Summary
详细介绍了如何使用基于全基因组序列的遗传图谱进行QTL定位，以鉴定弓形虫中的药物抗性基因，以及如何使用有效编辑基因组靶标的CRISPR / Cas9系统进行验证，在这种情况下耐药基因。
Abstract
科学知识与现有的技术和方法有着固有的联系。本文将介绍两种允许鉴别和鉴定弓形虫弓形虫弓形虫药物抗性基因的方法，该方法采用基于全基因组序列（WGS）的遗传图谱进行定量性状位点（QTL）定位及其方法的集群定期间隔短回归重复（CRISPR）/基于Cas9的基因编辑。 QTL定位的方法可以测试基因组区域和表型之间是否存在相关性。需要两个数据集来进行QTL扫描，这是基于在该交叉的每个后代中评估的重组交叉的后代和可量化表型的遗传图谱。然后将这些数据集格式化为与生成QTL扫描以识别与表型相关的显着位点的R / qtl软件兼容。虽然这可以大大缩小搜索范围可能的候选人的遗传，QTL跨越包含许多基因的区域，需要识别因果基因。确定后代的WGS对于鉴定基因水平的致病药物耐药突变是至关重要的。一旦鉴定，候选突变可以通过药物敏感寄生虫的遗传操作来验证。遗传修饰弓形虫最简单有效的方法是CRISPR / Cas9系统。该系统由仅在单个质粒上编码的两个组分组成，包含与基因组靶标互补的20bp序列的单个引导RNA（gRNA）和在靶标上产生双链DNA断裂（DSB）的Cas9内切核酸酶，其修复允许插入或删除断点位置周围的序列。本文提供详细的协议，使用基于CRISPR / Cas9的基因组编辑工具来验证负责丝氨酸蛋白酶抗性的基因并构建转基因寄生虫。
Introduction
宿主范围决定了寄生虫的流行程度。一些寄生虫具有非常具体的宿主要求，限制了它们被发现的区域，另一些是通才。一种这样的通才是弓形虫（ 弓形虫） 。这种寄生虫在世界各地被发现，因为它可以感染所有哺乳动物和许多鸟类。人类也很易受感染，估计全球大约有1/3的人口已被感染。幸运的是，强大的免疫反应通常控制寄生虫的生长，但是在免疫系统受损的情况下，寄生虫可以不加控制地生长并引起疾病，通常是脑炎。此外，如果先前未感染的妇女在怀孕期间感染，这种寄生虫可能会导致先天性疾病，因为它们缺乏免疫记忆，以迅速限制寄生虫的传播。另外，眼睛弓形体病的负担可导致视力丧失1 。对于这些reasons 弓形虫已经成为研究的焦点，由于为研究开发了许多分子方法，Apicomplexan寄生虫的模型。这里将讨论的两种方法是定量性状位点（QTL）映射和聚类定期间隔短回归重复（CRISPR）/ Cas9基因编辑。 QTL定位和CRISPR / Cas9编辑分别是以前研究中使用的正向和反向遗传方法，用于鉴定和/或表征弓形虫毒力基因。在这里，组合这些方法以鉴定和确认正弦蛋白抗性（SNF r ）基因，TgME49_290860及其直系同源物（注释为SNR1 ） 2的功能 。
虽然弓形虫可以感染多种中间宿主，但它必须通过并感染小肠上皮细胞以完成生命周期。猫是寄生虫的最终寄主产生外部阶段，并通过减数分裂进行遗传重组。进行QTL研究必须创建一个遗传交叉，而在弓形虫的情况下，这就意味着通过猫的两种不同的寄生虫种类，通过猫来表现出不同的寄生虫种类，即亲本污渍，以产生重组子代3 。在喂养猫之前，使亲本菌株对分离的药物具有抗性，以通过后代4的双重药物选择来更有效地鉴定重组体。为此，在弓形虫中使用了三种药物;尿嘧啶磷酸核糖转移酶（ UPRT ）为抗性基因5的氟脱氧核糖（FUDR），腺苷激酶（ AK ）为抗性基因6的阿糖胞苷（ARA）和抗性基因未知的正辛宁（SNF） 7 。几个遗传十字架已经对于弓形虫而言 ，仅使用全基因组测序（WGS） 8对ME49-FUDR r X VAND-SNF r交叉的24个后代进行基因分型。这使得通过使用该交叉作图和鉴定SNF抗性基因的可能性，因为通过药物敏感性VAND（VAND-SNF s ）株的化学诱变使VAND亲本被制成正辛宁抗性，并且使用VAND- SNF s菌株因此允许鉴定后代WGS和VAND-SNF参考基因组之间的所有多态性，包括遗传的父母VAND-SNF r突变，其使一些后代正辛酸抗性。
为了识别SNF r后代中的因果单核苷酸多态性（SNP），可以使用几种基于计算的开源资源来分析数据。为了创建ME49-FUDR r X VAND-SNF r通过REDHORSE软件套件9开发，使用父母和子代的WGS比对来准确检测基因交换的基因组位置。然后可以将该映射信息与表型数据（后代中的SNF r ）组合以格式化与R统计编程软件中的“qtl”包10兼容的数据集，其中可以运行QTL扫描以显示与表型。为了鉴定位于QTL基因座内的因果SNP，使用Bowtie 2比对程序11可以使用VarScan mpileup2snp变体呼叫者程序12来调用SNP，从而使后代的WGS读数可以单独对准正链霉素敏感性VAND基因组。使用这些SNP，然后可以扫描QTL基因座，存在于SNF r中但不存在的多态性在SNF 的后代。利用在基因编码区域鉴定的因子SNP，可以在SNF s株中进行候选SNF r基因的遗传修饰，以验证耐药性。
CRISPR / Cas9基因组编辑系统最近在Toxoplasma 13中成立，其中增加了用于探索这种寄生虫的复杂生物学的重要工具，特别是用于非实验室适应菌株的遗传研究。由于WT 弓形体细胞中非活性的非同源末端连接（NHEJ）活性，靶基因组修饰难以实现，因为外源引入的DNA以极高的频率14随机整合到基因组中。为了增加基因座特异性修饰的成功率，已经采用不同的方法来提高同源重组的效率和/或降低the NHEJ活动15,16 。其中一种方法是CRISPR / Cas9系统。与其他方法相比，CRISPR / Cas9系统在引入特定于站点的修改方面效率高，易于设计13,17,18 。此外，它可以用于任何弓形体，不需要额外修改寄生虫13,19。
CRISPR / Cas9系统起源于化脓性链球菌的适应性免疫系统，其用于捍卫移植遗传因子（如噬菌体20,21,22）的入侵。该系统利用RNA引导的DNA核酸内切酶Cas9将双链DNA断裂（DSB）引入目标，随后repa由容易出错的NHEJ通过短的indel突变来灭活靶基因，或通过同源性定向重组来改变目标基因座，如同设计的23,24 。靶特异性由称为单导向RNA（gRNA）的小RNA分子确定，其包含与靶DNA22具有100％同源性的单独设计的20nt序列。 gRNA分子还含有Cas9识别的鉴定指导核酸酶到靶位点，其中包括一个特殊的Protospacer相邻基序（PAM，序列为'NGG'） 25,26 。因此，gRNA分子和PAM序列共同作用来确定基因组中的Cas9切割位点。人们可以很容易地将gRNA序列改变成不同的位点进行切割。
当CRISPR / Cas9系统首次在Toxop开发时使用表达Cas9核酸酶和gRNA分子的单个质粒的拉斯马引导DSB在靶向位点13,17。已经表明，CRISPR / Cas9系统不仅通过同源重组，而且外源DNA的非同源整合，大大增加了位点特异性基因组修饰的效率。它在含有NHEJ活性的野生型菌株中进行。因此，该系统可用于基本上任何弓形体菌株进行有效的基因组编辑。在典型的实验中，目标特异性CRISPR质粒和用于修饰靶标的DNA片段共转染入寄生虫。如果用于修饰靶标的DNA片段含有与靶基因座的同源序列，则可以使用同源重组来修复由CRISPR / Cas9引入的DSB，以允许目标物的精确修饰。另一方面，如果intDNA片段不含同源序列，仍可以整合入CRISPR / Cas9靶向位点。后者通常用于通过插入选择性标记来破坏基因，或者在允许阴性选择的位点上补体突变体13 。这里的SNR1基因座作为一个例子来说明CRISPR / Cas9如何用于基因破坏和转基因寄生虫的产生。
Protocol
1.评估ME49-FUDR r x VAND-SNF r Cross后代中的SNF r
注意： 弓形虫是一种专性细胞内寄生虫，速殖子阶段在组织培养中容易生长。
- 为了生长弓形虫寄生虫，将它们保持在汇合的人类毛皮成纤维细胞（HFF）单层培养物中，该培养基用补充有10％胎牛血清（FBS）（D10培养基）的Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）培养基（37℃）接种到T25烧瓶中C和5％CO 2 。
注：请参见附录1中的协议1.1注释。 - 为了测试个体后代克隆的抗丝氨酸抗性，在T25 HFF培养瓶中将每个克隆培养至高寄生虫密度2-3天，直到大部分寄生虫开始裂解宿主细胞。
- 用细胞刮刀刮除单层，并通过10 mL注射器/ 22 G钝针将寄生虫溶液通过2-3x to裂解宿主细胞释放寄生虫。该溶液可以拉回到注射器中用于多个针通道。
- 通过孔径为3μm的膜将寄生虫溶液过滤到新的锥形管中，以去除HFF细胞和细胞碎片。
- 在血球计数器上计数寄生虫，并确定每毫升寄生虫的数量。
- 使用移液器，将2.5×10 5个寄生虫通过含有0.3μM工作浓度的正辛醇药物的D10培养基的新的T25HFF培养瓶中。
- 在37°C和5％CO 2下生长寄生虫7-10 d。
- 评估sinefungin药物生长表型的后代。在倒置相差显微镜下观察单层，评分0为无生长（sinefungin敏感），得分1为单层生长和裂解（sinefungin抗性）。
注意：请参见补充文件1中的协议1.8注释。
2. R在R / qtl中进行SNF r表型的QTL扫描
注意：请参见补充文件1中的协议2注释。
- 在本地计算机上安装R编程语言软件。见27 。
- 运行R并安装软件包'qtl'。可以从R GUI界面选项“Packages->安装包”中执行此操作，或者从R命令行运行以下命令（每个示例中的第一个“>”符号表示命令的开头，不应为复制）：
> install.packages（ “QTL”）
注意：一旦安装了R和“qtl”包，有两种方法可以从R命令行运行R / qtl，或者使用J / qtl 28的图形用户界面（GUI）程序：参见29下载J / QTL。该协议将提供R / qtl命令行语法，偶尔引用J / qtl中的等效函数。 - 加载'qtl'包：
>库（qtl）
注：有关数据集格式和下载，请参见“ 补充文件1 ”中的“协议2.3注释”。 - 将数据集文件加载到R / qtl中。
- 对于“csv”格式（参见：数据文件1）：
> SNFR < - read.cross（format =“csv”，file =“$ PATH / Rqtl-SNFR.csv”，基因型= c（“0”，“1”），na.strings = c（“ - ” ，convertXdata = FALSE） - 或者用于“gary”格式（参见：数据文件2）：
> SNFR < - read.cross（format =“gary”，dir =“$ PATH”，chridfile =“chrid.txt”，mnamesfile =“mname.txt”，mapfile =“markerpos.txt”，genfile =“基因型。 txt“，phefile =”phenos.txt“，pnamesfile =”phenonames.txt“，convertXdata = FALSE）
其中$ PATH是包含qtl数据集的文件的目录路径。例如：/ Users / HotDiggityDog / QTLfiles
注意：文件也可以加载使用“插入注释或命令”选项将以前的命令编入J / qtl，或使用GUI“文件” - “加载交叉数据”选项加载数据。
- 对于“csv”格式（参见：数据文件1）：
- 计算地图的概率：
> SNFR < - calc.genoprob（SNFR，step = 2.0，off.end = 0.0，error.prob = 1.0E-4，map.function =“haldane”，stepwidth =“fixed”） - 使用所有染色体上的正辛宁抗性表型的二元分布进行单次扫描：
> SNFR.scan < - scanone（cross = SNFR，chr = c（“Ia”，“Ib”，“II”，“III”，“IV”，“V”，“VI”，“VIIa” “，”VIII“，”IX“，”X“，”XI“，”XII“），pheno.col = c（1），model =”binary“，method =”em“
注意：如果运行VIR表型使用'model =“normal”'distribution选项。 - 运行1000个排列来计算显着阈值，然后考察对SNFR.scan变量的排列：
> SNFR.scan.permutations < - scanone（cross = SNFR，chr = c（“Ia”，“Ib”，“II”，“III”，“IV”，“V”，“VI” “VIIb”，“VIII”，“IX”，“X”，“XI”，“XII”），pheno.col = c（1），model =“binary”，method =“em”，n.perm = 1000，perm.Xsp = FALSE，verbose = FALSE）
> attr（SNFR.scan，“pheno.col”）< - c（1）
注意：步骤2.5到2.7可以使用“分析 - >主扫描 - >运行一个QTL基因组扫描”选项在J / qtl中运行。 - 绘制扫描结果：
> plot（SNFR.scan，gap = 0，bandcol =“gray”）
注意：J / qtl中生成的图是交互式的。- 绘制仅染色体IX扫描结果，染色体最高峰：
> plot（SNFR.scan，chr = c（“IX”），gap = 0，bandcol =“gray”，show.marker.names = TRUE） - 从单次扫描显示所有标记位置和LOD分数：
> SNFR.scan - 显示排列测试的阈值结果：
>摘要（SNFR.scan.permutations） - 仅显示大于alpha = .05阈值的标记（取自先前的输出）：
> SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> 2.68，] - 显示每个染色体上具有最高LOD评分的标记：
>摘要（SNFR.scan） - 显示具有最大LOD得分值（取自先前输出）的标记：
> SNFR.scan [SNFR.scan $ lod> = 6.57，]
注：参见协议2.13 补充文件1中的注释。
3.使用后代的WGS阅读确定因果SNF r突变
注：请参见附录1中的协议3注释。
- 将WGS读取个体后代与正辛宁敏感性VAND（VAND-SNF）亲本基因组。
注意：从NCBI组件AEYJ00000000.2下载VAND参考基因组（SNF），WGS从NCBI SRA PRJNA258152读取（.sra文件）24个后代。此外，请下载以下程序：Bowtie2 11 ，NCBI SRA工具包，SAMtools 30 ，VarScan 12和MUMmer 31 。- 使用bowtie2-build程序从VAND参考基因组FASTA文件创建Bowtie 2兼容索引，此处命名索引“VAND”：
> bowtie2-build GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna VAND - 使用fastq-dump将SRA格式的WGS读取文件转换为FASTQ文件，并使用--split-files选项进行配对读取（用于后代P1_14VB的SRR1555372.sra文件将用作示例）：
> fastq-dump --split-files SRR1555372.sra
注意：对于所有24，在协议3.1中运行以及所有以下命令后代。 - 使用bowtie2将WGS读取对齐到参考基因组，输出到SAM（.sam）文件和-end-to-end选项：
> bowtie2 -x VAND -1 SRR155372_1.fastq -2 SRR1555372_2.fastq -S SRR155372.sam - 端到端 - 将.sam文件转换为BAM（.bam）文件：
> samtools视图-bS SRR155372.sam> SRR155372.bam - 对.bam文件进行排序：
> samtools排序SRR155372.bam SRR155372.sort - 索引排序的.bam文件：
> samtools索引SRR155372.sort.bam
- 使用bowtie2-build程序从VAND参考基因组FASTA文件创建Bowtie 2兼容索引，此处命名索引“VAND”：
- 使用VarScan调用后代的SNP
注：参见附录1中的协议3.2注释。- 将所有索引的BAM（.sort.bam）文件转换为一个堆积格式的文件，使用samtools mpileup与VAND基因组参考文件，所有后代.sort.bam文件，并输出到名为AllProgeny-mpileup.txt的文件：
> samtools mpileup -f GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna SRR1555599。sort.bam SRR1555372.sort.bam SRR1555660.sort.bam SRR1555672.sort.bam SRR1556052.sort.bam SRR1556122.sort.bam SRR1556192.sort.bam SRR1556194.sort.bam SRR1556195.sort.bam SRR1556199.sort.bam SRR1556200。 sort.bam SRR1556202.sort.bam SRR1556203.sort.bam SRR1556274.sort.bam SRR1556276.sort.bam SRR1556278.sort.bam SRR1556395.sort.bam SRR1556396.sort.bam SRR1556397.sort.bam SRR1556398.sort.bam SRR1556399。 sort.bam SRR1556400.sort.bam SRR1556401.sort.bam SRR1556402.sort.bam> AllProgeny-mpileup.txt - 使用AllProgeny-mpileup.txt文件使用VarScan mpileup2snp程序调用所有SNP，最小读取覆盖率为5，跨越读取.8的最小变体频率，p值为.01，并输出到文件名称AllProgeny-SNP。文本：
> java -jar VarScan.jar mpileup2snp AllProgeny-mpileup.txt --min-coverage 5 --min-var-freq .8 --p-value .01> AllProgeny-SNPs.txt
注意：AllProgeny-SNPs.txt文件是一个制表符分隔的文本文件，将在协议3.4中使用以定位因果SNP。
- 将所有索引的BAM（.sort.bam）文件转换为一个堆积格式的文件，使用samtools mpileup与VAND基因组参考文件，所有后代.sort.bam文件，并输出到名为AllProgeny-mpileup.txt的文件：
- 找到对应于基于ME49的QTL位点的坐标的VAND基因组坐标
注：参见附录1中的协议3.3注释。- 使用MUMmer nucmer程序调整ME49基因组（可从ToxoDB.org 32下载）和VAND参考基因组文件（输出到out.delta文件）：
> nucmer ToxoDB-28_TgondiiME49_Genome.fasta GCA_000224845.2_TGVAND_v2_genomic.fna - 使用MUMmer show-coords程序来获取两个基因组比对的坐标，输出到名为ME49vsVAND-coords.txt的文件：
> show-coords out.delta> ME49vsVAND-coords.txt
注意：ME49vsVAND-coords.txt文件可用于查找对应于QTL轨迹的VAND重叠群和位置;位于ME49染色体IX上的标记MV359至MV366在3,187,537至4,202,258bp之间。有两个VAND contig跨越对应上调QTL位点; KN044604.1：657,441-1bp和KN042501.1：430,910-41,870bp（两个重叠群与ME49染色体相反排列）。
- 使用MUMmer nucmer程序调整ME49基因组（可从ToxoDB.org 32下载）和VAND参考基因组文件（输出到out.delta文件）：
- 评估仅在SNF r后代遗传的SNP位于QTL基因座内的后代SNP
注：参见协议3.4 补充文件1中的注释。- 查看数据文件3以鉴定位于QTL基因座内的因果突变。扫描SNF r后代具有SNP和SNF s的模式的数据（可行，因为通过与VAND-SNF参考基因组相比获得后代SNP）。这只能导致一个这样的位置，位置348130在VAND contig KN042501.1上。
- 参见数据文件3中的第6604行（ 图3 ）。
注：参见协议3.4.2 补充文件1中的注释。
4.通过CRISPR / Cas9-介导的基因失活。
注意：为了确认通过QTL作图和WGS SNP分析鉴定的因果SNP，需要在WT SNF背景下进行相应的遗传变化，并检查所得的表型。在sinefungin抗性的情况下，负责的突变导致早期终止的SNR1基因的失活2 。因此，可以使用SNR1的中断来进行确认。这里提供了一个详细的方案，用于使用CRISPR / Cas9诱导的indel突变来破坏SNR1 ，以证明其参与sinefungin抗性（ 图4 ）。
- SNR1特异性CRISPR质粒构建
注：参见补充文件1中的协议4.1注释，以获得质粒和图谱。- 从ToxoDB 32获得靶基因的基因组序列（ SNR1 ，TGME49_290860）。
- 使用E-CRISP 33等在线工具设计目标特异性gRNA。不要在gRNA中包含PAM序列（NGG）。
注：参见协议4.1.2 补充文件1中的注释。 - 合成引物构建目标特异性CRISPR质粒。
- 根据步骤4.1.2的设计，合成两个引物，通过定点诱变将原始CRISPR质粒中的UPRT靶向gRNA改变为所选择的gRNA序列。
注意：这两个引物的序列如下：gRNA-Fw：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTTTAGAGCTAGAAATAGC（N20是靶特异性gRNA序列）和gRNA-Rv：AACTTGACATCCCCATTTAC 2 。
- 根据步骤4.1.2的设计，合成两个引物，通过定点诱变将原始CRISPR质粒中的UPRT靶向gRNA改变为所选择的gRNA序列。
- 进行定点诱变反应。
- 使用针对CRISPR质粒（pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT）的UPRT作为模板和上述两种引物，进行定点诱变反应根据制造商的说明。
注意：使用以下循环条件进行PCR：98℃1分钟，然后进行25个循环，98℃10秒，55℃30秒和72℃5分钟，然后最终延伸2分钟在72℃。
- 使用针对CRISPR质粒（pSAG1 :: CAS9-U6 :: sgUPRT）的UPRT作为模板和上述两种引物，进行定点诱变反应根据制造商的说明。
- 根据供应商的方案，通过化学转化将包含GOI特异性CRISPR质粒的诱变产物转化到大肠杆菌感受态细胞（参见材料表 ）。在含有氨苄青霉素（100μg/ mL）的溶菌酵母（LB）平板上在37℃培养转化体。随后，挑取2-4个克隆，并在补充有100μg/ mL氨苄青霉素的5mL LB培养基中独立生长12-16小时。
- 使用DNA分离试剂盒从培养物中提取质粒，并通过DNA凝胶电泳分析，以检查质粒的大小（预期的质粒大小为9674bp，使用原始的CRISPR质粒为cONTROL）。使用M13-Rev引物（5'-CAGGAAACAGCTATGACC）对质粒进行序列测定以确定靶特异性gRNA序列。
- 一旦鉴定出阳性克隆，将质粒DNA保存在-20℃，并将相应的细菌培养物储存在-80℃以备将来使用。
注意：用于转染的CRISPR质粒应溶于去离子水中，浓度用分光光度法或其他方法测定。
- 一旦鉴定出阳性克隆，将质粒DNA保存在-20℃，并将相应的细菌培养物储存在-80℃以备将来使用。
- 使用DNA分离试剂盒从培养物中提取质粒，并通过DNA凝胶电泳分析，以检查质粒的大小（预期的质粒大小为9674bp，使用原始的CRISPR质粒为cONTROL）。使用M13-Rev引物（5'-CAGGAAACAGCTATGACC）对质粒进行序列测定以确定靶特异性gRNA序列。
- 寄生虫转染。
注意：在D10培养基的HFF细胞中培养弓形虫的一般方法已经在之前描述过34 。- 在转染前两到三天，向包含汇合的HFF细胞单层（0.5-1×10 6，1型菌株，1-2×10 6为其他菌株）的T25烧瓶添加足够的寄生虫以达到70-80％的HFF细胞2-3 d内溶解
- Exami在倒置相差显微镜下，当HFF单层70〜80％被寄生虫裂解时，用移液管轻轻取出培养基，并用5mL cytomix缓冲液（120mM KCl，0.15mM CaCl 2，10mM K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 pH = 7.6,25mM HEPES，2 mM EDTA，5mM MgCl 2 ，pH = 7.6）。随后，将寄生虫溶液转移到15 mL锥形管中。
注：参见协议4.2.2 补充文件1中的注释。 - 将寄生虫溶液通过10 mL注射器/ 22 G钝针2-3x。
- 通过孔径为3μm的膜将寄生虫溶液过滤到新的锥形管中，以去除HFF细胞和细胞碎片。
- 通过在400×g离心10分钟来过滤寄生虫。
- 倒出上清液，用10 mL cytomix缓冲液重悬浮颗粒寄生虫，取10μL等分试样用血细胞计数器测定寄生虫浓度，并以400×g的离心沉淀10分钟。
- 除去上清液并将沉淀重悬于细胞模型缓冲液中以获得4×10 7个寄生虫/ mL的密度。
- 在4 mm间隙比色皿中，将250-300μL寄生虫溶液（1-1.3 x 10 7个寄生虫）与7.5μgCRISPR质粒，6μLATP（100mM）和6μL谷胱甘肽（GSH）（250 mM）混合。
- 电击寄生虫35 。包括单独的电穿孔作为阴性对照，其中CRISPR质粒靶向其他地方，例如靶向CRIPSR质粒的UPRT 。
注意：电穿孔设置取决于设备。对于材料中列出的电穿孔机使用4 mm间隙比色皿。建议使用以下协议：1,700 V，176μs脉冲长度，2脉冲，100 ms间隔。
- 确定正辛宁抗性的频率在CRISPR定位后。
- 将种子HFF细胞置于置于24孔板中的盖玻片上3-4d，然后进行电穿孔，使得它们在4.2进行转染的时候融合。
- 从一个汇合的T25烧瓶中对HFF细胞进行胰蛋白酶化，随后加入12mL D10培养基并充分混合。
- 向24孔板的每个孔中加入盖玻片，并将500μLHFF细胞溶液等分至每个孔。将板在37℃孵育3 4 d，使细胞生长直至汇合。
注意：一个T25烧瓶的细胞足以种子一个24孔板。 - 将50μL的电穿孔寄生虫溶液从步骤4.2.9加入到含有汇合的HFF细胞接种的盖玻片的24孔板的一个孔中。将剩余的电穿孔寄生虫溶液转移到用融合的HFF细胞接种的T25瓶中。
- 评估转染效率。
- 在24孔板中培养细胞24小时并随后用500μl4％甲醛固定细胞（宿主细胞和寄生虫），以通过免疫荧光测定（IFA）检查Cas9-GFP的表达。
- 用抗GFP抗体和弓形体特异性抗体（如抗-TAGEALD）探测细胞以标记总寄生虫。有关推荐的稀释度，请参见抗体产品表（通常，IFA为1：1,000）。如果抗体未偶联，则使用与荧光染料缀合的两种不同的二抗来标记一抗。
- 用荧光显微镜观察适用于次级荧光染料的滤膜上的标记细胞。通过将GFP阳性寄生虫的数量除以总寄生虫的数量来获得转染效率。
注意：用于IFA的两种抗体应来自两种不同的宿主物种，例如使用小鼠抗GFP和兔抗TgALD的组合。
- 确定f转染寄生虫中正辛宁霉素抗性的要求。
- 对于在T25烧瓶中培养的转染寄生虫，将其长2-3天，直到自然出口。然后收集寄生虫，钝针裂解宿主细胞以释放细胞内寄生虫，并通过孔径为3μm的膜过滤纯化。用血细胞计数器计数寄生虫以估计密度。
- 将纯化的寄生虫添加到用融合的HFF细胞接种的6孔板中：对于第一排（3孔），加入200个寄生虫/孔，并以常规D10培养基（2mL /孔）生长;对于第二排，添加5000个寄生虫/孔，并在含有0.3μM正辛芬的D10培养基中生长。
- 将板放在5％CO 2培养箱中，并在37℃，8-10天生长寄生虫，不受干扰，形成斑块。用70％乙醇（2mL /孔）固定样品，并用0.1％结晶紫（2mL /孔）染色单层。用水冲洗井眼观察斑块（透明区）由寄生虫生长形成。
注意：负控制应以并排处理方式相同。
- 计算CRISPR诱导的正辛酸耐药率。
- 从不含药物的井中获取斑块的平均数（X），并将寄生虫存活力计算为X / 200。从含有sinefungin的井获得斑块的平均数（Y），以计算CRISPR诱导的正纯蛋白耐药率如下：
CRISPR诱导电阻率= 200×Y /（5000×X×转染效率）
注意：从4.3.2获得转染效率。
- 从不含药物的井中获取斑块的平均数（X），并将寄生虫存活力计算为X / 200。从含有sinefungin的井获得斑块的平均数（Y），以计算CRISPR诱导的正纯蛋白耐药率如下：
- 将种子HFF细胞置于置于24孔板中的盖玻片上3-4d，然后进行电穿孔，使得它们在4.2进行转染的时候融合。
- 检查由CRISPR / Cas9诱导的indel突变
- 在接种HFF细胞的T25烧瓶中，在37℃下将第4.2.9节的电穿孔寄生虫生长2 d。然后，用含有0.3μM正弦蛋白（选择培养基）的5mL D10培养基代替培养基）。
- 将寄生虫保持在选择培养基中至少3代，直到抗性池变得稳定（由阴性对照组中没有寄生虫生长，但在实验组中具有强大的寄生虫生长）。
- 亚克隆抗sinefungin抗性池获得克隆菌株。
- 收集新鲜出现的寄生虫，通过3μm膜过滤纯化，并将其亚克隆到在150μLD10培养基中接种融合HFF细胞的96孔板中。在CO 2培养箱中在37℃下生长亚克隆培养物7-10天，而不干扰平板。
注：参见协议4.4.2.1 补充文件1中的注释。
- 收集新鲜出现的寄生虫，通过3μm膜过滤纯化，并将其亚克隆到在150μLD10培养基中接种融合HFF细胞的96孔板中。在CO 2培养箱中在37℃下生长亚克隆培养物7-10天，而不干扰平板。
- 在倒置相差显微镜下检查96孔板，寻找仅含有一个斑块的孔。标记这样的孔，然后使用移液管将细胞从每个孔转移到用HFF细胞接种的24孔板。 <当孔中的80-90％的HFF细胞被裂解时，收获寄生虫（约500μL），并将50μL寄生虫溶液通过新的孔以维持菌株。使用其余的（≈450μL）提取基因组DNA进行PCR扩增。
- 对于SNF r克隆的基因组DNA分离，将1,000 xg的寄生虫（少量的HFF细胞污染是可耐受的）沉淀10分钟。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗沉淀的寄生虫一次并再次沉淀。使用商业试剂盒或通过煮沸将沉淀的细胞分离基因组DNA。将寄生虫重悬于50-100μLPBS中。
注意：进行PCR以获得用于测序的SNR1基因的片段。使用以下引物扩增SNR1基因座2 ：SNR1-Amp-Fw：5'CCGACCACAA CAATTTTC和SNR1-Amp-Rv：5'GACGTGATTCACTTTTTACACACACACAC。使用高保真DNA聚合酶。为了控制目的，扩增WT基因座。
- 在接种HFF细胞的T25烧瓶中，在37℃下将第4.2.9节的电穿孔寄生虫生长2 d。然后，用含有0.3μM正弦蛋白（选择培养基）的5mL D10培养基代替培养基）。
- 执行t他用20μL反应体积进行PCR，并用以下程序运行：98℃1分钟，然后进行98个循环，10秒，55℃30秒和72℃2.5分钟的30个循环，随后最终延伸72分钟2分钟。
注意：使用以下引物序列PCR产物：SNR1-Seq1：5'GCC ACA TGC TTT AGC GTG，SNR1-Seq2：5'TCC TCT CCA TCA CGG GTT GG，SNR1-Seq3：5'GCA AGA GCC GCG TGA CG ，SNR1-Seq4：5'CTC TCC CGC GGT CGA G，SNR1-Seq5：5'GCA CCG TCC GCA AGC和SNR1-Seq6：5'CCG GAA GGT GAA TCG TTC TTC。 - 使用序列比对工具比较来自sinefungin抗性突变体的SNR1基因序列与WT菌株的序列。
注意：关于利用遗传互补或转基因应变构建的SNR1基因座处的阴性选择的细节，参见补充文件2方案5。
- 绘制仅染色体IX扫描结果，染色体最高峰：
Representative Results
本文概述了可以连续使用以鉴定负责耐药性的基因的几种方法（ 图1 ）。评估ME49-FUDR r X VAND-SNF r交叉的24个后代，如方案1所述对药物sinefungin的抗性进行评估。使用遗传图谱和后代的SNF r表型，在R / qtl - 协议2（ 图2 ）。这导致在染色体IX上跨越约1Mbp的一个显着的峰。在这个地区，因果突变位于。
为了鉴定因果突变，使用Bowtie2 - Protocol 3.1将来自后代的WGS读数与VAND-SNF参考基因组进行比对，使用VarScan mpileup2snp - Protocol 3.2调用SNPs，并使用MUMmer鉴定了VAND基因组中的QTL位点 - Protoc醇3.3。提取QTL基因座内的后代SNP并扫描其中SNF r后代具有SNP并且SNF不存在的模式，这是可行的，因为通过与VAND-SNF参考基因组比较获得后代SNP（ 图3 ） 。只有一个SNP匹配这种模式，导致名为SNR1的推定的氨基酸转运蛋白基因中的早期终止密码子。
使用CRISPR / Cas9系统确认SNR1是SNF r抗性基因。制备了用于革兰氏阴性菌基因编辑的新的CRISPR / Cas9质粒，其含有靶向在后代 - 方案4中鉴定的SNF r突变附近的SNR1基因的gRNA（ 图4A ）。将针对CRISPR / Cas9质粒的SNR1电穿孔入SNF s WT寄生虫菌株，当培养时获得抗性突变体在0.3μM正弦蛋白中。当用针对CRISPR / Cas9质粒的UPRT电穿孔时，没有获得SNF r寄生虫。克隆了几种SNF r CRISPR突变体，并对SNR1 gRNA靶标周围的区域进行了测序。每个突变体具有破坏SNR1基因的编码序列的indel （ 图4B ）。该方法也可用于通过NHEJ（ 图5）或HR（ 图6 ） - 补充文件2将靶向构建体插入SNR1基因座。
图1：协议中概述的实验示意图工作流程。使用ME49-FUDR r X VAND-SNF r交叉鉴定和确认SNF r基因的主要步骤参照t中列出的适当方案他的文章。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：R / qtl在SNF r表型上运行QTL扫描的命令。协议2中概述的命令使用qtl包在R中运行。显示代表性的命令和情节。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：因果SNP的位置。使用Bowtie 2将后代WGS读数与VAND-SNF参考基因组进行比对，使用VarScan调用SNP，并对应用MUMmer鉴定的VAND QTL位点。位于QTL基因座内的SNP被导入到电子表格中，并鉴定了因果SNP。 SNF r后代（黄色），SNF后代（绿色），SNF r SNP（红色）（参见数据文件3 ）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：使用CRISPR / Cas9将SNR1确认为SNF r基因。 （ A ）CRISPR / Cas9在SNR1基因座中诱导吲哚突变（绿色）。 （ B ）由两种不同的SNR1特异性CRISPR质粒（分别为C5和C6）引起的SNR1中的代表性插入片段。 RH是WT菌株，C5和C6是SNF r突变体。 （B取自参考文献s =“xref”> 2）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5. 使用CRISPR / Cas9的插入诱变。 （ A ）通过CRISPR / Cas9介导的位点特异性整合将补体或转基因基因插入到SNR1基因座中。插入的DHFR * mini基因和用于鉴定的引物，F1 / 2和R1 / 2的两个可能取向代表用于诊断PCR的寡核苷酸的引发位点。 （ B ）将一个snr1 :: DHFR *克隆，RH的诊断PCR用作WT对照。包括GRA1p的PCR作为对照，检查基因组DNA的质量作为模板。星号表示具有非特异性谱带的泳道（图5B取自参考文献ce 2 ）。 请点击此处查看此图的较大版本。
图6： 使用CRISPR / Cas9的基因敲除。 CRISPR / Cas9介导的弓形虫同源基因替代的经典设计。在这种情况下，插入的转基因的方向是固定的。 F1 / R1，F2 / R2和F3 / R3代表用于诊断PCR的寡核苷酸的引物位点。 请点击此处查看此图的较大版本。
数据文件1：ME49-FUDR r X VAND-SNF r 交叉文件f或用于R / qtl，“csv”格式。一个.csv文件，可以使用format =“csv”选项加载到R / qtl中。 请点击这里下载此文件。
数据文件2：（chrid txt，基因型txt，markerpos.txt，mname.txt，phenonames.txt和phenos.txt）。 ME49-FUDR r X VAND-SNF r 用于R / qtl，“gary”格式的Cross文件。可以使用format =“gary”选项加载到R / qtl中的六个.txt文件。 请点击这里下载此文件。
数据文件3.跨SNF的后代SNP的电子表格 r
补充文件1：附加协议详细信息。 请点击这里下载此文件。
补充文件2：方案5 - 利用 遗传互补或转基因菌株构建 的 SNR1位点 处的负选择 。 请点击这里下载此文件。
Discussion
这些方案提出了几种方法，当组合时，可以鉴定弓形虫中的耐药性基因。两个特别是项目的组成部分，相对经验丰富的QTL定位方法和最近开发的CRISPR / Cas9基因编辑方法。 Lander和Botstein在1989年发表了有影响力的论文，展示了将遗传基因座与表型36相关联的QTL定位。最近在2012年，Dounda和Charpentier描述了在化脓链球菌 22中的CRISPR / Cas9编辑系统，被迅速适应为许多不同模型的遗传工具，包括弓形虫13，17 。两种方法在这里是有用的，其中QTL定位定义了使用基于WGS的SNP检测最终鉴定的含有耐药性突变的基因座，CRISPR / Cas9编辑提供了我确认SNR1是正弦蛋白药物抗性基因。
最初开发的ME49-FUDR r X VAND-SNF r cross 8用于询问毒力表型19 ，但是亲本菌株也发生了另外的表型差异，其中因果基因未知，VAND亲本中的正辛酸抗性。这突出了十字架的一个好处，因为当观察到父母的其他表型差异时，它们可以重新利用。另外一种类型为2×3型的弓形体十字架是这种情况，其中通过绘制多种表型37,38,39,40 ，发现了涉及毒力的几个基因。迄今为止，已经描述了四种不同的弓形虫十字交叉，用于描绘负责表型的基因ss =“xref”> 8,37,41,42，所有这些都有可能被重新用于绘制遗传基础未知的新表型。按照这些方法，已经对代表已知全球遗传多样性的62个弓形虫菌株的基因组进行了测序。可以从这个池中获得新的杂交，以获得不同有趣表型的菌株。夸耀了QTL映射的优点，需要说的是产生十字架不是一个小事。还有其他方法可用于鉴定因果基因。一个强大的技术使用化学诱变来产生可以筛选表型的突变体。为了找到致病基因，突变体可以用粘粒文库44进行补充，也可以使用基因组重排序方法找到因果突变45 。对于莫在这里，参见Coleman 等人的两篇JoVE文章。和Walwyn 等人概述了这些方法46,47 。
导致鉴定因果SNF r突变的许多步骤（方案2和3）依赖于可免费获得学术用途的软件进行的计算方法。提供每个步骤的详细命令，当运行正确的文件将允许用户重新创建必要的数据集以找到因果SNF r SNP。请记住，命令中的一些语法指的是可以修改为用户首选项的文件名或目录结构（$ PATH）。尽管这里给出的命令肯定不会耗尽分析QTL分析和基于WGS的SNP识别的交叉方式，但它们足够全面，可以重复本文所述的实验，并且应允许用户变为m熟悉如何以一步一步的方式利用这些方法。
虽然QTL作图和基于WGS序列的SNP检测足以鉴定候选SNF r基因，但需要额外的实验来证实其在耐药性中的作用。这可以通过基因破坏或敲除技术令人信服地显示，这两种技术可以使用CRISPR / Cas9基因编辑实现。给出了使用CRISPR / Cas9产生indel突变或将转基因构建体插入到弓形虫中的靶基因的详细方法。 CRISPR / Cas9提供的靶向特异性提高了基因编辑与传统方法的效率。此外，这有效地提高了使用非实验室适应的菌株进行以前难以修改的遗传研究的可能性13 。即使在起步阶段，CRISPR / Cas9已被用于使基因中断lass =“xref”> 2，13，17，18，48，49，标签基因17 ，并使得弓形虫中的基因敲除16,19,50,51,52,53,54有望成为有用的工具对于未来的许多其他研究。
SNR1失活导致正辛宁抗性的发现使得SNR1基因座成为转基因插入或遗传互补的有希望的位点。为了最大限度地利用CRISPR / Cas9介导的基因靶向来指导转基因整合到SNR1基因座中的成功，应该考虑以下几个方面红色在实验设计。首先，推荐将选择标记包括在转基因构建体中以增加菌株构建的效率。如果包括选择标记，则可以使用阳性和阴性选择，导致几乎100％的双选择的寄生虫是在GI1整合在SNR1基因座处的GOI转基因的。相比之下，如果转基因构建体不含有其他可选性状并且依赖于在SNR1基因座处的阴性选择，则成功转基因的效率在很大程度上取决于CRISPR质粒和转基因构建体的共转染效率。
第二，虽然CRISPR / Cas9介导的非同源DNA片段的位点特异性整合经常用于互补和转基因，但是应该注意的是，在这种情况下，不能保证插入的方向是可能的。这可能会造成问题ms到某些应用程序。例如，为了补充具有不同基因等位基因的突变体，难以确保所有等位基因以相同方向插入，并且取向的差异可能导致表达差异。对于这种类型的应用，推荐具有与SNR1基因座同源的DNA构建体，这将驱动适当的整合方向（ 图6 ）。
第三，在转染过程中，CRISPR质粒与转基因DNA分子之间的比例对成功转基因株系的构建至关重要。这个比例需要根据选择策略进行调整。推荐以下指南：1）如果转基因构建体含有耐药标记，相应的药物是用于产生转基因寄生虫的唯一选择， 即不使用正辛宁素，则建议的转基因构建体与CRISPR等离子体的摩尔比id为1：5。在这种情况下使用更多的CRISPR质粒增加接受转基因构建体的寄生虫也将接受CRISPR质粒的可能性，因此耐药性寄生虫更可能将标记插入CRISPR靶向位点。如果比例相反，接受转基因构建体的大多数寄生虫将不会得到CRISPR质粒。因此，绝大多数耐药寄生虫通过与CRISPR / CAS9介导的位点特异性插入不相关的随机整合获得转基因构建体。 2）如果转基因构建体含有耐药性标记，并且相应的药物与sinefungin一起使用以选择转基因寄生虫，则建议的转基因构建体与CRISPR质粒之间的摩尔比为1:1。这种策略提供了转基因株系施工效率最高。 3）如果转基因结构不包含可选择的制造商，则依赖于否定选择通过sinefungin单独获得转基因寄生虫，转基因构建体和CRISPR质粒之间的建议摩尔比为5：1。此设计的理由与上述第一条指导相同。由于在方案5中使用了乙胺嘧啶和正辛宁作选择，所以将DHFR * mini基因与靶向CRISPR质粒的SNR1之比设定为1:1。
总而言之，这里概述的方法具有不可能在识别SNR1 2的原始出版物中传达的细节水平。这些协议;具体来说，命令行语法，所使用的程序的顺序布局以及CRISPR / Cas9的使用应有助于未来确定新基因的表型。
Acknowledgments
我们要感谢L. David Sibley和Asis Khan对这些协议所基于的原始出版物的贡献。这项工作由美国国家卫生研究院拨款AI108721资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 flasks | Corning | 430639 | |
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) | ATCC | SCRC-1041 | |
| T. gondii ME49 strain | ATCC | 50840 | |
| T. gondiiVAND strain | ATCC | PRA-344 | |
| DMEM (No Sodium Bicarbonate) | Life Sciences | 12800017 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) Premium Grade | VWR International | 97068-085 | |
| L-Glutamine 200 mM | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Gentamicin (10 mg/mL) | Life Technologies | 15710064 | |
| Cell Scraper for Flasks | VWR International | 10062-904 | |
| Syringe 10 mL | BD | 309604 | |
| Blunt needles 22 G x 1" | BRICO Products | BN2210 | |
| Nuclepore Filter 3.0 µm, 25 mm | GE Healthcare | 110612 | |
| Swin-Lok Filter Holder 25 mm | GE Healthcare | 420200 | |
| Hemacytometer | Propper MFG | 90001 | |
| Sinefungin | Enzo Life Sciences | 380-070-M001 | |
| R | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| J/qtl | The Churchill Group | http://churchill.jax.org/software/jqtl.shtml | |
| Bowtie2 | John Hopkins University | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | |
| NCBI SRA Toolkit | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?view=toolkit_doc | |
| SAMtools | Wellcome Trust Sanger Institute | http://www.htslib.org/ | |
| VarScan | Washington University, St Louis | http://varscan.sourceforge.net/ | |
| MUMmer | JCVI & Univ Hamburg | http://mummer.sourceforge.net/ | |
| pSAG1::CAS9-U6::sgUPRT | Addgene | Plasmid #54467 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the UPRT gene |
| pSAG1::CAS9-U6::sg290860-6 | Addgene | Plasmid #59855 | T. gondii CRISPR plasmid to cut the TG*_290860 SNR1 gene |
| pUPRT::DHFR-D | Addgene | Plasmid #58528 | Template for DHFR* mini gene |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0552S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-07-5 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | 746495 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P9791 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P5504 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Adenosine triposhpate (ATP) | Sigma Aldrich | A6419 | |
| L-glutathione (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | |
| ECM 830 Electroporation System | BTX | 45-0002 | |
| Electroporation Cuvette 4 mm | Harvard Apparatus | 45-0126 | |
| Crytal Violet | Alfa Aesar | B21932-14 | |
| 6-well TC plate | Corning | 353046 | |
| 24-well TC plate | Corning | 353935 | |
| Cover glass 12 mm round | VWR International | 89015-724 | |
| 96-well TC plate | Corning | 353075 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit (Multi-fragment) | New England Biolabs | E5510S | |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Pyrimethamine | TCI AMERICA | P2037-1G | Use cuation when using pyrimethamine resistant parasites - see Protocol |
References
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