입 또는 결실을 허용한다. 이 기사는 sinefungin 저항성을 담당하는 유전자를 확인하고 형질 전환 기생충을 구축하기 위해 CRISPR / Cas9 기반 게놈 편집 도구를 사용하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

Introduction

숙주 범위는 기생충의 유행 정도를 결정합니다. 일부 기생충은 발견 된 영역을 제한하는 매우 구체적인 호스트 요구 사항을 가지고 있으며 일부는 일반 주의자입니다. 그 중 한 명은 Toxoplasma gondii ( T. gondii) 입니다. 이 기생충은 모든 포유 동물과 많은 새들을 감염시킬 수 있기 때문에 전 세계적으로 발견됩니다. 인간도 감염되기 쉽고 전세계 인구의 약 1/3이 감염된 것으로 추정됩니다. 다행히 강력한 면역 반응은 일반적으로 기생충의 성장을 조절하지만 면역계가 손상된 상황에서 기생충은 확인되지 않고 성장하여 질병을 일으킬 수 있습니다 (종종 뇌염). 또한이 기생충은 이전에 감염되지 않은 여성이 면역 기억이 부족하여 기생충의 확산을 제한하기 때문에 임신 중에 감염된 경우 선천적 인 질병을 일으킬 수 있습니다. 또한 시력 손실을 초래할 수있는 안구 독소증의 부담이 있습니다 1 . 이 reaso 들어ns T. gondii 는 연구의 초점이되었고, Apicomplexan 기생충에 대한 모델로 연구를 위해 개발 된 많은 분자 방법으로 인해 연구 대상이되었습니다. 여기에 설명 할 두 가지 방법은 QTL (Quantitative Trait Locus) 매핑 및 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas9 유전자 편집입니다. QTL 매핑과 CRISPR / Cas9 편집은 이전 연구에서 T. gondii 병독성 유전자를 확인 및 / 또는 특성화하기 위해 사용 된 전진 및 역 유전 접근법입니다. 여기에서 이들 방법을 결합하여 sinefungin 내성 (SNF r ) 유전자, TgME49_290860 및 이의 ortholog ( SNR1로 표시 ) 2 의 기능을 확인하고 확인합니다.

T. gondii 는 다양한 중간 숙주를 감염시킬 수 있지만, 생명주기를 완료하기 위해서는 felid의 장 상피 세포를 통과시켜 감염시켜야합니다. 고양이는 기생충의 결정적인 숙주입니다.exial stage가 생성되고 감수 분열을 통한 유전 재조합이 일어난다. QTL 연구를 수행하려면 유전 적 십자가를 만들어야하며, Toxoplasma 의 경우 이것은 표현형 형질이 다른 두 가지 기생충 균주, 즉 모계 얼룩을 고양이를 통해 재조합 자손 3 을 생산하는 것입니다. 고양이에게 먹이기 전에 부모의 계통은 별도의 약물에 내성을 갖게되어 자손 4 의 이중 약물 선택으로 재조합 체를보다 효율적으로 확인할 수 있습니다. 이 목적을 위해 T. gondii 에는 세 가지 약물이 사용되었습니다. 저항성 유전자 5 가 우라실 포스 포리보실 트랜스퍼 라제 ( FUR ), 저항성 유전자 6 이 아데노신 키나아제 ( AK ), 저항성 유전자가 알려지지 않은 시네 파인 신 (SNF)이 7 인 아데노신 아라 비노 시드 (ARA). 몇 가지 유전 적 십자가가T. gondii에 대해 생성되었지만 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)을 사용하여 ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross의 24 자손 만 genotyped 하였다. 이것은 VAND 부모가 약물에 민감한 VAND (VAND-SNF s ) 균주 화학적 돌연변이 유발에 저항하여 sinefungin 내성을 갖도록이 십자가를 사용하여 SNF 내성 유전자를 매핑하고 식별 할 수있는 가능성을 열었고, VAND 참조 게놈은 VAND- 따라서 SNF s 균주는 자손 Wine과 VAND-SNF 참조 게놈 사이의 모든 다형성을 식별 할 수있게 해줍니다. 그 유전 적 부모 VAND-SNF r 돌연변이는 자손의 sinefungin 내성을 일부 변이 시켰습니다.

SNF r 자손에서 원인 단일 뉴클레오타이드 다형성 (SNP)을 확인하기 위해 여러 컴퓨터 기반 오픈 소스 리소스를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. ME49-부모와 자손의 WGS 정렬을 사용하여 유전자 크로스 오버의 게놈 위치를 정확하게 검출하는 REDHORSE 소프트웨어 세트 9 가 개발되었습니다. 이 맵핑 정보는 R 통계 프로그래밍 소프트웨어에서 'qtl'패키지 10 과 호환되는 데이터 세트를 포맷하기 위해 표현형 데이터 (자손의 SNF r) 와 결합 될 수있다. QTL 스캔은 QTL 스캔이 실행되어 표현형. QTL 유전자좌 내에 위치한 인과적인 SNP를 확인하기 위해 VarScan mpileup2snp 변형 호출 프로그램 12를 사용하여 SNP를 호출 할 수있는 Bowtie 2 정렬 프로그램 11 을 사용하여 자손의 WGS 읽기를 개별적으로 sinefungin에 민감한 VAND 게놈에 맞출 수 있습니다. 이러한 SNP를 사용하여, QTL 유전자좌는 SNF r에 존재하는 다형성을 검색 할 수 있지만SNF 자손에서 유전자의 코딩 영역에서 확인 된 인과적인 SNP로, 후보 SNF r 유전자의 유전 적 변형이 SNF s 변형에서 수행되어 약물 내성 기능을 검증 할 수있다.

CRISPR / Cas9 게놈 편집 시스템은 최근 Toxoplasma 13 에 설립되었으며,이 기생충의 복잡한 생물학 탐구, 특히 비 실험실 변형 계통의 유전 연구에 중요한 도구가 추가되었습니다. WT Toxoplasma 세포에서 매우 활성 인 Non-Homologous End Joining (NHEJ) 활성으로 인해, 외인성으로 도입 된 DNA가 매우 높은 빈도로 게놈에 무작위로 통합되기 때문에 표적 게놈 변형을 달성하기가 어렵습니다. 궤적 특이 적 변형의 성공률을 증가시키기 위해, 상이한 접근법이 동종 재조합의 효율을 증가시키고 / 시키거나e NHEJ 활동 15 , 16 . 이러한 접근법 중 하나는 CRISPR / Cas9 시스템입니다. 다른 방법과 비교하여 CRISPR / Cas9 시스템은 사이트 별 수정 사항을 효율적으로 적용 할 수 있으며 13 , 17 , 18을 쉽게 디자인 할 수 있습니다. 또한 기생충 13 , 19 의 추가 변형없이 Toxoplasma 균주에서 사용할 수 있습니다.

CRISPR / Cas9 시스템은 Streptococcus pyogenes 의 적응 면역 체계에서 유래되었으며,이를 파지 20 , 21 , 22 와 같은 이동 유전 요소의 침입을 방어하는 데 사용합니다. 이 시스템은 RNA 유도 DNA 엔도 뉴 클레아 제 효소 Cas9를 이용하여 이중 가닥 DNA 브레이크 (DSB)를 표적에 도입하고,짧은 indel 돌연변이를 통해 표적 유전자를 불 활성화시키는 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ에 의해, 또는 설계된대로 정확하게 표적 유전자를 변경시키기위한 상 동성 직접 재조합에 의해 야기된다. 표적 특이성은 표적 DNA와 100 % 상 동성을 갖는 개별적으로 설계된 20nt 서열을 포함하는 단일 가이드 RNA (gRNA)라는 작은 RNA 분자에 의해 결정됩니다 22 . gRNA 분자는 또한 특정 Protospacer Adjacent Motif (PAM, 서열은 'NGG')를 포함하는 표적 사이트로 핵산 분해를 유도하는 Cas9에 의해 인식 된 시그니처를 포함한다 25 , 26 . 따라서, gRNA 분자와 PAM 서열은 함께 작용하여 게놈에서 Cas9 절단 부위를 결정한다. 하나는 쉽게 절단을위한 다른 사이트를 대상으로 gRNA 시퀀스를 변경할 수 있습니다.

CRISPR / Cas9 시스템이 Toxop에서 처음 개발되었을 때Lasas에서, Cas9 핵산 분해 효소를 발현하는 단일 플라스미드와 gRNA 분자를 사용하여 표적 부위 13 , 17에 DSB를 도입 하였다. CRISPR / Cas9 시스템은 동종 재조합에 의해서뿐만 아니라 외인성 DNA의 비 상동 적 통합을 통해서 현장 특이적인 게놈 변형의 효율을 크게 증가시키는 것으로 나타났다. 그것은 NHEJ 활동을 포함하는 야생형 계통에서 이것을합니다. 따라서이 시스템은 효율적인 게놈 편집을 위해 본질적으로 모든 Toxoplasma 균주에서 사용할 수 있습니다. 전형적인 실험에서, 표적 특이 적 CRISPR 플라스미드 및 표적을 변형 시키는데 사용 된 DNA 단편은 기생충 내로 동시에 형질 감염된다. 표적을 변형시키는 데 사용 된 DNA 단편이 표적 궤적에 상 동성 서열을 포함하면 상 동성 재조합을 이용하여 CRISPR / Cas9에 의해 도입 된 DSB를 수복하여 표적을 정확하게 변형시킬 수있다. 다른 한편, int생성 된 DNA 단편은 상 동성 서열을 포함하지 않으며, 여전히 CRISPR / Cas9 표적화 사이트에 통합 될 수있다. 후자는 흔히 선별 마커를 삽입하거나 네거티브 선발을 허용하는 유전자좌를 보완하기 위해 유전자를 파괴하는 데 사용됩니다 13 . 여기 SNR1 유전자좌는 CRISPR / Cas9가 어떻게 유전자 파괴 및 형질 전환 기생충의 생성에 사용될 수 있는지를 보여주기위한 예입니다.

Protocol

1. ME49-FUDR r x VAND-SNF r 자손의 SNF r 을 조사하십시오

참고 : T. gondii 는 의무적 인 세포 내 기생충이며 tachyzoite 단계는 조직 배양에서 쉽게 자랍니다.

  1. T. gondii 기생충을 성장시키기 위하여, 37 ℃에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) (D10 배지)으로 보충 된 Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM) 배지와 함께 T25 플라스크에 접종 된 합류하는 Human Foreskin Fibroblast (HFF) C 및 5 % CO2이다.
    참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 1.1 참고 사항을 참조하십시오.
  2. sinefungin 저항에 대한 개별 후손 클론을 테스트하려면 대부분의 기생충이 숙주 세포를 녹일 때까지 2-3 일 동안 T25 HFF 배양 플라스크에서 각 클론을 높은 기생충 밀도까지 성장시킵니다.
  3. 세포 스크레이퍼로 단층을 긁고 기생충 용액을 10 mL 주사기 / 22 G 둔화 바늘 2-3 x t를 통과시킵니다기생충을 방출하는 숙주 세포를 용해시킨다. 솔루션은 여러 바늘 통로에 대한 주사기로 다시 끌어 올 수 있습니다.
  4. HFF 세포와 세포 파편을 제거하는 3 μm의 구멍 크기 멤브레인을 통해 새로운 원뿔 튜브에 기생충 솔루션을 필터링합니다.
  5. hemocytometer에 기생충을 세고 mL 당 기생충의 수를 결정하십시오.
  6. pipettor를 사용하여 sinefungin 약물의 0.3 μm의 작동 농도와 D10 미디어를 포함하는 새로운 T25 HFF 문화 플라스크 2.5 X 10 5 기생충을 전달합니다.
  7. 37-10 ℃에서 5 % CO 2 에서 기생충을 자랍니다.
  8. sinefungin 약물의 성장 표현형에 대한 자손 점수. 거꾸로 위상차 현미경과 monolayer (sinefungin 내성)의 성장과 lysis에 대한 성장 없음 (sinefungin 민감한)에 대한 점수 0 0 monolayer를 관찰.
    참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 1.8 참고 사항을 참조하십시오.

2. RR / qtl의 SNF r 표현형의 QTL 검사

참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 2 참고 사항을 참조하십시오.

  1. R 프로그래밍 언어 소프트웨어를 로컬 컴퓨터에 설치하십시오. 27을보십시오 .
  2. R을 실행하고 'qtl'패키지를 설치하십시오. R GUI 인터페이스 옵션 'Packages-> Install package (s)'에서이 작업을 수행하거나 R 명령 줄에서 다음 명령을 실행하십시오 (각 예제의 첫 번째 ">"기호는 명령의 시작을 나타냅니다. 복사 됨) :
    > install.packages ( "qtl")
    참고 : R 및 'qtl'패키지가 설치되면 R 명령 줄에서 또는 J / qtl 28 이라는 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 프로그램을 사용하여 R / qtl을 실행하는 두 가지 방법이 있습니다. J를 다운로드하려면 29 를 참조하십시오. / qtl. 이 프로토콜은 R / qtl 명령 줄 구문과 함께 J / qtl의 해당 기능을 간혹 참조합니다.
  3. 'qtl'패키지를로드하십시오.
    > 도서관 (qtl)
    참고 : 데이터 세트 형식 및 다운로드에 대해서는 부록 파일 1의 프로토콜 2.3 참고 사항을 참조하십시오.
  4. R / qtl에 데이터 세트 파일을로드하십시오.
    1. "csv"형식 (참조 : 데이터 파일 1) :
      > SNFR <- read.cross (format = "csv", file = "$ PATH / Rqtl-SNFR.csv", genotypes = c ( "0", "1"), na.strings = c ( "-" , convertXdata = FALSE)
    2. 또는 "게리"형식 (데이터 파일 2 참조) :
      > SNFR <- read.cross (형식 = "게리", dir = "$ PATH", chridfile = "chrid.txt", mnamesfile = "mname.txt", mapfile = "markerpos.txt", genfile = "genotype. txt ", phefile ="phenos.txt ", pnamesfile ="phenonames.txt ", convertXdata = FALSE)
      여기서 $ PATH는 qtl 데이터 세트를 포함하는 파일에 대한 디렉토리 경로입니다. 예 : / Users / HotDiggityDog / QTLfiles
      참고 : 파일을로드 할 수도 있습니다.'Insert Comment or Command'옵션을 사용하여 이전 명령으로 J / qtl에 추가하거나 GUI 'File-> Load Cross Data'옵션을 사용하여 데이터를로드하십시오.
  5. 지도의 확률 계산 :
    > SNFR <- calc.genoprob (SNFR, 단계 = 2.0, off.end = 0.0, error.prob = 1.0E-4, map.function = "haldane", stepwidth = "fixed")
  6. 모든 염색체에서 sinefungin 저항성 표현형의 이진 분포를 사용하여 단일 스캔을 실행합니다.
    > SNFR.scan <- scanone (cross = SNFR, chr = c ( "Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa", "VIIb ","XI ","XII "), pheno.col = c (1), model ="binary ", method ="em ")
    참고 : VIR 표현형을 사용하는 경우 'model = "normal"'배포 옵션을 사용하십시오.
  7. 유의성 임계 값을 계산하기 위해 1000 개의 순열을 실행 한 다음 attr순열을 SNFR.scan 변수로 바꿉니다.
    > SNFR.scan.permutations <- scanone (cross = SNFR, chr = c ( "Ia", "Ib", "II", "III", "IV", "V", "VI", "VIIa" "phenol.col = c (1), model ="binary ", method ="em ", n.perm ="pII ","XI ","XII " 1000, perm.Xsp = FALSE, 자세한 정보 = FALSE)
    > attr (SNFR.scan, "pheno.col") <- c (1)
    참고 : 'Analysis-> Main Scan-> One QTL Genome Scan 실행'옵션을 사용하여 2.5 ~ 2.7 단계를 J / qtl에서 실행할 수 있습니다.
  8. 스캔 결과를 플롯합니다.
    > 플롯 (SNFR.scan, 간격 = 0, bandcol = "회색")
    참고 : J / qtl에서 생성 된 플롯은 대화식입니다.
    1. 가장 높은 피크를 가진 염색체 IX에 대한 스캔 결과를 플롯합니다.
      > plot (SNFR.scan, chr = c ( "IX"), gap = 0, bandcol = "회색", show.marker.names = TRUE)
    2. 단일 스캔에서 모든 마커 위치 및 LOD 점수 표시 :
      > SNFR.scan
    3. 순열 테스트의 임계 값 결과 표시 :
      > 요약 (SNFR.scan.permutations)
    4. 알파 = .05 임계 값 (이전 출력에서 ​​가져온 것)보다 큰 마커 만 표시 :
      > SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> 2.68,]
    5. 각 염색체에서 가장 높은 LOD 점수를 가진 마커 표시 :
      > 요약 (SNFR.scan)
    6. LOD 점수가 최대치 인 마커를 표시합니다 (이전 출력에서 ​​가져옴).
      > SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> = 6.57,]
      참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 2.13 참고 사항을 참조하십시오.

    3. 후손에서 읽은 WGS를 사용하여 원인 SNF 돌연변이 확인

    참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 3 참고 사항을 참조하십시오.

    1. 개별 자손의 WGS 읽기를 sinefungin에 민감한 VAND와 일치시킵니다.(VAND-SNF s ) 페어런트 게놈.
      참고 : NCBI 어셈블리 AEYJ00000000.2에서 VAND 참조 게놈 (SNF s )을 다운로드하고 WGS는 NCBI SRA PRJNA258152에서 24 자손에 대한 (.sra 파일)을 읽습니다. 또한 Bowtie2 11 , NCBI SRA 툴킷, SAMtools 30 , VarScan 12 및 MUMmer 31 프로그램을 다운로드하십시오.
      1. bowtie2-build 프로그램을 사용하여 VAND 참조 게놈 FASTA 파일에서 Bowtie 2 호환 색인을 작성하십시오. 여기서 "VAND"색인의 이름을 지정합니다 :
        > bowtie2-build GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna VAND
      2. SRA 형식의 WGS 읽기 파일을 fastq-dump를 사용하여 FASTQ 파일로 변환합니다 (쌍을 이루는 읽기에 대해 --split-files 옵션 사용). 예를 들어 자손 P1_14VB에 대한 SRR1555372.sra 파일이 사용됩니다.
        > fastq-dump --split-files SRR1555372.sra
        참고 :이 모든 명령을 모든 프로토콜 241에 대해 실행합니다.자손.
      3. bowtie2를 사용하여 SAM (.sam) 파일 및 --end-to-end 옵션에 대한 출력과 함께 WGS 읽기를 참조 게놈에 맞 춥니 다.
        > bowtie2 -x VAND -1 SRR155372_1.fastq -2 SRR1555372_2.fastq -S SRR155372.sam - 끝에서 끝까지
      4. .sam 파일을 BAM (.bam) 파일로 변환하십시오.
        > samtools보기 -bS SRR155372.sam> SRR155372.bam
      5. .bam 파일을 정렬하십시오.
        > samtools sort SRR155372.bam SRR155372.sort
      6. 정렬 된 .bam 파일 색인 :
        > samtools 색인 SRR155372.sort.bam
    2. VarScan을 사용하여 자손의 SNP 호출
      참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 3.2 참고 사항을 참조하십시오.
      1. VAND 게놈 참조 파일, 모든 자손 .sort.bam 파일과 samtools mpileup을 사용하여 모든 인덱싱 된 BAM (.sort.bam) 파일을 하나의 파일 형식 파일로 변환하고 AllProgeny-mpileup.txt라는 파일에 출력합니다.
        > samtools mpileup -f GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna SRR1555599.sort.bam SRR1555372.sort.bam SRR1555660.sort.bam SRR1555672.sort.bam SRR1556052.sort.bam SRR1556122.sort.bam SRR1556192.sort.bam SRR1556194.sort.bam SRR1556195.sort.bam SRR1556199.sort.bam SRR1556200. sort.bam SRR1556202.sort.bam SRR1556203.sort.bam SRR1556274.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556396.sort.bam SRR1556397.sort.bam SRR1556398.sort.bam SRR1556399. sort.bam SRR1556400.sort.bam SRR1556401.sort.bam SRR1556402.sort.bam> AllProgeny-mpileup.txt
      2. AllProgeny-mpileup.txt 파일을 사용하여 VarScan mpileup2snp 프로그램을 사용하여 모든 SNP를 호출하십시오. 최소 판독 가능 범위는 5, .8의 읽기 동안의 최소 변이 빈도, .01의 ​​p- 값 및 파일 이름 AllProgeny-SNP에 대한 출력. txt :
        > java -jar VarScan.jar mpileup2snp AllProgeny-mpileup.txt - min-coverage 5 - min-var-freq .8 --p 값 .01> AllProgeny-SNPs.txt
        참고 : AllProgeny-SNPs.txt 파일은 프로토콜 3.4에서 사용되는 탭으로 구분 된 텍스트 파일입니다원인이되는 SNP
    3. ME49 기반 QTL 유전자좌의 좌표에 해당하는 VAND 게놈 좌표를 찾습니다.
      참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 3.3 참고 사항을 참조하십시오.
      1. MUMmer nucmer 프로그램을 사용하여 ME49 게놈 (ToxoDB.org 32 에서 다운로드 가능)과 VAND 참조 게놈 파일 (출력은 out.delta 파일로 이동)을 정렬합니다.
        > nucmer ToxoDB-28_TgondiiME49_Genome.fasta GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna
      2. MUMmer show-coords 프로그램을 사용하여 ME49vsVAND-coords.txt라는 파일에 출력되는 두 개의 게놈 정렬 좌표를 가져옵니다.
        > show-coords out.delta> ME49vsVAND-coords.txt
        참고 : ME49vsVAND-coords.txt 파일을 사용하여 QTL 위치에 해당하는 VAND 컨 티그와 위치를 찾을 수 있습니다. ME49 염색체 IX에 위치한 마커 MV359 내지 MV366은 3,187,537 내지 4,202,258 bp이다. 해당하는 두 개의 VAND contig가 있습니다.QTL 로커스 (onlying QTL locus); KN044604.1 : 657,441-1 bp 및 KN042501.1 : 430,910-41,870 bp (두 contig는 ME49 염색체와 역 정렬 됨).
    4. SNF r 자손에서만 유전되는 SNP에 대해 QTL 유전자좌 내에 위치한 자손 SNP를 평가합니다
      참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 3.4 참고 사항을 참조하십시오.
      1. 데이터 파일 3을 검토하여 QTL 유전자좌 내에 위치한 인과 돌연변이를 확인하십시오. SNF r 자손이 SNP를 갖고 SNF가없는 패턴 (자손 SNP가 VAND-SNF 참조 게놈과 비교하여 얻어 졌기 때문에 가능)에서 데이터를 스캔하십시오. 이것은 VAND contig KN042501.1에 348130 위치 만이 패턴으로 한 위치에 있어야합니다.
      2. 데이터 파일 3 ( 그림 3 )의 6604 행을 참조하십시오.
        참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 3.4.2를 참조하십시오.

    4. CRISPR / Cas9-매개 된 유전자 불 활성화.

    참고 : QTL 매핑 및 WGS SNP 분석으로 확인 된 인과적인 SNP를 확인하려면 WT SNF s 배경에서 해당 유전 적 변화를 확인하고 결과 표현형을 검사해야합니다. sinefungin 저항성의 경우, 책임있는 돌연변이는 조기 종결에 의한 SNR1 유전자의 불 활성화를 초래한다. 따라서 확인을 위해 SNR1의 중단을 사용할 수 있습니다. 여기에 CRISPR / Cas9 유도 indel 돌연변이를 사용하여 sinefungin 내성에 관여한다는 것을 입증하기 위해 SNR1 을 파괴시키는 상세한 프로토콜이 제공됩니다 ( 그림 4 ).

    1. SNR1 특이 적 CRISPR 플라스미드 구축
      참고 : 플라스미드와 맵을 얻으려면 보충 파일 1의 프로토콜 4.1 참고 사항을 참조하십시오.
      1. ToxoDB 32 에서 표적 유전자 ( SNR1 , TGME49_290860)에 대한 게놈 서열을 얻습니다.
      2. E-CRISP 33 과 같은 온라인 도구를 사용하여 표적 특정 gRNA를 고안하십시오. gRNA에 PAM 서열 (NGG)을 포함시키지 마십시오.
        참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 4.1.2 참고 사항을 참조하십시오.
      3. 표적 특정 CRISPR 플라스미드를 만들기 위해 프라이머를 합성하십시오.
        1. 단계 4.1.2의 설계에 따라, 사이트 지시 된 돌연변이 유발에 의해 원래의 CRISPR 플라스미드에서 gRNA를 타겟팅하는 UPRT를 선택된 gRNA 서열로 변경하기위한 2 개의 프라이머를 합성한다.
          참고 :이 두 프라이머의 순서는 다음과 같습니다 : gRNA-Fw : NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTAGAGCTAGAAATAGC (N20은 표적 특이 적 gRNA 서열 임) 및 gRNA-Rv : AACTTGACATCCCCATTTAC 2 .
      4. 사이트 지정 돌연변이 유발 반응을 수행하십시오.
        1. 위에 나열된 두 프라이머와 템플릿으로 CRISPR 플라스미드 (pSAG1 :: CAS9 - U6 :: sgUPRT)를 대상으로 UPRT를 사용하여 사이트 지정 돌연변이 유발 반응제조업체의 지침에 따라
          참고 : 다음 순환 조건을 PCR에 사용하십시오 : 98 ° C에서 1 분, 98 ° C에서 10 초, 55 ° C에서 30 초, 72 ° C에서 5 분 25 회 반복 한 후 2 분간 최종 연장 72 ° C에서.
      5. GOI 특이 적 CRISPR 플라스미드를 함유 한 돌연변이 생성물을 공급자의 프로토콜 ( Tables of Materials 참조)에 따라 화학적 변형에 의해 대장균 유능한 세포로 형질 전환시킨다. 37 ° C에서 암피실린 (100 μg / ML)을 포함하는 lysogeny 국물 (LB) 플레이트에 transformants를 성장. 그 후, 2-4 개의 클론을 골라내어 개별적으로 100 μg / mL 암피실린을 보충 한 5 mL LB 배지에서 12-16 시간 동안 성장시킵니다.
        1. DNA 분리 키트를 사용하여 배양 물로부터 플라스미드를 추출하고 플라스미드의 크기를 확인하기 위해 DNA 겔 전기 영동으로 분석한다 (예상 플라스미드 크기는 9674 bp이며 원래의 CRISPR 플라스미드를 c온 트롤). M13-Rev 프라이머 (5'-CAGGAAACAGCTATGACC)를 사용하여 플라스미드를 배열하여 표적 특정 gRNA 서열을 확인하십시오.
          1. 일단 양성 클론이 확인되면 향후 사용을 위해 -20 ℃에서 플라스미드 DNA와 -80 ℃에서 상응하는 세균 배양액을 저장하십시오.
            주 : 형질 감염에 사용되는 CRISPR 플라스미드는 탈 이온수에 용해시켜야하며, 농도는 분광 광도계 또는 다른 방법으로 결정해야한다.
    2. 기생충 형질 감염.
      참고 : D10 배지에서 HFF 세포에서 T. gondii 를 배양하는 일반적인 방법은 이전에 기술되어있다.
      1. transfection 2 ~ 3 일 전에, 70 - 80 % HFF 세포를 달성하기 위해 합류 HFF 세포 monolayer (타입 1 변종에 대해 0.5-1 X 106, 다른 변종에 대해 1-2 X 106)를 포함하는 T25 플라스크에 충분한 기생충을 추가 2-3 일 이내에 용해.
      2. ExamiHFF 단일 층이 기생충에 의해 70-80 % 용해 될 때 역상 위상차 현미경 하에서 배양한다. 부드럽게 피펫으로 매체를 제거하고 5 ML cytomix 버퍼 (120 MM KCl, 0.15 MM CaCl 2 , 10 MM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 산도 = 7.6, 25 MM HEPES, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, pH = 7.6)에 용해시켰다. 이어서, 기생충 용액을 15 mL 원뿔 튜브로 옮긴다.
        참고 : 보충 파일 1의 프로토콜 4.2.2를 참조하십시오.
      3. 기생충 솔루션을 10 ML 주사기 / 22 G 무딘 바늘 2-3 X를 통과하십시오.
      4. HFF 세포와 세포 파편을 제거하는 3 μm의 구멍 크기 멤브레인을 통해 새로운 원뿔 튜브에 기생충 솔루션을 필터링합니다.
      5. 400xg에서 10 분간 원심 분리하여 여과 된 기생충을 펠렛으로 펠렛.
      6. 뜨는을 붓고 10 ML cytomix 버퍼와 pelleted 기생충을 resuspend, det 10 μL 나누어지는 걸릴hemocytometer로 기생충 농도를 결정하고 나머지는 400xg에서 10 분 동안 원심 분리하여 펠렛을 만든다.
      7. 뜨는을 제거하고 4 x 10 7 기생충 / ML의 밀도를 얻기 위해 cytomix 버퍼에서 펠렛을 resuspend.
      8. 4mm 간격의 큐벳에서 7.5μg CRISPR 플라스미드, 6μL ATP (100mM), 6μL 글루타티온 (GSH) (250mM)과 함께 250-300 μL 기생충 용액 (1-1.3 x 107 기생충)을 혼합합니다.
      9. 기생충을 electroporate 35 . CRISP 플라스미드가 CRISP 플라스미드를 표적으로하는 UPRT 와 같은 다른 곳을 표적으로하는 음성 대조군으로서 별도의 전기 천공을 포함시킨다.
        참고 : 일렉트로 포 레이션 설정은 장치에 따라 다릅니다. 재료에 나열된 일렉트로 포터는 4mm 간격의 큐벳을 사용합니다. 다음 프로토콜을 권장합니다 : 1,700 V, 펄스 길이 176 μs, 100 ms 간격으로 2 펄스.
    3. sinefungin resista의 주파수를 결정하십시오CRISPR 타겟팅 후 nce.
      1. 4.2에서 transfection을 수행하는 시간까지 합류되도록 electroporation 전에 24 - 웰 플레이트 3-4 d에 배치 coverslips에 종자 HFF 세포.
        1. 하나의 합류 T25 플라스크에서 HFF 세포를 Trypsinize 후 연속 12 ML D10 매체를 추가하고 잘 섞는다.
        2. 24 잘 접시와 각 잘 500 μL HFF 세포 솔루션의 각 우물에 coverslip을 추가합니다. 세포가 합류까지 성장할 수 있도록 3 4 D 37 판을 품어.
          참고 : 하나의 T25 flasks에서 세포는 하나의 24 - 웰 플레이트를 시드 정도로 충분합니다.
        3. 합류 HFF 세포와 함께 뿌리 coverslip을 포함하는 24 잘 접시의 하나의 우물에 단계 4.2.9에서 electroporated 기생충 솔루션 50 μL를 추가합니다. 합류 HFF 세포와 시드 T25 플라스크에 electroporated 기생충 솔루션의 나머지를 전송합니다.
      2. 형질 감염의 효율성을 평가하십시오.
        1. 24 시간 동안 24 웰 플레이트에서 세포를 성장시킨다.그리고 immunofluorescent 분석 (IFA)에 의해 Cas9 - GFP의 표현을 확인 500 μl 4 % 포름 알데히드로 세포 (호스트 세포와 기생충)을 고정.
        2. 총 기생충을 표시하기 위해 항 -GFP 항체 및 Toxoplasma 특이 항체 (예 : 항 -TgALD)로 세포를 탐침하십시오. 권장 희석액은 항체 제품 표를 참조하십시오 (일반적으로 IFA에는 1 : 1,000으로 충분합니다). 항체가 비 접합 된 경우, 1 차 항체를 표지하기 위해 형광 염료와 결합 된 2 개의 다른 2 차 항체를 사용하십시오.
        3. 보조 형광 염료에 적합한 필터와 형광 현미경에 표시된 세포를 관찰. GFP 양성 기생충의 수를 전체 기생충의 수로 나누어 형질 감염 효율을 얻습니다.
          참고 : IFA에 사용되는 두 항체는 마우스 항 -GFP와 토끼 항 -TgALD의 조합을 사용하는 것과 같이 두 가지 다른 숙주 종에서 유래해야합니다.
      3. f를 결정하십시오.transfected 기생충에서 sinefungin 저항의 requency.
        1. T25 플라스크에서 배양 한 형질 감염된 기생충의 경우 자연 이탈까지 2-3 일 동안 성장시킵니다. 그런 다음 기생충을 수집하고 무딘 바늘이 세포 내 기생충을 방출하는 숙주 세포를 용해시키고 세공 크기가 3 μm 인 멤브레인을 통해 여과하여 정제합니다. hemocytometer로 기생충을 계수하여 밀도를 추정하십시오.
        2. 합병 된 HFF 세포를 뿌린 6 잘 접시에 정화 기생충을 추가 : 첫 번째 행 (3 우물), 200 기생충 / 잘 추가하고 일반 D10 매체 (2 ML / 우물)에서 그들을 성장; 두 번째 행을 위해, 5000 기생충 / 잘 추가하고 0.3 μm의 sinefungin을 포함하는 D10 매체에서 그들을 성장.
        3. 접시를 5 % CO 2 배양기에 넣고 37 ℃에서 8-10 일 동안 기생충을 성장시켜 플라크 형성을 방해하지 않도록하십시오. 70 % 에탄올 (2 ML / 우물)와 샘플을 고정하고 0.1 % 크리스탈 바이올렛 (2 ML / 음)와 monolayer를 얼룩. 시각화를 위해 우물을 물로 씻는다.기생충 성장에 의해 형성된 플라크 (클리어 존).
          참고 : 음수 컨트롤은 같은 방법으로 나란히 처리해야합니다.
      4. CRISPR에 의한 sinefungin 저항성의 비율을 계산하시오.
        1. 마약이없는 우물에서 플라크의 평균 수 (X)를 구하고 기생충 생존력을 X / 200로 계산하십시오. 다음과 같이 CRISPR에 의한 sinefungin 저항성의 비율을 계산하기 위해 sinefungin을 함유 한 우물에서 플라크의 평균 수 (Y)를 구한다.
          CRISPR 유도 저항 비율 = 200 × Y / (5000 × X × 트랜 스펙 션 효율)
          참고 : Transfection 효율은 4.3.2에서 얻습니다.
    4. CRISPR / Cas9에 의해 유도 된 indel 돌연변이 검사
      1. 37 ° C에서 2 일 동안 HFF 세포를 뿌린 T25 플라스크에서 4.2.9 절에서 electroporated 기생충을 성장 시키십시오. 그런 다음, 0.3 μm의 sinefungin (선택 매체를 포함하는 5 ML D10 매체로 매체를 대체).
        1. 내성균이 안정화 될 때까지 (부정적 대조군에서는 기생충 성장이없고 실험군에서는 강력한 기생충 성장으로 나타남) 적어도 3 회의 계대 동안 기생충을 선별 배지에 보관하십시오.
      2. 클론 균주를 얻기 위해 sinefungin 내성 풀을 서브 클론하십시오.
        1. 갓 기생충을 수집하고 3 μm 멤브레인 여과로 정제하고 150 μL D10 배지에서 합류 HFF 세포를 뿌린 96- 웰 플레이트로 서브 클론하십시오. 플레이트를 방해하지 않고 37 ℃에서 7-10 일 동안 CO2 배양기에서 서브 클로닝 배양 물을 성장시킨다.
          참고 : 프로토콜 4.4.2.1 주 파일 1을 참조하십시오.
      3. 거꾸로 한 위상차 현미경하에 96 웰 플레이트를 점검하여 단 하나의 플라크가 포함 된 우물을 찾으십시오. 그런 우물을 표시하고 연속적으로 피펫을 사용하여 HFF 세포와 씨 뿌린 24 잘 접시에 각 우물에서 세포를 전송하십시오.
      4. <웰에서 HFF 세포의 80-90 %가 lysed 때, 기생충 (약 500 μL)을 수확하고 변형을 유지하기 위해 새로운 우물에 50 μL 기생충 솔루션을 전달하십시오. 나머지 (약 450 μL)를 사용하여 PCR 증폭을위한 게놈 DNA를 추출하십시오.
        1. SNF r 클론에서 게놈 DNA를 분리하기 위해 1,000 xg에서 10 분 동안 기생충 (작은 양의 HFF 세포 오염은 허용 가능)을 펠렛 화합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)로 pelleted 기생충을 한 번 씻고 다시 펠렛. 상업용 키트를 사용하거나 끓여서 펠렛 세포에서 게놈 DNA를 분리합니다. 50-100 μL PBS에 Resuspend 기생충.
          참고 : 시퀀싱을 위해 SNR1 유전자 단편을 얻기 위해 PCR을 수행하십시오. 다음 프라이머를 사용하여 SNR1 유전자좌 2 를 증폭하십시오 : SNR1-Amp-Fw : 5'CCGACCACAA CAATTTTC 및 SNR1-Amp-Rv : 5'GACGTGATTCACTTTTTACACACACAC. 높은 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하십시오. 제어 목적으로 WT 유전자좌를 증폭시킵니다.
      5. 수행 t그는 20 μl 반응 볼륨과 PCR 및 다음 프로그램과 함께 실행 : 98 ° C 1 분, 98 ° C 10 초, 55 ° C 30 초 및 72 ° C 2.5 분, 다음 30 사이클 72 ℃에서 2 분 동안 최종 연장.
        참고 : 다음 프라이머를 사용하여 PCR 산물을 시퀀싱하십시오 : SNR1-Seq1 : 5'GCCACA TGCTTTAGC GTG, SNR1-Seq2 : 5 'TCC TCT CCA TCA CGG GTT GG, SNR1-Seq3 : 5'GCA AGA GCC GCG TGA CG , SNR1-Seq4 : 5 'CTC TCC CGC GGT CGA G, SNR1-Seq5 : 5'GCA CCG TCC GCA AGC 및 SNR1-Seq6 : 5 'CCG GAA GGT GAA TCG TTC TTC.
      6. 시퀀스 정렬 도구를 사용하여 sinefungin 저항성 돌연변이 체의 SNR1 유전자와 WT strain의 SNR1 유전자의 서열을 비교하십시오.
        주 : 유전 적 보완 또는 형질 전환 균주 건설을위한 SNR1 유전자좌의 음성 선택 활용에 대한 자세한 내용은 Supplementary File 2 Protocol 5를 참조하십시오.

Representative Results

이 기사에서는 약물 내성을 일으키는 유전자를 확인하기 위해 연속적으로 사용할 수있는 몇 가지 방법에 대해 자세히 설명합니다 ( 그림 1 ). ME49-FUDR r X VAND-SNF r 십자가의 24 자손은 의정서 1에 기술 된대로 sinefungin에 대한 저항성에 대한 평가를 받았다. 유전지도와 자손의 SNF r 표현형을 이용하여 QTL 스캔을 R / qtl - 프로토콜 2 ( 그림 2 ). 이것은 대략 1 Mbp에 걸친 염색체 IX에 하나의 중요한 피크를 초래했습니다. 인과 돌연변이가있는 것은이 지역에있다.

원인 돌연변이를 확인하기 위해 Bowtie2 - Protocol 3.1을 사용하여 자손에서 WGS 읽기를 VAND-SNF 참조 게놈에 정렬하고, VarScan mpileup2snp - Protocol 3.2를 사용하여 SNP를 호출했으며 VAND 게놈의 QTL 위치를 MUMmer- Protoc3.3. QTL 유전자좌 내의 자손 SNP를 추출하여 SNF r 자손이 SNP를 가지고 SNF가없는 패턴을 찾았는데, 이것은 자손 SNP가 VAND-SNF 레퍼런스 게놈과 비교하여 얻어 졌기 때문에 가능하다 ( 그림 3 ) . 하나의 SNP만이 SNR1 이라는 추정 아미노산 수송 체 유전자에서 조기 종료 코돈을 초래하는이 패턴과 일치했다.

SNR1 이 SNF r 내성 유전자임을 확인하는 것은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 수행 하였다. T. gondii 유전자 편집을 위해 조작 된 새로운 CRISPR / Cas9 플라스미드는 프로토콜 4 ( 그림 4A )에서 확인 된 SNF r 돌연변이 근처의 SNR1 유전자를 표적으로하는 gRNA를 포함하도록 만들어졌다. SNR1 표적화 CRISPR / Cas9 플라스미드를 SNFs WT 기생충 균주 내로 전기 천공시키고, 저항성 돌연변이 체를 컬트0.3 μM sinefungin에서 측정 하였다. CRISPR / Cas9 플라스미드를 표적으로하는 UPRT로 전기 천공 시켰을 때 어떠한 SNF r 기생충도 수득되지 않았다. 몇몇 SNF r CRISPR 돌연변이 체를 클로닝하고 SNR 1 gRNA 표적 주위의 영역을 서열 분석 하였다. 각각의 돌연변이는 SNR1 유전자의 암호화 서열을 파괴하는 indel을 가지고있다 ( 그림 4B ). 이 방법은 NHEJ ( 그림 5) 또는 HR ( 그림 6 ) - 보충 파일 2 를 통해 SNR1 유전자좌에 표적 생성물 을 삽입하는 데에도 사용할 수 있습니다.

그림 1
그림 1 : 프로토콜에 설명 된 실험을위한 도식 워크 플로. ME49-FUDR r X VAND-SNF r 십자 표시를 사용하여 SNF r 유전자를 확인하고 확인하는 주요 단계는 t에 요약 된 적절한 프로토콜그의 기사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : SN / R 표현형에서 QTL 스캔을 실행하기위한 R / qtl 명령. 프로토콜 2에서 설명 된 명령은 qtl 패키지를 사용하여 R로 실행됩니다. 대표적인 명령과 플롯이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 인과 SNP의 위치. 자손 WGS 읽기는 Bowtie 2를 사용하여 VAND-SNF 참조 게놈에 맞추어졌고, VarScan과 함께 SNP가 호출되었으며, MUMmer로 식별되는 VAND QTL 유전자좌. QTL 유전자좌 내에 위치한 SNP를 스프레드 시트로 가져와 인과 관계의 SNP를 확인했다. SNF r 자손 (황색), SNF s 자손 (녹색), SNF r SNP (적색) ( 데이터 파일 3 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : SNR1 을 SNF r 유전자로 확인 CRISPR / Cas9를 사용. ( A ) CRISPR / Cas9는 SNR1 유전자좌에서 indel 돌연변이 (녹색)를 유도했다. ( B ) 두 개의 다른 SNR1 특이 CRISPR 플라스미드 (각각 C5 및 C6)에 의해 야기 된 SNR1의 대표 돌연변이. RH는 WT strain이고 C5와 C6은 SNF r 돌연변이이다. (B는 참고 문헌s = "xref"> 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. CRISPR / Cas9를 이용한 삽입 돌연변이 유발. ( A ) CRISPR / Cas9 매개 사이트 - 특정 통합에 의해 SNR1 유전자좌에 보완 또는 형질 전환 유전자 삽입. 삽입 된 DHFR * 미니 유전자의 2 가지 가능한 배향 및 동정을 위해 사용 된 프라이머, F1 / 2 및 R1 / 2는 진단용 PCR에서 사용되는 올리고의 프라이밍 위치를 나타낸다. ( B ) 한 snr1 :: DHFR * 클론, RH의 진단 PCR은 WT 컨트롤로 사용됩니다. GRA1p의 PCR은 게놈 DNA의 품질을 주형으로하는 대조군으로 포함됩니다. 별표는 비특이적 인 띠가있는 레인을 나타낸다 (그림 5B는 참조 번호ce 2 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6
도표 6 : CRISPR / Cas9를 사용하여 유전자 녹아웃. T. gondii의 CRISPR / Cas9 매개 동종 유전자 대체를위한 고전적인 디자인. 삽입 된 도입 유전자의 방향은이 경우 고정됩니다. F1 / R1, F2 / R2 및 F3 / R3은 진단용 PCR에 사용되는 올리고의 프라이밍 부위를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 파일 1 : ME49-FUDR r X VAND-SNF r 크로스 파일 f또는 R / qtl, "csv"형식으로 사용하십시오. format = "csv"옵션으로 R / qtl에로드 할 수있는 하나의 .csv 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 파일 2 : (chrid txt, genotype txt, markerpos.txt, mname.txt, phenonames.txt 및 phenos.txt). ME49-FUDR r X VAND-SNF r R / qtl에서 사용하기위한 크로스 파일, "gary"형식. 6 개의 .txt 파일은 R / qtl에서 "gary"형식으로로드 할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 파일 3. SNF 전체에 Progeny SNP가있는 스프레드 시트 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1 : 추가 프로토콜 세부 사항. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2 : 프로토콜 5 - 유전 적 보완 또는 형질 전환 균주 건설을위한 SNR1 유전자 에서 음성 선택의 이용 . 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 결합되었을 때 T. gondii 에서 약제 내성 유전자를 확인하는 몇 가지 방법을 제시합니다. 두 가지는 특히 프로젝트에 필수적이었고, 상대적으로 노련한 QTL 매핑 방법과 최근에 개발 된 CRISPR / Cas9 유전자 편집 방법이었다. Lander와 Botstein은 1989 년에 영향력있는 논문을 발간하여 유전형 유전자좌와 표현형을 연관시키는 QTL 매핑을 시연했다. 최근에 Dounda와 Charpentier는 Streptococcus pyogenes 22 의 CRISPR / Cas9 편집 시스템을 T. gondii 13 , 17을 비롯한 여러 모델에서 신속하게 유전 도구로 채택했다고 설명했습니다. 두 방법 모두 유용했는데 QTL 매핑은 WGS 기반 SNP 검출을 사용하여 궁극적으로 확인 된 약물 내성 변이를 포함하는 유전자좌를 정의하고 CRISPR / Cas9 편집은 SNR1 이 sinefungin 약물 내성 유전자임을 확인합니다.

ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross 8 은 독성 표현형 19 을 조사하기 위해 원래 개발되었지만, 부모의 계통도 VAND 부모에서 sinefungin 내성 인 인과 관계 유전자가 알려지지 않은 부가적인 표현형의 차이를 가져왔다. 이것은 부모의 추가적인 표현형 차이가 관찰 될 때 재사용 될 수 있다는 점에서 십자가의 한 가지 이점을 강조합니다. 이것은 다른 Toxoplasma 십자가 유형 2 x 3 형의 경우였으며, 독성에 관여하는 여러 유전자가 여러 표현형 37 , 38 , 39 , 40 을 매핑하여 발견되었습니다. 지금까지 4 가지 T. gondii 십자가가 기술되어 표현형에 관여하는 유전자를지도 화했다ss = "xref"> 8 , 37 , 41 , 42 모두 유전 적 기초가 알려지지 않은 새로운 표현형을 매핑 할 재사용 가능성이있다. 이 줄을 따라 알려진 세계적인 유전 적 다양성을 나타내는 62 개의 T. gondii 균주에 대한 게놈이 서열화되었다. 흥미로운 표현형이 다른 균주를위한 새로운 풀을이 풀에서 만들 수 있습니다. QTL 매핑의 장점을 강조한 결과, 십자가를 생성하는 것이 사소한 일이 아니라고 말할 필요가 있습니다. 인과 관계 유전자를 확인하는 데 사용할 수있는 다른 방법이 있습니다. 하나의 강력한 기술은 화학적 돌연변이 유발을 사용하여 표현형을 선별 할 수있는 돌연변이를 만듭니다. 원인 유전자를 찾기 위해, 돌연변이 체는 cosmid 라이브러리 44 로 보완 될 수 있거나 유전체 resequencing 방법은 원인 돌연변이 45 를 찾는 데 사용될 수 있습니다. 미주리이것에 관해서는, Coleman et al. 및 Walwyn et al. 이러한 접근 방식의 개요 46 , 47 .

원인이되는 SNF 돌연변이 (Protocol 2와 3)의 확인을 유도하는 많은 단계는 학문적 목적으로 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어로 수행되는 계산 방법에 의존합니다. 각 단계에 대한 자세한 명령이 제공되며 적절한 파일과 함께 실행하면 사용자가 원인 SNF r SNP를 찾는 데 필요한 데이터 세트를 다시 만들 수 있습니다. 명령의 일부 구문은 사용자 기본 설정으로 수정할 수있는 파일 이름 또는 디렉토리 구조 ($ PATH)를 참조합니다. 여기에 제시된 명령이 QTL 분석 및 WGS 기반 SNP 식별을 통해 교차 분석을 할 수있는 방법을 확실히 피할 수는 없지만이 기사에서 설명한 실험을 반복 할 수있을만큼 포괄적이며 사용자가 m 이러한 접근 방식이 단계적으로 활용되는 방식을 잘 알고 있습니다.

QTL 매핑 및 WGS 서열 기반 SNP 검출이 후보 SNF r 유전자를 식별하기에 충분했지만, 약물 저항성에서 그 역할을 확인하기 위해서는 추가적인 실험이 필요하다. 이것은 CRISPR / Cas9 유전자 편집을 사용하여 달성 할 수있는 유전자 파괴 또는 녹아웃 기술을 통해 설득력있게 나타낼 수 있습니다. CRISPR / Cas9를 사용하여 indel 돌연변이를 생성하거나 T. gondii 의 표적 유전자에 형질 전환 작 제물을 삽입하는 상세한 방법이 제시되어있다. CRISPR / Cas9가 제공하는 표적 특이성은 전통적인 방법에 비해 유전자 편집의 효율성을 증가시킨다. 또한 이것은 효율적으로 증가하여 이전에 수정하기 어려운 유전 연구를 위해 비 실험실 변형 균주를 사용할 수있게되었습니다. 초기 단계에 있지만, CRISPR / Cas9는 이미 유전자 손상을 일으키는 데 사용되어왔다유용한 유전자가 될 것으로 기대되는 T. gondii의 유전자 녹아웃 16 , 19 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 를 만든다 . 미래의 많은 다른 연구들에 대해서.

SNR1 불 활성화가 sinefungin 내성을 일으킨다는 발견은 SNR1 유전자좌가 유전자 도입 또는 유전 적 보완을위한 유망한 장소가되게한다. SNR1 유전자좌로 도입 유전자의 통합을 유도하기 위해 CRISPR / Cas9 매개 유전자 타겟팅을 사용하는 성공을 극대화하기 위해서는 다음 측면을 고려해야한다빨간색 실험 디자인 중. 첫째, 변형 마커의 효율을 높이기 위해 형질 전환 구조체에 선택 마커를 포함시키는 것이 좋습니다. 선별 마커가 포함되면 양성 및 음성 선발을 모두 사용할 수있어 이중 선별 된 기생충의 거의 100 %가 SNR1 유전자좌에 통합 된 GOI로 형질 전환됩니다. 대조적으로, 형질 전환 구조물이 추가적인 선택 가능한 형질을 포함하지 않고 SNR1 유전자좌에서 음성 선택에 의존하는 경우 성공적인 형질 전환의 효율은 크게 CRISPR 플라스미드 및 형질 전환 구조물의 동시 형질 전환 효율에 달려있다.

둘째, CRISPR / Cas9 매개 된 부위가 아닌 상 동성 DNA 단편의 특이 적 통합이 보체 및 형질 전환에 자주 사용 되더라도 삽입 방향은 양 방향이 가능할 경우 보장 할 수 없다는 점에 유의해야한다. 이것은 프로포즈를 일으킬 수있다.몇 가지 응용 프로그램에 ms. 예를 들어, 유전자 대립 유전자가 다른 돌연변이를 보완하기 위해서는 모든 대립 유전자가 같은 방향으로 삽입되도록하는 것이 어렵고, 방향의 불일치로 인해 표현의 차이가 생길 수 있습니다. 이러한 유형의 적용을 위해서는 SNR1 유전자좌와 상 동성이있는 서열을 가진 DNA 구조체가 권장되며 이는 적절한 통합 방향을 유도 할 것이다 ( 그림 6 ).

셋째, 형질 감염 중에 CRISPR 플라스미드와 형질 전환 DNA 분자 사이의 비율은 성공적 형질 전환 균주 건설에 중요합니다. 이 비율은 선택 전략에 따라 조정해야합니다. 다음 지침을 권장합니다 : 1) 유전자 변형 구조체에 약물 내성 마커가 포함되어 있고 해당 약물이 유전자 변형 기생충 생성에 사용 된 유일한 선택 인 경우, sinefungin을 사용하지 않는 경우, 유전자 변형 구조물과 CRISPR plasm 사이의 권장 몰비id는 1 : 5입니다. 이 경우 더 많은 CRISPR 플라스미드를 사용하면 트랜스 제닉 구조물을받는 기생충도 CRISPR 플라스미드를 받게 될 가능성이 높아 지므로 약물 내성 기생충은 CRISPR 표적화 사이트에 마커를 삽입 할 가능성이 더 높습니다. 그 비율이 역전된다면 형질 전환 체를받는 대부분의 기생충은 CRISPR 플라스미드를 얻지 못할 것이다. 결과적으로, 대다수의 약물 내성 기생충은 CRISPR / CAS9 매개 부위 - 특이 적 삽입과 관련이없는 무작위 적 통합을 통해 트랜스 제닉 구조물을 얻는다. 2) 유전자 변형 구조체가 약물 내성 마커를 포함하고 해당 약물이 유전자 변형 기생충을 선택하기 위해 sinefungin과 함께 사용되는 경우, 유전자 변형 구조체와 CRISPR 플라스미드 사이의 제안 된 몰비는 1 : 1이다. 이 전략은 형질 전환 균주 건설의 최고 효율을 제공합니다. 3) 형질 전환 체가 선택 가능한 생산자를 포함하지 않고, 음성 선택에 의지 할 경우트랜스 제닉 기생충을 얻기 위해 sinefungin 단독으로, 트랜스 제닉 구조물과 CRISPR 플라스미드 사이에 제안 된 몰비는 5 : 1이다. 이 디자인의 이론적 근거는 위의 첫 번째 지침과 동일합니다. Protocol 5에서 pyrimethamine과 sinefungin이 모두 선택 되었기 때문에 DHFR * mini 유전자와 CRISPR plasmid를 표적으로하는 SNR1 사이의 비율은 1 : 1로 설정되었습니다.

종합 해 보면, 여기에 설명 된 방법은 SNR1 2 를 식별 한 원래의 출판물에서 전달할 수 없었던 수준의 세부 사항을 가지고 있습니다. 이러한 프로토콜; 특히, 명령 줄 구문, 활용되는 프로그램의 순차적 레이아웃 및 CRISPR / Cas9의 사용은 표현형을 담당하는 새로운 유전자를 식별하기위한 미래의 노력을 지원해야합니다.

Acknowledgments

우리는이 프로토콜이 기초를 이루고있는 원 발행에 기여한 L. David Sibley와 Asis Khan에게 감사 드린다. 이 연구는 National Institutes of Health의 보조금 AI108721에 의해 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T25 flasks Corning 430639
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) ATCC SCRC-1041
T. gondii ME49 strain ATCC 50840
T. gondiiVAND strain ATCC PRA-344
DMEM (No Sodium Bicarbonate) Life Sciences 12800017
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
Fetal Bovine Serum (FBS) Premium Grade VWR International 97068-085
L-Glutamine  200 mM Sigma Aldrich G7513
Gentamicin (10 mg/mL) Life Technologies  15710064
Cell Scraper for Flasks VWR International 10062-904
Syringe 10 mL BD 309604
Blunt needles 22 G x 1" BRICO Products BN2210
Nuclepore Filter 3.0 µm, 25 mm GE Healthcare 110612
Swin-Lok Filter Holder 25 mm GE Healthcare 420200
Hemacytometer Propper MFG 90001
Sinefungin Enzo Life Sciences 380-070-M001
The R Foundation https://www.r-project.org/
J/qtl The Churchill Group http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml
Bowtie2 John Hopkins University http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
NCBI SRA Toolkit NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc
SAMtools Wellcome Trust Sanger Institute http://www.htslib.org/
VarScan Washington University, St Louis http://varscan.sourceforge.net/
MUMmer JCVI & Univ Hamburg http://mummer.sourceforge.net/
pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT Addgene Plasmid #54467 T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene
pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 Addgene Plasmid #59855 T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene
pUPRT::DHFR-D Addgene Plasmid #58528 Template for DHFR* mini gene
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit  New England Biolabs E0552S
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000
LB Broth Fisher Scientific DF0446-07-5
Potassium chloride Sigma Aldrich P9541
Calcium chloride Sigma Aldrich 746495
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P5504
EDTA Sigma Aldrich E5134
Magnesium chloride Sigma Aldrich M1028
Adenosine triposhpate (ATP) Sigma Aldrich A6419
L-glutathione (GSH) Sigma Aldrich G4251
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0002
Electroporation Cuvette  4 mm Harvard Apparatus 45-0126
Crytal Violet Alfa Aesar B21932-14
6-well TC plate Corning 353046
24-well TC plate Corning 353935
Cover glass 12 mm round VWR International 89015-724
96-well TC plate Corning 353075
Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) New England Biolabs E5510S
Q5 High-Fidelity Polymerase  New England Biolabs M0491S
Pyrimethamine TCI AMERICA P2037-1G Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites - see Protocol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dubey, J. P. The history of Toxoplasma gondii--the first 100 years. J Eukaryot Microbiol. 55 (6), 467-475 (2008).
  2. Behnke, M. S., Khan, A., Sibley, L. D. Genetic Mapping Reveals that Sinefungin Resistance in Toxoplasma gondii Is Controlled by a Putative Amino Acid Transporter Locus That Can Be Used as a Negative Selectable Marker. Eukaryot Cell. 14 (2), 140-148 (2015).
  3. Dubey, J. P. History of the discovery of the life cycle of Toxoplasma gondii. Int J Parasitol. 39 (8), 877-882 (2009).
  4. Pfefferkorn, L. C., Pfefferkorn, E. R. Toxoplasma gondii: genetic recombination between drug resistant mutants. Exp Parasitol. 50 (3), 305-316 (1980).
  5. Donald, R. G., Roos, D. S. Insertional mutagenesis and marker rescue in a protozoan parasite: cloning of the uracil phosphoribosyltransferase locus from Toxoplasma gondii. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5749-5753 (1995).
  6. Sullivan, W. J. Jr Insertional tagging of at least two loci associated with resistance to adenine arabinoside in Toxoplasma gondii, and cloning of the adenosine kinase locus. Mol Biochem Parasitol. 103 (1), 1-14 (1999).
  7. Khan, A. Composite genome map and recombination parameters derived from three archetypal lineages of Toxoplasma gondii. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2980-2992 (2005).
  8. Khan, A. NextGen sequencing reveals short double crossovers contribute disproportionately to genetic diversity in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15 (1), 1168 (2014).
  9. Shaik, J. S., Khan, A., Beverley, S. M., Sibley, L. REDHORSE-REcombination and Double crossover detection in Haploid Organisms using next-geneRation SEquencing data. BMC Genomics. 16 (1), 133 (2015).
  10. Arends, D., Prins, P., Jansen, R. C., Broman, K. W. R/qtl: high-throughput multiple QTL mapping. Bioinformatics. 26 (23), 2990-2992 (2010).
  11. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  12. Koboldt, D. C. VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing. Genome Res. 22 (3), 568-576 (2012).
  13. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient gene disruption in diverse strains of Toxoplasma gondii using CRISPR/CAS9. MBio. 5 (3), e01114 (2014).
  14. Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining. Eukaryot Cell. 8 (4), 520-529 (2009).
  15. Huynh, M. H., Carruthers, V. B. Tagging of endogenous genes in a Toxoplasma gondii strain lacking Ku80. Eukaryot Cell. 8 (4), 530-539 (2009).
  16. Wang, J. L. The Past, Present, and Future of Genetic Manipulation in Toxoplasma gondii. Trends Parasitol. , (2016).
  17. Sidik, S. M., Hackett, C. G., Tran, F., Westwood, N. J., Lourido, S. Efficient genome engineering of Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. PLoS One. 9 (6), e100450 (2014).
  18. Sugi, T., Kato, K., Weiss, L. M. An improved method for introducing site-directed point mutation into the Toxoplasma gondii genome using CRISPR/Cas9. Parasitol Int. , (2016).
  19. Behnke, M. S. Rhoptry Proteins ROP5 and ROP18 Are Major Murine Virulence Factors in Genetically Divergent South American Strains of Toxoplasma gondii. PLoS Genet. 11 (8), e1005434 (2015).
  20. Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
  21. Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
  22. Jinek, M. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  23. Cong, L. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  24. Mali, P. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  25. Jiang, F., Zhou, K., Ma, L., Gressel, S., Doudna, J. A. STRUCTURAL BIOLOGY. A Cas9-guide RNA complex preorganized for target DNA recognition. Science. 348 (6242), 1477-1481 (2015).
  26. Nishimasu, H. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  27. The R Project for Statistical Computing. , Available from: https://www.r-project.org (2016).
  28. Smith, R., Sheppard, K., DiPetrillo, K., Churchill, G. Quantitative trait locus analysis using J/qtl. Methods Mol Biol. 573, 175-188 (2009).
  29. The Churchill Group. , J/qtl. http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml (2013).
  30. Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  31. Kurtz, S. Versatile and open software for comparing large genomes. Genome Biol. 5 (2), (2004).
  32. Gajria, B. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36 (Database issue), D553-D556 (2008).
  33. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  34. Roos, D. S. Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii. Curr Top Microbiol Immunol. 219, 247-259 (1996).
  35. Soldati, D., Boothroyd, J. C. Transient transfection and expression in the obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. Science. 260 (5106), 349-352 (1993).
  36. Lander, E. S., Botstein, D. Mapping mendelian factors underlying quantitative traits using RFLP linkage maps. Genetics. 121 (1), 185-199 (1989).
  37. Saeij, J. P. Polymorphic secreted kinases are key virulence factors in toxoplasmosis. Science. 314 (5806), 1780-1783 (2006).
  38. Saeij, J. P. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  39. Rosowski, E. E. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  40. Reese, M. L., Zeiner, G. M., Saeij, J. P., Boothroyd, J. C., Boyle, J. P. Polymorphic family of injected pseudokinases is paramount in Toxoplasma virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9625-9630 (2011).
  41. Taylor, S. A secreted serine-threonine kinase determines virulence in the eukaryotic pathogen Toxoplasma gondii. Science. 314 (5806), 1776-1780 (2006).
  42. Behnke, M. S. Virulence differences in Toxoplasma mediated by amplification of a family of polymorphic pseudokinases. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (23), 9631-9636 (2011).
  43. Lorenzi, H. Local admixture of amplified and diversified secreted pathogenesis determinants shapes mosaic Toxoplasma gondii genomes. Nat Commun. 7, 10147 (2016).
  44. Gubbels, M. J. Forward genetic analysis of the apicomplexan cell division cycle in Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 4 (2), e36 (2008).
  45. Farrell, A. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  46. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), (2012).
  47. Walwyn, O. Forward genetics screens using macrophages to identify Toxoplasma gondii genes important for resistance to IFN-gamma-dependent cell autonomous immunity. J Vis Exp. (97), (2015).
  48. Rugarabamu, G., Marq, J. B., Guerin, A., Lebrun, M., Soldati-Favre, D. Distinct contribution of Toxoplasma gondii rhomboid proteases 4 and 5 to micronemal protein protease 1 activity during invasion. Mol Microbiol. 97 (2), 244-262 (2015).
  49. Varberg, J. M., Padgett, L. R., Arrizabalaga, G., Sullivan, W. J. Jr TgATAT-Mediated alpha-Tubulin Acetylation Is Required for Division of the Protozoan Parasite Toxoplasma gondii. mSphere. 1 (1), (2016).
  50. Zheng, J., Jia, H., Zheng, Y. Knockout of leucine aminopeptidase in Toxoplasma gondii using CRISPR/Cas9. Int J Parasitol. 45 (2-3), 141-148 (2015).
  51. Long, S., Wang, Q., Sibley, L. D. Analysis of Noncanonical Calcium-Dependent Protein Kinases in Toxoplasma gondii by Targeted Gene Deletion Using CRISPR/Cas9. Infect Immun. 84 (5), 1262-1273 (2016).
  52. Wang, K. Identification of Novel O-Linked Glycosylated Toxoplasma Proteins by Vicia villosa Lectin Chromatography. PLoS One. 11 (3), e0150561 (2016).
  53. Yang, M., Zheng, J., Jia, H., Song, M. Functional characterization of X-prolyl aminopeptidase from Toxoplasma gondii. Parasitology. , 1-7 (2016).
  54. Zhang, W. Analysis of the virulence determination mechanisms in a local Toxoplasma strain (T.gHB1) isolated from central China. Parasitol Res. , (2016).

Tags

(QTL)지도 작성 CRISPR 가이드 RNA (gRNA) sinefungin 단일 염기 다형성 (SNP) 유전 적 교차 전체 게놈 시퀀싱 (WGS)
약물 저항 유전자를 확인하기위한 QTL 매핑 및 CRISPR / Cas9 편집<em&gt; Toxoplasma gondii</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shen, B., Powell, R. H., Behnke, M.More

Shen, B., Powell, R. H., Behnke, M. S. QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (124), e55185, doi:10.3791/55185 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter