Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX

Published: June 27, 2017 doi: 10.3791/55187
* These authors contributed equally

Summary

Denne studien beskriver metoder for T7-mediert samuttrykk av flere gener fra et enkelt plasmid i Escherichia coli ved bruk av pMGX-plasmidsystemet.

Abstract

Samuttrykk av flere proteiner er stadig viktigere for syntetisk biologi, studerer protein-proteinkomplekser, og karakteriserer og utnytter biosyntetiske veier. I dette manuskriptet beskrives bruken av et svært effektivt system for konstruksjon av multigenene syntetiske operoner under kontroll av en inducerbar T7-RNA-polymerase. Dette systemet tillater mange gener å bli uttrykt samtidig fra ett plasmid. Her er et sett med fire relaterte vektorer, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K og pMGX-hisK, med enten ampicillin eller kanamycinresistensvelgerbar markør (A og K) og enten besitter eller mangler en N-terminalt heksahistidin Tag (hans) er beskrevet. Detaljert protokoller for konstruksjonen av syntetiske operoner som bruker dette vektorsystemet, er gitt sammen med de tilsvarende data, hvilket viser at et pMGX-basert system som inneholder fem gener lett kan konstrueres og brukes til å produsere alle fem kodede proteiner i Escherichia coli . Denne systEm og protokoll gjør det mulig for forskere å uttrykke komplekse multikomponentmoduler og veier i E. coli rutinemessig.

Introduction

Samuttrykk av flere proteiner blir stadig viktigere, særlig i syntetiske biologiske applikasjoner, hvor flere funksjonsmoduler må uttrykkes 1 ; Ved å studere protein-proteinkomplekser, hvor uttrykk og funksjon ofte krever samuttrykk 2 , 3 ; Og karakterisere og utnytte biosyntetiske veier, hvor hvert gen i stien må uttrykkes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Et antall systemer er blitt utviklet for samuttrykk, spesielt i vertsorganismen Escherichia coli , arbeidshesten for rekombinant proteinekspresjon 9 . For eksempel kan flere plasmider med forskjellige selekterbare markører brukes til å uttrykke individuelle proteiner ved å bruke et vell av forskjellige ex Trykkvektorer 10 , 11 . Enkelte plasmidsystemer for multipleproteinuttrykk har anvendt enten multiple promotorer for å kontrollere ekspresjonen av hvert gen 10 , 12 ; Syntetiske operoner, hvor flere gener er kodet på et enkelt transkripsjon 2 , 13 ; Eller i noen tilfeller et enkelt gen som koder for et polypeptid som i siste instans behandles proteolytisk, hvilket gir de ønskede proteiner av interesse 14 .

Figur 1
Figur 1: pMGX-arbeidsflyt som viser konstruksjonen av en polykistronisk vektor. PMGX-systemet gir en fleksibel, brukervennlig strategi for konstruksjon av syntetiske operoner under kontroll av en induktiv T7-promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I dette manuskriptet beskrives bruken av et svært effektivt system for konstruksjon av multigene syntetiske operoner under kontroll av en inducerbar T7-RNA-polymerase ( figur 1 ). Dette systemet tillater mange gener å bli uttrykt samtidig fra ett plasmid. Den er basert på et plasmidsystem, opprinnelig kalt pKH22, som har blitt brukt med suksess for en rekke forskjellige applikasjoner 6 , 7 , 8 . Her ekspanderes dette plasmidsettet for å inkludere fire relaterte vektorer: pMGX-A, en ekspresjonsvektor som mangler noen C- eller N-terminale merker og med ampicillinresistensmarkøren; PMGX-hisA, en ekspresjonsvektor som koder for et N-terminalt heksahistidintag og med ampicillinresistensmarkøren; PMGX-K, en ekspresjonsvektor lAkkingerer noen C- eller N-terminale koder og med kanamycinresistensmarkøren; Og pMGX-hisK, en ekspresjonsvektor som koder for en N-terminalt heksahistidin-tag og med kanamycinresistensmarkøren. I denne studien demonstreres fremgangsmåten for å generere en polykistronisk vektor som inneholder fem gener som bruker pMGX-systemet, spesielt pMGX-A, sammen med den vellykkede produksjonen av hvert enkelt protein i Escherichia coli .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Innhenting av interesser

  1. Design syntetiske gener.
    1. Optimaliser en gensekvens for E. coli- ekspresjon.
    2. Fjern eventuelle problematiske restriksjonsseter fra sekvensen (AvrII, NdeI, EcoRI og XbaI).
    3. Innlemme begrensningssteder for kloning; Et 5'-NdeI-sted og et 3'-EcoRI-område anbefales. Andre steder kan brukes, hvis det er nødvendig; Referer til multicloning regionen av det valgte plasmidet ( Figur S1- S4 ). Om ønskelig, inkludere en 5 'eller 3' koding merket for Western blot deteksjon.
    4. Kommercielt bestille det konstruerte genet.
    5. Enten klumpet klon genet i en stump vektor ved hjelp av et stumt kloning kit, i henhold til produsentens instruksjoner; Designe primere for å amplifisere genet (fortsett deretter til trinn 1.2.2); Eller tilsett ytterligere 5'- og 3'-ender for direkte kloning i et pMGX-plasmid og fortsett til trinn 2. Her, thE representative resultater er fra stump kloning av genene av interesse.
  2. Forsterk det ønskede genet (fra et designet og optimalisert syntetisk gen eller fra template DNA som inneholder det ønskede genet) 15 .
    1. Design primere med restriksjonsseter for kloning; Et 5'-NdeI-sted og et 3'-EcoRI-område anbefales. Andre steder kan brukes, hvis det er nødvendig; Referer til multicloning regionen av det valgte plasmidet ( Figur S1- S4 ). Om ønskelig, inkludere enten en 5 'eller 3' kodende tag for Western blot-deteksjon.
    2. PCR amplifiserer det ønskede gen 15 .
    3. Analyser PCR ved hjelp av agarosegelelektroforese 16 .
    4. Hvis det er uspesifikk amplifisering, rydder du opp det amplifiserte genet ved gelekstraksjon. Hvis ikke, bruk et enzym opprydningssett.
    5. Kvantifiser DNA ved å bruke et spektrofotometer ved å sjekke absorbansenE ved 260 nm; Blank med elueringsbuffer 17 .

2. Kloning av interessante interesser i et multigene uttrykkssystem Vector, pMGX 18

  1. Begrensning fordøyer det oppnådde gen av interesse og den ønskede vektor, pMGX, med Ndel og EcoRI.
    MERK: Hvis en stor mengde resirkulæriserte plasmider oppnås, la NdeI-reaksjonen fortsette i 1 time før tilsetning av EcoRI.
    1. Bruk en 40 μL fordøyelsesreaksjon som inneholder 0,5-1,5 μg DNA og 1 μl av hvert enzym med 4 μl av den passende 10x buffer.
    2. For en NdeI- og EcoRI-fordøyelse, bruk EcoRI-buffer og legg først til NdeI-endonuklease. Fordel i 1 time ved 37 ° C. Deretter tilsett EcoRI endonuclease, og la fordøyelsen gå videre i ytterligere en time. NdeI er følsom for spaltninger nær slutten av DNA, slik at opprinnelig fordøyelse av EcoRI kan forhindre effektiv fordøyelse av NdeI.
  2. ElectrOphorese begrensningsfordøyelsen på agarosegel (for et 1 kb-gen, bruk en 0,7% agarosegel ved 110 V i 55 minutter, for å velge prosent av agarosegelen for forskjellige genstørrelser, se referanse 16 .
  3. Punktsett og vektbånd med en ren skalpels- eller barberblad og plasser det ekskluderte gelsegmentet i et 1,5 ml rør.
  4. Ekstra DNA fra agarosegelen ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll.
  5. Ligere genet av interesse i pMGX-vektoren ved å bruke et 3: 1-sett-til-vektor-forhold; Sette opp en negativ ligering av fordøyd pMGX uten innsatsen.
    1. Sett opp en 20 μl ligasjonsreaksjon inneholdende 1 μl T4 DNA ligase, 0,15-0,5 μg vektor DNA (~ 5 μl) og en passende mengde innsats basert på et 3: 1-sett-til-vektor-forhold og størrelsen på Genet blir satt inn; PMGX backbones er mellom 5,312 og 5,504 bp i størrelse. Inkluder en negativ kontrollreaksjon som inneholder alt buT genet blir satt inn. Sørg for at mengden av vektor-DNA er ekvivalent i den negative kontrollligasjonen og vektor-pluss-innsatsligasjonsreaksjonene.
  6. Transformere ligeringsreaksjoner i XL1-Blå kjemisk kompetente E. coli- celler og ligerte plasmider pMGX- yfg1 (inneholder gen av interesse 1), pMGX- yfg2 (inneholder gen av interesse 2) ... pMGX- yfgn (inneholdende gen av interesse n). Bruk aseptisk teknikk (inne i et biosikkerhetsskap eller under en flamme).
    1. Tør 100 μl alikvoter av kjemisk kompetent XL1-Blå E. coli på is i 5 minutter og tilsett deretter 5 μl av ligeringsreaksjonene. Inkubér i 30 minutter på is.
    2. Varme-sjokk cellene i 45 s i et vannbad holdt ved 42 ° C og deretter tilsett 200 μL kaldt LB. Inkubér dem på is i 2 minutter.
    3. Rist cellene ved 37 ° C, 220 rpm i 1 time og deretter spre plate 100 μL på en LB-agarplate som inneholder en passendePriatvalgbar markør (enten ampicillin eller kanamycin).
  7. Skjerm klonene for positive transformanter.
    1. Sammenlign kolonitellingene på de negative kontroll- og ligeringsplatene. Et kolonifeltforhold på over 1: 2 er ønsket. Hvis det er et stort antall kolonier på den negative kontrollplaten, gå tilbake til trinn 2.1 og gå gjennom notatet.
    2. Velg 4-8 individuelle kolonier (avhengig av negativ kontroll: ligasjonsforhold) fra hver ligeringsreaksjon av de forskjellige genene som er satt inn for screening (1 n) og inokulere en 4 ml LB og passende antibiotikum over natten kultur / individuell koloni. Voks kulturer over natten med risting ved 37 ° C og 220 rpm.
    3. Isolere plasmid-DNA ved bruk av et plasmid-DNA-isolasjonskit i henhold til produsentens protokoll.
    4. Sett opp en 20 μl NdeI + EcoRI fordøyelsesreaksjon som inneholder 150-500 ng DNA og 1 μl av hvert enzym med 2 μl av den passende 10x buffer. I thEr tilfelle, legg til NdeI og EcoRI samtidig som genet av interesse vil være mellom restriksjonene. En negativ kontroll med den tomme pMGX-vektoren anbefales. Fordel i 2 timer ved 37 ° C i et vannbad.

3. Sette inn Gene 2 i pMGX Vector Containing Gene 1, pMGX- yfg1

  1. Begrensning fordøye pMGX- yfg1 med AvrII og behandle med kalveintestinal fosfatase (CIP).
    1. Bruk en 40 μl fordøyelsesreaksjon som inneholder 0,5-1,5 μg vektor DNA (~ 5-10 μl isolert DNA) og 1 μl AvrII med 4 μl av den passende 10x buffer. Fordel i 1,5 time ved 37 ° C og tilsett deretter 1,5 μL CIP. La det stå ved 37 ° C i ytterligere 30 minutter.
  2. Begrensning fordøye pMGX- yfg2 med AvrII og XbaI for å frigjøre genet av interesse.
    1. Bruk en 40 μL fordøyelsesreaksjon som inneholder 0,5-1,5 μg DNA og 1 μ; L av hvert enzym med 4 μl av den passende 10x buffer Fordel i 2 timer ved 37 ° C.
  3. Elektroforese restriksjon fordøyer på en passende prosent (0,7%) agarosegel og aksesserer innsatsen og vektorbåndene ved hjelp av et rent skalpell / knivblad (se trinn 2.2-2.3).
  4. Ekstraher DNA ved hjelp av et gelekstraksjonssett i henhold til produsentens protokoll og kvantifiser DNA 17 .
  5. Ligér gen 2 til pMGX- yfg1 ved å bruke et 3: 1-sett-til-vektor-forhold. Sett opp en negativ ligering av fordøyd pMGX- yfg1 uten tilleggsinnsatsen. Sett opp som ovenfor i trinn 2.5.
  6. Transform 5 μL ligeringsreaksjonene til XL1-Blå kjemisk kompetente E. coli- celler, ligerte plasmider pMGX- yfg1,2 (inneholdende gen av interesse 1 og 2) og negativ pMGX- yfg1- kontroll, som vist i trinn 2.6.
  7. Sammenlign koloniantallet på de negative kontroll- og ligeringsplatene. Et kolonifeltforhold gReater enn 1: 2 er ønsket. Hvis det er et stort antall kolonier på den negative kontrollplaten, gå tilbake til trinn 3.1 og gå gjennom CIP-behandlingen.
  8. Velg 4-8 individuelle kolonier (avhengig av negativ kontroll: ligasjonsforhold) fra ligeringsreaksjonen og inokuler 4 ml LB pluss det aktuelle antibiotikumet per individuell koloni og vokse over natten ved 37 ° C og 220 rpm.
  9. Isolere plasmid-DNA ved bruk av et plasmid-DNA-isolasjonskit i henhold til produsentens protokoll og kvantifisere DNA 17 .
  10. Skjerm den effektive innsetting av det andre genet ved å utføre en restriksjonsfordøyelse av pMGX- yfg1,2 med EcoRI.
    1. Bruk en 20 μL fordøyelsesreaksjon som inneholder 150-500 ng DNA og 1 μl EcoRI enzym med 2 μl EcoRI 10x buffer. Fordel i 2 timer ved 37 ° C.
  11. Elektroforese begrensningsfordøyelsen på en passende prosent agarosegel; Se etter et bånd som samsvarerS til størrelsen på gen 2 (se trinn 2.2). Et gen kan sette inn i vektoren i uønsket, reversert orientering.

4. Tilsetning av et tredje gen i pMGX vektorinnholdende gener 1 og 2, pMGX- yfg1,2

  1. Begrensning fordøye pMGX- yfg1,2 med AvrII og behandle med CIP, som vist i trinn 3.1.
  2. Begrensning fordøye pMGX- yfg3 med AvrII og XbaI, som vist i trinn 3.2.
  3. Elektroforese begrensningsfordøyelsene på en passende prosent agarosegel og punksjonsinnsats og vektorbånd ved bruk av et rent skalpels / knivblad; Se trinn 2.2-2.3.
  4. Ekstra DNA fra agarosegelen ved hjelp av et gelekstraksjonssett og kvantifiser DNA 17 .
  5. Ligér gen 3 til pMGX- yfg1,2 ved å bruke et 3: 1-sett-til-vektor-forhold og sett opp en negativ ligering av fordøyd pMGX- yfg1,2 uten ytterligere innsats, som vist i Trinn 3.5.
  6. Transform 5 μL ligeringsreaksjonene inn i XL1-Blå kjemisk kompetente E. coli- celler, ligert plasmid pMGX- yfg1,2,3 (inneholdende gener av interesse 1, 2 og 3) og negativ pMGX- yfg1,2- kontroll, som vist i trinn 2.6.
  7. Sammenlign koloniantallet på de negative kontroll- og ligeringsplatene. Hvis det er et stort antall kolonier på den negative kontrollplaten, gå tilbake til trinn 4.1 og se gjennom CIP-behandlingen.
  8. Velg 4-8 individuelle kolonier (avhengig av negativ kontroll: ligasjonsforhold) fra ligeringsreaksjonen og inokuler 4 ml LB pluss det aktuelle antibiotikumet per individuell koloni; Vokse over natten ved 37 ° C og 220 rpm.
  9. Isoler plasmid-DNA ved bruk av et plasmid-DNA-isolasjonskit i henhold til produsentens protokoll.
  10. Skjerm den effektive innsetting av det tredje genet ved å utføre en restriksjonsfordøyelse av pMGX- yfg1,2,3 med EcoRI, som vist i trinn 3.10.
  11. Elektroforese begrensningsfordøyelsen på en passende prosent agarosegel; seFor bånd som korresponderer med størrelsene av gen 2 og gen 3 (se trinn 2.2). Merk: gen 3 kan sette inn vektoren i uønsket, reversert orientering. Hvis gener 2 og 3 er av samme størrelse, må det velges et annet passende begrensningsfordøyelsessted for screening.
    MERK: Gjenta etter behov for hvert nytt gen.

5. Produsere protein av interesse ved bruk av et multigene Expressions System og vurdering av produksjon ved Western Blotting

  1. Transform den positive klonen som inneholder alle genene av interesse for kjemisk kompetent proteinproduksjon E. coli , slik som BL21- (XDE3).
    1. Tør 100 μl alikvoter av kjemisk kompetent BL21- (XDE3) E. coli på is i 5 minutter og tilsett deretter 1 μL av det positive klonede plasmid-DNA; Inkuber i 30 minutter på is.
    2. Varm støt cellene i 45 s i et vannbad holdt ved 42 ° C og tilsett deretter 200 μL kaldt LB. Inkubér på is i 2 minutter.
    3. Rist cellene ved 37 ° C og 220 rpm i 1 time og spred plate deretter 100 μl på en LB-agarplate inneholdende den passende selekterbare markøren (enten ampicillin eller kanamycin).
  2. Express protein ved isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) induksjon.
    1. Velg en isolert koloni fra transformasjonsplaten B21- (λDE3) og inokuler 4 ml LB pluss det aktuelle antibiotikumet; Vokse over natten, rist ved 37 ° C og 220 rpm.
    2. Inokuler en 100 ml LB pluss den passende antibiotiske kulturen ved bruk av 1 ml over natten kultur.
    3. Voks ved 37 ° C ved risting ved 220 rpm til en OD 600 på 0,6.
    4. Induktor kulturen med 100 μM IPTG og vokse i 15 timer ved 25 ° C og 220 rpm.
    5. Fjern 1 ml av kulturen og sentrifuger den ved 13 000 xg i 1 min; Kast supernatanten.
  3. Lyse cellene ved hjelp av lysisløsning i henhold til produsentens instruksjonerOg preform en Western blot av det løselige cellelysatet for å avgjøre om alle proteiner ble produsert med suksess 19 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne studien var målet å co-uttrykke fem proteiner fra et enkelt plasmid. De femkodonoptimaliserte syntetiske genfragmentene som koder for enten N- eller C-terminale heksahistidin-merker ble kjøpt kommersielt. De syntetiske gener ble amplifisert ved PCR og individuelt klonet i en PCR-stump vektor og sekvensert. For å generere den polykistroniske plasmid ble de fem interesserte genene først klonet inn i et egnet pMGX-plasmid, pMGX-A. Figur 2 viser PCRBlunt- yfg1 og PCRBlunt- yfg2 i tillegg til pMGX-A fordøyd med NdeI + EcoRI (se trinn 2). For å klone de to første gener i pMGX-A, ble plasmidet fordøyd med NdeI + EcoRI ( Figur 2 ). Ved kloning av genene av interesse for pMGX-A ble de nylig konstruerte plasmidene betegnet som pMGX- yfg1 og pMGX- yfg2 fordøyd med AvrII + XbaI for å bekrefte at vellykkede kloner ble oppnådd somVist i 1,1 kb og 1,3 kb band oppnådd i figur 3 .

Figur 2
Figur 2: Kloning av pMGX plasmider. De forventede resultatene av PCR-stumpe plasmider som inneholder yfg1 og yfg2 etter fordøyelsen med NdeI + EcoRI er vist på en 0,7% agarosegel (110 V, 55 min). Bane 1, 1 kb DNA-stige; Bane 2, PCRBlunt- yfg1 ; Bane 3, PCRBlunt- yfg2 ; Bane 4, pMGX-A-kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Screening av pMGX- yfg1 og pMGX- yfg2. 0,7% agarosegelen (110 V, 55 min) viser De to båndene som genereres av både pMGX- yfg1 og pMGX- yfg2 etter fordøyelsen med AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA-stige; Bane 2, pMGX- yfg1 ; Bane 3, pMGX- yfg2 ; Bane 4, pMGX-A-kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Med begge gener i den passende pMGX-vektoren ble det polykistroniske plasmid konstruert. For å generere plasmidet pMGX- yfg1,2 ble pMGX- yfg1 fordøyd med AvrII, som vist i figur 4 . PMGX- yfg2 ble fordøyd med AvrII + XbaI, og 1,3-kb-genet som inneholdt fragmentet ble ligert inn i AvrII-stedet av linearisert pMGX- yfg1 , genererer pMGX- yfg1,2 . Fordøyelse av pMGX- yfg1,2 med EcoRI bekreftet den vellykkede kloning av det ønskede plasmid og er vist i> Figur 5.

Figur 4
Figur 4: Generering av det bicistroniske plasmidet pMGX- yfg1,2. Resultatene på 0,7% agarosegelelektroforese (110 V, 55 min) av pMGX- yfg1 fordøyd med AvrII og pMGX- yfg2 fordøyd med AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA-stige; Bane 2, pMGX- yfg1 fordøyd med AvrII; Bane 3, pMGX- yfg2 fordøyd med AvrII + XbaI; Bane 4, pMGX-A-kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: Screening av pMGX- yfg1,2 kloner . Den resulterende 0,7% agarosegelen (110 V, 55 min) av pMGX- yfG1,2 kloner fordøyd med EcoRI er vist. Vellykkede kloner genererer to bånd, en for det innsatte genet yfg2 og den andre som svarer til ryggraden + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). Bane 1, 1 kb DNA-stige; Bane 2, pMGX- yfg1,2 fordøyd med EcoRI, klon 1; Bane 3, pMGX- yfg1,2 fordøyd med EcoRI, klon 2; Bane 4, pMGX-A-kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Ved generering av et polykistronisk plasmid som inneholder to eller flere gener, kan man oppleve en uønsket reversert innsetting av genet klonet inn i AvrII-stedet. Figur 6 er en gel som fremhever forskjellen mellom resultatene av et fordøyd plasmid med et gen satt inn i riktig orientering i motsetning til et gen som er satt inn i den reverserte orienteringen. Hvis genet erLigert og klonet i uønsket orientering, vil EcoRI-stedet ved enden av genet bli satt inn rett ved siden av EcoRI-stedet i det forrige gen. Dette ville gi en fragmentstørrelse som er nesten uoppdagelig ved DNA-gelelektroforese (mindre enn 50 bp). I tillegg vil det sist innsatte genet vises i ryggraden, som lett kan identifiseres på grunn av at ryggradsstørrelsen er større enn forventet. Forskjellen i ryggradens størrelse fra forventet størrelse vil indikere størrelsen på det sist innsatte genet.

Figur 6
Figur 6: Screening av pMGX- yfg1-5 kloner . En 1,3% agarosegel (110 V, 65 min) som viser resultatene av pMGX- yfg1-5 fordøyd med EcoRI, er vist. Vellykkede kloner (bane 2) vil generere et bånd som tilsvarer det sist innsatte genet ( yfg5 i dette tilfellet, 1,1 kb). LanE 1, 1-kb DNA-stige; Bane 2, positiv klon av pMGX- yfg1-5, fordøyd med EcoRI; Bane 3, negativ klon av pMGX- yfg1-5, fordøyd med EcoRI; Bane 4, pMGX- yfg1-4- kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

For å fullføre den femgen polykistroniske ekspresjonsvektor ble de gjenværende tre gener klonet etter hverandre i pMGX- yfg1,2 for å danne pMGX- yfg1-5 (se trinn 5). Dette plasmidet ble deretter transformert til BL21- (XDE3), og ekspresjon av proteiner ble indusert i en mid-log-fase-kultur ved tilsetning av IPTG. Figur 7 er et Western blott av cellelysater, som bekrefter at alle fem proteiner fra et enkelt plasmid som inneholder flere gener i en enkelt operon kan uttrykkes. Ekspresjonen av pMGX- yfg1 (som inneholder 1 gen),PMGX- yfg1,2 (inneholdende 2 gener), og pMGX- yfg1-5 (inneholdende 5 gener) er vist.

Figur 7
Figur 7: Western blot-analyse av multi-genekspressjon ved bruk av pMGX-systemet. Inkorporering av enten N- eller C-terminale heksahistidin-tagger gjorde det mulig for Western blot-deteksjon av proteinekspresjon. Prøver ble separert på forhåndsgjorte 4-20% gradientfri-fri akrylamidgeler (200 V, 35 min, 10 cm x 8,5 cm) og deretter en overføring (40 V, 90 min) på en nitrocellulosemembran (0,45 um, 10 cm x 7 cm) ble utført. HRP-konjugert anti-His monoklonalt antistoff, som ikke krever et sekundært antistoff, ble anvendt. Blokkering, overføring og antistoff fortynningsbuffere ble fremstilt som anbefalt av antistoffprodusenten. Deteksjon ble utført med Western Chemiluminescent HRP-substrat etter produsentens instructions. Den resulterende membran ble visualisert ved bruk av et bildebeholder uten et filter. Bane 1, dobbeltfarget standard overført til membranen (ikke kjemiluminescerende); Bane 2, His6pMGX- yfg1 ; Bane 3, His6pMGX- yfg1,2 ; Bane 4, His6pMGX- yfg1-5. Merk: Protein produsert av yfg5 har samme størrelse som proteinet produsert av yfg1 (begge er 36 kDa) og kan ikke skilles på gelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figurer: Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Samuttrykk av flere gener er stadig viktigere, særlig ved karakterisering og rekonstituering av komplekse, multigen metabolske veier 3 , 4 , 5 . PMGX-systemet gjør multigen co-ekspresjon i E. coli rutine 6 , 7 , 8 og tilgjengelig for ulike forskere. I denne studien ble fem proteiner av interesse vist å bli produsert samtidig fra et enkelt plasmidsystem ved bruk av pMGX-A. Mange samuttrykkssystemer som for øyeblikket er tilgjengelige, tillater bare innsetting av to gener, som genererer bikistroniske plasmider som pET Duet-vektorer 12 . Hvis man krever tillegg av flere gener, er det nødvendig med flere bicistroniske vektorer med forskjellige valgbare markører. I motsetning til andre multigenekspresjonssystemer, tillater pMGX-systemet faksekloningAv flere gener til ett plasmid, med evnen til å gjenbruke restriksjonssteder uten behov for forskjellige donorplasmider eller for fjerning av flere restriksjonsenzymsteder fra gener 13 , 14 . Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer gendesign, forebygging av bakgrunnsrekirkulering av enkeltfordelte pMGX-vektorer og skjermbilder av de polykistroniske vektorer for riktig orientering av det innsatte genet.

Ved planlegging av kloningsstrategien for å konstruere et polykistronisk system, er det viktig å sikre at genene av interesse ikke inneholder restriksjonssteder som kreves for nedstrøms kloning. Spesielt inkluderer disse Xbal og AvrII, som kreves for innsetting av det andre og etterfølgende gener i pMGX-vektoren som inneholder det første gen av interesse (trinn 3 og 4). I tillegg er det viktig å eliminere restriksjonsseter som skal brukes til den første kloning av gInteresser i pMGX (trinn 2). Vanligvis inkluderer disse NdeI eller NheI ved 5'-enden av genet og BamHI eller EcoRI ved 3'-enden av genet, selv om andre restriksjonsseter også kan anvendes for dette trinnet, om nødvendig. Eliminering av ekstra uønskede restriksjonssteder kan enkelt utføres ved gensyntesetrinnet eller, når det gjelder gener klonet fra andre kilder, ved synonymt nukleotidsubstitusjoner via stedrettet mutagenese 20 .

Tilsetningen av etterfølgende gener av interesse for pMGX som inneholder det første gen av interesse, krever linearisering av pMGX- yfg1 med AvrII (trinn 3.1, merk at den også kan lineariseres med XbaI). Denne lineære vektoren vil raskt religere under innsetting av det andre gen av interesse (Trinn 3.5), som fører til et ekstremt høyt antall bakgrunnskloner. For å unngå dette er det viktig å behandle den lineære vektoren med en fosfatase for å de fosforylere 52; Endene av den lineariserte vektoren. Vanligvis brukes CIP, selv om andre er tilgjengelige. Optimalisering av både enhetene av fosfatase og inkubasjonstiden kan være nødvendig for å optimalisere ligasjonene av påfølgende genene av interesse i den lineære vektoren.

Til slutt, ved generering av et polykistronisk system, blir genet av interesse utelatt ved fordøyelse med XbaI og AvrII, og genererer komplementære kohesive ender ved 5'- og 3'-endene av genet (trinn 3.2 og 4.2). Denne innsatsen kan ligeres inn i den lineariserte vektoren i frem- eller bakoverretningen. Da alle kohesive ender er identiske, blir ingen retningsstyrke tvunget gjennom komplementær annealing av de kohesive ender. Det er således nødvendig å skjermere de resulterende kloner for riktig innføringsretning av genet av interesse. Dette kan enkelt gjøres ved å skjerme kloner med et av restriksjonsstedene som brukes til å klone det opprinnelige genet av interesse for pMGX (trinn 2). Typisk,EcoRI brukes, da restriksjonsstedet er ved 3'-enden av genet, og det er således hensiktsmessig å skjerme for retningsstyrke, som vist i figur 6 . I de fleste tilfeller har 50% av klonene som inneholder genet av interesse genet i riktig orientering og 50% har genet i motsatt orientering.

Uvanlig (~ 10% av ligeringer) kan alle klonene fra en bestemt ligasjon ha det gen av interesse som er satt inn i bare én retning. Dette resultatet ser ut til å være sekvensavhengig, siden det er svært reproduserbart i disse spesifikke tilfellene. Hvis dette skjer, og genet av interesse kontinuerlig setter inn i omvendt orientering, kan den ønskede vektoren vanligvis nås ved å bytte retning av kloning. For eksempel, i stedet for kloning av yfg2 i AvrII- stedet av pMGX- yfg1 , kan yfg1 klones inn i Xbal-stedet av pMGX- yfg2 . Merk at dette gir den samme sluttvektorensystem. Denne ekstra fleksibiliteten som gir tilgang til det samme systemet fra forskjellige kloningsstrategier, er svært fordelaktig.

En viktig begrensning av denne metoden er at proteiner kodet ved 3'-enden av det polykistroniske transkrips vanligvis uttrykkes ved lavere nivåer enn proteiner kodet ved 5'-enden av transkripsjonen, og denne effekten er mer uttalt, jo lengre transkripsjonen er . Dette betyr at endring av rekkefølgen av genene av interesse i den syntetiske operonen kan påvirke de relative uttrykksnivåene av proteiner som de koder, og gir en mekanisme for finjustering av relative uttrykksnivåer.

Sammendrag gir pMGX-systemet en pålitelig metode for samuttrykk av flere proteiner fra et enkelt plasmid i E. coli , som kan brukes til en rekke syntetiske biologiske applikasjoner og for biokjemisk vei karakterisering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Canadas naturvitenskapelige og tekniske forskningsråd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enzymes
Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) New England Biolabs M0290S
AvrII New England Biolabs R0174S
EcoRI New England Biolabs R0101S
NdeI New England Biolabs R0111S
XbaI New England Biolabs R0145S
Herculase II Fusion DNA Polymerase Agilent Technologies 600677
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
1 kb DNA ladder New England Biolabs N3232L
4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels Bio-Rad 456-8095
50x TAE Fisher Thermo Scientific BP1332-4
Agar Fisher Thermo Scientific BP1423-500
Agarose Fisher Thermo Scientific BP160-500
Ampicilin Sigma-Alrich A9518-5G
BL21 (DE3) chemically comeptent cells Comeptent cell prepared in house
B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent Fisher Thermo Scientific PI78243
dNTP mix Agilent Technologies Supplied with polymerase
Gel Extraction Kit Omega D2500-02 E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972
Glycine Fisher Thermo Scientific BP381-1
His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse GenScript A00612
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate EMD Millipore WBKLS0100
IPTG Sigma-Alrich 15502-10G
LB Fisher Thermo Scientific BP1426-500
Methanol Fisher Thermo Scientific A411-20
Pasteurized instant skim milk powder Local grocery store No-name grocery store milk is adequate
Nitrocellulose membrane Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) 10600007 Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086
Plasmid DNA Isolation Kit Omega D6943-02 E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898
pMGX Boddy Lab Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca
Primers Intergrated DNA Technologies Design primers as needed for desired gene
Synthetic Gene Life Technologies Design and optimize as needed
Thick Blot Filter Paper Bio-Rad 1703932
Tris base BioShop TRS001.1
Tween-20 Sigma-Alrich P9416-50ML
XL1-Blue chemically competent cells Comeptent cell prepared in house
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
BioSpectrometer Eppendorf RK-83600-07
Gel box - PAGE Bio-Rad 1658005 Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell
Gel Imager Alpha Innotech AlphaImager EC
Incubator-oven Fisher Thermo Scientific 11-690-650D Isotemp
Incubator-shaker Fisher Thermo Scientific SHKE6000-7 MaxQ 6000
Personna Razors Fisher Thermo Scientific S04615
Power Pack Bio-Rad S65533Q FB300
Transilluminator VWR International M-10E,6W
Thermocylcer Eppendorf Z316091 Mastercycler Personal, supplied by Sigma
UV Face-Shield 18-999-4542
Waterbath Fisher Thermo Scientific 15-460-2SQ
Western Transfer Apparatus Bio-Rad 1703935 Mini-Trans Blot Cell

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
  2. Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
  3. Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
  4. Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
  5. Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
  6. Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
  7. Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
  8. Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
  9. Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
  10. Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
  11. Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
  12. Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
  13. Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
  14. Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
  15. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
  17. Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
  18. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
  19. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
  20. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).

Tags

Genetikk utgave 124 Syntetisk biologi biokjemi multigenet ekspresjon syntetisk operon polykistronisk T7 RNA polymerase plasmid DNA.
Inducerbart T7 RNA Polymerase-mediert Multigen Expressions System, pMGX
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hassan, M. I., McSorley, F. R.,More

Hassan, M. I., McSorley, F. R., Hotta, K., Boddy, C. N. Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX. J. Vis. Exp. (124), e55187, doi:10.3791/55187 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter