Summary
Denna studie beskriver metoder för det T7-medierade samuttrycket av multipla gener från en enda plasmid i Escherichia coli med användning av pMGX-plasmidsystemet.
Abstract
Samuttryck av multipla proteiner är allt viktigare för syntetisk biologi, studier av protein-proteinkomplex och karaktärisering och utnyttjande av biosyntetiska vägar. I detta manuskript beskrivs användningen av ett högeffektivt system för konstruktion av multigene syntetiska operoner under kontroll av ett inducerbart T7-RNA-polymeras. Detta system medger att många gener kan uttryckas samtidigt från en plasmid. Här är en uppsättning av fyra besläktade vektorer, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K och pMGX-hisK, med antingen ampicillin eller kanamycinresistens-selekterbar markör (A och K) och som antingen har eller saknar en N-terminal hexahistidin Tagg (hans) beskrivs. Detaljerade protokoll för konstruktionen av syntetiska operoner som använder detta vektorsystem tillhandahålls tillsammans med motsvarande data, vilket visar att ett pMGX-baserat system innehållande fem gener lätt kan konstrueras och användas för att producera alla fem kodade proteiner i Escherichia coli . Denna systEm och protokoll gör det möjligt för forskare rutinmässigt att uttrycka komplexa multipomponentmoduler och vägar i E. coli .
Introduction
Samuttryck av multipla proteiner är allt viktigare, särskilt i syntetiska biologiska tillämpningar, där flera funktionella moduler måste uttryckas 1 ; Vid studier av protein-proteinkomplex, där uttryck och funktion ofta kräver samuttryck 2 , 3 ; Och att karakterisera och utnyttja biosyntetiska vägar, där varje gen i vägen måste uttryckas 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Ett antal system har utvecklats för samuttryck, särskilt i värdorganismen Escherichia coli , arbetshästen för rekombinant proteinuttryck 9 för laboratorier. Till exempel kan flera plasmider med olika selekterbara markörer användas för att uttrycka individuella proteiner med användning av en mängd olika ex Pressvektorer 10 , 11 . Enkla plasmidsystem för multipelt proteinuttryck har använt antingen multipla promotorer för att styra uttrycket av varje gen 10 , 12 ; Syntetiska operoner, där flera gener kodas på ett enda transkript 2 , 13 ; Eller i vissa fall en enda gen som kodar för en polypeptid som i slutändan behandlas proteolytiskt, vilket ger de önskade proteinerna av intresse 14 .
Figur 1: pMGX-arbetsflöde som visar konstruktionen av en polykistronisk vektor. PMGX-systemet ger en flexibel, lättanvänd strategi för konstruktion av syntetiska operoner under kontroll av en inducerbar T7-promotor.E.com/files/ftp_upload/55187/55187fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
I detta manuskript beskrivs användningen av ett högeffektivt system för konstruktion av multigene syntetiska operoner under kontroll av ett inducerbart T7-RNA-polymeras ( Figur 1 ). Detta system medger att många gener kan uttryckas samtidigt från en plasmid. Det är baserat på ett plasmidsystem, ursprungligen kallat pKH22, som har använts framgångsrikt för ett antal olika applikationer 6 , 7 , 8 . Här expanderas denna plasmidsats för att innefatta fyra besläktade vektorer: pMGX-A, en expressionsvektor som saknar några C- eller N-terminala taggar och med ampicillinresistensmarkören; PMGX-hisA, en expressionsvektor som kodar för en N-terminal hexahistidintag och med ampicillinresistensmarkören; PMGX-K, en expressionsvektor lAckingera några C- eller N-terminala taggar och med kanamycinresistensmarkören; Och pMGX-hisK, en expressionsvektor som kodar för en N-terminal hexahistidintag och med kanamycinresistensmarkören. I denna studie demonstreras förfarandet för att alstra en polykistronisk vektor innehållande fem gener som använder pMGX-systemet, specifikt pMGX-A, tillsammans med den framgångsrika framställningen av varje enskilt protein i Escherichia coli .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Erhålla intressen av intresse
- Design syntetiska gener.
- Optimera en gensekvens för E. coli- uttryck.
- Ta bort eventuella problematiska restriktionsställen från sekvensen (AvrII, Ndel, EcoRI och Xbal).
- Inkorporera restriktionsställen för kloning; En 5'-NdeI-plats och en 3'-EcoRI-plats rekommenderas. Andra platser kan användas om det behövs. Hänvisa till multikloningsområdet hos den valda plasmiden ( Figur S1- S4 ). Om så önskas, inkludera en 5 'eller 3' kodning tagg för Western blot detektion.
- Kommersiellt beställ den designade genen.
- Antingen stumma klon genen i en trubbig vektor med hjälp av ett trubbigt kloningspaket, enligt tillverkarens instruktioner. Designa primers för att amplifiera genen (fortsätt sedan till steg 1.2.2); Eller tillsätt ytterligare 5'- och 3'-ändar för direkt kloning i en pMGX-plasmid och fortsätt till steg 2. Här, thE representativa resultat är från trubbiga kloning av generna av intresse.
- Förstärka den önskade genen (från en designad och optimerad syntetisk gen eller från mall-DNA innehållande den önskade genen) 15 .
- Designprimrar med restriktionsställen för kloning; En 5'-NdeI-plats och en 3'-EcoRI-plats rekommenderas. Andra platser kan användas om det behövs. Hänvisa till multikloningsområdet hos den valda plasmiden ( Figur S1- S4 ). Om så önskas, inkludera antingen en 5 'eller 3' kodning tagg för Western blot detektering.
- PCR amplifierar den önskade genen 15 .
- Analysera PCR med agarosgelelektrofores 16 .
- Om det finns ospecifik amplifiering, rengör den amplifierade genen genom gel extraktion. Om inte, använd ett enzym rengöringssats.
- Kvantifiera DNA genom att använda en spektrofotometer genom att kontrollera absorbansenE vid 260 nm; Blank med elueringsbuffert 17 .
2. Kloning av intressanta intressen i en multigene expressionssystemvektor, pMGX 18
- Restriktion digererar den erhållna genen av intresse och den önskade vektorn, pMGX, med Ndel och EcoRI.
ANMÄRKNING: Om en stor mängd recirkuläriserade plasmider erhålles, tillåta NdeI-reaktionen att fortsätta under 1 h före tillsats av EcoRI.- Använd en 40 μL digestionsreaktion innehållande 0,5-1,5 μg DNA och 1 μl av varje enzym med 4 μl av lämplig 10x buffert.
- För en Ndel och EcoRI digerering, använd EcoRI-buffert och lägg först NdeI-endonukleas. Smälta i 1 timme vid 37 ° C. Lägg sedan till EcoRI-endonukleas, och låt smältningen fortsätta i ytterligare en timme. Ndel är känslig för klyvningar nära DNA-änden, så initialt digestion av EcoRI kan förhindra effektiv digestion av NdeI.
- ElectrOphorese restriktionsfördelningen på agarosgelen (för en 1 kb-gen, använd en 0,7% agarosgel vid 110 V under 55 min; för att välja procent av agarosgelen för olika genstorlekar se referens 16 .
- Punktskattinsats och vektorband med hjälp av ett rent skalpell eller rakblad och placera det excise-rade gelsegmentet i ett 1,5 ml rör.
- Extrahera DNA från agarosgelen med hjälp av ett gel-extraktionssats enligt tillverkarens protokoll.
- Ligera genen av intresse i pMGX-vektorn med användning av ett 3: 1-insert-till-vektor-förhållande; Upprätta en negativ ligering av digererad pMGX utan insatsen.
- Ställ in en 20 μl ligationsreaktion innehållande 1 | jL T4 DNA-ligas, 0,15-0,5 jig vektor DNA (~ 5 jil) och en lämplig mängd insats baserat på ett 3: 1-sats-till-vektor-förhållande och storleken på Genen är insatt PMGX-ryggraden är mellan 5,312 och 5,504 bp i storlek. Inkludera en negativ kontrollreaktion som innehåller allt buT genen är införd. Se till att mängden vektor-DNA är ekvivalent i negativ kontrollligering och vektor plus-insert-ligeringsreaktionerna.
- Transformera ligeringsreaktioner i XL1-Blå kemiskt kompetenta E. coli- celler och ligerade plasmider pMGX- yfg1 (innehållande gen av intresse 1), pMGX- yfg2 (innehållande gen av intresse 2) ... pMGX- yfgn (innehållande gen av intresse n). Använd aseptisk teknik (inuti ett biosäkerhetsskåp eller under en flamma).
- Tina 100 μl alikvoter av kemiskt kompetent XL1-Blå E. coli på is under 5 minuter och tillsätt sedan 5 | il av ligeringsreaktionerna. Inkubera i 30 minuter på is.
- Värmchocka cellerna i 45 s i ett vattenbad hållet vid 42 ° C och tillsätt därefter 200 μL kall LB. Inkubera dem på is i 2 minuter.
- Skaka cellerna vid 37 ° C, 220 rpm i 1 h och sprid plattan 100 | il på en LB-agarplatta som innehåller en lämpligPriat-selekterbar markör (antingen ampicillin eller kanamycin).
- Skärma klonerna för positiva transformanter.
- Jämför koloniantalet på de negativa kontroll- och ligeringsplattorna. Ett koloniantalförhållande större än 1: 2 är önskvärt. Om det finns ett stort antal kolonier på den negativa kontrollplattan, gå tillbaka till steg 2.1 och granska noten.
- Välj 4-8 individuella kolonier (beroende på negativ kontroll: ligeringsförhållande) från varje ligeringsreaktion av de olika generna införda för screening (1 n) och ympa en 4 ml LB och lämplig antibiotikum över natten odling / individuell koloni. Odla odlingar över natten med skakning vid 37 ° C och 220 rpm.
- Isolera plasmid-DNA med användning av ett plasmid-DNA-isoleringskit enligt tillverkarens protokoll.
- Konfigurera en 20 μL NdeI + EcoRI-digestionsreaktion innehållande 150-500 ng DNA och 1 jil av varje enzym med 2 jil av lämplig 10x buffert. I thÄr fallet, lägg till NdeI och EcoRI samtidigt som genen av intresse kommer att ligga mellan restriktionsställena. En negativ kontroll med den tomma pMGX-vektorn rekommenderas. Smälta i 2 timmar vid 37 ° C i ett vattenbad.
3. Sätta in gen 2 i pMGX-vektorinnehållande gen 1, pMGX- yfg1
- Restriktion smälter pMGX- yfg1 med AvrII och behandlas med kalcintestinalfosfatas (CIP).
- Använd en 40 μl digereringsreaktion innehållande 0,5-1,5 μg vektor DNA (~ 5-10 μl isolerat DNA) och 1 μl AvrII med 4 μl av lämplig 10x buffert. Smälta i 1,5 h vid 37 ° C och tillsätt därefter 1,5 μl CIP. Låt den ligga vid 37 ° C i ytterligare 30 minuter.
- Restriktion smälter pMGX- yfg2 med AvrII och XbaI för att befria genen av intresse.
- Använd en 40 μL digestreaktion innehållande 0,5-1,5 μg DNA och 1 μL av varje enzym med 4 pl av lämplig 10x buffert. Smälta i 2 timmar vid 37 ° C.
- Elektrofores restriktion smälter på en lämplig procent (0,7%) agarosgel och exciserar insatsen och vektorbanden med ett rent skalpell / rakblad (se stegen 2.2-2.3).
- Extrakt DNA genom att använda ett gel extraktions kit enligt tillverkarens protokoll och kvantifiera DNA 17 .
- Ligera gen 2 i pMGX- yfg1 med ett 3: 1-insert-till-vektor-förhållande. Ställ in en negativ ligering av digererad pMGX- yfg1 utan den extra insatsen. Ställ in som ovan i steg 2.5.
- Transformera 5 μl av ligeringsreaktionerna i XL1-Blå kemiskt kompetenta E. coli- celler, ligerade plasmider pMGX- yfg1,2 (innehållande gen av intresse 1 och 2) och negativ pMGX- yfg1- kontroll, såsom ses i steg 2.6.
- Jämför koloniantalet på de negativa kontroll- och ligeringsplattorna. Ett koloniantalförhållande gReater än 1: 2 är önskvärt. Om det finns ett stort antal kolonier på den negativa kontrollplattan, gå tillbaka till steg 3.1 och granska CIP-behandlingen.
- Välj 4-8 individuella kolonier (beroende på negativ kontroll: ligeringsförhållande) från ligeringsreaktionen och ympa 4 ml LB plus lämpligt antibiotikum per enskild koloni och odla över natten vid 37 ° C och 220 rpm.
- Isolera plasmid-DNA med användning av ett plasmid-DNA-isoleringskit enligt tillverkarens protokoll och kvantifiera DNA 17 .
- Skärma den effektiva införandet av den andra genen genom att utföra en restriktionsförslutning av pMGX- yfg1,2 med EcoRI.
- Använd en 20 μl digereringsreaktion innehållande 150-500 ng DNA och 1 | il EcoRI-enzym med 2 | il EcoRI 10x buffert. Smälta i 2 timmar vid 37 ° C.
- Elektrofores restriktionsfördelningen på en lämplig procent agarosgel; Leta efter ett band som motsvararS till storleken av gen 2 (se steg 2.2). En gen kan införa i vektorn i den oönskade, omvänd orienteringen.
4. Lägga till ett tredje gen i pMGX-vektorinnehållande generna 1 och 2, pMGX- yfg1,2
- Restriktion smälter pMGX- yfg1,2 med AvrII och behandlas med CIP, vilket ses i steg 3.1.
- Restriktion smälter pMGX- yfg3 med AvrII och XbaI, vilket ses i steg 3.2.
- Elektrofores restriktionsmassan på en lämplig procent agarosgel och punktskattinsats och vektorband med användning av ett rent skalpell / rakblad Se Steg 2.2-2.3.
- Extrakt DNA från agarosgelen med hjälp av ett gel extraktions kit och kvantifiera DNA 17 .
- Ligera genen 3 i pMGX- yfg1,2 med användning av ett 3: 1-insert-till-vektorförhållande och upprätta en negativ ligering av digererad pMGX- yfg1,2 utan ytterligare insats, vilket ses i steg 3.5.
- Transformera 5 | il av ligeringsreaktionerna i XL1-Blå kemiskt kompetenta E. coli- celler, ligerad plasmid pMGX- yfg1,2,3 (innehållande intressen 1, 2 och 3) och negativ pMGX- yfg1,2- kontroll, såsom ses i steg 2.6.
- Jämför koloniantalet på de negativa kontroll- och ligeringsplattorna. Om det finns ett stort antal kolonier på den negativa kontrollplattan, gå tillbaka till steg 4.1 och granska CIP-behandlingen.
- Välj 4-8 individuella kolonier (beroende på negativ kontroll: ligeringsförhållande) från ligeringsreaktionen och ympa 4 ml LB plus lämpligt antibiotikum per enskild koloni; Växa över natten vid 37 ° C och 220 rpm.
- Isolera plasmid-DNA med användning av ett plasmid-DNA-isoleringskit enligt tillverkarens protokoll.
- Skärma den effektiva införandet av den tredje genen genom att utföra en restriktionsförslutning av pMGX- yfg1,2,3 med EcoRI, såsom ses i steg 3.10.
- Elektrofores restriktionsfördelningen på en lämplig procent agarosgel; seFör band som motsvarar storleken av gen 2 och gen 3 (se steg 2.2). Obs! Gen 3 kan infoga i vektorn i oönskad, omvänd orientering. Om gener 2 och 3 har samma storlek, måste en annan lämplig restriktionsmältningsplats väljas för screening.
OBS: Upprepa vid behov för varje ny gen.
5. Framställning av proteiner av intresse med användning av ett multigenetryckssystem och bedömning av produktion genom Western Blotting
- Transformera den positiva klonen som innehåller alla gener av intresse för kemiskt kompetent proteinproduktion E. coli , såsom BL21- (XDE3).
- Tina 100 μl alikvoter av kemiskt kompetent BL21- (XDE3) E. coli på is under 5 minuter och tillsätt sedan 1 jil av det positiva klonade plasmid-DNA; Inkubera i 30 minuter på is.
- Värme stöt cellerna i 45 s i ett vattenbad hållet vid 42 ° C och tillsätt därefter 200 μL kall LB. Inkubera på is i 2 minuter.
- Skaka cellerna vid 37 ° C och 220 rpm i 1 h och sprid plattan 100 μL på en LB-agarplatta innehållande lämplig selekterbar markör (antingen ampicillin eller kanamycin).
- Express proteinet genom isopropyl-p-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) induktion.
- Välj en isolerad koloni från transformationsplattan B21- (XDE3) och ympa 4 ml LB plus lämpligt antibiotikum; Växa över natten, skaka vid 37 ° C och 220 rpm.
- Inokulera en 100 ml LB plus lämplig antibiotikakultur med användning av 1 ml över natten odling.
- Växa vid 37 ° C med skakning vid 220 rpm till en OD 600 av 0,6.
- Inducera kulturen med 100 μM IPTG och odla i 15 h vid 25 ° C och 220 rpm.
- Avlägsna 1 ml odlingen och centrifugera den vid 13 000 xg under 1 min; Kassera supernatanten.
- Lyse cellerna med lysislösning enligt tillverkarens instruktionerOch förforma en Western blot av det lösliga cellysatet för att bestämma om alla proteiner framgångsrikt producerades 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie var målet att samuttrycka fem proteiner från en enda plasmid. De femkodonoptimerade syntetiska genfragmenten som kodar antingen N- eller C-terminala hexahistidinmarkörer inköptes kommersiellt. De syntetiska generna amplifierades genom PCR och klonades individuellt i en PCR-trubbig vektor och sekvenserades. För att generera den polykistroniska plasmiden klonades de fem generna av intresse först i en lämplig pMGX-plasmid, pMGX-A. Figur 2 visar PCRBlunt- yfg1 och PCRBlunt- yfg2 utöver pMGX-A digererad med Ndel + EcoRI (se steg 2). För att klona de två första generna i pMGX-A, spjälkades plasmiden med Ndel + EcoRI ( Figur 2 ). Vid kloning av generna av intresse i pMGX-A, digererades de nykonstruerade plasmiderna betecknade pMGX- yfg1 och pMGX- yfg2 med AvrII + XbaI för att bekräfta att framgångsrika kloner erhölls, såsomVisad i 1,1-kb- och 1,3-kb-banden erhållna i figur 3 .
Figur 2: Kloning av pMGX-plasmider. De förväntade resultaten av PCR-stumma plasmider innehållande yfg1 och yfg2 efter digestion med Ndel-EcoRI visas på en 0,7% agarosgel (110 V, 55 min). Bana 1, 1 kb DNA-stege; Spår 2, PCRBlunt- yfg1 ; Spår 3, PCRBlunt- yfg2 ; Bana 4, pMGX-A-kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Screening av pMGX- yfg1 och pMGX- yfg2. 0,7% agarosgelén (110 V, 55 min) visar De två banden som genereras av både pMGX- yfg1 och pMGX- yfg2 efter matsmältning med AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA-stege; Spår 2, pMGX- yfg1 ; Spår 3, pMGX- yfg2 ; Bana 4, pMGX-A-kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Med båda generna i den lämpliga pMGX-vektorn konstruerades den polykistroniska plasmiden. För att alstra plasmiden pMGX-yfg1,2 digererades pMGX- yfg1 med AvrII, såsom visas i figur 4 . PMGX- yfg2 digererades med AvrII + XbaI och 1,3-kb-genen innehållande fragmentet ligerades in i AvrII-stället av linjäriserad pMGX- yfgl , vilket genererade pMGX- yfg1,2 . Digestion av pMGX- yfg1,2 med EcoRI bekräftade framgångsrik kloning av den önskade plasmiden och visas i> Figur 5.
Figur 4: Generering av den bicistroniska plasmiden pMGX- yfg1,2. Resultaten av 0,7% agarosgelelektrofores (110 V, 55 min) av pMGX- yfgl digererad med AvrII och pMGX- yfg2 digererad med AvrII + XbaI. Lane 1, 1-kb DNA-stege; Bana 2, pMGX- yfg1 digererad med AvrII; Spår 3, pMGX- yfg2 digererad med AvrII + Xbal; Bana 4, pMGX-A-kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Screening av pMGX- yfg1,2 kloner . Den erhållna 0,7% agarosgelen (110 V, 55 min) av pMGX- yfG1,2 kloner digererade med EcoRI visas. Framgångsrika kloner kommer att generera två band, en för den infogade genen yfg2 och den andra som motsvarar ryggraden + yfg1 ( pMGX-yfg1 ). Bana 1, 1 kb DNA-stege; Bana 2, pMGX- yfg1,2 digererad med EcoRI, klon 1; Bana 3, pMGX- yfg1,2 digererad med EcoRI, klon 2; Bana 4, pMGX-A-kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Vid framställning av en polykistronisk plasmid innehållande två eller flera gener kan man stöta på en oönskad, omvänd införing av genen klonad i AvrII-stället. Figur 6 är en gel som markerar skillnaden mellan resultaten av en digererad plasmid med en gen insatt i korrekt orientering i motsats till en gen som införs i den omvända orienteringen. Om genen ärLigeras och klonas i oönskad orientering, kommer EcoRI-stället i slutet av genen att införas intill EcoRI-stället i den föregående genen. Detta skulle ge en fragmentstorlek som är praktiskt taget odetekterbar genom DNA-gelelektrofores (mindre än 50 bp). Dessutom skulle den senast infogade genen förekomma i ryggraden, vilket är lätt identifierbar på grund av att ryggradsstorleken är större än förväntad. Skillnaden i ryggradens storlek från den förväntade storleken kommer att indikera storleken på den senast infogade genen.
Figur 6: Screening av pMGX- yfg1-5 kloner . En 1,3% agarosgel (110 V, 65 min) som visar resultaten av pMGX- yfgl-5 digererad med EcoRI visas. Framgångsrika kloner (lane 2) kommer att generera ett band som motsvarar den senast införda genen ( yfg5 i detta fall, 1,1 kb). LanE 1, 1-kb DNA-stege; Bana 2, positiv klon av pMGX- yfg1-5, digererad med EcoRI; Bana 3, negativ klon av pMGX- yfg1-5, digererad med EcoRI; Bana 4, pMGX- yfg1-4- kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
För att slutföra den femgeniga polykistroniska expressionsvektorn klonades de återstående tre generna ena efter varandra i pMGX- yfg1,2 för att alstra pMGX- yfg1-5 (se steg 5). Denna plasmid transformerades sedan till BL21- (XDE3) och expression av proteinerna inducerades i en mid-log-fasodling genom tillsats av IPTG. Figur 7 är en Western blot av celllysat, vilket bekräftar att alla fem proteiner från en enda plasmid innehållande flera gener i en enda operon kan uttryckas. Uttrycket av pMGX- yfg1 (innehållande 1 gen),PMGX- yfg1,2 (innehållande 2 gener) och pMGX- yfg1-5 (innehållande 5 gener) visas.
Figur 7: Western blot-analys av multi-genuttryck med användning av pMGX-systemet. Införlivande av antingen N- eller C-terminala hexahistidinmarkörer möjliggjorde Western blot-detektering av proteinuttryck. Prover separerades på förgjutna 4-20% gradientfria akrylamidgeler (200 V, 35 min, 10 cm x 8,5 cm) och därefter en överföring (40 V, 90 min) på ett nitrocellulosamembran (0,45 um, 10 cm x 7 cm) utfördes. HRP-konjugerad anti-His monoklonal antikropp, som inte kräver en sekundär antikropp, användes. Blockerings-, överförings- och antikroppspädningsmedelsbuffertar framställdes såsom rekommenderas av antikroppstillverkaren. Detektion utfördes med Western Chemiluminescent HRP-substrat enligt tillverkarens instructions. Det erhållna membranet visualiserades med användning av en bildskärm utan filter. Bana 1, dubbelfärgstandard överförd till membranet (ej kemiluminescerande); Spår 2, His6pMGX- yfg1 ; Bana 3, His6pMGX- yfg1,2 ; Bana 4, His6pMGX- yfg1-5. Obs! Protein producerat av yfg5 är lika stor som proteinet producerat av yfg1 (båda är 36 kDa) och kan inte separeras på gelén. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggsuppgifter: Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Samuttryck av multipla gener är allt viktigare, särskilt vid karakterisering och rekonstituering av komplexa, multigena metaboliska vägar 3 , 4 , 5 . PMGX-systemet gör multigensamekspression i E. coli rutin 6 , 7 , 8 och tillgänglig för olika forskare. I denna studie visade sig fem proteiner av intresse att framställas samtidigt från ett enkelt plasmidsystem med användning av pMGX-A. Många samexpressionssystem som för närvarande är tillgängliga möjliggör endast insättning av två gener, vilket genererar bicistroniska plasmider såsom pET Duet-vektorer 12 . Om man kräver tillsättning av flera gener krävs flera bicistroniska vektorer med olika selekterbara markörer. I motsats till andra multigena expressionssystem möjliggör pMGX-systemet för enkel kloningAv multipla gener i en plasmid med förmågan att återanvända restriktionsställen utan behov av olika donatorplasmider eller för att avlägsna flera restriktionsenzymställen från generna 13 , 14 . Kritiska steg i detta protokoll innefattar gendesign, förebyggande av bakgrundscirkulärisering av singelt digererade pMGX-vektorer och skärmar av de polykistroniska vektorerna för korrekt orientering av den insatta genen.
Vid planering av kloningsstrategin för att konstruera ett polykistroniskt system är det viktigt att säkerställa att generna av intresse inte innehåller restriktionsställen som krävs för nedströms kloning. I synnerhet innefattar dessa Xbal och AvrII, vilka erfordras för införandet av den andra och följande generna i pMGX-vektorn innehållande den första genen av intresse (steg 3 och 4). Dessutom är det viktigt att eliminera restriktionsställen som kommer att användas för initial kloning av gIntressen i pMGX (steg 2). Typiskt innefattar dessa NdeI eller NheI vid 5'-änden av genen och BamHI eller EcoRI vid 3'-änden av genen, även om andra restriktionsställen också kan användas för detta steg, om så är nödvändigt. Eliminering av extra, oönskade restriktionsställen kan enkelt utföras vid gensyntessteget eller, i fallet med gener klonade från andra källor, genom synonymt nukleotidsubstitutioner via platsriktad mutagenes 20 .
Tillsatsen av efterföljande gener av intresse för pMGX innehållande den första genen av intresse kräver linearisering av pMGX- yfg1 med AvrII (steg 3.1, observera att det också kan linjäriseras med XbaI). Denna linjäriserade vektor religionerar snabbt under införandet av den andra genen av intresse (steg 3.5), vilket leder till ett extremt stort antal bakgrundskloner. För att undvika detta är det väsentligt att behandla den linjäriserade vektorn med ett fosfatas för att defosforylera 52; Ändarna av den linjäriserade vektorn. Vanligtvis används CIP, även om andra är tillgängliga. Optimering av både enheterna av fosfatas och inkubationstiden kan vara nödvändig för att optimera ligeringarna av efterföljande gener av intresse i den linjäriserade vektorn.
Slutligen, när ett polykistroniskt system bildas, exciseras genen av intresse initialt genom digestion med Xbal och AvrII, vilket genererar komplementära sammanhängande ändar vid 5'- och 3'-änden av genen (steg 3.2 och 4.2). Denna insats kan ligeras in i den linjäriserade vektorn i framåtriktningen eller bakåtriktningen. Eftersom alla kohesiva ändar är identiska, verkställs ingen riktning genom komplementär glödgning av de sammanhängande ändarna. Det är således nödvändigt att skärpa de resulterande klonerna för den korrekta införingsriktningen av genen av intresse. Detta kan enkelt göras genom att screena kloner med en av restriktionsställena som används för att klona den ursprungliga genen av intresse i pMGX (steg 2). Typiskt,EcoRI används, eftersom restriktionsstället ligger vid 3'-änden av genen, och det är således lämpligt att skärpa för riktning, såsom visas i figur 6 . I de flesta fall har 50% av klonerna innehållande genen av intresse genen i korrekt orientering och 50% har genen i motsatt orientering.
Sällan (~ 10% av ligationerna) kan alla kloner från en viss ligering ha genen av intresse införd i endast en riktning. Detta resultat verkar vara sekvensberoende, eftersom det är mycket reproducerbart i dessa specifika fall. Om detta inträffar och genen av intresse kontinuerligt införs i omvänd orientering, kan den önskade vektorn vanligtvis nås genom att växla riktningen av kloning. I stället för att klona yfg2 i AvrII-stället av pMGX- yfg1 kan till exempel yfgl klonas i Xbal-stället av pMGX- yfg2 . Observera att detta ger samma slutvektorsystemet. Denna extra flexibilitet som möjliggör åtkomst till samma system från olika kloningsstrategier är mycket fördelaktigt.
En viktig begränsning av denna metod är att de proteiner som kodas vid 3'-änden av det polykistroniska transkriptet typiskt uttrycks vid lägre nivåer än proteinerna kodade vid 5'-änden av transkriptet, och denna effekt är mer uttalad ju längre transkriptet är . Detta innebär att förändring av ordningen av generna av intresse för syntetisk operon kan påverka de relativa uttrycksnivåerna för proteinerna som de kodar, vilket ger en mekanism för finjustering av relativa expressionsnivåer.
Sammanfattningsvis tillhandahåller pMGX-systemet en tillförlitlig metod för samuttryck av multipla proteiner från en enda plasmid i E. coli , vilken kan användas för en mängd olika syntetiska biologiska tillämpningar och för karakterisering av biokemiska vägar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Kanada: s naturvetenskapliga och tekniska forskningsråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | New England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 1 kb DNA ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarose | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilin | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) chemically comeptent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| B-PER Bacterial Protein Extraction Reagent | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Supplied with polymerase | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, supplied by VWR Cat 3: CA101318-972 |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Methanol | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Pasteurized instant skim milk powder | Local grocery store | No-name grocery store milk is adequate | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrane PT 0.45 µm 200 mm x 4 m, supplied by VWR Cat #: CA10061-086 |
| Plasmid DNA Isolation Kit | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, supplied by VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Request from the Boddy Lab Contact cboddy@uottawa.ca | |
| Primers | Intergrated DNA Technologies | Design primers as needed for desired gene | |
| Synthetic Gene | Life Technologies | Design and optimize as needed | |
| Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Tris base | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue chemically competent cells | Comeptent cell prepared in house | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Gel box - PAGE | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubator-oven | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubator-shaker | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Razors | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Power Pack | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminator | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, supplied by Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
References
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Jochimsen, B., et al. Five phosphonate operon gene products as components of a multi-subunit complex of the carbon-phosphorus lyase pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (28), 11393-11398 (2011).
- Martin, V. J. J., Pitera, D. J., Withers, S. T., Newman, J. D., Keasling, J. D. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat. Biotechnol. 21 (7), 796-802 (2003).
- Ajikumar, P. K., et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in Escherichia coli. Science. 330 (6000), 70-74 (2010).
- Boddy, C. N., Hotta, K., Tse, M. L., Watts, R. E., Khosla, C. Precursor-directed biosynthesis of epothilone in Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 126 (24), 7436-7437 (2004).
- Lundgren, B. R., Boddy, C. N. Sialic acid and N-acyl sialic acid analog production by fermentation of metabolically and genetically engineered Escherichia coli. Org. Biomol. Chem. 5 (12), 1903-1909 (2007).
- Horsman, M. E., Lundgren, B. R., Boddy, C. N. N-Acetylneuraminic Acid Production in Escherichia coli Lacking N-Acetylglucosamine Catabolic Machinery. Chem. Eng. Commun. 203 (10), 1326-1335 (2016).
- Romier, C., et al. Co-expression of protein complexes in prokaryotic and eukaryotic hosts: experimental procedures, database tracking and case studies. Acta Crystallogr. D, Biol. Crystallogr. 62 (Pt 10), 1232-1242 (2006).
- Tolia, N. H., Joshua-Tor, L. Strategies for protein coexpression in Escherichia coli. Nat. Methods. 3 (1), 55-64 (2006).
- Chanda, P. K., Edris, W. A., Kennedy, J. D. A set of ligation-independent expression vectors for co-expression of proteins in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 47 (1), 217-224 (2006).
- Kim, K. -J., et al. Two-promoter vector is highly efficient for overproduction of protein complexes. Protein Sci. 13 (6), 1698-1703 (2004).
- Tan, S., Kern, R. C., Selleck, W. The pST44 polycistronic expression system for producing protein complexes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 40 (2), 385-395 (2005).
- Chen, X., Pham, E., Truong, K. TEV protease-facilitated stoichiometric delivery of multiple genes using a single expression vector. Protein Sci. 19 (12), 2379-2388 (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), (2012).
- Sukumaran, S. Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), (2011).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2016).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. J. Vis. Exp. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2016).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J. Vis. Exp. (27), (2009).
