Summary
이 연구는 pMGX 플라스미드 시스템을 사용하여 대장균 에서 단일 플라스미드로부터 다중 유전자의 T7 매개 공동 - 발현을위한 방법을 기술한다.
Abstract
여러 단백질의 동시 발현은 합성 생물학, 단백질 - 단백질 복합체 연구, 생합성 경로 규명 및 활용에 점점 더 필수적입니다. 이 원고에서, 유도 성 T7 RNA 중합 효소의 조절하에 multigene 합성 오페론의 건설을위한 매우 효과적인 시스템의 사용이 설명된다. 이 시스템은 많은 유전자가 한 플라스미드에서 동시에 발현되도록합니다. 여기서, 암피실린 또는 카나마이신 내성 선택 마커 (A 및 K) 및 N 말단 헥사 히스티딘을 보유하거나 보유하지 않은 4 개의 관련된 벡터, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K 및 pMGX-hisK의 세트 태그 (his)가 공개됩니다. 이 벡터 시스템을 이용한 합성 오페론의 구축을위한 상세한 프로토콜은 대응 유전자와 함께 제공되어, 5 개의 유전자를 함유하는 pMGX- 기반 시스템이 용이하게 구축되어 대장균 에서 5 가지 암호화 된 단백질 모두를 생성하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 이 시스템em과 프로토콜을 사용하여 연구자는 대장균 에서 복잡한 다중 구성 요소 모듈과 경로를 일상적으로 표현할 수 있습니다.
Introduction
여러 단백질의 동시 발현은 점점 더 필수적이며, 특히 합성 생물학 분야에서 여러 기능적 모듈이 표현되어야한다. 단백질 단백질 복합체를 연구 할 때, 발현과 기능은 흔히 동시 발현 2 , 3을 필요로 한다. 경로의 각 유전자가 4 , 5 , 6 , 7 , 8 로 표현되어야하는 생합성 경로를 특성화하고 활용하는데있다. 실험실 재조합 단백질 발현을위한 작업 말인 대장균 (Escherichia coli) 에서 특히 공동 발현을위한 많은 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 선택성 마커가 다른 여러 플라스미드를 사용하여 다양한 다른 ex 압흔 벡터들 ( 10 , 11) . 다중 단백질 발현을위한 단일 플라스미드 시스템은 각 유전자의 발현을 조절하기 위해 다중 프로모터를 사용 하였다. 다수의 유전자가 단일 전사 물에 암호화되어있는 합성 오페론 2 , 13 ; 또는 어떤 경우에는 궁극적으로 단백질 분해 처리 된 폴리 펩타이드를 암호화하는 단일 유전자로 목적하는 목적 단백질을 생성한다.
그림 1 : polycistronic vector의 구조를 보여주는 pMGX workflow. pMGX 시스템은 유도 성 T7 프로모터의 제어하에 합성 오페론을 제조하기위한 유연하고 사용하기 쉬운 전략을 제공한다.e.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 원고에서 유도 성 T7 RNA 중합 효소 ( 그림 1 )의 제어하에 multigene 합성 오페론의 건설을위한 매우 효과적인 시스템의 사용이 설명됩니다. 이 시스템은 많은 유전자가 한 플라스미드에서 동시에 발현되도록합니다. 이것은 원래 pKH22라고 불리는 플라스미드 시스템에 기반을두고 있으며, 여러 가지 다양한 응용 분야에서 성공적으로 사용되고 있습니다. 6 , 7 , 8 . 여기서,이 플라스미드 세트는 4 개의 관련된 벡터, 즉 C- 또는 N- 말단 태그가없는 발현 벡터 인 pMGX-A 및 암피실린 내성 마커를 포함하도록 확대된다. pMGX-hisA, N- 말단 헥사 히스티딘 태그 및 암피실린 내성 마커를 코딩하는 발현 벡터; pMGX-K, 발현 벡터 l임의의 C- 또는 N- 말단 태그 및 카나마이신 내성 마커를 수취하는 단계; 및 N 말단 헥사 히스티딘 태그 및 카나마이신 내성 마커를 코딩하는 발현 벡터 인 pMGX-hisK. 이 연구에서, pMGX 시스템, 특히 pMGX-A를 사용하여 5 개의 유전자를 포함하는 폴리 시스트 론 벡터를 생성하는 방법이 대장균 에서 각각의 개별 단백질의 성공적인 생산과 함께 입증되었다.
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Protocol
1. 관심 유전자 얻기
- 합성 유전자를 디자인하십시오.
- 대장균 발현을위한 유전자 서열을 최적화하십시오.
- 염기 서열 (AvrII, NdeI, EcoRI 및 XbaI)에서 문제가되는 제한 효소 부위를 제거합니다.
- 복제를위한 제한 사이트 통합; 5'-NdeI 사이트 및 3'-EcoRI 사이트가 권장된다. 필요한 경우 다른 사이트를 사용할 수 있습니다. 선택된 플라스미드의 다중 클로닝 영역을 참조하십시오 ( 그림 S1- S4 ). 원하는 경우 Western blot detection을 위해 5 '또는 3'encoding tag를 포함하십시오.
- 상업적으로 설계된 유전자를 주문하십시오.
- 제조 업체의 지시에 따라 무딘 복제 키트를 사용하여 무딘 벡터에 유전자를 무작위로 복제하십시오. 유전자를 증폭시키는 프라이머를 디자인한다 (단계 1.2.2로 진행). 또는 pMGX 플라스미드에 직접 클로닝하기 위해 추가로 5 '및 3'말단을 첨가하고 단계 2로 진행한다. 여기서, th대표적인 결과는 관심있는 유전자를 무딘 복제 한 결과입니다.
- 원하는 유전자를 증폭하십시오 (설계되고 최적화 된 합성 유전자로부터, 또는 원하는 유전자를 포함하는 주형 DNA로부터). 15 .
- 클로닝을위한 제한 사이트가있는 프라이머 디자인; 5'-NdeI 사이트 및 3'-EcoRI 사이트가 권장된다. 필요한 경우 다른 사이트를 사용할 수 있습니다. 선택된 플라스미드의 다중 클로닝 영역을 참조하십시오 ( 그림 S1- S4 ). 원하는 경우 Western blot detection을 위해 5 '또는 3'encoding tag를 포함 시키십시오.
- PCR은 원하는 유전자를 증폭 15 .
- 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 PCR 분석 16 .
- 비특이적 증폭이있는 경우 젤 추출을 통해 증폭 된 유전자를 제거하십시오. 그렇지 않으면 효소 정화 키트를 사용하십시오.
- 흡광도를 확인하여 분광 광도계를 사용하여 DNA를 정량화하십시오260 nm에서의 e; 용리 완충액이없는 blank 17 .
2. 다중 유전자 발현 시스템 벡터 pMGX 18 에 대한 관심 유전자 클로닝
- 제한은 얻은 관심 유전자와 원하는 벡터 인 pMGX를 NdeI 및 EcoRI로 소화시킨다.
참고 : 많은 양의 재 원형화 된 플라스미드를 얻은 경우, EcoRI을 첨가하기 전에 1 시간 동안 NdeI 반응을 진행시킨다.- 0.5-1.5 μg의 DNA와 각 효소 1 μL를 포함하는 40 μL 다이제스트 반응을 적절한 10x 완충액 4 μL와 함께 사용하십시오.
- NdeI 및 EcoRI 소화를 위해 EcoRI 완충액을 사용하고 먼저 NdeI 엔도 뉴 클레아 제를 첨가한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 분해하십시오. 그런 다음 EcoRI 엔도 뉴 클레아 제를 첨가하고 다이제스트가 추가 시간 동안 진행되도록하십시오. NdeI는 DNA 말단에 가까운 절단에 민감하므로 EcoRI에 의한 초기 소화는 NdeI에 의한 효과적인 소화를 방해 할 수있다.
- 전기아가로 오스 젤에 제한 다이제스트를 ophorese (1 킬로바이트 유전자, 55 분 동안 110 V에서 0.7 % 아가로 오스 겔을 사용, 다른 유전자 크기에 대한 아가로 오스 겔의 비율을 선택하려면 참조 16 참조하십시오.
- 깨끗한 메스 또는 면도날을 사용하여 삽입 및 벡터 밴드를 잘라 내고 excised gel segment를 1.5 mL 튜브에 넣으십시오.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 아가로 오스 겔에서 DNA를 추출합니다.
- 3 : 1 인서트 - 벡터 비율을 사용하여 관심있는 유전자를 pMGX 벡터에 삽입한다. 삽입물없이 소화가 된 pMGX의 음성 연결을 설정하십시오.
- 1 μL의 T4 DNA ligase, 0.15-0.5 μg의 벡터 DNA (~ 5 μL) 및 3 : 1 insert-to-vector ratio와 크기에 기초한 적절한 양의 insert를 포함하는 20 μL 연결 반응을 설정하십시오 삽입 된 유전자; pMGX 백본의 크기는 5,312 ~ 5,504 bp입니다. 모든 것을 포함하는 부정적인 반응 반응 포함 bu삽입되는 유전자. 음성 대조군 연결 및 벡터 삽입 삽입 반응에서 벡터 DNA의 양이 동등한 지 확인하십시오.
- ligation 반응을 XL1-Blue 화학적으로 유능한 대장균 세포로 연결하고 플라스미드 pMGX- yfg1 (관심 유전자 1 포함), pMGX- yfg2 (관심 유전자 2 포함) ... pMGX- yfgn (관심 유전자 n 함유). 무균 기술 (바이오 안전성 캐비닛 내부 또는 화염 아래)을 사용하십시오.
- 화학적으로 유능한 XL1-Blue E. coli 의 100 μL 분량을 얼음 위에서 5 분 동안 녹인 다음 5 μL의 연결 반응을 추가하십시오. 얼음 위에서 30 분 동안 품어 낸다.
- 42 ° C에서 보관 한 수욕에서 45 초 동안 세포를 가열 충격을 가한 다음 차가운 LB 200 μL를 넣으십시오. 얼음 위에서 2 분 동안 품어 낸다.
- 1 시간 동안 37 ° C, 220 RPM에서 세포를 흔들고, 다음을 포함하는 LB- 한천 플레이트에 플레이트 100 μL을 펼칩니다.priate 선택 마커 (암피실린 또는 카나마이신).
- 양성 형질 전환 체를 스크리닝하십시오.
- 음성 대조군 및 연결 플레이트의 식민지 수를 비교합니다. 1 : 2보다 큰 식민지 비율이 요구됩니다. 음성 대조군 플레이트에 많은 수의 콜로니가 있으면 단계 2.1로 돌아가서 메모를 검토합니다.
- 스크리닝 (1 n)을 위해 삽입 된 다른 유전자의 각 연결 반응으로부터 4-8 개의 개별 콜로니 (음성 대조군에 따라 : 라이 게이션 비)를 선택하고 4 mL LB 및 적절한 항생제 밤새 배양 / 개별 콜로니에 접종한다. 37 ° C 및 220 rpm으로 흔들어서 밤새 배양하십시오.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA 분리 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다.
- 적절한 150X 버퍼 2 μL와 150-500 NG DNA 및 각 효소 1 μL를 포함하는 20 μL NdeI + EcoRI 다이제스트 반응을 설정하십시오. 에서NdeI와 EcoRI를 동시에 추가하여 관심 유전자가 제한 효소 사이에 삽입되도록하십시오. 빈 pMGX 벡터로 부정적인 제어가 권장됩니다. 37 ℃에서 2 시간 동안 수욕상에서 소화시킨다.
3. 유전자 1, pMGX - yfg1을 포함하는 pMGX 벡터에 유전자 2 삽입
- 제한 효소는 AvrII 로 pMGX- yfg1 을 소화시키고 종아 장 인산 가수 분해 효소 (CIP)로 치료한다.
- 0.5-1.5 μg의 벡터 DNA (~ 5 ~ 10 μL의 분리 된 DNA)와 1 μL의 Avr II를 포함하는 40 μL 다이 제스트 반응물을 적절한 10x 완충액 4 μL와 함께 사용합니다. 37 ° C에서 1.5 시간 동안 다이제스트 한 다음 CIP 1.5 μL를 첨가합니다. 37 ℃에서 30 분간 더 방치한다.
- 제한 효소 는 AvrII 및 XbaI로 pMGX- yfg2 를 분해하여 관심 유전자를 유리시킨다.
- 0.5-1.5 μg의 DNA와 1 μ를 함유하는 40 μL 분해 반응을 사용하십시오; 4㎕의 적절한 10x 완충액을 갖는 각 효소의 L. 37 ° C에서 2 시간 동안 분해하십시오.
- 전기 영동 제한은 적절한 퍼센트 (0.7 %) 아가로 오스 겔에서 소화되고 깨끗한 메스 / 면도날을 사용하여 삽입 및 벡터 밴드를 제거합니다 (2.2-2.3 단계 참조).
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출하고 DNA를 정량 17 .
- 3 : 1 인서트 - 벡터 비율을 사용하여 pMGX- yfg1에 Ligate 유전자 2를 삽입. 추가 삽입물이없는 pMGX- yfg1 의 음성 연결을 설정하십시오. 2.5 단계에서 위와 같이 설정하십시오.
- 단계 2.6에서 볼 수 있듯이 5 μL의 연결 반응을 XL1-Blue 화학적으로 유능한 대장균 세포로 연결하고 플라스미드 pMGX- yfg1,2 (관심 유전자 1 및 2 포함) 및 음성 pMGX- yfg1 대조 물을 연결 합니다.
- 음성 대조군 및 연결 플레이트의 식민지 수를 비교하십시오. 콜로니 카운트 비율 g1 : 2 이상이 필요합니다. 네거티브 컨트롤 플레이트에 많은 수의 콜로니가 있으면 단계 3.1로 돌아가서 CIP 처리를 검토하십시오.
- 라이 게이션 반응에서 4-8 개별 식민지 (부정적인 제어에 따라 : 결찰 비율)를 선택하고 개별 식민지 당 적절한 항생제 플러스 LB 4 ML을 접종하고 37 ° C와 220 RPM에서 하룻밤 자랍니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA 절연 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하고 DNA 17 정량.
- EcoRI로 pMGX- yfg1,2 의 제한 효소 절단을 수행하여 두 번째 유전자의 효과적인 삽입을 스크리닝 하십시오 .
- 150-500 ng의 DNA와 1 μL의 EcoRI 효소와 2 μL의 EcoRI 10x 완충액을 포함하는 20 μL 분해 반응을 사용하십시오. 37 ° C에서 2 시간 동안 분해하십시오.
- 적절한 퍼센트 아가 로스 겔에서 제한 다이제스트를 전기 영동한다; 해당하는 밴드를 찾는다.s를 유전자 2의 크기로 증가시킨다 (2.2 단계 참조). 유전자는 원하지 않는 역전 된 방향으로 벡터에 삽입 될 수 있습니다.
4. 유전자 1과 2, pMGX - yfg1,2를 포함하는 pMGX 벡터에 세 번째 유전자를 추가
- 제한은 AvrII 로 pMGX- yfg1,2 를 다이제스트하고 3.1 단계에서 볼 수 있듯이 CIP로 처리합니다.
- 제한 3.2 절에서 볼 수 있듯이 AvrII와 XbaI를 갖는 pMGX- yfg3 를 소화시킨다.
- 깨끗한 메스 / 면도날을 사용하여 적절한 퍼센트 아가로 오스 겔에서 제한 효소 절단 및 전기 용품 삽입 및 벡터 밴드의 전기 분해; 단계 2.2-2.3을 참조하십시오.
- 겔 추출 키트를 사용하여 아가로 오스 젤에서 DNA를 추출하고 DNA를 계량 17 .
- 3 : 1 삽입 대 벡터 비율을 사용하여 pMGX- yfg1,2 로 Ligate 유전자 3을 삽입하고 단계 3.5에서 볼 수 있듯이 추가 삽입없이 digested pMGX- yfg1,2 의 음성 연결을 설정합니다.
- 5 μL의 연결 반응을 XL로 전환1-Blue 화학적으로 유능한 대장균 세포, 단계 2.6에서 볼 수 있듯이 플라스미드 pMGX- yfg1,2,3 (관심 유전자 1, 2 및 3 포함) 및 음성 pMGX- yfg1,2 컨트롤을 연결했다.
- 음성 대조군 및 연결 플레이트의 식민지 수를 비교하십시오. 네거티브 컨트롤 플레이트에 많은 수의 콜로니가있는 경우 4.1 단계로 돌아가서 CIP 처리를 검토하십시오.
- 라이 게이션 반응에서 4 ~ 8 개의 개별 콜로니 (음성 대조군에 따라 결찰 비율에 따라)를 선택하고 개별 콜로니 당 적절한 항생제 + LB 4mL를 접종하십시오. 37 ° C와 220 rpm으로 밤새 자랍니다.
- 제조 업체의 프로토콜에 따라 플라스미드 DNA 분리 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리합니다.
- 단계 3.10에서 볼 수 있듯이 EcoRI로 pMGX - yfg1,2,3 의 제한 다이제스트를 수행하여 세 번째 유전자의 효과적인 삽입을 스크리닝 하십시오 .
- 적절한 퍼센트 아가 로스 겔에서 제한 다이제스트를 전기 영동한다; 보기유전자 2와 유전자 3의 크기에 상응하는 밴드 (2.2 단계 참조). 참고 : 유전자 3은 원하지 않는 반대 방향으로 벡터에 삽입 될 수 있습니다. 유전자 2와 3이 같은 크기라면, 다른 적당한 제한 다이제스트 사이트가 스크리닝을 위해 선택되어야한다.
참고 : 각 새 유전자에 대해 필요한만큼 반복하십시오.
5. Multigene 발현 시스템을 사용하여 관심있는 단백질 생산 및 Western Blotting에 의한 생산 평가
- 관심있는 모든 유전자를 포함하는 양성 클론을 BL21- (λDE3)과 같은 화학적으로 유능한 단백질 생산 대장균 으로 변형시킵니다.
- 화학적으로 유능한 BL21 - (λDE3) 대장균 의 100 μL 분량을 얼음에 5 분 동안 녹인 다음 1 μL의 양성 복제 된 플라스미드 DNA를 첨가하십시오. 얼음 위에서 30 분 동안 품어 낸다.
- 42 ° C로 유지 수조에서 45 초 동안 세포를 가열 충격을 가한 다음 차가운 LB 200 μL를 추가합니다. 얼음 위에서 2 분 동안 품어 낸다.
- 1 시간 동안 37 ° C와 220 RPM에서 세포를 흔들고 적절한 선택 마커 (암피실린 또는 카나마이신)가 들어있는 LB- 한천 플레이트에 플레이트 100 μL을 펴십시오.
- isopropyl-β-D-1- thiogalactopyranoside (IPTG) 유도로 단백질을 발현하십시오.
- B21 - (λDE3) 변형 플레이트에서 격리 된 식민지를 선택하고 적절한 항생제를 더한 LB 4 ML을 접종하십시오. 37 ° C 및 220 rpm으로 흔들어 밤새 성장.
- 하룻밤 배양 1 ML을 사용하여 적절한 항생제 문화 플러스 100 ML LB를 예방 접종.
- OD 600 이 0.6이되도록 220 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 성장시킵니다.
- 100 μM IPTG로 배양하고 25 ° C 및 220 rpm에서 15 시간 동안 성장시킵니다.
- 문화 1 ML을 제거하고 1 분 13,000 XG에서 원심 분리기; 상등액을 버린다.
- 제조 업체의 지침에 따라 용해 솔루션을 사용하여 세포를 Lyse용해성 세포 용 해물의 웨스턴 블럿을 수행하여 모든 단백질이 성공적으로 생산되었는지 여부를 확인하십시오 19 .
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Representative Results
이 연구에서 목표는 단일 플라스미드에서 5 개의 단백질을 동시에 발현시키는 것이 었습니다. N- 또는 C- 말단 헥사 히스티딘 태그를 암호화하는 5 개 코돈 최적화 된 합성 유전자 단편은 상업적으로 구매되었다. 합성 유전자를 PCR에 의해 증폭시키고 개별적으로 PCR-blunt 벡터에 클로닝하고 서열을 결정 하였다. 폴리 시스 트론 플라스미드를 생성하기 위해, 관심있는 5 개의 유전자를 먼저 적합한 pMGX 플라스미드, pMGX-A에 클로닝 하였다. 그림 2 는 NdeI + EcoRI (2 단계 참조)로 소화 한 pMGX - A뿐만 아니라 PCRBlunt - yfg1 과 PCRBlunt - yfg2 를 보여줍니다. 처음 두 유전자를 pMGX-A로 복제하기 위해 플라스미드를 NdeI + EcoRI로 절단 하였다 ( 그림 2 ). 관심있는 유전자를 pMGX-A에 클로닝하자마자, 새로 제조 된 플라스미드 (pMGX- yfg1 및 pMGX- yfg2 로 명명 됨) 를 AvrII + XbaI로 절단하여 성공적인 클론이 수득되는 것을 확인 하였다.도 3 에서 수득 된 1.1kb 및 1.3kb 밴드에 도시 된 것이다.
그림 2 : pMGX 플라스미드의 클로닝. NdeI + EcoRI로 소화 한 후 yfg1 및 yfg2를 함유 한 PCR- 평활성 플라스미드의 예상 결과는 0.7 % 아가 로즈 겔 (110V, 55 분) 상에 나타난다. 레인 1, 1kb DNA 사다리; 레인 2, PCRBlunt- yfg1 ; 레인 3, PCRBlunt- yfg2 ; 레인 4, pMGX-A 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : pMGX- yfg1 및 pMGX - yfg2의 스크리닝. 0.7 % 아가 로즈 겔 (110V, 55 분)은 AvrII + XbaI로 분해 한 후 pMGX- yfg1 및 pMGX- yfg2 둘 모두에 의해 생성 된 두 밴드. 레인 1, 1-kb DNA 사다리; 레인 2, pMGX- yfg1 ; 레인 3, pMGX- yfg2 ; 레인 4, pMGX-A 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
적절한 pMGX 벡터에서 두 유전자 모두로 폴리 시스 트론 플라스미드가 구축되었다. 플라스미드 pMGX- yfg1,2 를 생성하기 위해, 도 4에 나타낸 바와 같이, pMGX - yfg1을 AvrII 로 절단 하였다. pMGX- yfg2 를 AvrII + XbaI로 절단하고, 단편을 함유하는 1.3kb 유전자를 선형화 된 pMGX- yfg1 의 AvrII 부위에 연결하여 pMGX- yfg1,2 를 생성 시켰다 . EcoRI로 pMGX- yfg1,2 를 분해하면 목적하는 플라스미드의 성공적인 클로닝이 확인되었고,> 그림 5.
그림 4 : bicistronic plasmid pMGX- yfg1,2 생성 . AvrII로 분해 된 pMGX-yfg1 및 AvrII + XbaI로 분해 된 pMGX- yfg2 의 0.7 % 아가 로스 겔 전기 영동 결과 (110V, 55 분). 레인 1, 1-kb DNA 사다리; 레인 2, AvrII로 절단 된 pMGX-yfg1; 레인 3, AvrII + XbaI로 분해 된 pMGX-yfg2; 레인 4, pMGX-A 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 : pMGX- yfg1,2 클론의 스크리닝 . 생성 된 0.7 % 아가 로즈 겔 (110V, 55 분)의 pMGX- yfEcoRI로 절단 된 g1,2 클론을 나타낸다. 성공적인 클론은 삽입 된 유전자 yfg2 와 백본 + yfg1 ( pMGX-yfg1 )에 해당하는 두 개의 밴드를 생성합니다. 레인 1, 1kb DNA 사다리; 레인 2, EcoRI로 절단 된 pMGX- yfg1,2 , 클론 1; 레인 3, EcoRI로 절단 된 pMGX- yfg1,2 , 클론 2; 레인 4, pMGX-A 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2 개 이상의 유전자를 함유하는 폴리 시스 트론 플라스미드를 생성 할 때, AvrII 부위에 클로닝 된 유전자의 바람직하지 않은 역 삽입이 발생할 수있다. 도 6 은 역방향으로 삽입 된 유전자와는 대조적으로 정확한 배향으로 삽입 된 유전자를 갖는 분해 된 플라스미드의 결과 사이의 차이를 강조한 겔이다. 유전자가결찰되고 바람직하지 않은 방향으로 클로닝 될 때, 유전자 말단의 EcoRI 부위는 이전 유전자의 EcoRI 부위 바로 옆에 삽입 될 것이다. 이것은 DNA 겔 전기 영동 (50 bp 미만)에 의해 사실상 감지 할 수없는 조각 크기를 산출 할 것이다. 또한, 마지막으로 삽입 된 유전자는 백본 크기가 예상보다 크기 때문에 쉽게 식별 할 수있는 백본에 나타납니다. 예상되는 크기와 백본의 크기의 차이는 마지막으로 삽입 된 유전자의 크기를 나타냅니다.
도 6 : pMGX- yfg1-5 클론의 스크리닝 . EcoRI로 절단 된 pMGX- yfg1-5 의 결과를 나타내는 1.3 % 아가 로즈 겔 (110V, 65 분)이 도시되어있다. 성공적인 클론 (레인 2)은 마지막으로 삽입 된 유전자 (이 경우, yfg5 , 1.1kb)에 상응하는 밴드를 생성 할 것이다. Lane 1,1 kb DNA 사다리; 레인 2, EcoRI로 절단 된 pMGX- yfg1-5 의 양성 클론; 레인 3, EcoRI로 절단 된 pMGX- yfg1-5 의 음성 클론; 레인 4, pMGX- yfg1-4 컨트롤. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5 개 유전자 폴리 시스 트론 발현 벡터를 완성하기 위해, 나머지 3 개의 유전자를 pMGX- yfg1,2 에 차례로 복제하여 pMGX- yfg1-5 를 생성 시켰다 (단계 5 참조). 이 플라스미드를 BL21- (λDE3)로 형질 전환시키고 IPTG를 첨가하여 중간 대뇌 상 배양에서 단백질의 발현을 유도 하였다. 그림 7 은 단일 라이온에서 여러 유전자를 포함하는 단일 플라스미드의 5 개 단백질 모두를 발현 할 수 있음을 확인하는 세포 용 해물의 웨스턴 블 럿트입니다. pMGX- yfg1 (유전자 1 개 포함),pMGX- yfg1,2 (2 개 유전자 포함) 및 pMGX- yfg1-5 (5 개 유전자 포함)가 표시됩니다.
그림 7 : pMGX 시스템을 이용한 다중 유전자 발현의 Western blot 분석. N- 또는 C- 말단 헥사 히스티딘 태그의 혼입은 단백질 발현의 웨스턴 블롯 검출을 가능하게했다. 샘플을 프리 캐스트 4-20 % 그라디언트 스트레인 프리 아크릴 아마이드 젤 (200V, 35 분, 10cm x 8.5cm)에서 분리 한 다음 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (0.45㎛, 10 cm x 7 cm)을 수행 하였다. 2 차 항체를 필요로하지 않는 HRP- 접합 된 항 -His 모노클로 날 항체를 사용 하였다. 차단, 전달 및 항체 희석 완충액은 항체 제조자에 의해 권장되는대로 준비되었다. 검출은 제조사의 설명에 따라 Western Chemiluminescent HRP 기판으로 수행 하였다처참한. 생성 된 멤브레인을 필터가없는 이미 저 (imager)를 사용하여 시각화 하였다. 레인 1, 멤브레인에 전사 된 이중 색상 표준 (화학 발광이 아님). 레인 2, His6pMGX- yfg1 ; 레인 3, His6pMGX- yfg1,2 ; 레인 4, His6pMGX- yfg1-5. 주 : yfg5 에 의해 생성 된 단백질은 yfg1 에 의해 생성 된 단백질과 동일한 크기 이며 (둘 다 36 kDa 임) 겔상에서 분리 될 수 없다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
복합 유전자의 동시 발현은 특히 복잡하고 다중 유전자 대사 경로 3 , 4 , 5 를 특성화하고 재구성하는 데 점점 더 필수적입니다. pMGX 시스템은 대장균 루틴 6 , 7 , 8 에서 다중 유전자 동시 발현을 만들고 다양한 연구자가 접근 할 수 있도록한다. 이 연구에서는 관심있는 5 개의 단백질이 pMGX-A를 사용하여 단일 플라스미드 시스템에서 동시에 생산되는 것으로 나타났습니다. 현재 이용 가능한 많은 동시 발현 시스템은 pET Duet 벡터와 같은 bicistronic 플라스미드를 생성하는 2 개의 유전자의 삽입만을 허용한다. 더 많은 유전자를 추가해야하는 경우 선택 가능한 마커가 다른 여러 개의 bicistronic 벡터가 필요합니다. 다른 multigene 발현 시스템과는 달리, pMGX 시스템은 간편한 클로닝을 가능하게합니다다른 기증자 플라스미드를 필요로하지 않고 제한 효소를 재사용하거나 유전자로부터 다중 제한 효소 부위를 제거하는 능력을 가진 하나의 플라스미드로 다중 유전자의 도입. 이 프로토콜의 중요한 단계는 유전자 디자인, 단일 소화 pMGX 벡터의 백그라운드 재순환 방지 및 삽입 유전자의 올바른 방향에 대한 polycistronic 벡터의 스크린을 포함합니다.
polycistronic 시스템을 만들기위한 복제 전략을 계획 할 때, 관심 유전자가 downstream cloning에 필요한 제한 효소를 포함하지 않도록하는 것이 필수적이다. 특히, 이들은 제 1 및 제 2 유전자를 함유하는 pMGX 벡터에 두 번째 및 후속 유전자를 삽입하는데 필요한 XbaI 및 AvrII를 포함한다 (단계 3 및 4). 또한 g의 초기 복제에 사용될 제한 효소를 제거하는 것이 필수적입니다pMGX에 관심있는 사람 (2 단계). 전형적으로, 이들은 유전자의 5 '말단에 NdeI 또는 NheI 및 유전자의 3'말단에 BamHI 또는 EcoRI를 포함하지만, 필요하다면 다른 제한 사이트도이 단계에 사용될 수있다. 불필요한 제한 효소 부위의 제거는 유전자 합성 단계에서, 또는 다른 소스로부터 복제 된 유전자의 경우, 부위 지정 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis)을 통한 동의어 염기 치환에 의해 쉽게 수행 될 수있다.
관심있는 첫 번째 유전자를 포함하는 pMGX에 관심있는 후속 유전자를 추가하려면 AvrII 로 pMGX- yfg1 을 선형화해야한다 (단계 3.1; XbaI로 선형화 할 수도 있음). 이 선형화 된 벡터는 두 번째 관심 유전자 (단계 3.5)를 삽입하는 동안 신속하게 연결되어 매우 많은 수의 백그라운드 클론을 생성합니다. 이를 피하기 위해, 선형화 된 벡터를 포스 파타 아제로 처리하여 탈 인산화시키는 것이 필수적이다2; 선형화 된 벡터의 끝. 일반적으로 CIP가 사용되지만 나머지는 사용 가능합니다. 후속 유전자의 선형화 된 벡터로의 연결을 최적화하기 위해서는 포스 파타 아제 단위와 항온 처리 시간의 최적화가 필요할 수 있습니다.
마지막으로, 폴리 시스 트론 시스템을 생성 할 때, 관심 유전자는 XbaI 및 AvrII로 소화시킴으로써 초기에 절단되어 유전자의 5 '및 3'말단에서 상보 적 응집성 말단을 생성한다 (단계 3.2 및 4.2). 이 인서트는 정방향 또는 역방향으로 선형화 된 벡터에 연결할 수 있습니다. 모든 응집력이 동일하므로 응집력의 상보 적 어닐링을 통해 방향성이 적용되지 않습니다. 따라서 관심 유전자의 정확한 삽입 방향에 대한 결과 클론을 스크리닝하는 것이 필요합니다. 이것은 흥미있는 원래의 유전자를 pMGX로 복제하는 데 사용 된 제한 사이트 중 하나를 사용하여 클론을 스크리닝함으로써 쉽게 수행 할 수 있습니다 (2 단계). 일반적으로,제한 효소 부위는 유전자의 3 '말단에 위치하므로 EcoRI를 사용하므로 그림 6 과 같이 방향성을 스크리닝하는 것이 적절합니다. 대부분의 경우 관심 유전자를 포함하는 클론의 50 %는 올바른 방향으로 유전자를 가지고 50 %는 반대 방향으로 유전자를 가지고 있습니다.
드물게 (약 10 %의 결찰), 특정 결찰에서 유래 한 모든 클론은 관심 유전자를 한 방향으로 만 삽입 할 수 있습니다. 이러한 결과는 이러한 특정 사례에서 매우 재현 가능하기 때문에 서열에 의존적 인 것으로 보인다. 이것이 일어나고 관심 유전자가 역방향으로 연속적으로 삽입되는 경우 복제의 방향을 전환하여 일반적으로 원하는 벡터에 액세스 할 수 있습니다. 예를 들어, yfg2 를 pMGX-yfg1 의 AvrII 사이트에 클로닝하는 대신, yfg1 을 pMGX- yfg2 의 XbaI 사이트에 클로닝 할 수있다. 이것은 동일한 최종 벡터체계. 다양한 복제 전략으로 동일한 시스템에 액세스 할 수있는 유연성이 추가되어 매우 유용합니다.
이 방법론의 중요한 한계는 polycistronic 전 사체의 3 '말단에서 인코딩 된 단백질이 전형적으로 전 사체의 5'말단에서 인코딩 된 단백질보다 낮은 수준에서 발현되며,이 효과는 전 사물이 길수록 더 발음됩니다 . 이것은 합성 오페론에서 관심 유전자의 순서를 바꾸면 상대적인 발현 수준을 미세 조정하는 메커니즘을 제공하여 인 코드하는 단백질의 상대적 발현 수준에 영향을 미칠 수 있음을 의미합니다.
요약하면, pMGX 시스템은 다양한 합성 생물학 응용 및 생화학 적 경로 특성화에 사용될 수있는 대장균 의 단일 플라스미드로부터의 다중 단백질의 동시 - 발현에 대한 신뢰성있는 방법을 제공한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Natural Science and Engineering Research Council of Canada)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
References
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
