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Medicine

Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen von gesunden Freiwilligen und ihre Migratory Potential Beeinflusst von Serumproben nach einer Herzoperation

doi: 10.3791/55192 Published: February 14, 2017

Summary

Endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) sind entscheidend in der Neovaskularisation von ischämischen Geweben beteiligt. Dieses Verfahren beschreibt die Isolierung von menschlichem EPCs aus peripherem Blut sowie die Identifizierung ihres Migrationspotential gegen Serumproben von Herzchirurgiepatienten.

Abstract

Endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) aus dem Knochenmark unter pathologischen Bedingungen wie Hypoxie rekrutiert und sind in der Neovaskularisation von ischämischem Gewebe entscheidend beteiligt. Die Herkunft, Klassifizierung und Charakterisierung von EPCs sind komplex; Trotz zwei prominente Untertypen von EPCs festgelegt wurden: die so genannte "early" EPCs und spät Auswuchs EPCs (late-EPCs) (nachfolgend als Early-EPCs bezeichnet). Sie können während der in vitro - Kultur sowie durch ihr Aussehen durch biologische Eigenschaften klassifiziert werden. Während "früh" EPCs in weniger als einer Woche nach der Kultur der peripheren Blut stammenden mononukleären Zellen in EC-spezifischen Medien erscheinen, können Spät Auswuchs EPCs nach 2-3 Wochen gefunden werden. Spät Auswuchs EPCs wurden erkannt direkt in Neovaskularisation beteiligt zu sein, vor allem durch ihre Fähigkeit, sich zu reifen Endothelzellen zu differenzieren, während "früh" EPCs verschiedene angiogene Faktoren als endogen exprimierenous Ladung Angiogenese in einem parakrine Weise zu fördern. Während myokardialen Ischämie / Reperfusion (I / R), steuern verschiedene Faktoren, die die Homing von EPCs in Regionen von Blutgefäßbildung.

Makrophagen - Migration hemmenden Faktor (MIF) ist ein Chemokin-ähnliche pro-inflammatorischen und ubiquitär exprimiert Zytokin und wurde kürzlich als Schlüsselregulator der EPCs Migration funktionieren bei physiologischen Konzentrationen 1 beschrieben. Interessanterweise wird MIF in intrazelluläre Pools gespeichert und können schnell in den Blutstrom nach mehreren Stimuli (zB Myokardinfarkt) freigegeben werden.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die zuverlässige Isolierung und Kultivierung von Früh EPCs aus adultem menschlichem peripherem Blut basierend auf CD34-positive Selektion mit anschließender Kultur in Medium endotheliale Wachstumsfaktoren auf Fibronectin-beschichteten Platten für den Einsatz in in vitro Migrationsassays gegen Serumproben enthalten , von herzchirurgischen Patienten. Weiterhin ist dieMigrations Einfluss von MIF auf Chemotaxis von EPCs im Vergleich zu anderen bekannten Angiogenese-stimulierenden Zytokinen demonstriert.

Introduction

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Endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) im menschlichen Blut zirkulierende und haben die Fähigkeit , sich in Endothelzellen zu differenzieren 2. Sie nehmen an der Vaskulogenese und sind in der Lage , den Schaden durch eine Entzündung und Ischämie / Reperfusions (I / R) Verletzungen auf verschiedene Weisen 3, 4 verursacht minimieren. Zum Beispiel zeigen EPCs erhöhten Mengen an intrazellulärem antioxidative Enzyme wie Katalase, Glutathionperoxidase oder Mangan - Superoxid - Dismutasen (MnSOD) 5. Die erhöhte Beständigkeit gegenüber oxidativem Stress ermöglicht EPCs 6 in Mikroumgebungen mit erhöhten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) nach ischämischer Verletzung zu funktionieren. Frühere Studien zeigten auch , dass die Anzahl von EPCs könnte vaskulären Reparatur korreliert werden , und dass eine reduzierte Anzahl von EPCs zirkulierende das Auftreten kardiovaskulärer Ereignisse vorhersagt 7,class = "xref"> 8. Allerdings hat eine klare Definition eines EPC noch nicht gefunden worden. Bis jetzt gibt es keine spezifische Zelloberflächenmarker oder konsistenten Phänotyp für EPCs und diese Zellen sind sehr selten im peripheren Blut 9. Eine menschliche EPC sollte als Umlaufzelle mit der Fähigkeit, in Betracht gezogen werden, um die Rekonstruktion des verletzten Endothel und neue Gefßstrukturen beizutragen.

Ein Weg zur Isolierung und Charakterisierung von EPCs ist durch Adhäsion an Fibronektin. Dadurch wird die Kapazität dieser Zellen verwendet , um eine bessere Haftung zu zeigen beschichteten Schalen an Fibronectin im Vergleich zu Typ 1 - Kollagen, beispielsweise 3, 10, 11. Jedoch fand andere , dass Zellen auf Fibronektin-beschichteten Schalen ohne vorherige oder weiteren Reinigungsschritt führt zu Kolonien einschließlich myeloiden Vorläuferzellen, Monozyten und T - Lymphozyten mononukleären Plattieren 12, 13, 14. Darüber hinaus wird in diesem Fall die Thrombozyten die mononukleären Zellen (MNC) Fraktion verunreinigen und somit die Plasmamembranproteine auf alle anhaftenden Zellen 15 übertragen.

Neben der Charakterisierung durch in vitro Adhäsionsassays, wird eine Kombination von verschiedenen Zelloberflächenmarker verwendet , um einen Zelltyp als EPC betrachtet zu beschreiben. In diesem Fall wird nach Fibronectin vermittelten Adhäsion werden die Zellen ihre endothelial-ähnlichen Eigenschaften analysiert betreffen. In diesem Verfahren werden die beiden endothelialen zellassoziierten Markern, acetylierte-low density lipoprotein (acLDL) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (VEGFR-2, KDR), eine Rolle spielen. Endothelial - Zellen und Makrophagen wurden "Scavenger - Zellen - Weg" 16 genannt gezeigt , speziell acLDL in einem Prozess in Anspruch nehmen. Ein weiterer Markerprotein ist KDR als Haupt VEGF-Rezeptor auf EndothelzellenZellen 17. Wie jedoch EPCs im allgemeinen kultiviert werden in Medien mit endothelialen Wachstumsfaktoren und fötalem Kälberserum ergänzt, ist es möglich, dass Makrophagen, die auch eine Endothel-ähnlichen Marker könnte wurden Profil irrtümlicherweise isoliert, zeigen. Wie zuvor gezeigt, kultiviert , wenn in einem Endothel-konditioniertes Medium, exprimieren Makrophagen "Endothel-spezifischen" Proteine 18.

Im allgemeinen gibt es zwei Kategorien von EPCs in mehrere Subtypen, die im Blut gefunden werden kann oder in vitro kultiviert werden. Spät Auswuchs EPCs (late-EPCs) erscheinen nach 2-3 Wochen der Kultur. Diese Zellen sind integriert schneller in eine Monoschicht aus menschlichen Nabelvenen - Endothelzellen und kann Kapillarröhrchen 19 bilden. Außerdem "early-EPCs" so genannte etwa eine Woche und handeln in einer passiven Weise durch Bereitstellung von angiogenen Molekülen, wie vaskulären endothelialen Wachstums im Blut zirkulierenFaktor (VEGF) oder CXCL8 19. Patienten mit koronarer Herzkrankheit (KHK) , zeigten eine signifikant geringere Mengen an early-EPCs im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne CAD 20. Interessanterweise zeigte die gleiche Gruppe höhere Mengen an late-EPCs im Vergleich zu einer Kontrollgruppe. Eine andere Studie zeigte , dass eine frühe-EPCs differenzierte EPCs von Apoptose unter oxidativen Bedingungen in einer parakrinen Weise 6 schützen. Deshalb ist der frühe EPCs könnten relevante Schutzwirkungen durch die Migration von anderen Zellen in einer Auto- oder parakrine Weise im peripheren Blut zur Verfügung stellen.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren early-EPCs zu reinigen , indem zuerst die PBMC-Fraktion aus menschlichem peripherem Blut isoliert und anschließend Isolieren von CD34 + Zellen aus der PBMC-Fraktion von unerwünschten Zellen dieser Zellsuspension zu entfernen. CD34 ist ein Marker, der für die Isolierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen verwendet wird 9 + Zellen, die auf Fibronectin-beschichteten Gewebekulturoberflächen. Nach drei Tagen wird das Medium gewechselt, wobei alle nicht-adhärente Zellen zu verlieren. Schließlich werden isoliert EPCs gefärbt, um die Aufnahme von acLDL und die Anwesenheit von KDR als Endothelzell-Marker zu verifizieren durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Als zusätzlicher Marker, wir plättchen endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1, CD31) analysiert, die auf Endothelzellen tritt auch auf.

Wiederherstellung von beschädigten oder myokardialen Gewebe durch verstärkte Rekrutierung von EPCs infarzierte gehört zu den intensivsten untersuchten Behandlungsstrategien bei kardiovaskulären Erkrankungen. Allerdings ist die Übersetzung von experimentellen Ergebnisse in die klinische Praxis immer noch eine Herausforderung, die komplexe zelluläre Wechselwirkungen im menschlichen Körper bei verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen gegeben. Darüber hinaus löst der myokardialen I / R-Verletzungen eine übermäßige Sekretion verschiedener Zytokine, Hormone und Wachstums fac toren, die das Homing von EPCs in Regionen von Blutgefäßbildung 13 steuern. Wie bereits gezeigt, CXCL8, stromal cell-derived Faktor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF und Makrophagen migration inhibitory factor (MIF) werden in Serumproben nach Myokard - I / R Schädigung 1 signifikant erhöht. Unter diesen Faktoren ist ein pleiotroper MIF Chemokin-ähnliche Cytokine mit überwiegend proinflammatorischen Eigenschaften. Im Gegensatz zu seinem historischen Namen, hat MIF pro-Migrationsfunktionen, als eine echte Chemokin auf verschiedenen Zelltypen handeln 1, 21, 22. MIF-vermittelten Zelleinstellungsverfahren haben zur Chemokin - Rezeptoren CXCR4 und CXCR2 in Verbindung gebracht worden, die MIF bindet an und aktiviert in einem nicht-verwandtes Weise 21. Bemerkens exprimieren EPCs beide dieser Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, die zusätzlich unter hypoxischen Bedingungen nach oben reguliert werden,ass = "xref"> 23, 24. Darüber hinaus schlägt Ansammeln Hinweise darauf , dass MIF hat eine Gesamt Herz-schützende Wirkung während des I / R Verletzung des Herzens 22, 25, 26. In diesem Zusammenhang hat es sich ferner gezeigt , dass MIF die Neovaskularisation bei hypoxischen Stress unterstützen kann , die von besonderer Bedeutung ist, wenn die begrenzte Wiederherstellungsmechanismen des verletzten Myokard 27 berücksichtigen. Zurück in - vitro - Studien und Experimente in der präklinischen Mausmodellen 4 erste Erkenntnisse über die Rolle von MIF in EPCs Rekrutierung zur Verfügung gestellt. Zu beachten ist , MIF ist auch ein prominentes Fracht - Protein von EPCs , die 28 innerhalb ischämischen Stellen während EPCs Rekrutierung freigesetzt werden können. Doch Studien im klinischen Umfeld insbesondere im Vergleich zu anderen (angiogene) Serum Zytokine bleiben schwer zu fassen.

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Protocol

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Blut für die Isolierung von EPCs wurde von gesunden Freiwilligen nach Einverständniserklärung in Übereinstimmung mit der lokalen Ethikkommission erhalten. Serumproben in den Migrationsassays verwendet wurden von Patienten erhalten, die konventionelle Herzchirurgie mit der Verwendung von kardiopulmonalen Bypass (CPB) unterzog. Ausschlusskriterien Notoperationen waren, bekannten oder vermuteten Schwangerschaft, Patienten `Alter unter 18 Jahren, und fehlende informierte Zustimmung erhalten. Die Serumproben wurden zusätzlich zu den klinischen Routinemessungen gezogen (unmittelbar vor der Operation und unmittelbar nach der myokardialen Reperfusion / Öffnung der Aorten-Kreuzklemme) und anschließend bei -80 ° C bis zur endgültigen Analyse gespeichert. Die Institutional Review Board (Ethikkommission, RWTH Aachen) genehmigte diese Studie. Die Patienten zeigten eine Durchschnittsalter 68,6 Jahre, und ein Durchschnittsgewicht von 81,7 kg. Vorerkrankungen enthalten: Hypertonie (65%), chronische Lungenerkrankung (19%), extra Herz Arteriopathie (16%), zerebrale Dysfunktion (6%), instabile Angina pectoris (3%), den letzten Myokardinfarkt (28% innerhalb von 90 d), chronischer Nierenerkrankung (14%), Lebererkrankungen (2%) und Diabetes (34%).

1. Beschichtung von T75-Flasche:

  1. Bereiten Sie 5 ml Fibronektin-Lösung (1 mg humanem Fibronektin, verdünnt in 15 ml Reinstwasser) pro T75-Flasche.
  2. Fügen Sie die Lösung auf eine T75-Flasche und warten, bis das Wasser verdampft ist. Um alle unnötigen Unterbrechungen während des Isolationsprozesses zu vermeiden aufgrund der Verdampfung, führen Sie diesen Prozess im Voraus (zB über Nacht) und bei Raumtemperatur. Diese Lösung gibt 4,44 ug Fibronektin / cm 2.
  3. Bereiten Sie die endotheliale Medium MV2 Zellwachstum durch die basale MV2 Medium mit den Wachstumsfaktor ergänzt durch den Hersteller zu ergänzen.

2. Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) aus 60 ml Blut:

Hinweis: Da die CD34-positive Selektion Cocktail einnd die magnetischen Beads sind im Handel erhältlich in einer kombinierten Auswahl-Kit gibt es keine Konzentrationen vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Jedoch etwa 100 & mgr; l des Antikörpers reichen für bis 5 x 10 8 Zellen Verarbeitung auf. Die magnetischen Kügelchen werden in Wasser verdünnt, Dextran-beschichtet und etwa 5.000-facher kleiner im Vergleich zu anderen im Handel erhältlichen Perlen. Für weitere Informationen siehe Herstellerangaben.

  1. Mischen Sie Blut (mit oder ohne Antikoagulantien) 1: 1 mit Ca 2+ -Mg 2+ -freier PBS.
  2. 15 ml Dichtegradient-Lösung pro 50 ml-Röhrchen. Für weitere Informationen siehe Herstellerangaben.
  3. Das verdünnte Blut auf der Oberseite der Dichtegradient-Lösung langsam Schicht.
  4. Zentrifuge Proben bei 2.500 xg für 30 min bei langsamer Beschleunigung und ohne Bremsen.
  5. Vorsichtig sammeln die Leukozytenfilmschicht jedes Rohr (Abbildung 1) eine sterile Plastikpipette und in ein anderes Röhrchen gegeben.Vermeiden Sammlung der Dichtegradient-Lösung. Die erwartete PBMC Ausbeute beträgt ca. 3-4 x 10 6 Zellen / ml Blut.

Abbildung 1
Abbildung 1: Dichtegradientenzentrifugation von Bbuffy Mantel auf Ficoll - Lösung. Gezeigt, ist das Ergebnis der Dichte-Gradienten-Zentrifugation bei 2.500 xg für 30 min auf der Dichtegradient-Lösung. Dargestellt sind Erythrozyten und Granulozyten (rot), die mononukleäre Zellfraktion (weiße Schicht), Plasma (gelb), und der Dichtegradient-Lösung (weißlich). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Verdünne die peripheren mononukleären Zellfraktion mit mindestens 3 Volumina PBS und mischen. Zentrifuge bei Raumtemperatur für 15 min bei 200 x g.
  2. Wiederholen Sie Schritt 2.6 zweimal. </ Li>
  3. Den Überstand aspirieren und resuspendieren Zellpellet in 5 ml MV2 Medium.
  4. Füge 100 & mgr; l des menschlichen CD34 - Antikörper (ausreichend für die Verarbeitung von bis zu 5 x 10 8 Zellen) pro verwendet buffy coat und dreht 15 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  5. Werden 50 & mgr; l Dextran-beschichteten magnetischen Kügelchen pro verwendet buffy coat und dreht 10 min bei 37 ° C mit 5% CO 2.
  6. Nach der Inkubation übertragen die Suspension auf FACS-Röhrchen mit einem Maximum von 3 ml in jedes Röhrchen. Höhere Mengen werden nicht mit dem Magneten zulässig.
  7. Einfügen FACS Röhre (n) in den Magnet (en) und für 5 min warten.
  8. Überstand verwerfen, ohne die FACS-Röhrchen aus dem Magneten ziehen.
  9. Resuspendieren der Zellen in jeder FACS-Röhrchen mit 3 ml MV2 Medium außerhalb des Magneten.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 2,12-2,14 zweimal.
  11. Ziehen die FACS-Röhrchen aus den Magneten und die Zellen in 3 ml Medium, MV2 resuspendieren.
  12. Übertragen die Zellsuspension in vorbeschichteten T75 flasks und 17 ml MV2 Medium pro Kolben hinzufügen.
    HINWEIS: Das Medium sollte nach 3 Tagen gewechselt werden. Nach einer Woche zeigen Zellen spindelartigen Strukturen (Figur 2) und sind gebrauchsfertig. Siehe einem Aussichtspunkt der Isolierung 3.

Figur 2
Abbildung 2: Mikroskopische Aufnahme von isolierten EPCs. Dargestellt ist ein repräsentatives Bild der isolierten frühen EPCs in einer T75-Flasche vor der Ablösung. Scheinbare ist die spindelartige Struktur der EPCs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3: Flussdiagramm des EPC Isolierungsverfahren werden angezeigt. Abgebildet ist ein Schema, Showing die einzelnen Schritte des EPC-Isolierungsprotokoll. Für eine detailliertere Protokoll finden Sie in Abschnitt 2 im Abschnitt Protokoll.

3. Migration Assay

  1. Entfernen Sie das Medium von EPCs in der T75-Flasche.
  2. Waschen mit 5 ml PBS durch vorsichtiges Schütteln.
  3. Entfernen PBS und 5 mL kommerzielle Zellablösung Lösung. Warten Sie, bis die Zellen abgelöst werden (überprüfen Sie unter einem Mikroskop). Beschleunigen Sie die Ablösung durch sorgfältig den Boden des Kolbens tippen.
  4. Wenn die Zellen abgelöst werden, fügen Sie schnell 5 ml MV2 Komplettmedium und Transfer in ein anderes Rohr die Zellsuspension.
  5. Zentrifuge bei 2.000 xg für 5 min.
  6. Die Zellen in 5-10 ml PBS und zentrifugiert erneut bei 2.000 xg für 5 min.
  7. Wiederholen Sie Schritt 3.6.
  8. Zellpellet in MV2 ausgehungert Medium (50.000 Zellen in 75 & mgr; l pro Trans gut gebraucht werden).
    HINWEIS: Welche Migrationssystem wird auf dem Zelltyp und Assay benötigt wird, hängt. Es gibt diff Erent Porendurchmesser und Plattengrößen (Anzahl der Brunnen). Für EPCs eine Porengröße von 5 & mgr; m in 96-Well-System ist optimal.
  9. Bereiten Sie die Migration Platte durch Zugabe von 235 ul der Serumprobe (Serum 1: 5 verdünnt in MV2 ausgehungert Medium) in die untere Kammer (Abbildung 4).

Abbildung 4
Abbildung 4: Migration Assay in einer modifizierten Boyden - Kammer. Dargestellt ist die allgemeine Gestaltung einer Kammer Boyden modifiziert. Die Zellkultur-Einsätze (= obere Kammer) sind in dunkelblau angezeigt und sind in die untere Kammer eingeführt. Der Boden (aber nicht die Wände) dieser Einsätze stellt das Filtersystem mit den Poren. (A) zeigt den Aufbau zum Zeitpunkt Null. (B) nach einer gewählten Zeitpunkt werden die Zellen durch das Filter auf einen Reiz migriert.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Fügen Sie den Einsatz kurz vor Zugabe der Zelllösung.
  2. Hinzuzufügen 75 ul der Zelllösung (= 50.000 Zellen) in die obere Kammer.
  3. Lassen Sie die EPCs bei 37 ° C für 3 h migrieren und 5% CO 2 (Migrationszeit hängt vom Zelltyp und System).
    1. Um Serum Autofluoreszenz Artefakte zu vermeiden, zu quantifizieren gewanderten Zellen durch Bilder des Bohrlochs unter einem Mikroskop zu nehmen und die Zellen zählen, um die halbautomatische Software "ImageJ" verwenden.
  4. Entfernen Sie die obere Kammer (alle nicht migrierten Zellen enthält).
  5. In 70 & mgr; l 3,6% Paraformaldehydlösung, einschließlich Hoechst-Farbstoff (verdünnt 1: 1000). Die Platte kann bei 37 ° C und 5% CO 2 über Nacht gelagert werden.
  6. Zentrifugieren Sie die Platte kurz alle Zellen in die gleiche Brennebene bei 2.000 × g für 1-2 Minuten zu bekommen.
  7. Nehmen Sie 5 Bilder pro well (5 und 6) mit einer 100 - facher Vergrößerung.

Abbildung 5
Abbildung 5: Schema der Position des aufgenommenen Bilder werden angezeigt. Das Schema zeigt die Position der fünf aufgenommenen Bilder, die für die Bestimmung von migrierten Zellen benötigt werden, in Bezug auf den Brunnen. Die Bilder werden ergriffen, um die Zellen zu zählen und einen Mittelwert für jeden gut berechnen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6: Mikroskopische Aufnahme für Zell Quantifizierung. Gezeigt wird ein repräsentatives Bild, das für die Zell Quantifizierung genommen wurde. Die Zellen wurden gefärbt und fixiert using Hoechst-Farbstoff in 3,6% Paraformaldehyd. Die Punkte stehen für feste und endothelialen Vorläuferzellen gefärbt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Zählen Sie die migrierten Zellen unter Verwendung des halbautomatischen Software "ImageJ" durch das National Institute of Health.

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Representative Results

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Die Charakterisierung der isolierten Endothelvorläuferzellen

Zunächst wurde die Aufnahme von acLDL überprüft, sowie die Expression von KDR und CD31 auf der Oberfläche der isolierten Zellpopulation. Wie in Abbildung 7a zeigt, 85,1% der isolierten EPCs zeigte eine Aufnahme von acLDL und ausgedrückt CD31. Figuren 7b und 7c weiterhin eine homogene Verteilung beider Marker nachweisen, obwohl es scheint eine kleinere Population, negativ für beide Marker sein. In einem zweiten Schritt, FACS-Analyse von acLDL in Kombination mit KDR wurde durchgeführt. 8a zeigt , dass über 80% der isolierten Zellen eine Aufnahme von acLDL zeigte und die Expression von KDR auf ihrer Oberfläche. Figuren 8b und 8c zeigen die Homogenität dieser Marker.

Um zu überprüfen, die importance von Fibronektin-beschichteten Schalen während der Kulturzeit, ein Vergleich der drei Marker zwischen isolierten Zellen nach zwei Tagen Kultur auf einer Oberfläche Fibronectin beschichtet mit isolierten EPCs nach sieben Tagen Kultur auf Fibronektin-beschichteten Schalen (wie in unserem Protokoll angegeben) durchgeführt wird , wurde sowohl mit früheren CD34 + -Selektion. Wie in 9a gezeigt, nur 46,4% der zweitägigen kultivierten Zellen zeigten eine Aufnahme von acLDL sowie einen Ausdruck von CD31 auf ihrer Oberfläche, im Vergleich zu 85% der Zellen nach sieben Tagen Kultur auf Fibronectin. Darüber hinaus sind die Histogramme (Figuren 9b und 9c) zeigen eine geringere Intensität der beiden Markierungen nach zwei Tagen Kultur im Vergleich zu sieben Tagen (7b Figuren und 7c). Dasselbe gilt für die Kombination der Marker acLDL und KDR wahr. Nach zwei Tagen der Kultur auf Fibronectin, nur 68,0% aller Zellen , die eine Aufnahme von acLDL zeigte sowie einen Ausdruck der KDR auf ihrer Oberfläche (Abbildungs 10a-10c). Nach sieben Tagen der Kultur auf Fibronectin zeigten 83,6% der Zellen eine Aufnahme von acLDL und Expression von KDR auf ihrer Oberfläche (8a bis 8c).

In einem nächsten Schritt wird die Bedeutung der CD34 + -Selektion während der Isolierung der EPCs wurde bewertet. Daher wird gemäß der vorliegenden Protokoll ausgewählten Zellen, einschließlich Dichtegradientenzentrifugation und sieben Tagen Kultur auf Fibronektin, aber die verpassten die CD34 + -Selektion isoliert. Wie in 10a gezeigt, über 18% aller isolierten Zellen tun weder ausdrückliche CD31 noch eine Aufnahme von acLDL zeigen, im Vergleich zu weniger als 8% nach CD34 + -Selektion, die eine CD31 - Expression und eine Aufnahme von acLDL (7a) zeigen . Zusätzlich Figuren 11b und 11c zeigen , dass die isolierten Zellen sehr inhomogen sind bezüglich beider Marker im Vergleich zu der im Zusammenhang 7c die gleichen Marker in einer Zellpopulation mit früheren CD34 + -Selektion zeigt.

Serum Cytokinspiegel in der Herzchirurgie

Um den Einfluss der Herzchirurgie folgenden myocardial I / R von den Konzentrationen von zirkulierenden Serumspiegel von MIF, CXCL12, CXCL8 und VEGF zu identifizieren, wurden Serumproben von im Handel erhältlichen ELISA (Figur 12) prä- und intraoperativ für die nachfolgende Analyse gezogen . Serumspiegel von MIF zeigte einen signifikanten Anstieg der intraoperativen Vergleich zu den Ausgangswerten (100,3 ng / ml vs. 127,4 ng / ml, p = 0,027). Ebenso zeigte CXCL12 Ebenen einen signifikanten Anstieg im Serum während der Operation (0,101 ng / ml vs. 0,198 ng / ml, p = 0,011). Ähnlich wie MIF und CXCL12, CXCL8 während der Operation (0,15 ng / ml vs. 0,3 ng / ml, p = 0,022) signifikant erhöht. in Fortsetzungrast, VEGF - Konzentrationen zeigten keine signifikanten Veränderungen während der Beobachtungsperiode (0,154 ng / ml vs. 0,134 ng / mL, p = 0,583) 1.

Migration Kapazität von Endothelial Progenitor Cells

Um die direkte Wirkung von patients' Serumproben und die darin enthaltenen Zytokine / Chemokine / angiogenen Faktoren auf EPC - Migration zu untersuchen, ein Ex - vivo - Migrationsassay Serumproben verwenden, die vor gezogen wurden und während der Operation durchgeführt wurde. EPCs wurden von gesunden Freiwilligen isoliert. Wie in Abbildung 13 dargestellt, EPC Migrationsrate gegenüber den intraoperativ entnommenen Proben im Vergleich zu präoperativ entnommenen Proben deutlich erhöht (+ 35% im Vergleich zum Ausgangswert, p = 0,047).

Da frühere Studien bereits gezeigt, dass I / R löst eine Sekretion von sevrere Zytokine, die Leukozyten-Chemotaxis und Migration, Migrationstests unter Verwendung dieser potenziellen Lockstoffe, einschließlich MIF, CXCL12, CXCL8 und VEGF modulieren wurden durchgeführt. Um ein besseres Verständnis des Einflusses dieser Zytokine auf EPC Rekrutierung in vivo, zusätzliche in vitro Migration Experimente erhalten, die physiologisch gemessenen Konzentrationen der oben genannten Zytokinen in die untere Kammer des Migrationsauftragseinrichtungen durchgeführt wurden, zu.

Da MIF - Serumkonzentrationen zwischen 100 und 130 ng / ml (Abbildung 12) gemessen worden war, wurde eine Konzentration von 100 ng / ml rekombinantem MIF verwendet, die im Vergleich zur Mediumkontrolle zu einem> 6-fachen Anstieg der EPC Migration führte ( Abbildung 14). Im Gegensatz dazu waren die Serumkonzentrationen von CXCL12, CXCL8 und VEGF im Bereich von 150 bis 300 pg / mL. Zu beachten ist , vermitteln diese Konzentrationen ergaben sich keine Auswirkungen auf EPC - Migration in vitro(Abbildung 14). Es ist daher denkbar , dass unter diesen vier Zytokinen, MIF die relative stärksten Einfluss auf EPC - Migration zeigt in - vivo - 1.

7
Abbildung 7: FACS Analyse von isolierten EPCs an Tag 7 (a) gezeigt , ist die Aufnahme von acLDL und CD31 Zelloberflächenexpression von isolierten EPCs nach CD34 + Auswahl und 7 Tage Kulturdauer auf Fibronektin-beschichteten Schalen. Oben links: Zellen zeigen die Aufnahme von acLDL, aber nicht CD31 exprimieren. Oben rechts: Die Zellen zeigen Aufnahme von acLDL und CD31 exprimieren. Unten links: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL und nicht exprimieren CD31. Unten rechts: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL, sondern Ausdruck CD31. (B) dargestellt ist , das Histogramm von PE-konjugiertem acLDL nach Aufnahme von isolierten EPCs. (C) gezeigt ist , das Histogramm von FITC-conjugated CD31 Antikörper nach CD31 von isolierten EPCs an Zelloberfläche binden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8
Abbildung 8: FACS Analyse von isolierten EPCs an Tag 7 (a) gezeigt , ist die Aufnahme von acLDL und KDR Zelloberflächenexpression von isolierten EPCs nach CD34 + Auswahl und 7 Tage Kulturdauer auf Fibronektin-beschichteten Schalen. Oben links: Zellen zeigen die Aufnahme von acLDL, aber nicht KDR exprimieren. Oben rechts: Die Zellen zeigen Aufnahme von acLDL und KDR exprimieren. Unten links: Zellen keine Aufnahme von acLDL zeigen und nicht KDR exprimieren. Unten rechts: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL, aber KDR exprimieren. (B) dargestellt ist , das Histogramm von PE-konjugiertem acLDL nach Aufnahme von isolierten EPCs. (C) gezeigt , ist dieHistogramm von FITC-konjugierten KDR-Antikörper nach an Zelloberflächen KDR von isolierten EPCs verbindlich. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

9
Abbildung 9: FACS Analyse von isolierten EPCs an Tag 2 (a) gezeigt , ist die Aufnahme von acLDL und CD31 Zelloberflächenexpression von isolierten EPCs nach CD34 + Auswahl und 2 Tageskulturperiode auf Fibronektin-beschichteten Schalen. Oben links: Zellen zeigen die Aufnahme von acLDL, aber nicht CD31 exprimieren. Oben rechts: Die Zellen zeigen Aufnahme von acLDL und CD31 exprimieren. Unten links: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL und nicht exprimieren CD31. Unten rechts: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL, sondern Ausdruck CD31. (B) dargestellt ist , das Histogramm von PE-konjugiertem acLDL nach Aufnahme von isolierten EPCs. ( Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

10
Abbildung 10: FACS Analyse von isolierten EPCs an Tag 2 (a) gezeigt , ist die Aufnahme von acLDL und KDR Zelloberflächenexpression von isolierten EPCs nach CD34 + Auswahl und 2 Tageskulturperiode auf Fibronektin-beschichteten Schalen. Oben links: Zellen zeigen die Aufnahme von acLDL, aber nicht KDR exprimieren. Oben rechts: Die Zellen zeigen Aufnahme von acLDL und KDR exprimieren. Unten links: Zellen keine Aufnahme von acLDL zeigen und nicht KDR exprimieren. Unten rechts: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL, aber KDR exprimieren. (B) dargestellt ist , das Histogramm von PE-konjugiertem acLDL nach Aufnahmevon isolierten EPCs. (C) gezeigt ist , das Histogramm von FITC-konjugiertem KDR - Antikörper nach der Bindung an Zelloberflächen - KDR isolierter EPCs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

11
Abbildung 11: FACS Analyse von isolierten EPCs an Tag 7 (a) gezeigt , ist die Aufnahme von acLDL und CD31 Zelloberflächenexpression von isolierten EPCs ohne vorherige CD34 + Auswahl, aber auch 7 Tage Kulturdauer auf Fibronektin-beschichteten Schalen. Oben links: Zellen zeigen die Aufnahme von acLDL, aber nicht CD31 exprimieren. Oben rechts: Die Zellen zeigen Aufnahme von acLDL und CD31 exprimieren. Unten links: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL und nicht exprimieren CD31. Unten rechts: Die Zellen zeigen keine Aufnahme von acLDL, sondern Ausdruck CD31. (B) gezeigt ,ist das Histogramm von PE-konjugierten acLDL, nachdem sie von isolierten EPCs Aufnahme. (C) gezeigt ist , das Histogramm von FITC-konjugierten CD31 - Antikörper nach der Bindung an Zelloberflächen - CD31 von isolierten EPCs. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

12
Abbildung 12: Serum Cytokinspiegel in der Herzchirurgie. Die Messung der Serumkonzentrationen von CXCL8, VEGF, CXCL12 und MIF von Patienten, die Herzchirurgie mittels ELISA unterzogen. Dargestellt sind Mittelwerte der präoperativen im Vergleich zu intraoperativen Konzentrationen ± SEM (*: p <0,05; vs. Pre-OP)

13
Abbildung 13: In - vitro - Migration von EPCs Auf dem Weg zu Patientenserum. Dargestellt ist die intraoperative Zunahme der EPC-Migration von gesunden Probanden zu Serumproben von Patienten, die Herzchirurgie unterzogen. 50.000 Zellen pro Vertiefung in MV2 Serum ausgehungert Medium wurden in die obere Kammer eines Transwell-Systems gegeben. 5 mit dem gleichen Medium: Die Serumproben in der unteren Kammer 1 wurden verdünnt. Die Zellen für 3 h bei 37 ° C und 5% CO 2 durch eine 5 um Membran gewandert. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM (*: p <0,05)

14
Abbildung 14: In - vitro - Migration von EPCs Auf dem Weg zu rekombinanten Zytokinen. Gezeigt, ist die Migration von EPCs auf repräsentative Konzentrationen von rekombinantem CXCL8, CXCL12, VEGF und MIF im Vergleich zu Serum-ausgehungert Medium (= Basislinie). Nur MIF konnteeine erhöhte EPC-Migration bei physiologisch gemessenen Konzentrationen zu vermitteln. Die rekombinanten Zytokinen wurden in MV2 Serum ausgehungert Medium verdünnt. Die Zellen für 3 h durch einen 5 um-Membran migriert. Die Balken stellen Mittelwerte ± SEM (**: p <0,01 vs. Serum ausgehungert Medium)

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Der erste Teil dieser Studie umfasste die Isolierung von humanen EPCs aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden, eine umfassende Bewertung des Blutes der Herzchirurgie-Patienten zu ermöglichen. Daher wurde eine Dichtegradientenzentrifugation geführt, um die PBMC-Fraktion aus Plasma, Granulozyten und Erythrozyten zu trennen. Für die meisten der verunreinigenden Blutplättchen zu entfernen, wurde diese Zellfraktion zu kurz ausgesetzt und langsam Waschschritte 29, 30. Als nächstes wurden CD34 + -Zellen aus der verbleibenden Fraktion isoliert Vorläuferzellen von den verbleibenden Lymphozyten zu trennen und Monozyten. Schließlich wurde die Zellsuspension auf Fibronektin-beschichteten Schalen gezüchtet in einem handelsüblichen endothelialen Zellwachstumsmedium endothelialen Vorläuferzellen von anderen (Vorläufer) Zellen der myeloiden Abstammungslinie 3 zu trennen. Bemerkenswert ist, wird diskutiert, dass Blutplättchen eine CD34 Zelloberfläche exprimieren zeigen kannIonen, zu. Obwohl frühere Studien einiger anti-CD34 - Antikörpern an Blutplättchen zeigten Bindung, könnte dies ein Artefakt aufgrund der Aggregation von Blutplättchen mit anderen (CD34-positive Zellen) 31, 32. Jedoch können die meisten Plättchen durch wiederholte langsame Waschschritte getrennt werden. Neben Blutplättchen, deren Vorstufen - Megakaryozyten - exprimieren dieses Antigen hämatopoetischen Vorläuferzellen und könnte im peripheren Blut vorhanden sein, obwohl sie vor allem im Knochenmark 33, 34 zu finden sind. Darüber hinaus ist auch beschrieben , dass die Zelloberflächenmarker CD34, in diesem Protokoll verwendet wird , 35 in sehr geringen Mengen auf reifen Endothelzellen exprimiert. Daher ist es wichtig, eine mögliche Kontamination von Blutplättchen / Megakaryozyten oder reifen Endothelzellen vorsichtig betrachten, wenn EPCs isoliert. Daher Schritt 2.6 ist von besonderer Bedeutung bei der isolation von EPCs Blutplättchen zu entfernen.

Um zu klären, wurden die Bedeutung der Kultivierung der isolierten Zellen auf Fibronektin-beschichteten Schalen, Zellpopulationen nach zwei Tagen und sieben Tagen Kultur auf Fibronektin im Vergleich sowohl mit früheren CD34-positive Selektion. Am zweiten Tag, weniger als die Hälfte der isolierten Zellen zeigten eine Aufnahme von acLDL und die gleichzeitige Expression von CD31 auf ihrer Oberfläche. Darüber hinaus ist eine weniger intensive Expression beider Markierungen auf den Bezug Histogramme zu sehen war. Diese Daten zeigen, dass sieben Tagen Kultur auf Fibronektin in der endothelialen zellspezifischen Medium notwendig sind, um EPCs zeigt charakteristische endothelialen Expressionsmuster zu erhalten. In diesem Schritt ist es wichtig, die richtige Konzentration / Menge von Fibronektin zu verwenden. Wijelath und Kollegen haben bereits gezeigt , dass Fibronektin die Expression von endothelialen zellähnlichen Muster fördert, wahrscheinlich in Kombination mit VEGF 36.

Im nächsten step des Protokolls, die Bedeutung von CD34 + -Selektion der Zellsuspension wurde untersucht, Zellen isoliert nach 7 Tagen Kultur auf Fibronektin-beschichteten Schalen mit und ohne vorherige CD34 + -Selektion vergleicht. Die Menge der Zellen war beide Marker (acLDL Aufnahme und CD31 Expression) fehlt viel höher nach Zellisolierung ohne vorherige CD34 + -Selektion im Vergleich zu Isolation einschließlich diesen Schritt. Interessanterweise nach sieben Tagen Kultur auf Fibronectin, Zellen fehlt CD34 + -Selektion zeigten eine weniger homogene Zellpopulation, wie durch die inhomogene Expression von CD31 im Vergleich zu Zellen, isoliert mit CD34 + -Selektion angegeben. Diese Daten zeigen , dass CD34 + -Selektion notwendig ist , EPCs aus anderen Monozyten / Makrophagen zu sortieren. Bei der Einrichtung dieses Protokolls haben wir festgestellt , dass CD34 + -Selektion in MV2 Medium bei 37 ° C führt zu einer erhöhten Anzahl von überlebenden Zellen im Vergleich mit viel niedrigeren temperatures, das vorsichtig in zukünftigen Studien untersucht werden muss. Wir müssen anerkennen, dass, wenn dieses Protokoll Anwendung der Antikörper Inkubation in calciumhaltigen Medium bei 37 ° C zu unspezifischen Wechselwirkungen führen und zu binden. In Zukunft Puffersysteme Kalzium bei niedrigeren Temperaturen fehlen sollte dieses Potenzial Störfaktor zu vermeiden, getestet und hergestellt werden.

Bemerkenswert ist , während unserer vorläufigen Analyse der Zellmigration Experimente mit Serumproben wurden Messungen zuerst durchgeführt , einen Fluoreszenzmikroplattenlesegerät und Calcein-Färbung der Zellen, wie zuvor für verschiedene Zelltypen (zB menschliche Nabelschnurvenen - Endothelzellen, HUVEC) 37 beschrieben. Die verschiedenen Extinktionswerte zwischen den Kammern angedeutet, dass nicht nur die Serumproben allein, sondern auch das Medium bereits einen bemerkenswerten Einfluss auf die gemessene Fluoreszenz aufweisen, die mit Vorsicht betrachtet werden muss. Daher we angepasst unserem Protokoll und umgeschaltet, in dem ein Messsystem können die Zellen durch eine halbautomatisierte Software über Lichtmikroskopie gezählt und beobachtet werden.

Während EPCs für etwa 0,1% der Zellen im peripheren Blut ausmachen , und es ist schwierig , diese spezifischen Zellen 38, eine beeindruckende Anzahl von Studien zu isolieren darauf hin , dass EPCs vorteilhafte Wirkungen hervorrufen kann und Gewebedurchblutung nach ischämischen Ereignissen in den Gliedern und im Myokard 39 verbessern , 40. Dennoch ist es immer noch eine ständige Herausforderung, diese Erkenntnisse in die klinische Praxis umgesetzt werden und ihre klinische Relevanz zu bewerten. Die Gründe können zum signifikanten Einfluss vieler perioperative Faktoren auf die Sekretion von verschiedenen chemischen Lockstoffe zurückzuführen sein, die zuvor 22 gezeigt worden ist, 41. Daher wird in dem zweiten Teil der Studie, die Rolle der verschiedenen cytokines auf die Migration von EPCs bei der Festlegung der myokardialen I / R wurden ausgewertet. Daher wurden die Serumkonzentrationen von Zytokinen in der Herzchirurgie-Patienten gemessen. MIF sowie CXCL12 und CXCL8 zeigten eine signifikante intraoperativen Erhöhung. Wenn diese Erkenntnisse wieder in die in - vitro - Experimenten zu übersetzen, zeigten vorliegenden Ergebnisse , dass es weder eine CXCL12- noch CXCL8-vermittelte Wirkung auf EPC - Migration bei den gemessenen physiologischen Konzentrationen in vitro. Mit dem beschriebenen EPC Isolationsmodell und die anschließende Migration Assay wurde MIF als Hauptmediator der EPC - Migration identifiziert 42. In diesem Zusammenhang Kanzler et al. in einem experimentellen Mausmodell gezeigt , dass MIF und VEGF die stärkste Wirkung auf EPC - Migration unter 23 Hypoxie bieten. Interessanterweise zeigen Messungen von VEGF, dass es keine signifikanten intraoperative Veränderung ist in VEGF-Konzentrationen im Blut, die aus der Bindung o führen kannf VEGF auf die intraoperative standardisierte Anwendung von Heparin. Daher kann MIF eine herausragende Rolle unter den angiogenen Chemokinen bei der Rekrutierung von EPCs in der Herzchirurgie - Patienten spielen und kann 44 Aber für den Heilungsprozess nach Myokard - I / R durch den Handel mit EPCs an der Verletzungsstelle 43, initiieren und tragen, wie MIF Werte erhöht unmittelbar nach Myokard - I / R, bleibt spekulativ , ob das MIF-vermittelte Wirkung auf die Rekrutierung von EPCs kardialen Remodeling beeinflussen können und die Angiogenese, die bei der Vorbeugung von Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt I / R 23 signifikante Auswirkungen haben. Bevor jedoch auf solche Analyse vorrückenden, ist es wichtig, die verschiedenen Subtypen von EPCs weiter zu charakterisieren und ihre funktionelle Rolle in der Humanbiologie zu bewerten. In diesem Zusammenhang stellt die vorliegende Protokoll, ein zuverlässiges Verfahren, wie EPCs aus menschlichem peripherem Blut zu isolieren i zu ermöglichen,ts weitere umfassende Charakterisierung und zukünftige Studien.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells

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Isolierung von endothelialen Vorläuferzellen von gesunden Freiwilligen und ihre Migratory Potential Beeinflusst von Serumproben nach einer Herzoperation
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Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).More

Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).

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