Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Published: June 27, 2017 doi: 10.3791/55187
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Chemistry and Biomolecular Sciences, University of Ottawa, 2School of Biosciences, The University of Nottingham Malaysia Campus
* These authors contributed equally

Summary

وتصف هذه الدراسة طرق للتعبير المشترك بوساطة T7 من جينات متعددة من البلازميد واحد في القولونية الإشريكية باستخدام نظام البلازميد بمغس.

Abstract

ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد للبيولوجيا التركيبية، ودراسة مجمعات البروتينات البروتينية، وتوصيف وتسخير المسارات الحيوية. في هذه المخطوطة، يتم وصف استخدام نظام فعال للغاية لبناء أوبيرونات الاصطناعية مولتيجين تحت سيطرة بوليميراز T7 الحمض النووي الريبي. هذا النظام يسمح العديد من الجينات ليتم التعبير عنها في وقت واحد من البلازميد واحد. هنا، مجموعة من أربعة ناقلات ذات الصلة، بمغس-A، بمغس-هيسا، بمغس-K، و بمغكس-هيسك، مع امبيسلين أو كاناميسين مقاومة اختيار علامة (A و K) وإما امتلاك أو تفتقر إلى N- محطة هيكساهستيدين علامة (له) يتم الكشف عنها. يتم توفير بروتوكولات مفصلة لبناء الأوبرونات الاصطناعية باستخدام هذا النظام المتجه جنبا إلى جنب مع البيانات المقابلة، تبين أن نظام القائم على بمغس تحتوي على خمسة جينات يمكن أن تكون شيدت بسهولة واستخدامها لإنتاج جميع البروتينات المشفرة الخمسة في الإشريكية القولونية . هذا الكيسإم والبروتوكول تمكن الباحثين من التعبير بشكل روتيني عن وحدات معقدة متعددة المكونات والمسارات في E. القولونية .

Introduction

ويعتبر التعبير المشترك عن بروتينات متعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، لا سيما في تطبيقات البيولوجيا التخليقية، حيث يجب التعبير عن وحدات وظيفية متعددة 1 ؛ في دراسة البروتينات المجمعات البروتين، حيث التعبير وظيفة غالبا ما تتطلب تعبير مشترك 2 ، 3 ؛ وفي تحديد وتسخير المسارات الحيوية، حيث يجب التعبير عن كل جين في المسار 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . وقد تم تطوير عدد من النظم للتعبير المشترك، وخاصة في الكائن المضيف الكولي القولونية ، الحصان العمل للتعبير المختبري البروتين المؤتلف 9 . على سبيل المثال، يمكن استخدام البلازميدات متعددة مع علامات اختيار مختلفة للتعبير عن البروتينات الفردية باستخدام ثروة من مختلف السابقين ناقلات بريسيون 10 ، 11 . وقد استخدمت أنظمة البلازميد واحدة لتعبير البروتين متعددة إما المروجين متعددة للسيطرة على التعبير عن كل جين 10 ، 12 ؛ أوبيرونات الاصطناعية، حيث يتم ترميز العديد من الجينات على نص واحد 2 ، 13 ؛ أو، في بعض الحالات، جين واحد ترميز ببتيد التي تتم معالجتها في نهاية المطاف بروتيوليتيكالي، مما أسفر عن البروتينات المطلوبة من الفائدة 14 .

شكل 1
الشكل 1: بمغكس سير العمل تظهر بناء متجه بوليسيسترونيك. يوفر نظام بمغس استراتيجية مرنة وسهلة الاستخدام لبناء الأوبرونات الاصطناعية تحت سيطرة المروج T7 محرض.e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه المخطوطة، يتم وصف استخدام نظام فعال للغاية لبناء مولدات الجينات الاصطناعية تحت سيطرة T7 الحمض النووي الريبي البلمرة ( الشكل 1 ). هذا النظام يسمح العديد من الجينات ليتم التعبير عنها في وقت واحد من البلازميد واحد. لأنه يقوم على نظام البلازميد، ودعا في الأصل pKH22، التي تم استخدامها بنجاح لعدد من التطبيقات المختلفة 6 ، 7 ، 8 . هنا، يتم توسيع هذه المجموعة البلازميد لتشمل أربعة ناقلات ذات الصلة: بمغس-A، ناقلات التعبير تفتقر إلى أي علامات C- أو N- المحطة ومع علامة مقاومة الأمبيسلين. بمغس-هيسا، ناقلات التعبير ترميز علامة هيكساهستيدين N- محطة ومع علامة مقاومة الأمبيسلين. بمغس-K، ناقلات التعبير lأي علامات C- أو N- محطة ومع علامة مقاومة الكاناميسين. و بمغس-هيسك، ناقلات التعبير ترميز علامة هيكساهستيدين N- محطة ومع علامة المقاومة كانامايسين. في هذه الدراسة، وتظهر طريقة لتوليد ناقلات بوليسيسترونيك التي تحتوي على خمسة الجينات باستخدام نظام بمغكس، تحديدا بمغس-A، جنبا إلى جنب مع الإنتاج الناجح لكل بروتين الفردية في القولونية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحصول على الجينات ذات الاهتمام

  1. تصميم الجينات الاصطناعية.
    1. تحسين تسلسل الجينات لتعبير E. القولونية .
    2. إزالة أي مواقع تقييد مشكلة من تسلسل (أفري، ندي، إكوري، و زباي).
    3. إدراج مواقع تقييد للاستنساخ؛ موقع 5-ندي و 3'-إكوري الموقع. ويمكن استخدام مواقع أخرى، إذا لزم الأمر؛ الرجوع إلى المنطقة مولتيكلونينغ من البلازميد المحدد ( الشكل S1 -S4 ). إذا رغبت في ذلك، تضمين علامة ترميز 5 'أو 3' للكشف عن البقع الغربية.
    4. تجاريا ترتيب الجين المصممة.
    5. إما استنساخ حادة الجين في ناقلات حادة باستخدام مجموعة استنساخ حادة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تصميم الاشعال لتضخيم الجين (ثم انتقل إلى الخطوة 1.2.2)؛ أو إضافة 5 'و 3' ينتهي إضافية للاستنساخ المباشر في البلازميد بمغس والانتقال إلى الخطوة 2. هنا، اله النتائج التمثيلية هي من استنساخ حادة الجينات ذات الاهتمام.
  2. تضخيم الجين المطلوب (من الجينات الاصطناعية مصممة والأمثل أو من الحمض النووي قالب تحتوي على الجين المطلوب) 15 .
    1. تصميم الاشعال مع مواقع تقييد للاستنساخ. موقع 5-ندي و 3'-إكوري الموقع. ويمكن استخدام مواقع أخرى، إذا لزم الأمر؛ الرجوع إلى المنطقة مولتيكلونينغ من البلازميد المحدد ( الشكل S1 -S4 ). إذا رغبت في ذلك، تضمين إما علامة ترميز 5 'أو 3' للكشف عن لطخة غربية.
    2. ير تضخيم الجين المطلوب 15 .
    3. تحليل ير بواسطة أغاروس هلام الكهربائي 16 .
    4. إذا كان هناك تضخيم غير محددة، وتنظيف الجينات تضخيم عن طريق استخراج هلام. إن لم يكن، استخدم مجموعة تنظيف الانزيم.
    5. تحديد الحمض النووي باستخدام الطيف عن طريق فحص امتصاصيةe في 260 نانومتر؛ فارغة مع شطف العازلة 17 .

2. استنساخ الجينات ذات الاهتمام في ناقل نظام التعبير مولتيجين، بمغس 18

  1. تقييد هضم الجينات التي تم الحصول عليها من الفائدة والنواقل المطلوب، بمغس، مع ندي و إكوري.
    ملاحظة: إذا تم الحصول على كمية كبيرة من البلازميدات ريسركولاريزد، والسماح للرد فعل ندي على المضي قدما لمدة 1 ساعة قبل إضافة إكوري.
    1. استخدام 40 ميكرولتر هضم رد فعل تحتوي على 0.5-1.5 ميكروغرام من الحمض النووي و 1 ميكرولتر من كل انزيم مع 4 ميكرولتر من العازلة 10X المناسبة.
    2. للحصول على هضم ندي و إكوري، استخدم المخزن المؤقت إكوري وأول إضافة نديلي نوكلياز. هضم لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ثم إضافة إكونيلياز إكوري، والسماح لهضم المضي قدما لمدة ساعة إضافية. ندي حساسة للانشقاقات بالقرب من نهاية الحمض النووي، لذلك الهضم الأولي من قبل إكوري يمكن أن تمنع الهضم الفعال من قبل ندي.
  2. إلكترونياتأوفيوريز الهضم تقييد على هلام الاغاروز (ل 1 كب الجينات، واستخدام هلام الاغاروز 0.7٪ في 110 V لمدة 55 دقيقة؛ لتحديد نسبة من هلام الاغاروز لمختلف أحجام الجينات، الرجوع إلى المرجع 16 .
  3. إدراج المكوس والعصابات ناقلات باستخدام مشرط نظيفة أو شفرة حلاقة ووضع شريحة هلام استئصال في أنبوب 1.5 مل.
  4. استخراج الحمض النووي من هلام الاغاروز باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. ليغات الجين من الفائدة في ناقلات بمغس باستخدام نسبة 3: 1 إدراج إلى متجه. إعداد ربط سلبية من هضم بمغس دون إدراج.
    1. إعداد 20 ميكرولتر رد فعل ربط تحتوي على 1 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي T4، 0.15-0.5 ميكروغرام من الحمض النووي ناقلات (~ 5 ميكرولتر)، وكمية مناسبة من إدراج على أساس نسبة 3: 1 إدراج إلى متجه وحجم الجين الذي يتم إدراجه. فإن العمود الفقري بمغس بين 5،312 و 5،504 نقطة أساس في الحجم. تضمين رد فعل السيطرة السلبية التي تحتوي على كل شيء بوt الجين الذي يتم إدراجه. تأكد من أن كمية من الحمض النووي متجه ما يعادل في ربط السيطرة السلبية والناقلات بالإضافة إلى إدراج ردود الفعل ربط.
  6. تحويل ردود الفعل ربط في الخلايا الزرقاء القولونية مختلطة كيميائيا زل 1-الأزرق والبلازميدات ليغاتد pMGX- yfg1 (التي تحتوي على الجينات من الفائدة 1)، PMGX- yfg2 (التي تحتوي على الجينات من الفائدة 2) ... PMGX- يفغن (التي تحتوي على الجينات من الفائدة ن). استخدام تقنية العقيم (داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية أو تحت لهب).
    1. ذوبان الجليد 100 أليكوتس ميكرولتر من المختصة كيميائيا XL1-الأزرق E. القولونية على الجليد لمدة 5 دقائق ثم قم بإضافة 5 ميكرولتر من ردود الفعل ربط. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    2. الحرارة صدمة الخلايا لمدة 45 ثانية في حمام مائي عقد في 42 درجة مئوية ثم قم بإضافة 200 ميكرولتر من لب الباردة. احتضان لهم على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    3. هز الخلايا عند 37 درجة مئوية، 220 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة ثم تنتشر لوحة 100 ميكرولتر على لوحة لب-أجار تحتوي على موافقة(إما امبيسيلين أو كانامايسين).
  7. شاشة استنساخ لمحولات إيجابية.
    1. قارن التهم مستعمرة على لوحات التحكم والربط السلبية. مطلوب نسبة عدد مستعمرة أكبر من 1: 2. إذا كان هناك عدد كبير من المستعمرات على لوحة التحكم السلبية، والعودة إلى الخطوة 2.1 ومراجعة المذكرة.
    2. حدد 4-8 المستعمرات الفردية (اعتمادا على السيطرة السلبية: نسبة الربط) من كل رد فعل ربط من الجينات المختلفة المدرجة للفحص (1 ن) وتطعيم 4 مل لب والمضادات الحيوية المناسبة بين عشية وضحاها ثقافة / مستعمرة الفردية. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.
    3. عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام البلازميد دنا العزلة كيت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. إعداد 20 ميكرولتر ندي + إكوري هضم رد فعل تحتوي على 150-500 نانوجرام من الحمض النووي و 1 ميكرولتر من كل انزيم مع 2 ميكرولتر من العازلة 10X المناسبة. في ثهو حالة، إضافة ندي و إكوري في نفس الوقت أن الجين من الفائدة سيكون بين مواقع تقييد. ويوصى السيطرة السلبية مع ناقلات بمغس فارغة. هضم لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.

3. إدراج جين 2 في ناقلات بمغس تحتوي على جين 1، PMGX- yfg1

  1. هضم تقييد PMGX- yfg1 مع أفري وعلاج مع الفوسفاتيز المعوية الساق (سيب).
    1. استخدام رد فعل هضم 40 ميكرولتر تحتوي على 0.5-1.5 ميكروغرام من الحمض النووي ناقلات (~ 5-10 ميكرولتر من الحمض النووي المعزول) و 1 ميكرولتر من أفري مع 4 ميكرولتر من العازلة 10X المناسبة. هضم لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية ثم قم بإضافة 1.5 ميكرولتر من سيب. اتركه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية.
  2. تقييد هضم PMGX- yfg2 مع أفري و زباي لتحرير الجين من الفائدة.
    1. استخدام 40 ميكرولتر هضم رد فعل تحتوي على 0.5-1.5 ميكروغرام من الحمض النووي و 1 μ؛ L من كل انزيم مع 4 ميكرولتر من المخزن المؤقت المناسب10x. هضم لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. تقييد هيدروكوريز هضم على نسبة مناسبة (0.7٪) الاغاروز هلام والمكوس إدراج والعناصر ناقلات باستخدام مشرط نظيفة / شفرة حلاقة (راجع الخطوات 2.2-2.3).
  4. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتحديد الحمض النووي 17 .
  5. ليغات 2 في pmGX- yfg1 باستخدام نسبة 3: 1 إدراج إلى متجه. إعداد ربط سلبي من PMGX- yfg1 هضمها دون إدراج إضافية. الإعداد كما هو موضح أعلاه في الخطوة 2.5.
  6. تحويل 5 ميكرولتر من ردود الفعل ربط خلايا XL1-الأزرق المختصة كيميائيا E. القولونية ، ليغاتد البلازميدات pMGX- yfg1،2 (التي تحتوي على الجينات في المصالح 1 و 2)، والسيطرة السلبية PMGX- yfg1 ، كما هو موضح في الخطوة 2.6.
  7. قارن عدد المستعمرات على لوحات التحكم والربط السلبية. نسبة عدد المستعمرات gريتر من 1: 2 هو المطلوب. إذا كان هناك عدد كبير من المستعمرات على لوحة التحكم السلبية، والعودة إلى الخطوة 3.1 ومراجعة العلاج سيب.
  8. حدد 4-8 المستعمرات الفردية (اعتمادا على السيطرة السلبية: نسبة الربط) من رد فعل ربط وتطعيم 4 مل من لب بالإضافة إلى المضادات الحيوية المناسبة لكل مستعمرة الفردية وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.
  9. عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام البلازميد دنا العزلة كيت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة وتحديد الحمض النووي 17 .
  10. شاشة الإدراج الفعال للجين الثاني من خلال تنفيذ هضم تقييد pMGX- yfg1،2 مع إكوري.
    1. استخدام 20 ميكرولتر هضم رد فعل تحتوي على 150-500 نانوغرام من الحمض النووي و 1 ميكرولتر من انزيم إكوري مع 2 ميكرولتر من إكوري العازلة 10X. هضم لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  11. إليكتروفوريز هضم تقييد على نسبة مناسبة هلام الاغاروز. والبحث عن الفرقة التي تتوافقs إلى حجم الجين 2 (انظر الخطوة 2.2). قد يدخل الجين في المتجه في الاتجاه غير المرغوب فيه، عكس.

4. إضافة الجين الثالث في ناقلات بمغس تحتوي على الجينات 1 و 2، PMGX- yfg1،2

  1. هضم تقييد PMGX- yfg1،2 مع أفري وعلاج مع سيب، كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  2. هيمستريكتيون ديجيست pMGX- yfg3 مع أفري و زباي، كما هو موضح في الخطوة 3.2.
  3. إليكتروفوريز هضم قيود على نسبة مناسبة هلام الاغاروز والمكوس إدراج والعصابات ناقلات باستخدام مشرط نظيفة / شفرة حلاقة. راجع الخطوات 2.2-2.3.
  4. استخراج الحمض النووي من هلام الاغاروز باستخدام مجموعة استخراج هلام وتحديد الحمض النووي 17 .
  5. ليغات 3 في pmGX- yfg1،2 باستخدام نسبة 3: 1 إدراج إلى ناقلات وإنشاء ربط سلبي من هضم PMGX- yfg1،2 دون إدراج إضافية، كما هو موضح في الخطوة 3.5.
  6. تحويل 5 ميكرولتر من ردود الفعل ربط في زل1-الزرقاء مختصة كيميائيا E. كولاي الخلايا، ليغاتد البلازميد pmGX- yfg1،2،3 (التي تحتوي على الجينات ذات الاهتمام 1 و 2 و 3)، والسيطرة السلبية PMGX- yfg1،2 ، كما هو موضح في الخطوة 2.6.
  7. قارن عدد المستعمرات على لوحات التحكم والربط السلبية. إذا كان هناك عدد كبير من المستعمرات على لوحة التحكم السلبية، والعودة إلى الخطوة 4.1 ومراجعة العلاج سيب.
  8. حدد 4-8 المستعمرات الفردية (اعتمادا على السيطرة السلبية: نسبة الربط) من رد فعل ربط وتطعيم 4 مل من لب بالإضافة إلى المضادات الحيوية المناسبة لكل مستعمرة الفردية. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.
  9. عزل الحمض النووي البلازميد باستخدام البلازميد دنا العزلة كيت وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  10. شاشة الإدراج الفعال للجين الثالث من خلال تنفيذ هضم تقييد pmGX- yfg1،2،3 مع إكوري، كما هو موضح في الخطوة 3.10.
  11. إليكتروفوريز هضم تقييد على نسبة مناسبة هلام الاغاروز. نظرةللعصابات التي تتوافق مع أحجام الجين 2 والجين 3 (انظر الخطوة 2.2). ملاحظة: قد يدخل الجين 3 في المتجه في الاتجاه غير المرغوب فيه، عكس. إذا كانت الجينات 2 و 3 بنفس الحجم، فيجب تحديد موقع آخر لهيكل تقييد مناسب للفحص.
    ملاحظة: كرر حسب الحاجة لكل جين جديد.

5. إنتاج بروتينات الفائدة باستخدام نظام التعبير مولتيجين وتقييم الإنتاج من قبل الغربية النشاف

  1. تحويل استنساخ إيجابي يحتوي على جميع الجينات ذات الاهتمام في كفاءة كيميائيا، والبروتين إنتاج E. القولونية ، مثل BL21- (λDE3).
    1. ذوبان الجليد 100 قسامة ميكرولتر من BL21- المختصة كيميائيا (λDE3) E. القولونية على الجليد لمدة 5 دقائق ومن ثم إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد المستنسخة إيجابية. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    2. صدمة الحرارة الخلايا لمدة 45 ثانية في حمام مائي عقد في 42 درجة مئوية ثم قم بإضافة 200 ميكرولتر من لب الباردة. احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    3. هز الخلايا عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة ثم تنتشر لوحة 100 ميكرولتر على لوحة لب-أجار تحتوي على علامة اختيار المناسبة (امبيسيلين أو كانامايسين).
  2. التعبير عن البروتين عن طريق إيسوبروبيل-β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت) الحث.
    1. حدد مستعمرة معزولة من لوحة التحول B21- (λDE3) وتطعيم 4 مل من لب بالإضافة إلى المضادات الحيوية المناسبة. تنمو بين عشية وضحاها، والهز عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.
    2. تطعيم 100 مل لب بالإضافة إلى ثقافة المضادات الحيوية المناسبة باستخدام 1 مل من الثقافة بين عشية وضحاها.
    3. تنمو عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة إلى أود 600 من 0.6.
    4. إغناء الثقافة مع 100 ميكرومتر إيبت وتنمو لمدة 15 ساعة عند 25 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.
    5. إزالة 1 مل من الثقافة وأجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف.
  3. ليس الخلايا باستخدام حل تحلل وفقا لتعليمات الشركة الصانعةوتشكيل لطخة غربية من المحللة الخلية القابلة للذوبان لتحديد ما إذا كانت جميع البروتينات أنتجت بنجاح 19 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذه الدراسة، كان الهدف هو المشاركة في التعبير عن خمسة بروتينات من البلازميد واحد. وقد تم شراء الشظايا الاصطناعية المثلى المكونة من خمسة كودون والتي ترميز إما علامات هيكساهستيدين N- أو C- الطرفية تجاريا. تم تضخيم الجينات الاصطناعية عن طريق ير واستنساخها بشكل فردي في ناقلات ير حادة ومتسلسلة. لتوليد البلازميد بوليسيسترونيك، تم استنساخ الجينات الخمسة من الفائدة لأول مرة في البلازميد بمغس المناسب، بمغس-A. ويبين الشكل 2 PCRBlunt- yfg1 و PCRBlunt- yfg2 بالإضافة إلى بمغس-A هضم مع ندي + إكوري (انظر الخطوة 2). لاستنساخ الجين الأولين في بمغس-A، تم هضم البلازميد مع ندي + إكوري ( الشكل 2 ). عند استنساخ الجينات ذات الاهتمام في بمغس-A، تم هضم البلازميدات التي شيدت حديثا، والمعينة باسم PMGX- yfg1 و PMGX- yfg2 ، مع أفري + زباي للتأكد من أن استنساخ ناجحة تم الحصول عليها، كماالموضحة في النطاقين 1.1 و كب 1،3 كب الذي تم الحصول عليهما في الشكل 3 .

الشكل 2
الشكل 2: استنساخ البلازميدات بمغس. تظهر النتائج المتوقعة من البلازميدات ير حادة تحتوي على yfg1 و yfg2 بعد الهضم مع ندي + إكوري على هلام الاغاروز 0.7٪ (110 V، 55 دقيقة). لين 1، 1 كب سلم الحمض النووي. لين 2، PCRBlunt- yfg1 ؛ لين 3، PCRBlunt- yfg2 ؛ حارة 4، بمغس-A السيطرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: فحص ال PMGX- yfg1 و PMGX- yfg2. ويظهر هلام الاغاروز 0.7٪ (110 V، 55 دقيقة) وهما العصابات التي يتم إنشاؤها بواسطة كل من PMGX- yfg1 و PMGX- yfg2 بعد الهضم مع أفري + زباي. لين 1، 1-كب سلم الحمض النووي. لين 2، pMGX- yfg1 ؛ لين 3، pMGX- yfg2 ؛ حارة 4، بمغس-A السيطرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مع كل من الجينات في ناقلات بمغ المناسب، تم بناء البلازميد بوليسيسترونيك. لتوليد البلازميد pmGX- yfg1،2 ، PMGX- yfg1 تم هضمها مع أفري، كما هو مبين في الشكل 4 . تم هضم pmGX- yfg2 مع أفري + زباي، وجين 1.3 كب التي تحتوي على جزء تم ربطها في موقع أفري من خطي PMGX- yfg1 ، توليد PGGX- yfg1،2 . هضم PMGX- yfg1،2 مع إكوري أكد الاستنساخ الناجح للبلازميد المطلوب ويظهر في> الشكل 5.

الشكل 4
الشكل 4: توليد البلازميد بيسيسترونيك pmGX- yfg1،2. نتائج الهلام الكهربائي 0.7٪ الاغاروز (110 V، 55 دقيقة) من PMGX- yfg1 هضمها مع أفري و PMGX- yfg2 هضمها مع أفري + زباي. لين 1، 1-كب سلم الحمض النووي. حارة 2، pMGX- yfg1 هضمها مع أفري. لين 3، pMGX- yfg2 هضمها مع أفري + زباي؛ حارة 4، بمغس-A السيطرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5
الشكل 5: فحص pmGX- yfg1،2 استنساخ . الناتج 0.7٪ هلام الاغاروز (110 فولت، 55 دقيقة) من بمغكسg1،2 استنساخ هضم مع إكوري يظهر. سوف استنساخ ناجحة تولد اثنين من العصابات، واحدة للجين yfg2 إدراج والآخر المقابلة العمود الفقري + yfg1 ( بمغس-yfg1 ). لين 1، 1 كب سلم الحمض النووي. حارة 2، PMGX- yfg1،2 هضمها مع إكوري، استنساخ 1؛ حارة 3، PMGX- yfg1،2 هضمها مع إكوري، استنساخ 2؛ حارة 4، بمغس-A السيطرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عند توليد البلازميد متعدد الستيرونيك يحتوي على اثنين أو أكثر من الجينات، يمكن للمرء أن يواجه الإدراج غير مرغوب فيه عكس الجين المستنسخ في موقع أفري. الشكل 6 هو هلام تسليط الضوء على الفرق بين نتائج البلازميد هضمها مع الجينات المدرجة في التوجه الصحيح بدلا من الجينات التي يتم إدراجها في الاتجاه عكسها. إذا كان الجين هوليغاتد واستنساخ في التوجه غير المرغوب فيه، سيتم إدراج موقع إكوري في نهاية الجين بجوار موقع إكوري من الجينات السابقة. وهذا من شأنه أن يسفر عن حجم شظية يكاد لا يمكن الكشف عنها من قبل هلام الكهربائي الحمض النووي (أقل من 50 نقطة أساس). وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجين إدراج آخر تظهر في العمود الفقري، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة نظرا لحجم العمود الفقري أكبر مما كان متوقعا. الفرق في حجم العمود الفقري من الحجم المتوقع سوف تشير إلى حجم آخر إدراج الجين.

الشكل 6
الشكل 6: فحص استنساخ pmGX- yfg1-5 . ويرد هلام الاغاروز 1.3٪ (110 V، 65 دقيقة) تصور نتائج PMGX- yfg1-5 هضمها مع إكوري. سوف استنساخ ناجحة (حارة 2) توليد الفرقة المقابلة لآخر إدراج الجين ( yfg5 في هذه الحالة، 1.1 كيلو بايت). لانe 1، 1-كب سلم الحمض النووي؛ حارة 2، استنساخ إيجابية من PMGX- yfg1-5، هضمها مع إكوري. حارة 3، استنساخ سلبي من PMGX- yfg1-5، هضمها مع إكوري. حارة 4، pmgx- yfg1-4 السيطرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لاستكمال ناقلات التعبير بوليسيسترونيك خمسة الجينات، تم استنساخ الجينات الثلاثة المتبقية واحدا تلو الآخر في PMGX- yfg1،2 لتوليد PMGX- yfg1-5 (انظر الخطوة 5). ثم تحولت هذه البلازميد إلى BL21- (λDE3)، والتعبير عن البروتينات كان مستحثا في منتصف مرحلة مرحلة الثقافة من خلال إضافة إيبت. الشكل 7 هو لطخة غربية من ليسيتس الخلية، مؤكدا أن جميع البروتينات الخمسة من البلازميد واحد يحتوي على جينات متعددة في أوبيرون واحد يمكن التعبير عنها. التعبير عن pMGX- yfg1 (التي تحتوي على 1 الجينات)،pmGX- yfg1،2 (التي تحتوي على 2 الجينات)، و PMGX- yfg1-5 (التي تحتوي على 5 الجينات).

الشكل 7
الشكل 7: تحليل لطخة غربية من التعبير متعدد الجينات باستخدام نظام بمغس. دمج إما N- أو C- محطة هيكساهستيدين العلامات تمكين الكشف لطخة غربية من التعبير البروتين. تم فصل العينات على ما قبل الصب 4-20٪ التدرج خالية من سلالة المواد الهلامية الأكريلاميد (200 V، 35 دقيقة، 10 سم × 8.5 سم)، ثم نقل (40 V، 90 دقيقة) على غشاء النيتروسليلوز (0.45 ميكرون، 10 سم × 7 سم). وقد استخدمت هرب مترافق مكافحة له الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، والتي لا تتطلب الأجسام المضادة الثانوية،. تم إعداد حظر، ونقل، والأجسام المضادة تخفيف الأجسام المضادة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة للأجسام المضادة. تم إجراء الكشف مع الركيزة هرب الغربية تشيميلومينسنت بعد إنزيرس الشركة المصنعةtructions. تم تصور الغشاء الناتج باستخدام تصوير بدون فلتر. حارة 1، ثنائي اللون القياسية نقلها على الغشاء (لا تشيميلومينسنت). لين 2، His6pMGX- yfg1 ؛ لين 3، His6pMGX- yfg1،2 ؛ لين 4، His6pMGX- yfg1-5. ملاحظة: البروتين الذي ينتجه yfg5 هو نفس حجم البروتين التي تنتجها yfg1 (كلاهما 36 كيلو دالتون) ولا يمكن فصلها على هلام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الأرقام الإضافية: الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويعتبر التعبير المشترك عن الجينات المتعددة أمرا ضروريا بشكل متزايد، خاصة في تحديد وإعادة تشكيل مسارات الأيض المعقدة المتعددة الأقطاب 3 و 4 و 5 . نظام بمغس يجعل مولتيجين شارك في التعبير في E. القولونية الروتينية 6 ، 7 ، 8 ويمكن الوصول إليها للباحثين متنوعة. في هذه الدراسة، أظهرت خمسة بروتينات للاهتمام أن تنتج في وقت واحد من نظام البلازميد واحد باستخدام بمغس-A. العديد من أنظمة التعبير المشترك المتاحة حاليا تسمح فقط لإدخال اثنين من الجينات، وتوليد البلازميدات بيسيسترونيك مثل ناقلات بيت ديت 12 . إذا كان المرء يتطلب إضافة المزيد من الجينات، مطلوب عدة ناقلات بيسيسترونيك مع علامات اختيار مختلفة. على النقيض من أنظمة التعبير مولتيجين أخرى، ونظام بمغس يسمح للاستنساخ الوجهمن الجينات متعددة في البلازميد واحد، مع القدرة على إعادة استخدام مواقع تقييد دون الحاجة إلى البلازميدات المانحة المختلفة أو لإزالة مواقع انزيم تقييد متعددة من الجينات 13 ، 14 . وتشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول تصميم الجينات، والوقاية من إعادة تدوير الخلفية من ناقلات بمغس هضمها منفردة، وشاشات من ناقلات بوليسيسترونيك للتوجه الصحيح للجين إدراجها.

في التخطيط لاستراتيجية الاستنساخ لبناء نظام بوليسيسترونيك، فمن الضروري التأكد من أن الجينات ذات الاهتمام لا تحتوي على مواقع تقييد المطلوبة لاستنساخ المصب. على وجه الخصوص، وتشمل هذه زباي و أفري، والتي هي مطلوبة لإدراج الجينات الثانية واللاحقة في ناقلات بمغس التي تحتوي على الجين الأول من الفائدة (الخطوات 3 و 4). وبالإضافة إلى ذلك، من الضروري إزالة مواقع التقييد التي ستستخدم للاستنساخ الأولي لل gإينس من الفائدة في بمغس (الخطوة 2). عادة، وتشمل هذه ندي أو نهي في نهاية 5 من الجين و بامهي أو إكوري في نهاية 3 من الجين، على الرغم من أن مواقع تقييد أخرى يمكن أن تستخدم أيضا لهذه الخطوة، إذا لزم الأمر. القضاء على مواقع تقييد إضافية، غير المرغوب فيها يمكن أن يؤديها بسهولة في مرحلة التوليف الجيني أو، في حالة الجينات المستنسخة من مصادر أخرى، عن طريق بدائل النوكليوتيدات مرادفة عن طريق الطفرات الموجهة للموقع 20 .

إضافة الجينات التالية من الاهتمام في بمغس التي تحتوي على الجين الأول من الفائدة يتطلب خطي من PMGX- yfg1 مع أفري (الخطوة 3.1؛ لاحظ أنه يمكن أيضا أن تكون خطي مع زباي). هذا ناقلات الخطية سوف تدين بسرعة خلال إدخال الجين الثاني من الفائدة (الخطوة 3.5)، مما يؤدي إلى عدد كبير للغاية من الحيوانات المستنسخة الخلفية. لتجنب هذا، فمن الضروري لعلاج ناقلات الخطية مع الفوسفاتيز إلى ديفوسفوريلات 5̸2. ينتهي من ناقلات الخطية. عادة، يتم استخدام سيب، على الرغم من أن البعض الآخر متاح. الأمثل من كل من وحدات الفوسفاتيز ووقت الحضانة قد تكون ضرورية لتحسين ربط الجينات اللاحقة من الفائدة في ناقلات الخطية.

وأخيرا، عند إنشاء نظام بوليسيسترونيك، يتم استئصال الجينات من الفائدة في البداية عن طريق الهضم مع زباي و أفري، وتوليد نهايات متماسكة التكميلية في 5 'و 3' ينتهي من الجين (خطوات 3.2 و 4.2). يمكن إدراج هذه الإدخال في ناقلات الخطية في الاتجاه إلى الأمام أو الاتجاه المعاكس. وبما أن جميع الغايات متماسكة متطابقة، لا يتم تنفيذ أي اتجاه من خلال الصلب التكميلية من نهايات متماسكة. وبالتالي فمن الضروري لفحص الحيوانات المستنسخة الناتجة عن الاتجاه الإدراج الصحيح للجين من الفائدة. ويمكن القيام بذلك بسهولة عن طريق فحص الحيوانات المستنسخة مع واحدة من المواقع تقييد تستخدم لاستنساخ الجين الأصلي من الفائدة في بمغس (الخطوة 2). عادة،يستخدم إكوري، حيث أن موقع التقييد هو في نهاية 3 'من الجين، وبالتالي فمن المناسب لفحص اتجاهي، كما هو مبين في الشكل 6 . في معظم الحالات، 50٪ من الحيوانات المستنسخة التي تحتوي على الجينات ذات الاهتمام لديها الجين في التوجه الصحيح و 50٪ لديهم الجينات في الاتجاه المعاكس.

نادرا (~ 10٪ من ربط)، جميع الحيوانات المستنسخة من ربط معين قد يكون الجينات من الفائدة المدرجة في اتجاه واحد فقط. ويبدو أن هذه النتيجة تعتمد على تسلسل، لأنه هو استنساخه للغاية في هذه الحالات المحددة. إذا حدث هذا، وجين الفائدة هو إدراج مستمر في الاتجاه العكسي، يمكن عادة الوصول إلى ناقلات المطلوب عن طريق تحويل اتجاه الاستنساخ. على سبيل المثال، بدلا من استنساخ yfg2 في موقع أفري من PMGX- yfg1 ، يمكن استنساخ yfg1 في موقع زباي من pMGX- yfg2 . لاحظ أن هذا يعطي ناقلات النهائي متطابقةالنظام. هذه المرونة المضافة تمكين الوصول إلى نفس النظام من استراتيجيات الاستنساخ مختلفة هو مفيد للغاية.

ومن القيود الهامة لهذه المنهجية أن البروتينات المشفرة في نهاية 3 'من نص بوليسيسترونيك عادة ما يتم التعبير عنها في مستويات أقل من البروتينات المشفرة في نهاية 5 من النص، وهذا التأثير هو أكثر وضوحا كلما كان النص هو أكثر وضوحا . وهذا يعني أن تغيير ترتيب الجينات ذات الاهتمام في أوبيرون الاصطناعية يمكن أن تؤثر على مستويات التعبير النسبي للبروتينات التي ترميز، وتوفير آلية لصقل مستويات التعبير النسبية.

وباختصار، يوفر نظام بمغس طريقة يمكن الاعتماد عليها للتعبير المشترك للبروتينات متعددة من البلازميد واحد في E. القولونية ، والتي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجيا الاصطناعية وتوصيف المسار الكيميائي الحيوي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box - PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Tags

علم الوراثة، العدد 124، البيولوجيا التركيبية، الكيمياء الحيوية، التعبير مولتيجين، أوبيرون الاصطناعية، بوليسيسترونيك، T7 رنا بوليميراز، دنا البلازميد.
مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hassan, M. I., McSorley, F. R.,… More

Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter