Summary
As células progenitoras endoteliais (CPE) são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. Este método descreve o isolamento de EPCs humanos a partir de sangue periférico, bem como a identificação do seu potencial migratório contra amostras de soro de pacientes de cirurgia cardíaca.
Abstract
As células progenitoras endoteliais (CPE) são recrutadas a partir da medula óssea em condições patológicas como a hipóxia e são crucialmente envolvidas na neovascularização de tecidos isquémicos. A origem, classificação e caracterização de EPCs são complexas; Não obstante, dois sub-tipos importantes de EPCs foram estabelecidas: os chamados "early" EPCs (posteriormente referido como primeiros-EPCs) EPCs e tardio-excrescência (late-EPCs). Eles podem ser classificados pelo propriedades biológicas, bem como pela sua aparência durante a cultura in vitro. Enquanto EPCs "precoces" aparecem em menos de uma semana depois de a cultura de células mononucleares derivadas de sangue periférico em meios-CE específico, EPCs de fim de conseqüência pode ser encontrado após 2-3 semanas. EPCs Late-desdobramento ter sido reconhecido como estando directamente envolvido na neovascularização, principalmente através da sua capacidade de se diferenciar em células endoteliais maduras, enquanto que "cedo" EPCs expressar vários fatores angiogênicos como endógenaous carga para promover a angiogénese de um modo parácrino. Durante miocárdio a isquemia / reperfusão (I / R), vários factores controlar o homing de CPE para as regiões de formação de vasos sanguíneos.
Factor de inibição de migração de macrófagos (MIF) é uma citocina pró-inflamatória e ubiquamente expresso quimiocina-e como foi recentemente descrito como a função do regulador chave da migração EPCs em concentrações fisiológicas 1. Curiosamente, MIF é armazenado em piscinas intracelulares e pode rapidamente ser liberado na corrente sanguínea após vários estímulos (por exemplo, enfarte do miocárdio).
Este protocolo descreve um método para o isolamento seguro e cultura de início-EPCs a partir de sangue periférico humano adulto com base na selecção de células CD34-positivas com a cultura subsequente em meio contendo factores de crescimento endoteliais em placas revestidas com fibronectina para utilização em ensaios in vitro de migração contra amostras de soro dos pacientes cirúrgicos cardíacos. Além disso, oinfluência migratória de MIF em quimiotaxia de EPCs em comparação com outras citocinas de estimulação de angiogénese bem conhecido é demonstrada.
Introduction
As células progenitoras endoteliais (CPE) estão em circulação no sangue humano e têm a capacidade de se diferenciarem em células endoteliais 2. Eles participam na vasculogénese e são capazes de minimizar o dano causado por ferimentos inflamação e isquemia / reperfusão (I / R) de várias maneiras, 3 4. Por exemplo, EPCs mostram níveis elevados de enzimas antioxidantes intracelular, tal como a catalase, glutationa peroxidase ou superóxido dismutase de manganês (MnSOD) 5. A elevada resistência contra o estresse oxidativo permite EPCs para funcionar em microambientes com espécies elevados reactivas de oxigénio (ROS) após a lesão isquêmica 6. Estudos anteriores indicaram que também o número de CPE pode ser correlacionada com a reparação vascular e que um número reduzido de circulantes EPCs prevê a ocorrência de eventos cardiovasculares 7,class = "xref"> 8. No entanto, uma definição clara de um EPC ainda não foi encontrado. Até agora, não existe um marcador da superfície celular específico ou fenótipo consistente para CPE e estas células são muito raros no sangue periférico 9. Um EPC humana deve ser considerada como uma célula de circulação com a capacidade de contribuir para a reconstrução do endotélio lesionado e novas estruturas vasculares.
Uma maneira de isolar e caracterizar EPCs é através da adesão à fibronectina. Deste modo, a capacidade destas células é utilizado para mostrar uma aderência superior à fibronectina pratos revestidos em comparação com um tipo de colagénio, por exemplo, 3, 10, 11. No entanto, outros descobriram que o plaqueamento de células mononucleares em pratos revestidos com fibronectina sem qualquer passo de purificação anterior ou ainda leva a colónias incluindo células progenitoras mielóides, monócitos e linfócitos T 12, 13, 14. Além disso, neste caso, as plaquetas podem contaminar a fracção de células mononucleares (MNC) e transferir, assim, proteínas de membrana de plasma de todas as células aderentes 15.
Além da caracterização através de ensaios in vitro de adesão, uma combinação de diferentes marcadores de superfície de células é utilizado para descrever um tipo de célula considerado como um EPC. Neste caso, após a adesão mediada por fibronectina, as células são analisadas quanto ao atributos de tipo endotelial. Neste processo, os dois marcadores associados às células endoteliais, de lipoproteínas acetiladas de baixa densidade (AcLDL) e vascular do receptor do factor de crescimento endotelial 2 (VEGFR-2, KDR), desempenham um papel. As células endoteliais e macrófagos foram mostrados para tomar-se especificamente AcLDL em um processo chamado de "via celular sequestrante" 16. Outra proteína marcadora é KDR como o principal receptor de VEGF em endotelialAs células 17. No entanto, como EPCs em geral, são cultivadas em meio suplementado com factores de crescimento endoteliais e soro fetal de vitela, é possível que os macrófagos, que também pode ter sido erroneamente isolado, exibem um perfil de marcadores de tipo endotelial. Como foi mostrado anteriormente, se cultivadas em um meio com ar-endotelial, macrófagos expressam proteínas "específico-endoteliais" 18.
Em geral, existem duas categorias de EPCs dentro mais subtipos, os quais podem ser encontrados no sangue ou ser cultivadas in vitro. EPCs final-excrescência (late-EPCs) aparecem após 2-3 semanas de cultura. Estas células são integrados mais rápido para uma monocamada de células endoteliais da veia umbilical humana e pode formar tubos capilares 19. Além disso, os chamados "Early-EPCs" circulam no sangue para cerca de uma semana e agir de uma maneira mais passiva através da realização moléculas angiogénicas, tais como crescimento endotelial vascularfator (VEGF), ou CXCL8 19. Os pacientes com doença arterial coronariana (DAC) mostrou valores significativamente mais baixos de early-EPCs em comparação a um grupo controle sem DAC 20. Curiosamente, o mesmo grupo demonstrou valores mais elevados de final-EPCs em comparação com um grupo de controlo. Outro estudo mostrou que early-EPCs proteger CPE diferenciadas da apoptose em condições oxidantes, de uma forma parácrina 6. Portanto, os primeiros EPCs pode proporcionar efeitos protectores relevantes através da migração de outras células de uma forma automática ou parácrina dentro do sangue periférico.
Este protocolo descreve um método para purificar primeiros-EPCs em primeiro lugar isolar as PBMC-fracção a partir de sangue periférico humano e, subsequentemente, isolar as células CD34 + a partir de PBMC-fracção para limpar esta suspensão de células a partir de células não desejadas. O CD34 é um marcador, o qual é utilizado para o isolamento de células-tronco hematopoiéticas humanas 9 + são cultivadas em superfícies de cultura de tecidos revestidas com f ibronectina. Depois de três dias, o meio é mudado, perdendo assim todas as células não-aderentes. Finalmente, CPE isoladas são coradas para verificar a absorção de AcLDL e a presença de células endoteliais como KDR-marcador usando células activadas por fluorescência (FACS). Como um marcador adicional, analisamos molécula endotelial de adesão celular das plaquetas (PECAM-1, CD31), que também ocorre em células endoteliais.
Restauração do tecido do miocárdio danificado ou infartados pela maior recrutamento de EPCs pertence às estratégias de tratamento intensamente investigadas em doenças cardiovasculares. No entanto, a tradução de resultados experimentais para a prática clínica é ainda difícil, dado o complexo interacção celular no corpo humano durante várias condições fisiopatológicas. Além disso, o miocárdio I / R lesões desencadear uma secreção excessiva de diversas citoquinas, hormonas e FAC crescimento res, que controlam a homing de EPCs a regiões de formação de vasos sanguíneos 13. Tal como já foi mostrado, CXCL8, derivado de células do estroma fator 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF e factor inibidor da migração de macrófagos (MIF) estão significativamente aumentados em amostras de soro após lesão miocárdica de I / R 1. Entre esses fatores, MIF é uma citocina quimiocinas-like pleiotropic com características predominantemente pró-inflamatórias. Em contraste com o seu nome histórico, MIF tem funções pró-migratórios, actuando como uma verdadeira quimiocina em vários tipos de células de 1, 21, 22. Processos de recrutamento celular de MIF-mediadas foram ligados ao receptores de quimioquinas CXCR4 e CXCR2, que MIF se liga e activa de uma forma não-cognato 21. De nota, EPCs expressar ambos estes receptores na sua superfície, o qual, adicionalmente, tornam-se-reguladas sob condições hipóxicasass = "xref"> 23, 24. Além disso, evidências acumuladas sugerem que MIF tem um efeito global cardio-protector durante a lesão de I / R do coração 22, 25, 26. Neste contexto, foi ainda demonstrado que MIF pode apoiar a neovascularização durante o estresse hipóxico que é de particular relevância, quando se analisam os mecanismos de recuperação limitadas do miocárdio lesado 27. Anteriores estudos in vitro e experiências em modelos pré-clínicos de rato fornecida primeira evidência sobre o papel da MIF no EPCs recrutamento 4. De nota, MIF também é uma proteína de carga proeminente de EPCs que pode ser introduzida durante o recrutamento EPCs dentro de sites isquêmicas 28. No entanto, estudos em ambientes clínicos, em especial em comparação com outros (angiogênicas) citocinas séricas permanecem ainda desconhecidos.
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Protocol
Sangue para o isolamento de EPCs foi obtido de voluntários saudáveis após consentimento informado, de acordo com o comitê de ética local. As amostras de soro usados nos ensaios de migração foram obtidas de pacientes submetidos à cirurgia cardíaca convencional com o uso de circulação extracorpórea (CEC). Os critérios de exclusão foram operações de emergência, gravidez conhecida ou suspeita, do doente idade inferior a 18 anos, e falha na obtenção de consentimento informado. As amostras de soro foram desenhados para além das medições de rotina clínica (imediatamente antes da cirurgia e imediatamente após a reperfusão do miocárdio / abertura de aorta de pinçamento) e subsequentemente armazenado a -80 ° C até análise final. O (Comissão de Ética, RWTH Aachen University) de revisão institucional aprovou este estudo. Os pacientes apresentaram média de idade de 68,6 anos e um peso médio de 81,7 kg. doenças pré-existentes foram: hipertensão (65%), doença pulmonar crônica (19%), arteriopatia cardíaca extra (16%), disfunção cerebral (6%), angina instável (3%), enfarte do miocárdio recente (28% dentro de 90 d), doença renal crónica (14%), doença do fígado (2%) e a diabetes (34%).
1. Revestimento da garrafa T75:
- Prepare 5 mL de solução de fibronectina (1 mg de fibronectina humana diluída em 15 ml de água ultrapura) por frasco T75.
- Adicionar a solução para um frasco T75 e esperar até que a água é evaporada. Para evitar quaisquer interrupções desnecessárias durante o processo de isolamento devido à evaporação, efectuar este processo previamente (por exemplo durante a noite) e à temperatura ambiente. Esta solução dá 4,44 g de fibronectina / cm 2.
- Prepara-se o meio de crescimento celular endotelial MV2, completando a forma MV2 basal com suplementos de factor de crescimento fornecidos pelo fabricante.
2. Isolamento de células progenitoras endoteliais (CPE) a partir de 60 mL de sangue:
NOTA: Como o CD34 positivo selecção de cocktails umND as esferas magnéticas estão comercialmente disponíveis em um kit de selecção combinado, não há concentrações fornecidas pelo fabricante. No entanto, cerca de 100 ul do anticorpo são suficientes para o processamento de até 5 x 10 8 células. As pérolas magnéticas são diluídos em água, o dextrano-revestido e cerca 5,000x menor em comparação com outros grânulos disponíveis comercialmente. Para mais informações, consulte instruções do fabricante.
- Misture sangue (com ou sem anticoagulantes) 1: 1 com Ca 2+ Mg 2 + livre de PBS.
- Adicionar 15 ml de solução de gradiente de densidade por tubo de 50 mL. Para mais informações, consulte instruções do fabricante.
- Lentamente camada do sangue diluído em cima da solução de gradiente de densidade.
- Centrifugar as amostras a 2500 xg durante 30 minutos com a aceleração lenta e sem travagem.
- Recolher cuidadosamente a camada de creme leucocitário de cada tubo (Figura 1) usando uma pipeta de plástico estéril e colocá-lo em outro tubo.Evitar a recolha da solução de gradiente de densidade. O rendimento esperado PBMC é de aproximadamente 3-4 x 10 6 células / ml de sangue.
Figura 1: Densidade centrifugação em gradiente de Revestimento na Ficoll Solution Bbuffy. É mostrado o resultado da centrifugação em gradiente de densidade a 2500 xg durante 30 minutos na solução de gradiente de densidade. Descrito são os eritrócitos e granulócitos (vermelho), a fracção de células mononucleares (camada branca), plasma (amarela), e a solução do gradiente de densidade (esbranquiçado). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Dilui-se a fracção de células mononucleares de sangue periférico com pelo menos 3 volumes de PBS e misturar. Centrifuga-se a temperatura ambiente durante 15 min a 200 x g.
- Repita o passo 2.6 duas vezes. </ Li>
- Aspirar o sedimento celular sobrenadante e ressuspender em 5 mL de meio MV2.
- Adicionar 100 uL de anticorpo CD34 humano (suficiente para o processamento até 5 x 10 8 células) por buffy coat utilizado e girar durante 15 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Adicionar 50 uL de pérolas magnéticas revestidas com dextrano por buffy coat utilizado e girar durante 10 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Após a incubação, transferir a suspensão para tubos de FACS com um máximo de 3 mL em cada tubo. quantidades superiores não será permitida com o imã.
- Insira tubo (s) FACS para o ímã (s) e esperar por 5 min.
- Elimine o sobrenadante sem puxar os tubos de FACS fora do ímã.
- Ressuspender as células em cada tubo de FACS com 3 mL de meio MV2 fora do magneto.
- Repita os passos 2,12-2,14 duas vezes.
- Puxe os tubos FACS fora dos ímãs e ressuspender as células em 3 mL de meio MV2.
- Transferir a suspensão de células em pré-revestido T75 flasks e adicionar 17 mL de meio MV2 por frasco.
NOTA: O meio deve ser mudado após 3 dias. Após uma semana, as células mostram estruturas fusiformes (Figura 2) e está pronto para usar. Para uma negligência do isolamento ver Figura 3.
Figura 2: Imagem microscópica de isolado EPCs. É mostrada uma imagem representativa de isolado early-EPCs em um frasco T75 antes do destacamento. Aparente é a estrutura fusiforme do EPCs. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Fluxograma Mostrando o Procedimento de EPC isolamento. Retratado é um esquema, mostraing os passos individuais do protocolo de isolamento EPC. Para um protocolo mais detalhado ver Secção 2 na seção de protocolo.
3. Migration Assay
- Remover o meio das CPE no frasco T75.
- Lavar com 5 ml PBS, agitando-o com cuidado.
- Remover PBS e adicionar 5 ml de solução de separação celular comercial. Espere até que as células são separadas (verifique sob um microscópio). Acelerar o destacamento tocando cuidadosamente o fundo do frasco.
- Quando as células são separadas, adicionar rapidamente MV2 5 ml de meio completo e transferir a suspensão de células para outro tubo.
- Centrifugar a 2.000 xg durante 5 min.
- Ressuspender as células em 5-10 ml de PBS e centrifugar novamente a 2.000 xg durante 5 min.
- Repita o passo 3.6.
- Ressuspender o sedimento de células em meio de fome MV2 (50.000 células são necessários em 75 uL por poço transmigração).
NOTA: Qual sistema de migração é necessária depende do tipo de célula e ensaio. Existem diff diâmetros erent poros e tamanhos de placa (número de poços). Para EPCs um tamanho de poro de 5 um de 96 sistema assim é óptima. - Preparar a placa de migração através da adição de 235 ul da amostra de soro (soro diluído a 1: 5 em meio de fome MV2) para dentro da câmara inferior (Figura 4).
Figura 4: Ensaio de migração de uma câmara de Boyden modificada. É mostrada a concepção geral de uma câmara de Boyden modificada. As inserções de cultura de células (= câmara superior) estão indicados a azul escuro e são inseridos dentro da câmara inferior. A parte inferior (mas não as paredes) destas inserções representa o sistema de filtro incluindo os poros. (A) mostra a configuração no ponto de tempo zero. (B) depois de um ponto de tempo escolhido, as células são migraram através do filtro para um estímulo.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Adicionar a pastilha pouco antes de adicionar a solução de células.
- Adicionar 75 ul da solução de células (células = 50.000) para dentro da câmara superior.
- Deixe o EPCs migrar durante 3 h a 37 ° C e 5% de CO 2 (tempo de migração depende do tipo de célula e o sistema).
- Para evitar artefactos auto-fluorescência do soro, quantificar as células migraram por tirar fotos do bem sob um microscópio e contar as células utilizando o software semi-automático "ImageJ".
- Retire a câmara superior (contendo todas as células não migrados).
- Adicionar 70 ul solução de paraformaldeído a 3,6%, incluindo de corante Hoechst (diluído 1: 1000). A placa pode ser armazenada a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a noite.
- Centrifugar a placa em breve para obter todas as células em um mesmo plano focal a 2.000 xg por 1-2 min.
- Take 5 imagens por well (Figuras 5 e 6) com uma ampliação de 100x.
Figura 5: Esquema mostrando a posição das fotos tiradas. O esquema ilustra a posição das cinco fotografias tiradas, os quais são necessários para a determinação das células que migraram, em relação ao poço. As fotos são tiradas para contar as células e calcular um valor médio para cada poço. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imagem microscópica para a quantificação celular. É mostrada uma imagem representativa, que foi feita para quantificação celular. As células foram coradas e fixadas USIng de corante Hoechst, em 3,6% de paraformaldeído. Os pontos representam fixadas e coradas células progenitoras endoteliais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Contar as células que migraram, utilizando o software semi-automático "ImageJ" pelo Instituto Nacional de Saúde.
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Representative Results
Caracterização de isolados células endoteliais progenitoras
Em primeiro lugar, a absorção de AcLDL foi verificado, bem como a expressão de KDR, e CD31 sobre a superfície da população de células isoladas. Como mostra a figura 7A, 85,1% dos EPCs isoladas mostrou uma absorção de AcLDL e expressou CD31. As Figuras 7b e 7c mostram, adicionalmente, uma distribuição homogénea de ambos os marcadores, embora não parece haver uma população menor, negativa para ambos os marcadores. Numa segunda fase, foi realizada a análise de FACS de AcLDL em combinação com KDR. A Figura 8a mostra que mais de 80% das células isoladas mostraram uma captação de AcLDL e a expressão de KDR sobre a sua superfície. As Figuras 8b e 8c mostram a homogeneidade destes marcadores.
Para verificar a importance de pratos revestidos com fibronectina durante o tempo de cultura, uma comparação dos três marcadores entre células isoladas após dois dias de cultura em uma superfície revestida de fibronectina com EPCs isoladas após sete dias de cultura em placas revestidas com fibronectina (como indicado em nosso protocolo) foi realizada, tanto com células CD34 + -Selecção anterior. Como se mostra na figura 9a, apenas a 46,4% de células de dois dias de cultura mostrou uma absorção de AcLDL, bem como uma expressão de CD31 na sua superfície, em comparação com 85% das células ao fim de sete dias de cultivo sobre a fibronectina. Além disso, os histogramas (Figuras 9B e 9C) mostram menor intensidade de ambos os marcadores, após dois dias de cultura em comparação com sete dias (Figuras 7b e 7c). O mesmo é verdadeiro para uma combinação dos marcadores AcLDL e KDR. Após dois dias de cultura em fibronectina, apenas a 68,0% de todas as células mostrou uma absorção de AcLDL, bem como uma expressão de KDR sobre a sua superfície (Figuras 10a-10c). Após sete dias de cultura em fibronectina, 83,6% das células mostraram uma captação de AcLDL e expressão de KDR sobre a sua superfície (Figuras 8a-8c).
Num passo seguinte, avaliou-se a importância do CD34 + -Selecção durante o isolamento de EPCs. Portanto, as células seleccionadas em conformidade com o presente protocolo, incluindo densidade de centrifugação de gradiente e sete dias de cultura em fibronectina, mas que perdeu a CD34 + -Selecção foram isolados. Como mostrado na Figura 10a, mais de 18% de todos os isolados de células CD31 fazer nem explicita nem mostram uma absorção de AcLDL, em comparação com menos do que 8% células CD34 + após -Selecção, que mostram uma expressão de CD31 e uma absorção de AcLDL (Figura 7a) . Além disso, as figuras 11b e 11c mostram que as células isoladas são muito inhomogeneous sobre ambos os marcadores em comparação com a relativa
Os níveis séricos de citocinas durante a cirurgia cardíaca
Para identificar a influência da cirurgia cardíaca após miocárdio I / R sobre as concentrações circulantes de níveis séricos de MIF, CXCL12, CXCL8 e VEGF, as amostras de soro foram tiradas antes e intra-operatório para a análise subsequente por meio de ELISA disponível comercialmente (Figura 12) . Os níveis séricos de MIF mostrou um aumento intra-operatória significativa em relação aos valores basais (100,3 ng / mL vs. 127,4 ng / mL, p = 0,027). Do mesmo modo, os níveis de CXCL12 mostraram um aumento significativo no soro durante a cirurgia (0,101 ng / mL comparativamente com 0,198 ng / mL, p = 0,011). Semelhante ao MIF e CXCL12, CXCL8 aumentou significativamente durante a cirurgia (0,15 ng / mL comparativamente com 0,3 ng / ml, p = 0,022). em contrast, as concentrações de VEGF não mostrou mudanças significativas durante o período de observação (0,154 ng / mL vs. 0,134 ng / mL, p = 0,583) 1.
Capacidade migração de células endoteliais progenitoras
Para investigar o efeito directo das amostras de soro e o patients' nele contidas citocinas / quimiocinas / factores angiogénicos na migração EPC, um ensaio ex vivo, utilizando amostras de soro de migração, que foram tiradas antes e durante a cirurgia, foi realizada. EPCs foram isoladas a partir de voluntários saudáveis. Como representado na Figura 13, a taxa de migração EPC aumentou significativamente para as amostras tomadas intra-operatório em comparação com amostras pré-operatório tomadas (+ 35% em relação à linha de base, p = 0,047).
Uma vez que estudos anteriores já demonstraram que a I / R desencadeia uma secreção de sevcitocinas eral que modulam a quimiotaxia dos leucócitos e das migrações, ensaios de migração que utilizem estes chemoattractants potenciais, incluindo MIF, CXCL12, CXCL8 e VEGF foram realizadas. Para obter uma melhor compreensão da influência destas citocinas no recrutamento EPC adicionais in vivo, em experiências in vitro de migração, aplicando as concentrações fisiologicamente medidos das citocinas acima para a câmara inferior da migração foram realizados dispositivos, também.
Como as concentrações séricas de MIF entre 100 e 130 ng / mL foi medida (Figura 12), uma concentração de 100 ng / mL de MIF recombinante foi usado, o que levou a um aumento> 6 vezes na migração de EPC em comparação com o meio de controlo ( Figura 14). Em contraste, as concentrações séricas de CXCL12, CXCL8, VEGF e estavam na gama de 150-300 pg / ml. De nota, estas concentrações não mediou qualquer efeito sobre a migração EPC in vitro(Figura 14). Assim, é concebível que, entre estas quatro citoquinas, a MIF exibe a influência relativa mais forte sobre a migração in vivo EPC 1.
Figura 7: Análise FACS de CPE isoladas no Dia 7. (a) é mostrada a absorção de AcLDL CD31 e a expressão na superfície celular de EPCs isolado após selecção de CD34 + e período de 7 dias de cultura em placas revestidas com fibronectina. Superior esquerdo: células mostram absorção de AcLDL, mas não expressam CD31. superior direito: células mostram absorção de AcLDL e expressar CD31. Inferior esquerdo: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL e não expressam CD31. Inferior direito: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL, mas expressam CD31. (B) É mostrado o histograma de AcLDL PE-conjugado após absorção pelas EPCs isoladas. (C) É mostrado o histograma de FITC-conjanticorpo CD31 ugated depois de se ligar a CD31 da superfície celular de EPCs isoladas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Análise FACS de CPE isoladas no Dia 7. (a) é mostrada a absorção de AcLDL e KDR expressão na superfície celular de EPCs isolado após selecção de CD34 + e período de 7 dias de cultura em placas revestidas com fibronectina. Superior esquerdo: células mostram absorção de AcLDL, mas não expressam KDR. superior direito: células mostram absorção de AcLDL e expressam KDR. Inferior esquerdo: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL e não expressam KDR. Inferior direito: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL, mas expressam KDR. (B) É mostrado o histograma de AcLDL PE-conjugado após absorção pelas EPCs isoladas. (C) É mostrado ohistograma de anticorpo conjugado com FITC KDR após a ligação com KDR na superfície celular de CPE isoladas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Análise FACS de CPE isoladas no dia 2. (a) é mostrada a absorção de AcLDL CD31 e a expressão na superfície celular de EPCs isolado após selecção de CD34 + e período de dois dias de cultura em placas revestidas com fibronectina. Superior esquerdo: células mostram absorção de AcLDL mas não expressam CD31. superior direito: células mostram absorção de AcLDL e expressar CD31. Inferior esquerdo: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL e não expressam CD31. Inferior direito: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL, mas expressam CD31. (B) É mostrado o histograma de AcLDL PE-conjugado após absorção pelas EPCs isoladas. (
Figura 10: Análise FACS de CPE isoladas no dia 2. (a) é mostrada a absorção de AcLDL e KDR expressão na superfície celular de EPCs isolado após selecção de CD34 + e período de dois dias de cultura em placas revestidas com fibronectina. Superior esquerdo: células mostram absorção de AcLDL, mas não expressam KDR. superior direito: células mostram absorção de AcLDL e expressam KDR. Inferior esquerdo: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL e não expressam KDR. Inferior direito: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL, mas expressam KDR. (B) É mostrado o histograma de AcLDL conjugado com PE após absorçãopor EPCs isoladas. (C) É mostrado o histograma de anticorpo conjugado com FITC KDR após a ligação com KDR na superfície celular de CPE isoladas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Análise FACS de CPE isoladas no Dia 7. (a) é mostrada a absorção de AcLDL CD31 e a expressão na superfície celular de EPCs isolados sem anterior CD34 + de selecção, incluindo, mas período de 7 dias de cultura em placas revestidas com fibronectina. Superior esquerdo: células mostram absorção de AcLDL, mas não expressam CD31. superior direito: células mostram absorção de AcLDL e expressar CD31. Inferior esquerdo: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL e não expressam CD31. Inferior direito: células não mostram nenhuma absorção de AcLDL, mas expressam CD31. (B) Mostradoé o histograma de AcLDL PE-conjugado após absorção pelas EPCs isoladas. (C) É mostrado o histograma de anticorpo CD31 conjugado com FITC, após ligação a CD31 na superfície celular de CPE isoladas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Níveis de soro de citocinas durante a cirurgia cardíaca. A determinação das concentrações séricas de CXCL8, VEGF, CXCL12, e MIF dos pacientes submetidos a cirurgia cardíaca com ELISA. São mostrados os valores médios de pré-operatório em comparação com as concentrações intra-operatórias ± SEM (*: p <0,05; vs pré-OP)
Figura 13: Eun Migração Vitro de EPCs Rumo Soro do Doente. É mostrado o aumento intra-operatória na migração EPC de voluntários saudáveis em relação ao amostras de soro de pacientes, submetidos a cirurgia cardíaca. 50.000 células por poço em meio de fome MV2 soro foram adicionadas à câmara superior de um sistema Transwell. As amostras de soro na câmara inferior foram diluídas 1: 5 com o mesmo meio. As células migraram durante 3 h a 37 ° C e 5% de CO2 através de uma membrana de 5 um. As barras representam valores médios ± SEM (*: p <0,05)
Figura 14: In Vitro A migração de EPCs Para recombinante citocinas. É mostrada a migração de EPCs para concentrações representativas dos CXCL8 recombinante, CXCL12, VEGF, e de MIF em comparação com meio privadas de soro (= Linha de base). Apenas MIF foi capazpara mediar um aumento da migração CPE a concentrações fisiologicamente medidos. As citocinas recombinantes foram diluídas em meio de fome soro MV2. As células migraram para 3 h através de uma membrana de 5 um. As barras representam valores médios ± SEM (**: p <0,01 versus soro médio fome)
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Discussion
A primeira parte deste estudo incluiu o isolamento de EPCs humanos do sangue periférico de voluntários saudáveis para permitir uma avaliação completa do sangue de pacientes de cirurgia cardíaca. Portanto, uma centrifugação em gradiente de densidade foi realizada para separar a fracção de PBMC a partir de plasma, granulócitos e eritrócitos. Para remover a maioria dos contaminantes plaquetas, célula esta fracção foi submetida a curto e lavagem lenta os passos 29, 30. Em seguida, as células CD34 + foram isoladas a partir da fracção remanescente para separar as células progenitoras a partir das restantes linfócitos e monócitos. Finalmente, a suspensão de células foi cultivada em placas revestidas com fibronectina de um meio de crescimento de células endoteliais comercialmente disponível para separar células progenitoras endoteliais (a partir de outras células progenitoras) da linhagem mielóide 3. De nota, discute-se que as plaquetas pode mostrar uma expressa superfície celular CD34de iões, também. Embora os estudos anteriores demonstraram ligação de alguns anticorpos anti-CD34 a plaquetas, isto pode ser um artefacto devido à agregação das plaquetas com outras células CD34 positivas (31), 32. No entanto, a maioria das plaquetas podem ser separados por passos de lavagem repetidas lentas. Ao lado de plaquetas, seus precursores - megacariócitos - expressam este antígeno de células progenitoras hematopoiéticas e podem estar presentes no sangue periférico, embora eles são encontrados principalmente na medula óssea 33, 34. Além disso, também está descrito que a CD34 marcador da superfície celular, utilizados no presente protocolo é expresso em níveis muito baixos em células endoteliais maduras 35. Portanto, é importante considerar cautelosamente uma possível contaminação por megacariócitos plaquetas / ou células endoteliais maduras, quando se isola EPCs. Assim, passo 2.6 é de particular relevância durante o isolation de EPCs para remover plaquetas.
Para esclarecer a importância da cultura das células isoladas em pratos revestidos com fibronectina, populações de células depois de dois dias e sete dias de cultura em fibronectina foram comparados tanto com a seleção CD34-positiva anterior. No segundo dia, menos de metade das células isoladas mostraram uma captação de AcLDL e expressão simultânea de CD31 na sua superfície. Além disso, uma expressão menos intensa de ambos os marcadores em relação histogramas poderia ser visto. Estes dados mostram que sete dias de cultura em fibronectina em meio específico de células endoteliais são necessárias para obter CPE, mostrando os padrões de expressão endoteliais característicos. Neste passo, é de importância para utilizar a concentração / quantidade certa de f ibronectina. Wijelath e colegas demonstraram anteriormente que a fibronectina promove a expressão de padrões semelhantes a células endoteliais, provavelmente em combinação com VEGF 36.
Na próxima stEP do protocolo, a importância de células CD34 + -Selecção da suspensão de células foi investigada, comparando células isoladas após 7 dias de cultura em placas revestidas com fibronectina, com e sem células CD34 + -Selecção anterior. A quantidade de células que faltam ambos os marcadores (AcLDL absorção e expressão de CD31) foi muito mais elevada após o isolamento das células, sem células CD34 + anterior -Selecção comparada com o isolamento, incluindo este passo. Curiosamente, após sete dias de cultura em fibronectina, as células CD34 + em falta -Selecção mostrou uma população de células menos homogénea, conforme indicado pela expressão de CD31 não homogéneo em comparação com as células, isolado com células CD34 + -Selecção. Estes dados mostram que células CD34 + -Selecção é necessário para resolver outros EPCs de monócitos / macrófagos. Durante o estabelecimento deste protocolo, descobrimos que CD34 + -Selecção em meio MV2 a 37 ° C leva a um aumento do número de células sobreviventes, quando comparado com o muito menor temperatures, que precisa ser cuidadosamente investigada em estudos futuros. Temos de reconhecer que, ao aplicar este protocolo, a incubação de anticorpos em meio contendo cálcio, a 37 ° C pode levar a interações e ligação não específica. No futuro, os sistemas de tampão com falta de cálcio a temperaturas mais baixas devem ser testados e estabelecido para evitar este factor de confusão potencial.
Nomeadamente, durante a análise preliminar dos ensaios de migração de células com as amostras de soro, as medições foram realizadas primeiro utilizando um leitor de fluorescência de microplacas e calceína-coloração das células, como descrito previamente para diferentes tipos de células (por exemplo, células endoteliais da veia umbilical humana, as HUVEC) 37. Os valores de extinção diferentes entre as câmaras indicou que não só as amostras de soro por si só, mas também a forma já tem uma influência notável sobre a fluorescência medida, que necessita de ser considerada com cuidado. Portanto, we adaptada nosso protocolo e transferido para um sistema de medição, em que as células podem ser observados por microscopia óptica e contadas por um software de semi-automatizada.
Enquanto EPCs representam cerca de 0,1% das células no sangue periférico, e é difícil de isolar essas células específicas 38, um impressionante número de estudos indicou que EPCs podem proporcionar efeitos benéficos e melhorar a vascularização de tecidos após eventos isquémicos nos membros e no miocárdio 39 , 40. No entanto, ainda é um desafio constante para traduzir esses achados para a prática clínica e para avaliar a sua relevância clínica. Os motivos podem ser devido à influência significativa de muitos factores perioperatórios sobre a secreção de diferentes quimioatractores, que tem sido mostrado previamente 22, 41. Portanto, na segunda parte deste estudo, o papel de c diferenteytokines sobre a migração de EPCs na configuração de I miocárdio / R foram avaliados. Portanto, as concentrações séricas de citocinas em pacientes de cirurgia cardíaca foram medidos. MIF, assim como CXCL12 e CXCL8 mostrou um aumento significativo intra-operatório. Ao traduzir esses achados de volta para os experimentos in vitro, apresentam resultados demonstraram que não é nem um nem CXCL12- efeito mediado-CXCL8 sobre a migração EPC nas concentrações fisiológicas medida in vitro. Utilizando o modelo de isolamento descrito EPC e o ensaio de migração subsequente, MIF foi identificada como um mediador predominante de migração EPC 42. Neste contexto, Kanzler et ai. demonstrada num modelo de rato experimental que MIF e VEGF fornecer o efeito mais forte sobre a migração EPC sob hipóxia 23. Curiosamente, as medições de VEGF mostram que não há nenhuma mudança significativa intra-operatória de sangue em concentrações de VEGF, o que pode resultar a partir de O obrigatóriof VEGF para a aplicação intra-operatória padronizada de heparina. Portanto, MIF pode desempenhar um papel predominante entre as quimiocinas angiogénicos no recrutamento de EPCs em pacientes de cirurgia cardíaca e pode iniciar e contribuir para o processo de cicatrização após miocárdio I / R através do tráfico de EPCs para o local da lesão 43, 44 No entanto, como níveis da CIM aumentou imediatamente após I do miocárdio / R, permanece especulativo se o efeito MIF mediada sobre o recrutamento de EPCs podem influenciar a remodelação cardíaca e angiogênese, o que tem implicações significativas na prevenção de insuficiência cardíaca após I do miocárdio / R23. No entanto, antes de avançar para uma tal análise, é importante caracterizar adicionalmente os diferentes subtipos de CPE e para avaliar o seu papel funcional na biologia humana. A este respeito, o presente protocolo proporciona um método fiável sobre como isolar EPCs a partir de sangue periférico humano para permitir ist caracterização mais abrangente e estudos futuros.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores não têm confirmações.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
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