Summary
Endotelceller progenitorceller (EPC) är avgörande inblandade i kärlnybildning av ischemiska vävnader. Denna metod beskriver isolering av mänskliga EPC från perifert blod, liksom fastställandet av deras migrations potential mot serumprover av hjärt kirurgiska patienter.
Abstract
Endotelceller progenitorceller (EPC) rekryteras från benmärgen i patologiska tillstånd som hypoxi och avgörande inblandade i kärlnybildning av ischemiska vävnader. Ursprunget, klassificering och karakterisering av EPC är komplexa; Trots har två framstående subtyper av EPCs fastställts: så kallade "tidiga" EPC (nedan kallad tidig-EPC) och sent utväxt EPC (sent EPC). De kan klassificeras med biologiska egenskaper liksom av deras utseende under in vitro kultur. Medan "tidiga" EPC visas i mindre än en vecka efter odling av perifera blodhärledda mononukleära celler i EG-specifika medier, kan sen utväxt EPC hittas efter 2-3 veckor. Sen utväxt EPC har erkänts vara direkt involverade i kärlnybildning, främst genom sin förmåga att differentiera till mogna endotelceller, medan "tidiga" EPC uttrycka olika angiogena faktorer som Endogengare last för att främja angiogenes på ett parakrint sätt. Under ischemi / reperfusion (I / R), olika faktorer styr målsökande av EPC till regioner av blodkärlsbildning.
Migration av makrofager hämmande faktor (MIF) är en kemokin liknande pro-inflammatoriska och allmänt utbrett uttryckt cytokin och beskrevs nyligen att fungera som nyckelregulator för EPC migration vid fysiologiska koncentrationer 1. Intressant är MIF lagras i intracellulära pooler och kan snabbt släppas ut i blodet efter flera stimuli (t.ex. hjärtinfarkt).
Detta protokoll beskriver en metod för tillförlitlig isolering och odling av tidiga-EPCs från vuxen human perifert blod baserat på CD34-positiv selektion med efterföljande odling i medium innehållande endoteliala tillväxtfaktorer på fibronektinbelagda plattor för användning i in vitro-migrationsanalyser mot serumprover av hjärt kirurgiska patienter. Dessutommigratory påverkan av MIF på kemotaxi av EPCs jämfört med andra välkända angiogenesstimulerande cytokiner demonstreras.
Introduction
Endoteliala progenitorceller (EPC) cirkulerar i humant blod och har förmågan att differentiera till endotelceller 2. De deltar i vaskulogenes och har förmåga att minimera de skador som orsakas av inflammation och ischemi / reperfusion (I / R) skador på olika sätt 3, 4. Till exempel, EPC visar förhöjda halter av intracellulära antioxidantenzymer som katalas, glutationperoxidas eller mangan superoxiddismutaser (MnSOD) 5. Den förhöjda motstånd mot oxidativ stress kan EPC att fungera i mikromiljöer med förhöjda reaktiva syreradikaler (ROS) efter ischemisk skada 6. Tidigare studier visade också att antalet EPC kan korreleras till vaskulär reparation och att ett minskat antal cirkulerande EPC förut förekomsten av kardiovaskulära händelser 7,class = "xref"> 8. Emellertid har en tydlig definition av en EPC inte hittats ännu. Hittills finns det ingen särskild cellytan markör eller konsekvent fenotyp för EPC och dessa celler är mycket sällsynta i det perifera blodet 9. En mänsklig EPC bör betraktas som ett cirkulerande cell med förmåga att bidra till återuppbyggnaden av den skadade endotel och nya kärlstrukturer.
Ett sätt att isolera och karakterisera EPC är genom vidhäftning till fibronektin. Därigenom är förmågan hos dessa celler används för att visa en överlägsen vidhäftning till fibronektin belagda rätter jämfört med typ 1 kollagen, till exempel 3, 10, 11. Men andra fann att plätering mononukleära celler på fibronektinbelagda rätter utan någon föregående eller ytterligare reningssteg leder till kolonier inklusive myeloida progenitorceller, monocyter och T-lymfocyter 12, 13, 14. Dessutom, i detta fall, kan trombocyter förorena mononukleära cell (MNC) fraktionen och därmed överföra plasmamembranproteiner till eventuella vidhäftande celler 15.
Förutom karakterisering genom in vitro-vidhäftningsanalyser, är en kombination av olika markörer på cellytan som används för att beskriva en celltyp betraktas som en EPC. I detta fall, efter fibronektin-förmedlad vidhäftning, cellerna analyseras angående deras endotel-liknande attribut. I denna process, de två endoteliala cellassocierade markörer, acetylerad-lågdensitetslipoprotein (AcLDL) och vaskulär endotelial tillväxtfaktorreceptor 2 (VEGFR-2, KDR), spela en roll. Endotelceller och makrofager har visat sig särskilt ta upp AcLDL i en process som kallas "renhållare cellvägen" 16. En annan markörproteinet är KDR som huvud VEGF-receptor på endotelcellerceller 17. Emellertid, som EPCs i allmänhet odlas i media som kompletterats med endoteliala tillväxtfaktorer och fetalt kalvserum, är det möjligt att makrofager, som kanske även har felaktigt isolerade, uppvisar en endotel-liknande markör profil. Som tidigare visats, om odlas i ett endotel-konditionerat medium, makrofager uttrycker "endotelceller specifika" proteiner 18.
I allmänhet finns det två kategorier av EPCs inom flera subtyper, vilka återfinns i blodet eller odlas in vitro. Sena-utväxt EPC (sent EPC) visas efter 2-3 veckors odling. Dessa celler är integrerade snabbare i ett monoskikt av humana navelvenendotelceller och kan bilda kapillärrör 19. Dessutom, så kallade "early-EPCs" cirkulerar i blodet i ungefär en vecka och agera på ett mer passivt sätt genom att leverera angiogena molekyler, såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor(VEGF), eller CXCL8 19. Patienter med kranskärlssjukdom (CAD) uppvisade signifikant lägre halter av tidiga-EPCs jämfört med en kontrollgrupp utan CAD 20. Intressant nog visade samma grupp högre mängder av sena-EPCs jämfört med en kontrollgrupp. En annan studie visade att tidig EPC skydda differentierade EPC från apoptos under oxidativa förhållanden parakrin sätt 6. Därför kan tidiga EPC ge relevanta skyddande effekter genom migration av andra celler i en auto- eller parakrina sätt i det perifera blodet.
Detta protokoll beskriver en metod för att rena tidiga-EPCs genom att först isolera PBMC-fraktionen från humant perifert blod och därefter isolera CD34 + celler från PBMC-fraktionen för att rensa denna cellsuspension från oönskade celler. CD34 är en markör, som används för isoleringen av humana hematopoietiska stamceller 9 + celler odlas på fibronektinbelagda vävnadsodlingsytor. Efter tre dagar, byts mediet och därmed förlora alla icke-vidhäftande celler. Slutligen är isolerade EPCs färgas för att kontrollera upptagningen av AcLDL och närvaron av KDR som endotelial cellmarkör genom användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Som en ytterligare markör, analyserade vi blodplätts endotelial celladhesionsmolekyl (PECAM-1, CD31), som också förekommer på endotelceller.
Restaurering av skadade eller infarkthjärtmuskelvävnaden genom ökad rekrytering av EPC hör till de intensivt undersökta behandlingsstrategier i hjärt- och kärlsjukdomar. Det är dock fortfarande en utmaning översättning av experimentella resultat i klinisk praxis, med tanke på den komplexa cellulära samspelet i människokroppen under olika patofysiologiska förhållanden. Dessutom myocardial I / R skador utlöser en överdriven utsöndring av olika cytokiner, hormoner och tillväxt FAC torer, som styr målsökande av EPCs till regioner i blodkärlsbildning 13. Som redan visats, CXCL8, stromal derived faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF och migration av makrofager hämmande faktor (MIF) är signifikant ökad i serumprov efter hjärtinfarkt I / R skada en. Bland dessa faktorer, är MIF en pleiotrop kemokin liknande cytokin med övervägande pro-inflammatoriska egenskaper. I motsats till dess historiska namn, har MIF pro-flyttande funktioner, i egenskap av en sann kemokin på olika celltyper 1, 21, 22. MIF-medierade cellrekryteringsprocesser har varit kopplade till kemokinreceptorer CXCR2 och CXCR4, vilket MIF binder till och aktiverar på ett icke-besläktat sätt 21. Notera EPC uttrycka båda dessa receptorer på sin yta, som dessutom blir uppregleras under hypoxiska betingelserass = "xref"> 23, 24. Dessutom föreslår ackumulera bevis för att MIF har en övergripande hjärt-skyddande effekt under I / R skada av hjärtat 22, 25, 26. I detta sammanhang har det visat sig vidare att MIF kan stödja kärlnybildning under hypoxisk stress som är av särskild betydelse, när man överväger de begränsade mekanismerna för återvinning av skadade hjärtmuskeln 27. Tidigare in vitro-studier och experiment i prekliniska musmodeller tillhandahålls första bevis om rollen av MIF i EPC rekrytering 4. Notera, är MIF också en framträdande last protein av EPC som får släppas ut under EPC rekrytering inom ischemiska platser 28. Men studier i kliniska inställningar, särskilt i jämförelse med andra (angiogena) serum cytokiner förblir gäckande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blod för isolering av EPC erhölls från friska frivilliga efter informerat samtycke i enlighet med den lokala etiska kommittén. Serumprover som användes i migrationsanalyser erhölls från patienter som genomgick konventionell hjärtkirurgi med användning av hjärt-lungbypass (CPB). Uteslutningskriterier var katastrofinsatser, känd eller misstänkt graviditet, patient`s ålder mindre än 18 år, och misslyckas med att erhålla informerat samtycke. Serumprover togs utöver kliniska rutinmätningar (omedelbart före operationen och omedelbart efter hjärtinfarkt reperfusion / öppning av aorta tvär klämma) och lagrades därefter vid -80 ° C till slutlig analys. Den institutionella Review Board (etikkommitté, RWTH Aachen) godkände denna studie. Patienterna uppvisade en medelålder på 68,6 år och en genomsnittlig vikt på 81,7 kg. Redan existerande sjukdomar ingår: hypertoni (65%), kronisk lungsjukdom (19%), extra hjärt arteriopati (16%), cerebral dysfunktion (6%), instabil angina (3%), nyligen genomgången hjärtinfarkt (28% inom 90 d), kronisk njursjukdom (14%), leversjukdom (2%) och diabetes (34%).
1. Beläggning av T75 Flask:
- Förbereda 5 ml fibronektin-lösning (1 mg humant fibronektin utspätt i 15 ml ultrarent vatten) per T75-kolv.
- Tillsätta lösningen till en T75-kolv och vänta tills vattnet avdunstas. För att undvika onödiga avbrott under isoleringsprocessen på grund av avdunstning, utföra denna process i förväg (t.ex. över natten) och vid rumstemperatur. Denna lösning ger 4,44 mikrogram fibronektin / cm2.
- Förbereda den endoteliala celltillväxtmedium MV2 genom att komplettera den basala MV2 medium med tillväxtfaktorn kosttillskott som tillhandahålls av tillverkaren.
2. Isolering av endoteliala progenitorceller (EPC) från 60 ml blod:
OBS: Eftersom CD34-positiv selektion cocktail ennd de magnetiska pärlorna är kommersiellt tillgängliga i en kombinerad urval kit finns det inga koncentrationer tillhandahålls av tillverkaren. Dock cirka 100 mikroliter av antikroppen är tillräckliga för att behandla upp till 5 x 10 8-celler. De magnetiska pärlorna späds i vatten, dextranbelagt och ca 5,000x mindre jämfört med andra kommersiellt tillgängliga pärlor. För ytterligare information, se tillverkarens anvisningar.
- Blanda blodet (med eller utan antikoagulantia) 1: 1 med Ca2 + -Mg 2+ -fri PBS.
- Tillsätt 15 ml av densitetsgradientlösningen per 50 ml rör. För ytterligare information, se tillverkarens anvisningar.
- Långsamt skikt det utspädda blodet ovanpå densitetsgradientlösningen.
- Centrifugera proverna vid 2500 xg under 30 min med långsam acceleration och utan bromsning.
- Samla koncentratskiktet i varje rör (figur 1) med hjälp av en steril plastpipett och sätta den i ett annat rör.Undvika samling av densitetsgradientlösningen. Den förväntade PBMC avkastningen är cirka 3-4 x 10 6 celler / ml blod.
Figur 1: densitetsgradientcentrifugering av Bbuffy Coat på Ficoll Solution. Visas är resultatet av densitetsgradientcentrifugering vid 2500 xg under 30 min på densitetsgradientlösningen. Avbildad är erytrocyter och granulocyter (röd), den mononukleära cellfraktionen (vita skiktet), plasma (gul), och densitetsgradienten lösning (vitaktig). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Späd den perifera blodmononukleära cellfraktionen med minst 3 volymer PBS och blanda. Centrifugera vid rumstemperatur under 15 min vid 200 x g.
- Upprepa steg 2,6 gånger. </ Li>
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 5 ml MV2 medium.
- Tillsätt 100 mikroliter av humant CD34-antikropp (tillräcklig för att behandla upp till 5 x 10 8 celler) per används buffy coat och rotera under 15 minuter vid 37 ° C med 5% CO2.
- Tillsätt 50 mikroliter av dextran-belagda magnetiska pärlor per används buffy coat och rotera under 10 minuter vid 37 ° C med 5% CO2.
- Efter inkubation, överföra suspensionen till FACS rör med maximalt 3 ml i varje rör. Större mängder kommer inte att vara tillåtet med magneten.
- Sätt FACS rör (s) i magneten (s) och vänta i 5 minuter.
- Kassera supernatanten utan att dra de FACS rör ur magneten.
- Resuspendera cellerna i varje FACS rör med 3 ml MV2-medium utanför magneten.
- Upprepa steg 2,12-2,14 två gånger.
- Dra FACS rör av magneterna och suspendera cellerna i 3 ml MV2 medium.
- Överför cellsuspensionen i förväg belagda T75 flasks och lägga 17 ml MV2 medium per flaska.
OBS! Mediet bör bytas efter 3 dagar. Efter en vecka, celler visar spindelliknande strukturer (Figur 2) och är redo att använda. För en vetter av isolerings se figur 3.
Figur 2: Mikroskopisk bild av isolerade EPC. Visas är en representativ bild av isolerade tidig EPC i en T75 kolv före avskiljandet. Skenbar är spindeln liknande struktur EPC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flödesschema Visar EPC isoleringsproceduren. Avbildas ett system, showning de enskilda stegen i EPC isolering protokollet. För en mer detaljerad protokoll se avsnitt 2 i protokollet avsnitt.
3. Migration Assay
- Ta bort mediet från EPC i T75 kolven.
- Tvätta med 5 ml PBS genom att skaka den försiktigt.
- Ta bort PBS och tillsätt 5 ml kommersiell cell lossnar lösning. Vänta tills cellerna fristående (se i mikroskop). Påskynda lossnar genom att försiktigt knacka på botten av kolven.
- När cellerna lossnat, snabbt tillsätt 5 ml MV2 komplett medium och överföra cellsuspensionen till ett annat rör.
- Centrifugera vid 2000 x g under 5 min.
- Resuspendera celler i 5-10 ml PBS och centrifugera igen vid 2000 xg under 5 min.
- Upprepa steg 3,6.
- Resuspendera cellpelleten i MV2 svalt medium (50000 celler i 75 mikroliter per transmigration väl behövs).
OBS: Vilken migrationssystemet behövs beror på celltypen och analys. Det finns diff tekniker när pordiametrar och plattstorlekar (antal brunnar). För EPCs en porstorlek av 5 | im i 96 väl systemet är optimal. - Förbereda migreringen plattan genom att tillsätta 235 mikroliter av serumprovet (serum utspätt 1: 5 i MV2 svalt medium) in i den nedre kammaren (Figur 4).
Figur 4: Migrations analys i en modifierad Boyden-kammare. Visas är den allmänna utformningen av en modifierad Boyden-kammare. Cellodlingsinsatser (= övre kammaren) indikeras i mörkblått och är införda i den nedre kammaren. Botten (men inte väggarna) av dessa skär utgör filtersystemet inklusive porerna. (A) visar installationen vid tidpunkt noll. (B) Efter en vald tidpunkt, celler migrerat genom filtret i riktning mot en stimulus.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Lägg insatsen kort före tillsats av celllösningen.
- Lägga 75 mikroliter av cell lösning (= 50000 celler) i den övre kammaren.
- Låt EPCs migrera under 3 h vid 37 ° C och 5% CO2 (migrationstiden beror på celltyp och systemet).
- För att undvika serumautofluorescens artefakter, kvantifiera migrerade celler genom att ta bilder av brunnen under ett mikroskop och räkna cellerna med hjälp av halvautomatisk programvara "ImageJ".
- Ta bort den övre kammaren (som innehåller alla icke-migrerade celler).
- Tillsätt 70 mikroliter 3,6% paraformaldehydlösning, inklusive Hoechst färgämne (utspädd 1: 1000). Plattan kan lagras vid 37 ° C och 5% CO2 över natten.
- Centrifugera plattan kort för att få alla celler i samma fokalplan vid 2000 xg under 1-2 minuter.
- Ta 5 bilder per well (fig 5 och 6) med en 100x förstoring.
Figur 5: Schema visar läget för den tagit bilder. Ordningen visar läget för de fem tagna bilderna, som behövs för bestämning av migrerade celler, i förhållande till brunnen. Bilderna är tagna för att räkna cellerna och beräkna ett medelvärde för varje brunn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Mikroskopisk Bilden Cell kvantifiering. Visas är en representativ bild, som togs för cell kvantifiering. Cellerna färgades och fast USIng Hoechst färgämne i 3,6% paraformaldehyd. Prickarna representerar fixerades och färgades endoteliala progenitorceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Räkna migrerade cellerna med hjälp av halvautomatiska programvara "ImageJ" av National Institute of Health.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av isolerade endoteliala progenitorceller
Först upptaget av AcLDL kontrolleras, liksom uttrycket av KDR, och CD31 på ytan av den isolerade cellpopulationen. Som Figur 7a visar, 85,1% av de isolerade EPC visade ett upptag av AcLDL och uttryckte CD31. Figurerna 7b och 7c visar vidare en homogen fördelning av båda markörerna, även om det verkar vara en mindre befolkning, negativ för båda markörerna. I ett andra steg, var FACS-analys av AcLDL i kombination med KDR utförs. Figur 8a visar att över 80% av de isolerade cellerna visade ett upptag av AcLDL och uttrycket av KDR på deras yta. Figurerna 8b och 8c visar homogeniteten av dessa markörer.
Att verifiera importance av fibronektin-belagda rätter under odlingstiden, en jämförelse av de tre markörerna mellan isolerade celler efter två dagars odling på en fibronektin-belagd yta med isolerade EPC efter sju dagars odling på fibronektinbelagda rätter (som anges i våra protokoll) utfördes både med tidigare CD34 + -selection. Såsom visas i figur 9a, endast 46,4% av två-dagars-odlade celler uppvisade ett upptag av AcLDL såväl som ett uttryck för CD31 på sin yta, jämfört med 85% av cellerna efter sju dagars odling på fibronektin. Dessutom histogrammen (figurerna 9b och 9c) visar mindre intensitet av båda markörerna efter två dagars odling jämfört med sju dagar (fig 7b och 7c). Detsamma gäller för en kombination av markörerna AcLDL och KDR. Efter två dagars odling på fibronektin, endast 68,0% av alla celler visade ett upptag av AcLDL såväl som ett uttryck för KDR på sin yta (figurs 10a-10c). Efter sju dagars odling på fibronektin, 83,6% av cellerna uppvisade ett upptag av AcLDL och expression av KDR på sin yta (figurerna 8a-8c).
I ett nästa steg, var betydelsen av CD34 + -selection under isoleringen av EPC utvärderas. Därför celler som valts i enlighet med det nuvarande protokollet, inklusive densitetsgradientcentrifugering och sju dagars odling på fibronektin, men som missade CD34 + -selection isolerades. Som visas i figur 10a, över 18% av alla isolerade celler gör varken uttryck CD31 eller visa ett upptag av AcLDL, jämfört med mindre än 8% efter CD34 + -selection, som visar en CD31 uttryck och ett upptag av AcLDL (figur 7a) . Dessutom Figurerna 11b och 11c visar att de isolerade cellerna är mycket inhomogena om båda markörerna jämfört med rör
Serum cytokinnivåer under hjärtkirurgi
Att identifiera påverkan av hjärtkirurgi efter hjärtinfarkt I / R på koncentrationerna av cirkulerande serumnivåer av MIF, CXCL12, CXCL8 och VEGF, var serumprover dras före och intra-operativt för den efterföljande analysen av kommersiellt tillgänglig ELISA (Figur 12) . Serumnivåer av MIF visade en signifikant intraoperativ ökning jämfört med baslinjevärden (100,3 ng / ml jämfört med 127,4 ng / ml, p = 0,027). Likaså CXCL12 nivåerna visade en signifikant ökning i serum under operation (0,101 ng / ml vs. 0,198 ng / ml, p = 0,011). I likhet med MIF och CXCL12, CXCL8 ökat kraftigt under operation (0,15 ng / ml jämfört med 0,3 ng / ml, p = 0,022). i fortsrast, hade VEGF koncentrationer som inte visar några större förändringar under observationsperioden (0,154 ng / ml jämfört med 0,134 ng / ml, p = 0,583) 1.
Migrations kapacitet Endothelial stamceller
För att undersöka den direkta effekten av patienternas serumprover och däri ingår cytokiner / kemokiner / angiogena faktorer EPC migration, en ex vivo migration analys med användning av serumprover, som togs före och under operation, utfördes. EPCs isolerades från friska frivilliga försökspersoner. Som visas i figur 13, EPC migrationshastighet ökat markant mot intraoperativt tagna prover jämfört med preoperativt tagna prover (+ 35% jämfört med baslinjen, p = 0,047).
Eftersom tidigare studier redan visat att jag / R utlöser en utsöndring av sevrala cytokiner som modulerar leukocytkemotaxi och migration, migrationsanalyser med användning av dessa potentiella kemoattraherande ämnen, inklusive MIF, CXCL12, CXCL8, och VEGF utfördes. För att få en bättre förståelse för inverkan av dessa cytokiner på EPC rekrytering in vivo, ytterligare i migrations vitro experiment, tillämpa fysiologiskt uppmätta halter av ovanstående cytokiner till den undre kammaren migrationen enheter utfördes också.
Som MIF serumkoncentrationer mellan 100 och 130 ng / ml hade mätts (Figur 12), en koncentration av 100 ng / ml av rekombinant MIF användes, vilket ledde till en> 6-faldig ökning av EPC migration jämfört med mediumkontroll ( Figur 14). I motsats, serumkoncentrationer av CXCL12, CXCL8, och VEGF var i intervallet 150-300 pg / ml. Notera gjorde dessa koncentrationer inte förmedla någon effekt på EPC migration in vitro(Figur 14). Det är därför tänkbart att bland dessa fyra cytokiner, MIF uppvisar relativt starkaste inflytandet på EPC migration in vivo en.
Figur 7: FACS analys av isolerade EPC dag 7. (a) Visas är upptaget av AcLDL och CD31 på cellytan uttryck av isolerade EPC efter CD34 + urval och 7 dagars odlingsperiod på fibronektinbelagda rätter. Uppe till vänster: Celler visar upptag av AcLDL, men uttrycker inte CD31. Uppe till höger: Celler visar upptag av AcLDL och uttrycka CD31. Nederst till vänster: Celler visar ingen upptag av AcLDL och uttrycker inte CD31. Nederst till höger: Celler visar ingen upptag av AcLDL, men uttrycker CD31. (B) Visas är histogrammet av PE-konjugerad AcLDL efter upptagning av isolerade EPC. (C) Visas är histogrammet av FITC-conjugated CD31 antikropp efter bindning till cellytan CD31 isolerade EPC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: FACS analys av isolerade EPC dag 7. (a) Visas är upptaget av AcLDL och KDR cellytan uttryck av isolerade EPC efter CD34 + urval och 7 dagars odlingsperiod på fibronektinbelagda rätter. Uppe till vänster: celler visar upptag av AcLDL, men inte uttrycka KDR. Uppe till höger: Celler visar upptag av AcLDL och uttrycka KDR. Nederst till vänster: Celler visar ingen upptag av AcLDL och inte uttrycker KDR. Nederst till höger: Celler visar ingen upptag av AcLDL, men uttrycker KDR. (B) Visas är histogrammet av PE-konjugerad AcLDL efter upptagning av isolerade EPC. (C) Visas är denhistogram av FITC-konjugerad KDR-antikropp efter bindning till cellytan KDR av isolerade EPC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: FACS analys av isolerade EPC dag 2. (a) Visas är upptaget av AcLDL och CD31 på cellytan uttryck av isolerade EPC efter CD34 + urval och två dagars odlingsperiod på fibronektinbelagda rätter. Uppe till vänster: celler visar upptag av AcLDL, men uttrycker inte CD31. Uppe till höger: Celler visar upptag av AcLDL och uttrycka CD31. Nederst till vänster: Celler visar ingen upptag av AcLDL och uttrycker inte CD31. Nederst till höger: Celler visar ingen upptag av AcLDL, men uttrycker CD31. (B) Visas är histogrammet av PE-konjugerad AcLDL efter upptagning av isolerade EPC. (
Figur 10: FACS analys av isolerade EPC dag 2. (a) Visas är upptaget av AcLDL och KDR cellytan uttryck av isolerade EPC efter CD34 + urval och två dagars odlingsperiod på fibronektinbelagda rätter. Uppe till vänster: celler visar upptag av AcLDL, men inte uttrycka KDR. Uppe till höger: Celler visar upptag av AcLDL och uttrycka KDR. Nederst till vänster: Celler visar ingen upptag av AcLDL och inte uttrycker KDR. Nederst till höger: Celler visar ingen upptag av AcLDL, men uttrycker KDR. (B) Visas är histogrammet av PE-konjugerad AcLDL efter upptagav isolerade EPC. (C) Visas är histogrammet av FITC-konjugerad KDR-antikropp efter bindning till cellytan KDR av isolerade EPC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: FACS analys av isolerade EPC dag 7. (a) Visas är upptaget av AcLDL och CD31 på cellytan uttryck av isolerade EPC utan föregående CD34 + urval, men med den 7 dagars odlingsperiod på fibronektinbelagda rätter. Uppe till vänster: Celler visar upptag av AcLDL, men uttrycker inte CD31. Uppe till höger: Celler visar upptag av AcLDL och uttrycka CD31. Nederst till vänster: Celler visar ingen upptag av AcLDL och uttrycker inte CD31. Nederst till höger: Celler visar ingen upptag av AcLDL, men uttrycker CD31. (B) Visasär histogrammet av PE-konjugerad AcLDL efter upptagning av isolerade EPC. (C) Visas är histogrammet av FITC-konjugerad CD31-antikropp efter bindning till cellytan CD31 isolerade EPC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: Serum cytokinnivåer under hjärtkirurgi. Mätning av serumkoncentrationer av CXCL8, VEGF, CXCL12 och MIF patienter som genomgick hjärtkirurgi med hjälp av ELISA. Visas är medelvärden av preoperativ jämfört med intra-operativa koncentrationer ± SEM (*: p <0,05; kontra pre-OP)
Figur 13: In vitro Migration av EPC Mot patientserum. Visas är den intra-operativ ökning av EPC migration av friska försökspersoner mot serumprover från patienter, som genomgick hjärtkirurgi. 50.000 celler per brunn i MV2 serum svältes mediet sattes till den övre kammaren i en Transwell-system. De serumprover i den undre kammaren späddes 1: 5 med samma medium. Cellerna migrerat under 3 timmar vid 37 ° C och 5% CO2 genom ett 5 | im membran. Staplarna representerar medelvärden ± SEM (*: p <0,05)
Figur 14: In vitro Migration av EPCs mot rekombinant cytokiner. Visas är migration av EPC mot representativa koncentrationer av rekombinant CXCL8, CXCL12, VEGF, och MIF jämfört med serum svältes medium (= baslinje). Endast MIF kundeatt förmedla en ökad EPC migration vid fysiologiskt uppmätta halter. De rekombinanta cytokiner späddes i MV2 serum svältes medium. Cellerna migrerat under 3 h genom en 5 | j, m membran. Staplarna representerar medelvärden ± SEM (**: p <0,01 jämfört med serum svältes medium)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den första delen av denna studie ingick isolering av mänskliga EPC från perifert blod från friska frivilliga för att möjliggöra en omfattande utvärdering av blod hjärtkirurgpatienter. Därför gjordes en densitetsgradient centrifugering utförs för att separera den PBMC-fraktionen från plasma, granulocyter och erytrocyter. Att avlägsna det mesta av de kontamine trombocyter, var detta cellfraktionen utsattes för kort och långsamma tvättningssteg 29, 30. Därefter tillsattes CD34 + -celler isolerade från den återstående fraktionen för att separera stamceller från återstående lymfocyter och monocyter. Slutligen tillsattes cellsuspensionen odlades på fibronektinbelagda rätter i en kommersiellt tillgänglig endotelcelltillväxt mediet för att separera endoteliala progenitorceller från andra (progenitor) celler av myeloid härkomst 3. Notera det diskuteras att trombocyter kan visa en CD34 på cellytan expression, också. Även tidigare studier visat bindning av vissa anti-CD34 antikroppar mot blodplättar, kan detta vara en artefakt på grund av aggregering av blodplättar med andra (CD34-positiva celler) 31, 32. Däremot kan de flesta blodplättar separeras med upprepade långsamma tvättsteg. Förutom blodplättar, deras föregångare - megakaryocyter - uttrycker denna hematopoetisk stamcellstransplantation antigen och kan finnas i perifert blod, även om de främst i benmärgen 33, 34. Dessutom är det också beskrivits att den cellytemarkören CD34, används i detta protokoll uttrycks i mycket låga nivåer på mogna endotelceller 35. Därför är det viktigt att försiktigt överväga en eventuell kontaminering av blodplättar / megakaryocyter eller mogna endotelceller, när isolera EPC. Följaktligen är steg 2,6 av särskild betydelse under isolation av EPCs för att avlägsna trombocyter.
För att tydliggöra vikten av att odla de isolerade cellerna på fibronektinbelagda rätter, cellpopulationer efter två dagar och sju dagars odling på fibronektin jämfördes både med föregående CD34-positiv selektion. På dag två, mindre än hälften av de isolerade celler visade en upptagning av AcLDL och samtidigt uttryck av CD31 på sin yta. Dessutom kan en mindre intensiv uttryck av båda markörerna på om histogram ses. Dessa data visar att sju dagars odling på fibronektin i den endoteliala cellspecifik mediet är nödvändigt för att få EPCs som visar karakteristiska endoteliala uttrycksmönster. I detta steg, är det av vikt att använda rätt koncentration / mängd fibronektin. Wijelath och kollegor tidigare visat att fibronektin befrämjar uttryck av endotelceller liknande mönster, troligen i kombination med VEGF 36.
I nästa mep av protokollet, var betydelsen av CD34 + -selection av cellsuspensionen undersökts, jämföra celler som isolerats efter 7 dagars odling på fibronektinbelagda rätter, med och utan föregående CD34 + -selection. Mängden celler saknade båda markörerna (AcLDL upptag och CD31 uttryck) var mycket högre efter cell isolering utan föregående CD34 + -selection jämfört med isolering, inklusive det här steget. Intressant, efter sju dagars odling på fibronektin, celler saknade CD34 + -selection visade en mindre homogen cellpopulation, såsom indikeras av den inhomogena uttryck av CD31 jämfört med celler, isolerade med CD34 + -selection. Dessa data visar att CD34 + -selection är nödvändigt att sortera ut EPCs från andra monocyter / makrofager. Under upprättandet av detta protokoll, fann vi att CD34 + -selection i MV2 medium vid 37 ° C leder till ett ökat antal överlevande celler, jämfört med mycket lägre temperatures, som måste försiktigt undersökas i framtida studier. Vi måste erkänna att vid tillämpningen av detta protokoll, antikroppen inkubation i kalciuminnehållande medium vid 37 ° C kan leda till icke-specifika interaktioner och bindande. I framtiden bör buffertsystem som saknar kalcium vid lägre temperaturer testas och inrättas för att undvika denna potentiella confounding faktor.
Notably, under vår preliminär analys av cellmigrationsförsök med serumprover, mätningar gjordes först med användning av en fluorescensmikroplattläsare och kalcein-färgning av cellerna, som tidigare beskrivits för olika celltyper (t.ex. humana umbilikala venendotelceller, HUVEC) 37. De olika extinktionsvärdena mellan kamrarna indikerade att inte bara de serum enbart prover, men också mediet redan har en anmärkningsvärd inverkan på den uppmätta fluorescensen, som måste övervägas med försiktighet. Därför we anpassat våra protokoll och bytte till ett mätsystem där cellerna kan observeras via ljusmikroskop och räknades med ett halvautomatiskt programvara.
Medan EPC svarar för cirka 0,1% av celler i perifert blod och det är svårt att isolera dessa specifika celler 38, ett mycket stort antal studier indikerade att EPC kan ge positiva effekter och förbättra vävnadskärlbildning efter ischemiska händelser i armar och ben och i hjärtmuskeln 39 , 40. Ändå är det fortfarande en ständig utmaning att översätta dessa resultat i klinisk praxis och att utvärdera dess kliniska relevans. Orsakerna kan bero på betydande inflytande från många perioperativa faktorer utsöndringen av olika kemoattraherande ämnen, som har visats tidigare 22, 41. Därför, i den andra delen av denna studie, den roll som olika cytokines om migration av EPC i fastställandet av hjärtmuskel I / R utvärderades. Därför var serumkoncentrationen av cytokiner i hjärtkirurgi patienter mäts. MIF, liksom CXCL12 och CXCL8 visade en signifikant intra-operativ ökning. Vid omräkningen av dessa konstateranden tillbaka till experimenten in vitro visade nuvarande resultat som det varken finns en CXCL12- eller CXCL8-medierad effekt på EPC migration på de uppmätta fysiologiska koncentrationer in vitro. Användning av den beskrivna EPC isolering modell och den efterföljande analysen migration, var MIF identifierades som en dominerande förmedlare av EPC migration 42. I detta sammanhang Kanzler et al. demonstreras i en experimentell musmodell som MIF och VEGF ger den starkaste effekten på EPC migration enligt hypoxi 23. Intressant, mätningar av VEGF visar att det inte finns någon signifikant intra-operativ förändring i VEGF blodkoncentrationer, vilket kan resultera från att binda of VEGF till intraoperativ standardiserad tillämpning av heparin. Därför kan MIF spela en framträdande roll bland de angiogena kemokiner i rekryteringen av EPC i hjärtkirurgi patienter och kan initiera och bidra till läkningsprocessen efter hjärtinfarkt I / R genom handel med EPC till platsen för skadan 43, 44 Men som MIF nivåerna ökade omedelbart efter hjärtinfarkt i / R, är det fortfarande spekulativa om MIF-förmedlad effekt på rekryteringen av EPC kan påverka hjärt ombyggnad och angiogenes, som har betydande konsekvenser i förebyggandet av hjärtsvikt efter hjärtinfarkt i / R23. Men innan avancera till en sådan analys, är det viktigt att ytterligare karakterisera olika subtyper av EPCs och utvärdera dess funktionella roll i humanbiologi. I detta sammanhang ger det nuvarande protokollet en tillförlitlig metod för att isolera EPC från humant perifert blod för att its ytterligare omfattande karakterisering och framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna har inga bekräftelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
References
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
