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L'isolamento di cellule progenitrici endoteliali da volontari sani e il loro potenziale migratori influenzato dal siero campioni dopo cardiochirurgia

Published: February 14, 2017 doi: 10.3791/55192
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4, 1, 5,6, 1
1Department of Intensive Care Medicine, University Hospital Aachen, 2Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University Hospital Aachen, 3Department of Radiology, German Cancer Research Center, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Hospital Aachen, 5Department of Vascular Biology, Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), Klinikum der Universität München, 6Deutsches Zentrum für Herz-/Kreislaufkrankheiten (DZHK), Munich Heart Alliance

Summary

cellule progenitrici endoteliali (EPC) sono cruciale coinvolti nella neovascolarizzazione di tessuti ischemici. Questo metodo descrive l'isolamento di EPC umani da sangue periferico, così come l'identificazione della loro potenziale migratorio contro campioni di siero di pazienti chirurgici cardiaci.

Abstract

cellule progenitrici endoteliali (EPC) sono reclutati dal midollo osseo in condizioni patologiche come l'ipossia e sono fondamentalmente coinvolti nella neovascolarizzazione di tessuti ischemici. L'origine, la classificazione e la caratterizzazione di EPC sono complesse; Nonostante, due importanti sottotipi di EPC sono stati stabiliti: i cosiddetti "primi" EPC (successivamente indicati come primi-EPC) e tardo-escrescenza EPC (fine-EPC). Essi possono essere classificati per proprietà biologiche nonché dal loro aspetto durante la coltura in vitro. Mentre EPC "precoce" appaiono in meno di una settimana dopo la coltura di cellule mononucleate del sangue periferico di derivazione nei media CE-specifica, EPC tardo-escrescenza si possono trovare dopo 2-3 settimane. EPC tardo-escrescenza sono stati riconosciuti di essere direttamente coinvolti nella neovascolarizzazione, soprattutto attraverso la loro capacità di differenziarsi in cellule endoteliali mature, mentre "presto" EPC esprimono diversi fattori angiogenetici come endogenocargo unità organizzative per promuovere l'angiogenesi in modo paracrino. Nel corso del miocardio da ischemia / riperfusione (I / R), vari fattori controllano la homing di EPC alle regioni di formazione dei vasi sanguigni.

Macrofagi fattore inibitorio della migrazione (MIF) è una citochina pro-infiammatoria e ubiquitariamente espresso chemochine simile ed è stato recentemente descritto a funzionare come regolatore chiave della migrazione EPC a concentrazioni fisiologiche 1. È interessante notare, MIF viene memorizzato in piscine intracellulari e può rapidamente essere rilasciato nel flusso sanguigno dopo diversi stimoli (ad esempio infarto miocardico).
Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento affidabile e cultura precoce EPC da sangue periferico umano adulto basato sulla selezione CD34-positive con successiva coltura in terreno contenente fattori di crescita endoteliali su piastre di fibronectina rivestite per uso in test in vitro migrazione contro campioni di siero dei pazienti chirurgici cardiaci. Inoltre, laè dimostrata influenza migratoria di MIF sulla chemiotassi di EPC rispetto ad altre citochine angiogenesi-stimolante ben noti.

Introduction

Cellule progenitrici endoteliali (EPC) circolano nel sangue umano e hanno la capacità di differenziarsi in cellule endoteliali 2. Partecipano vasculogenesi e sono in grado di ridurre al minimo i danni causati da infiammazione e ischemia / riperfusione (I / R) lesioni in vari modi 3, 4. Ad esempio, EPC mostrano elevati livelli di enzimi antiossidanti intracellulari come catalasi, glutatione perossidasi o superossido dismutasi manganese (MnSOD) 5. L'elevata resistenza contro lo stress ossidativo permette EPC di funzionare in microambienti con specie elevati reattive dell'ossigeno (ROS) dopo danno ischemico 6. Precedenti studi hanno anche indicato che il numero di EPC potrebbe essere correlata alla riparazione vascolare e che un numero ridotto di circolazione EPC predice il verificarsi di eventi cardiovascolari 7,class = "xref"> 8. Tuttavia, una chiara definizione di una CPI non è stato ancora trovato. Fino ad ora, non vi è alcun indicatore superficie cellulare specifico o fenotipo coerente per EPC e queste cellule sono molto rari nel sangue periferico 9. Un EPC umana deve essere considerato come una cellula circolazione con la capacità di contribuire alla ricostruzione dell'endotelio feriti e nuove strutture vascolari.

Un modo di isolare e caratterizzare EPC è attraverso l'adesione alla fibronectina. In tal modo, la capacità di queste cellule viene usato per mostrare una adesione superiore alla fibronectina piatti rivestiti rispetto al tipo 1 collagene, per esempio 3, 10, 11. Tuttavia, altri hanno scoperto che la placcatura cellule mononucleate sui piatti fibronectina rivestite senza alcuna fase di purificazione precedente o ulteriormente porta a colonie comprese le cellule progenitrici mieloidi, monociti, linfociti T e 12, 13, 14. Inoltre, in questo caso, le piastrine potrebbero contaminare il (MNC) frazione di cellule mononucleate e quindi trasferire proteine di membrana plasmatica di eventuali cellule aderenti 15.

Oltre caratterizzazione mediante saggi di adesione in vitro, una combinazione di diversi marcatori di superficie cellulare viene usato per descrivere un tipo di cellula considerata come EPC. In questo caso, dopo l'adesione fibronectina-mediata, le cellule vengono analizzati preoccupanti loro attributi endoteliali-like. In questo processo, i due marcatori di cellule endoteliali-associata, lipoproteine ​​a bassa densità acetilata (acLDL) e fattore di crescita vascolare endoteliale del recettore 2 (VEGFR-2, U), giocano un ruolo. Le cellule endoteliali e macrofagi hanno dimostrato di prendere specificamente fino acLDL in un processo chiamato "percorso delle cellule scavenger" 16. Un'altra proteina marcatore è KDR come il recettore VEGF principale endotelialecellule 17. Tuttavia, come EPC in generale sono coltivate in mezzi supplementato con fattori di crescita endoteliali e siero fetale di vitello, è possibile che i macrofagi, che potrebbe anche essere stato erroneamente isolato, presentano un profilo marcatore endoteliale-like. Come precedentemente indicato, se coltivate in un mezzo-endoteliale condizionata, macrofagi esprimono proteine "specifici endoteliali" 18.

In generale, ci sono due categorie di EPC all'interno più sottotipi, che possono essere trovati nel sangue o essere coltivate in vitro. Late-escrescenza EPC (fine-EPC) compaiono dopo 2-3 settimane di cultura. Queste cellule sono integrati velocemente in un monostrato di vena ombelicale cellule endoteliali umane e possono formare tubi capillari 19. Inoltre, cosiddetto "early-EPC" circolare nel sangue per circa una settimana e agire in maniera più passiva attraverso consegnano molecole angiogeniche, come la crescita endoteliale vascolarefactor (VEGF), o CXCL8 19. I pazienti con malattia coronarica (CAD) hanno mostrato significativamente minori quantità di early-EPC rispetto ad un gruppo di controllo senza CAD 20. È interessante notare che lo stesso gruppo ha mostrato una maggiore quantità di fine-EPC rispetto ad un gruppo di controllo. Un altro studio ha mostrato che i primi-EPC proteggere EPC differenziate da apoptosi in condizioni di ossidazione in modo paracrino 6. Pertanto, primi EPC potrebbero fornire effetti protettivi pertinenti attraverso la migrazione di altre cellule in maniera automatica o paracrino nel sangue periferico.

Questo protocollo descrive un metodo per purificare early-EPC dapprima isolando il PBMC in frazioni da sangue periferico umano e successivamente isolare cellule CD34 + da PBMC in frazioni per cancellare questa sospensione cellulare da cellule indesiderate. CD34 è un marcatore, che viene utilizzato per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche umane 9 + sono coltivate su terreni di coltura tissutale fibronectina rivestite. Dopo tre giorni, il mezzo viene cambiato, perdendo quindi tutte le cellule non aderenti. Infine, EPC isolati sono macchiati per verificare l'assorbimento di acLDL e la presenza di KDR come cellule endoteliali-marcatore utilizzando cellule fluorescenza attivate (FACS). Come marcatore addizionale, abbiamo analizzato piastrine molecola di adesione delle cellule endoteliali (PECAM-1, CD31), che si verifica anche sulle cellule endoteliali.

Restauro del tessuto miocardico danneggiato o infartuato da una maggiore assunzione di EPC appartiene alle strategie di trattamento intensivo indagati nelle malattie cardiovascolari. Tuttavia, la definizione di risultati sperimentali nella pratica clinica è ancora difficile, data la complessa interazione cellulare nel corpo umano durante varie condizioni fisiopatologiche. Inoltre, l'ho infarto / Infortuni R innescare una eccessiva secrezione di varie citochine, ormoni e fac crescita tori, che controllano la homing di EPC alle regioni di formazione dei vasi sanguigni 13. Come già evidenziato, CXCL8, stromali fattore derivato dalle cellule 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF e il fattore inibitorio della migrazione dei macrofagi (MIF) sono significativamente aumentata nei campioni di siero dopo danno miocardico I / R 1. Tra questi fattori, MIF è una citochina chemochine simile pleiotropica con caratteristiche prevalentemente pro-infiammatori. In contrasto con il suo nome storico, MIF ha funzioni pro-migratorie, agendo come un vero chemochine su vari tipi cellulari 1, 21, 22. Processi di reclutamento delle cellule MIF-mediate sono stati collegati alla recettori per le chemochine CXCR2 e CXCR4, che MIF si lega ed attiva in modo non-cognate 21. Da segnalare, EPC esprimono entrambi questi recettori sulla loro superficie, che in aggiunta diventano up-regolati in condizioni di ipossiaass = "xref"> 23, 24. Inoltre, prove accumulando suggerisce che MIF ha un effetto complessivo cardio-protettivo durante I / R pregiudizio del cuore 22, 25, 26. In questo contesto, è stato ulteriormente dimostrato che MIF può supportare la neovascolarizzazione durante stress ipossico di particolare rilevanza, quando si considerano i meccanismi di recupero limitati del miocardio danneggiato 27. Precedenti studi in vitro ed esperimenti in modelli murini di pre-clinici forniti prima testimonianza sul ruolo della MIF in EPC assunzioni 4. Da segnalare, anche MIF è un importante proteina carico di EPC che possono essere immesse durante EPC reclutamento all'interno di siti ischemici 28. Tuttavia, gli studi in ambienti clinici, in particolare in confronto con gli altri (angiogenici) citochine nel siero rimangono sfuggente.

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Protocol

Il sangue per l'isolamento di EPC è stato ottenuto da volontari sani, dopo consenso informato secondo il comitato etico locale. I campioni di siero utilizzati nei saggi di migrazione sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca convenzionale con l'uso del bypass cardiopolmonare (CPB). I criteri di esclusione erano operazioni di emergenza, la gravidanza accertata o sospetta, patient`s età inferiore a 18 anni, e il fallimento di ottenere il consenso informato. I campioni di siero sono stati elaborati oltre alle misurazioni di routine clinici (immediatamente prima dell'intervento e subito dopo riperfusione miocardica / apertura aortico cross-clamp) e successivamente conservati a -80 ° C fino all'analisi finale. Il comitato di revisione istituzionale (comitato etico, RWTH Aachen University) ha approvato questo studio. I pazienti hanno mostrato una età media di 68,6 anni e un peso medio di 81,7 kg. malattie pre-esistenti inclusi: ipertensione (65%), malattia polmonare cronica (19%), arteriopatia cardiaco extra (16%), disfunzione cerebrale (6%), angina instabile (3%), infarto miocardico recente (28% entro 90 d), malattia renale cronica (14%), malattie epatiche (2%) e diabete (34%).

1. Rivestimento di T75 Flask:

  1. Preparare 5 soluzione fibronectina ml (1 mg fibronectina umana diluito in 15 ml di acqua ultrapura) per bombola T75.
  2. Aggiungere la soluzione in un pallone T75 e attendere finché non viene evaporata l'acqua. Per evitare inutili interruzioni durante il processo di isolamento dovuto all'evaporazione, eseguire questo processo in anticipo (ad esempio durante la notte) ea temperatura ambiente. Questa soluzione dà 4,44 mcg fibronectina / cm 2.
  3. Preparare la crescita delle cellule endoteliali medio MV2 integrando il supporto MV2 basale con la crescita integratori fattore fornite dal produttore.

2. Isolamento di cellule progenitrici endoteliali (EPC) da 60 ml di sangue:

NOTA: Come il CD34-positivo selezione di cocktail unnd le perline magnetiche sono disponibili in commercio in un kit selezione combinato, non esistono concentrazioni fornite dal produttore. Tuttavia, circa 100 microlitri di anticorpo sono sufficienti per elaborare fino a 5 x 10 8 cellule. Le sfere magnetiche sono diluiti in acqua, destrano rivestito e circa 5,000x più piccola rispetto ad altre perle disponibili in commercio. Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni del fabbricante.

  1. Mescolare il sangue (con o senza anticoagulanti) 1: 1 con il Ca 2+ 2+ -Mg-free PBS.
  2. Aggiungere 15 ml di soluzione gradiente di densità per tubo da 50 ml. Per ulteriori informazioni, consultare le istruzioni del fabbricante.
  3. Lentamente strato il sangue diluito in cima alla soluzione gradiente di densità.
  4. Centrifugare i campioni a 2.500 xg per 30 min con accelerazione lenta e senza frenatura.
  5. Raccogliere accuratamente lo strato di buffy coat di ogni tubo (Figura 1) usando una pipetta di plastica sterile e metterlo in un altro tubo.Evitare di raccolta della soluzione gradiente di densità. La resa PBMC atteso è di circa 3-4 x 10 6 cellule / ml di sangue.

Figura 1
Figura 1: Densità centrifugazione in gradiente di Bbuffy Coat su Ficoll Solution. Viene mostrato il risultato del gradiente di centrifugazione densità a 2.500 xg per 30 min sulla soluzione gradiente di densità. Raffigurato sono eritrociti e granulociti (rosso), la frazione di cellule mononucleate (strato bianco), plasma (giallo), e la soluzione gradiente di densità (biancastra). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Diluire la frazione di cellule mononucleate del sangue periferico con almeno 3 volumi di PBS e mescolare. Centrifugare a temperatura ambiente per 15 min a 200 x g.
  2. Ripetere il punto 2.6 due volte. </ Li>
  3. Aspirare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 5 ml MV2 medium.
  4. Aggiungere 100 microlitri di anticorpo CD34 umano (sufficiente per elaborare fino a 5 x 10 8 cellule) per buffy coat utilizzato e ruotare per 15 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
  5. Aggiungere 50 ml di biglie magnetiche rivestite destrano per buffy coat utilizzato e ruotare per 10 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
  6. Dopo l'incubazione, trasferire la sospensione per tubi FACS con un massimo di 3 ml in ciascun tubo. quantità maggiori non sarà consentita con il magnete.
  7. Inserire il tubo (s) FACS nel magnete (s) e attendere 5 minuti.
  8. Scartare il surnatante senza tirare i tubi FACS dal magnete.
  9. Risospendere le cellule in ciascun tubo FACS con 3 ml di mezzo MV2 di fuori del magnete.
  10. Ripetere i passaggi 2,12-2,14 due volte.
  11. Tirare i tubi FACS fuori dei magneti e risospendere le cellule in 3 ml di mezzo MV2.
  12. Trasferire la sospensione cellulare in pre-rivestito T75 Flasks e aggiungere 17 ml MV2 medio per bombola.
    NOTA: Il mezzo deve essere cambiato dopo 3 giorni. Dopo una settimana, le cellule mostrano strutture mandrino-simili (Figura 2) e sono pronti all'uso. Per una trascuranza dell'isolamento vedi figura 3.

figura 2
Figura 2: Immagine microscopica di EPC isolate. Viene mostrato un immagine rappresentativa di isolato precoce EPC in un pallone T75 prima di distacco. Apparente è la struttura del mandrino-simile del EPC. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: diagramma di flusso che mostra la procedura di isolamento EPC. Raffigurato è uno schema, spettacoloing delle singole fasi del protocollo isolamento EPC. Per un protocollo più dettagliata si veda la Sezione 2 nella sezione del protocollo.

3. Migrazione Assay

  1. Rimuovere il supporto dal EPC nel pallone T75.
  2. Lavare con 5 ml di PBS agitandolo con attenzione.
  3. Rimuovere PBS e aggiungere 5 ml di soluzione commerciale distacco delle cellule. Attendere fino a quando le cellule si staccano (verificare al microscopio). Accelerare il distacco toccando con cura il fondo del pallone.
  4. Quando le cellule vengono staccate, aggiungere rapidamente 5 ml di terreno completo MV2 e trasferire la sospensione cellulare in un altro tubo.
  5. Centrifugare a 2000 xg per 5 min.
  6. Risospendere le cellule in 5-10 ml di PBS e centrifugare nuovamente a 2.000 xg per 5 min.
  7. Ripetere il punto 3.6.
  8. Risospendere il pellet cellulare in MV2 medio fame (50.000 cellule in sono necessari 75 microlitri per la trasmigrazione bene).
    NOTA: Quale sistema di migrazione è necessario dipende dal tipo di cellula e saggio. Vi sono diff diametri erenti pori e dimensioni piatto (numero di pozzi). Per EPC una dimensione dei pori di 5 micron di 96 sistema ben è ottimale.
  9. Preparare la piastra di migrazione aggiungendo 235 ml di campione di siero (siero diluito 1: 5 in MV2 medio fame) nella camera inferiore (figura 4).

Figura 4
Figura 4: Migrazione Assay in una camera di Boyden modificata. Viene mostrato il disegno generale di una camera di Boyden modificata. Gli inserti di coltura cellulare (= camera superiore) sono indicati in blu scuro e vengono inseriti nella camera inferiore. Il fondo (ma non le pareti) di questi inserti rappresenta il sistema di filtro inclusi i pori. (A) mostra la configurazione al punto di tempo zero. (B) Dopo un punto di tempo prescelto, le cellule sono migrate attraverso il filtro verso uno stimolo.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Aggiungere l'inserto poco prima di aggiungere la soluzione di cellule.
  2. Aggiungere 75 ml della soluzione di cellule (= 50.000 cellule) nella camera superiore.
  3. Sia l'EPC migrare per 3 ore a 37 ° C e CO 5% 2 (tempo di migrazione dipende dal tipo di cellula e del sistema).
    1. Per evitare di siero manufatti auto-fluorescenza, quantificare le cellule migrate per scattare foto del pozzo sotto un microscopio e contare le cellule utilizzando il software semi-automatico "ImageJ".
  4. Rimuovere la camera superiore (che contiene tutte le cellule non migrati).
  5. Aggiungere 70 ml soluzione di paraformaldeide 3,6%, tra cui la Hoechst colorante (diluito 1: 1.000). La piastra può essere conservato a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte.
  6. Centrifugare la piastra a breve per ottenere tutte le cellule nello stesso piano focale a 2.000 g per 1-2 min.
  7. Prendere 5 immagini per well (figure 5 e 6) con un ingrandimento 100x.

Figura 5
Figura 5: Schema che mostra la posizione delle foto scattate. Lo schema raffigura la posizione dei cinque immagini riprese, che sono necessari per la determinazione di cellule migrate, in relazione al pozzo. Le immagini sono prese a contare le cellule e calcolare un valore medio per ogni bene. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Immagine microscopica delle cellule per la quantificazione. Viene mostrato un'immagine rappresentativa, che è stata presa per la quantificazione delle cellule. Le cellule sono state colorate e USI fissing Hoechst colorante nel 3,6% paraformaldeide. I punti rappresentano fissate e colorate le cellule progenitrici endoteliali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Contare le cellule migrate utilizzando il software semi-automatico "ImageJ" da parte del National Institute of Health.

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Representative Results

Caratterizzazione di isolati cellule endoteliali progenitrici

Innanzitutto, l'assorbimento di acLDL stata verificata, così come l'espressione di KDR e CD31 sulla superficie della popolazione di cellule isolate. Come mostra la figura mostra 7a, 85,1% delle EPC isolati ha mostrato un assorbimento di acLDL ed espresso CD31. Le figure 7b e 7c mostrano inoltre una distribuzione omogenea dei due marcatori, anche se sembra che ci sia una popolazione più piccola, negativo per entrambi i marcatori. In una seconda fase, l'analisi FACS di acLDL in combinazione con KDR stata eseguita. La figura 8a mostra che oltre l'80% delle cellule isolate mostrato un assorbimento di acLDL e l'espressione di KDR sulla loro superficie. Figure 8b e 8c mostrano l'omogeneità di questi marcatori.

Per verificare l'importance di piatti fibronectina rivestite nel tempo la cultura, un confronto tra i tre marcatori tra le cellule isolate, dopo due giorni di coltura su una superficie fibronectina rivestite con EPC isolate dopo sette giorni di coltura su piatti fibronectina rivestite (come indicato nel nostro protocollo) è stata eseguita, entrambi con precedenti CD34 + -Selezione. Come mostrato in figura 9a, soltanto il 46,4% delle cellule due giorni in coltura ha mostrato un assorbimento di acLDL nonché espressione di CD31 sulla loro superficie, rispetto al 85% delle cellule dopo sette giorni di coltura su fibronectina. Inoltre, gli istogrammi (figure 9b e 9c) mostrano minore intensità di entrambi i marcatori dopo due giorni di coltura rispetto a sette giorni (figure 7b e 7c). Lo stesso vale per una combinazione dei marcatori acLDL e U. Dopo due giorni di coltura su fibronectina, solo 68,0% di tutte le cellule mostrava un assorbimento di acLDL nonché espressione di KDR sulla loro superficie (Figuras 10a-10c). Dopo sette giorni di coltura su fibronectina, 83,6% delle cellule ha mostrato un assorbimento di acLDL ed espressione di KDR sulla loro superficie (figure 8a-8c).

In una fase successiva, è stata valutata l'importanza del CD34 + -selezione durante l'isolamento di EPC. Pertanto, celle selezionate in accordo al presente protocollo, tra cui la densità centrifugazione in gradiente e sette giorni di coltura su fibronectina, ma che perso il CD34 + -Selezione sono stati isolati. Come mostrato nella Figura 10a, oltre il 18% di tutte le cellule isolate fare né CD31 espresso né mostrano un assorbimento di acLDL, rispetto a meno dell'8% dopo CD34 + -Selezione, che mostrano una espressione CD31 e un assorbimento di acLDL (Figura 7a) . Inoltre, Figure 11b e 11c mostrano che le cellule isolate sono molto disomogenea riguardanti sia marcatori rispetto alla relativa 7c che mostra gli stessi marcatori in una popolazione di cellule con precedente CD34 + -Selezione.

I livelli sierici di citochine durante cardiochirurgia

Per identificare l'influenza della chirurgia cardiaca dopo infarto I / R sulle concentrazioni di livelli sierici di MIF, CXCL12, CXCL8 e VEGF circolanti, campioni di siero sono stati elaborati pre- e intra-operativamente per la successiva analisi mediante ELISA disponibile in commercio (Figura 12) . I livelli sierici di MIF hanno mostrato un significativo aumento intraoperatorio rispetto ai valori basali (100,3 ng / mL vs 127,4 ng / mL, p = 0,027). Similmente, i livelli di CXCL12 mostrato un aumento significativo nel siero durante la chirurgia (0,101 ng / mL rispetto a 0,198 ng / mL, p = 0,011). Simile a MIF e CXCL12, CXCL8 significativamente aumentato durante l'intervento chirurgico (0.15 ng / mL vs. 0,3 ng / mL, p = 0,022). in contRAST, le concentrazioni di VEGF non ha mostrato alcun cambiamento significativo nel corso del periodo di osservazione (0.154 ng / mL vs. 0,134 ng / mL, p = 0,583) 1.

Capacità La migrazione delle cellule endoteliali progenitrici

Per studiare l'effetto diretto di campioni di siero patients' e ivi contenute citochine / chemochine / fattori angiogenici in materia di migrazione EPC, un test ex vivo migrazione utilizzando campioni di siero, che sono stati elaborati prima e durante l'intervento chirurgico, è stato eseguito. EPC sono stati isolati da volontari sani. Come illustrato nella figura 13, tasso di migrazione EPC ha aumentato significativamente verso i campioni intra-operatorio prese rispetto ai campioni prelevati-operatorio pre (+ 35% rispetto al basale, p = 0,047).

Dal momento che studi precedenti hanno dimostrato che già mi / R innesca una secrezione di SEVcitochine rale che modulano la chemiotassi dei leucociti e la migrazione, saggi di migrazione con questi potenziali fattori chemiotattici, tra cui MIF, CXCL12, CXCL8, e VEGF sono state eseguite. Per ottenere una migliore comprensione della influenza di queste citochine sull'assunzione EPC in vivo, in ulteriori esperimenti di migrazione in vitro, applicando le concentrazioni fisiologicamente misurati sui citochine sopra alla camera inferiore della migrazione sono stati eseguiti dispositivi, anche.

Come concentrazioni sieriche MIF tra 100 e 130 ng / mL erano stati misurati (figura 12), una concentrazione di 100 ng / ml di ricombinante MIF stato utilizzato, che ha comportato un aumento> 6 volte nella migrazione EPC rispetto al controllo mezzo ( Figura 14). Al contrario, le concentrazioni sieriche di CXCL12, CXCL8 e VEGF erano nella gamma di 150 - 300 pg / mL. Da notare, queste concentrazioni non hanno alcun effetto mediare sulla migrazione EPC in vitro(Figura 14). E 'quindi ipotizzabile che tra questi quattro citochine, MIF presenta la più forte influenza sulla migrazione relativa EPC in vivo 1.

Figura 7
Figura 7: FACS analisi di EPC isolati su Day 7. (a) Viene mostrato l'assorbimento di acLDL e CD31 superficie cellulare espressione di EPC isolate dopo CD34 + selezione e periodo di coltura 7 giorni su piatti fibronectina rivestite. In alto a sinistra: Le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL, ma non esprimono CD31. In alto a destra: Le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL ed esprimono CD31. In basso a sinistra: Le cellule non mostrano assorbimento di acLDL e non esprimono CD31. In basso a destra: le celle non mostrano assorbimento di acLDL, ma esprimono CD31. (B) è riportata la istogramma di acLDL PE-coniugato dopo l'assorbimento da EPC isolate. (C) è riportata la istogramma di FITC-conjanticorpo ugated CD31 dopo il legame al CD31 superficie cellulare di EPC isolate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 8
Figura 8: FACS analisi di EPC isolati su Day 7. (a) Viene mostrato l'assorbimento di acLDL e KDR superficie cellulare espressione di EPC isolate dopo CD34 + selezione e periodo di coltura 7 giorni su piatti fibronectina rivestite. In alto a sinistra: le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL, ma non esprimono KDR. In alto a destra: Le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL ed esprimono KDR. In basso a sinistra: Le cellule non mostrano assorbimento di acLDL e non esprimono KDR. In basso a destra: le celle non mostrano assorbimento di acLDL, ma esprimono KDR. (B) è riportata la istogramma di acLDL PE-coniugato dopo l'assorbimento da EPC isolate. (C) è riportata laistogramma di anticorpo KDR FITC-coniugato dopo il legame a KDR superficie cellulare di EPC isolate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9: FACS analisi di EPC isolati su Day 2. (a) Viene mostrato l'assorbimento di acLDL e CD31 superficie cellulare espressione di EPC isolate dopo CD34 + selezione e periodo di coltura due giorni su piatti fibronectina rivestite. In alto a sinistra: le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL, ma non esprimono CD31. In alto a destra: Le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL ed esprimono CD31. In basso a sinistra: Le cellule non mostrano assorbimento di acLDL e non esprimono CD31. In basso a destra: le celle non mostrano assorbimento di acLDL, ma esprimono CD31. (B) è riportata la istogramma di acLDL PE-coniugato dopo l'assorbimento da EPC isolate. ( Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 10
Figura 10: FACS analisi di EPC isolati su Day 2. (a) Viene mostrato l'assorbimento di acLDL e KDR superficie cellulare espressione di EPC isolate dopo CD34 + selezione e periodo di coltura due giorni su piatti fibronectina rivestite. In alto a sinistra: le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL, ma non esprimono KDR. In alto a destra: Le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL ed esprimono KDR. In basso a sinistra: Le cellule non mostrano assorbimento di acLDL e non esprimono KDR. In basso a destra: le celle non mostrano assorbimento di acLDL, ma esprimono KDR. (B) è riportata la istogramma di acLDL PE-coniugato dopo l'assorbimentoda EPC isolate. (C) illustrato è l'istogramma di anticorpo coniugato con FITC KDR dopo il legame a KDR superficie cellulare di EPC isolate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 11
Figura 11: FACS analisi di EPC isolati su Day 7. (a) Viene mostrato l'assorbimento di acLDL e CD31 superficie cellulare espressione di EPC isolate senza precedente CD34 + selezione, ma compreso il periodo della cultura 7 giorni su piatti fibronectina rivestite. In alto a sinistra: Le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL, ma non esprimono CD31. In alto a destra: Le cellule mostrano l'assorbimento di acLDL ed esprimono CD31. In basso a sinistra: Le cellule non mostrano assorbimento di acLDL e non esprimono CD31. In basso a destra: le celle non mostrano assorbimento di acLDL, ma esprimono CD31. (B) Indicatoè l'istogramma di acLDL PE-coniugato dopo l'assorbimento da EPC isolate. (C) illustrato è l'istogramma di anticorpi CD31 FITC-coniugato dopo il legame al CD31 superficie cellulare di EPC isolate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 12
Figura 12: i livelli sierici delle citochine durante l'intervento cardiaco. Misurazione delle concentrazioni sieriche di CXCL8, VEGF, CXCL12, e MIF di pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca con ELISA. Indicate rappresentano valori medi di pre-operatoria, rispetto a concentrazioni intra-operatorie ± SEM (*: p <0.05; vs pre-OP)

Figura 13
Figura 13: In Vitro migrazione di EPC Verso siero del paziente. Viene mostrato l'aumento intra-operatoria nella migrazione EPC di volontari sani verso i campioni di siero di pazienti, sottoposti a chirurgia cardiaca. 50.000 cellule per pozzetto in MV2 siero medio fame sono stati aggiunti nella camera superiore di un sistema di Transwell. I campioni di siero nella camera inferiore sono stati diluiti 1: 5 con lo stesso mezzo. Le cellule migrate per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2 attraverso una membrana 5 micron. Le barre rappresentano valori medi ± SEM (*: p <0.05)

Figura 14
Figura 14: In Vitro migrazione di EPC Verso ricombinante citochine. Viene mostrato la migrazione di EPC verso concentrazioni rappresentative di CXCL8 ricombinante, CXCL12, VEGF, e MIF rispetto al siero di fame media (= Baseline). Solo MIF è stato in gradoper mediare una maggiore migrazione EPC a concentrazioni fisiologicamente misurate. Le citochine ricombinanti sono stati diluiti in MV2 siero medio fame. Le cellule migrate per 3 h attraverso una membrana 5 micron. Le barre rappresentano valori medi ± SEM (**: p <0.01 vs siero medio affamato)

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Discussion

La prima parte di questo studio comprendeva l'isolamento di EPC umani da sangue periferico di volontari sani per consentire una valutazione globale del sangue di pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca. Pertanto, una centrifugazione in gradiente di densità è stata eseguita per separare la frazione PBMC dal plasma, granulociti e eritrociti. Per rimuovere la maggior parte delle piastrine contaminanti, questa frazione cellulare è stata sottoposta a breve e lavaggio lento passaggi 29, 30. Successivamente, le cellule CD34 + sono state isolate dal resto agli separare le cellule progenitrici dalle restanti linfociti e monociti. Infine, la sospensione cellulare è stato coltivato su piatti fibronectina rivestite in un mezzo disponibile in commercio endothelial crescita cellulare per separare le cellule progenitrici endoteliali da altri (progenitrici) cellule della linea mieloide 3. Di nota, si è discusso che le piastrine possono mostrare un CD34 superficie cellulare espressaion, troppo. Sebbene studi precedenti hanno dimostrato legame di alcuni anticorpi anti-CD34 a piastrine, questo potrebbe essere un artefatto dovuto alla aggregazione delle piastrine con altre cellule (CD34-positive) 31, 32. Tuttavia, la maggior parte delle piastrine possono essere separati da ripetuti lavaggi lenti. Accanto a piastrine, i loro precursori - megacariociti - esprimono questo antigene di cellule progenitrici ematopoietiche e potrebbero essere presenti nel sangue periferico, anche se si trovano principalmente nel midollo osseo 33, 34. Inoltre, è anche descritto che il CD34 marcatore di superficie cellulare, utilizzato in questo protocollo è espresso in livelli molto bassi sulle cellule endoteliali mature 35. Pertanto, è importante considerare con cautela una possibile contaminazione da piastrine / megacariociti o cellule endoteliali mature, quando isolando EPC. Quindi, passo 2.6 è di particolare importanza durante la isolation di EPC per rimuovere le piastrine.

Per chiarire l'importanza della coltura le cellule isolate sui piatti fibronectina rivestite, popolazioni cellulari dopo due giorni e sette giorni di coltura su fibronectina sono stati confrontati sia con precedente selezione CD34-positivo. Il secondo giorno, meno della metà delle cellule isolate mostrato un assorbimento di acLDL ed espressione simultanea di CD31 sulla loro superficie. Inoltre, un'espressione meno intenso di entrambi gli indicatori sui istogrammi in materia potrebbe essere visto. Questi dati mostrano che sette giorni di coltura su fibronectina nel medio-specifica delle cellule endoteliali sono necessari per ottenere EPC mostrano caratteristici modelli di espressione endoteliali. In questo passaggio, è di importanza di usare la giusta concentrazione / quantità di fibronectina. Wijelath e colleghi hanno in precedenza dimostrato che la fibronectina promuove l'espressione di modelli di cellule endoteliali, come, molto probabilmente in combinazione con VEGF 36.

Nel prossimo step del protocollo, l'importanza di CD34 + -Selezione della sospensione cellulare è stato indagato, confrontando le cellule isolate dopo 7 giorni di coltura su piatti fibronectina rivestite, con e senza precedenti CD34 + -Selezione. La quantità di cellule mancanti entrambi i marcatori (acLDL di assorbimento e di espressione CD31) era molto più alto dopo l'isolamento delle cellule senza precedente CD34 + -Selezione rispetto all'isolamento compreso questo passaggio. È interessante notare, dopo sette giorni di coltura su fibronectina, cellule mancanti CD34 + -selezione mostrato una popolazione di cellule meno omogenea, come indicato dall'espressione disomogeneo di CD31 rispetto alle cellule isolate, con CD34 + -selezione. Questi dati mostrano che CD34 + -selezione è necessario risolvere EPC da altri monociti / macrofagi. Durante la creazione di questo protocollo, abbiamo scoperto che CD34 + -Selezione in media MV2 a 37 ° C porta ad un aumento del numero di cellule sopravvissute, se confrontato con te molto più bassomperatures, che ha bisogno di essere cautamente studiata in studi futuri. Dobbiamo riconoscere che, quando l'applicazione di questo protocollo, l'incubazione anticorpi in media contenenti calcio a 37 ° C può portare ad interazioni non-specifico e vincolante. In futuro, sistemi tampone privi di calcio a temperature più basse devono essere testati e stabilito per evitare questo potenziale fattore di confondimento.

In particolare, durante la nostra analisi preliminare di esperimenti di migrazione delle cellule con campioni di siero, misurazioni furono effettuate con un lettore di fluorescenza per micropiastre e calceina-colorazione delle cellule, come precedentemente descritto per i diversi tipi di cellule (ad esempio vena ombelicale cellule endoteliali umane, HUVEC) 37. I diversi valori di estinzione tra le camere indicato che non solo i campioni di siero da solo, ma anche il mezzo hanno già una notevole influenza sulla fluorescenza misurata, che deve essere considerata con cautela. Pertanto, we adattato nostro protocollo e passato a un sistema di misura in cui le cellule possono essere osservate tramite microscopia ottica e contati da un software semiautomatico.

Mentre EPC rappresentano circa lo 0,1% delle cellule nel sangue periferico ed è difficile isolare queste cellule specifiche 38, un numero impressionante di studi ha indicato che EPC può fornire effetti benefici e migliorare la vascolarizzazione dei tessuti dopo eventi ischemici in arti e nel miocardio 39 , 40. Tuttavia, è ancora una sfida continua di tradurre questi risultati nella pratica clinica e di valutare la sua rilevanza clinica. I motivi possono essere causa dell'influenza notevole di molti fattori perioperatori sulla secrezione di diversi fattori chemiotattici, che è stato dimostrato in precedenza 22, 41. Pertanto, nella seconda parte di questo studio, il ruolo dei diversi cytokines sulla migrazione di EPC nella cornice di I infarto / R sono stati valutati. Pertanto, sono state misurate le concentrazioni sieriche di citochine nei pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca. MIF, nonché CXCL12 e CXCL8 mostravano un aumento significativo intra-operatoria. Quando si traduce questi risultati nuovamente dentro gli esperimenti in vitro, presentare i risultati hanno dimostrato che non vi è né un CXCL12- né effetto CXCL8 mediata sulla migrazione EPC alle concentrazioni fisiologiche misurate in vitro. Utilizzando il modello di isolamento EPC descritto e il test di migrazione successiva, MIF è stata identificata come mediatore predominante della migrazione EPC 42. In questo contesto, Kanzler et al. dimostrato in un modello murino che MIF e VEGF forniscono l'effetto più forte sulla migrazione EPC sotto ipossia 23. È interessante notare, misurazioni di VEGF mostrano che non vi è alcun cambiamento significativo intra-operatoria della concentrazione nel sangue di VEGF, che possono derivare da o vincolantef VEGF per l'applicazione standardizzata intraoperatoria di eparina. Pertanto, MIF può giocare un ruolo predominante tra le chemochine angiogeniche nel reclutamento di EPC in pazienti sottoposti a chirurgia cardiaca e può avviare e contribuire al processo di guarigione dopo infarto I / R attraverso il traffico di EPC al sito di lesione 43, 44 Tuttavia, come livelli MIF sono aumentati subito dopo ho infarto / R, rimane speculativa se l'effetto MIF mediata sul reclutamento di EPC può influenzare il rimodellamento cardiaco e l'angiogenesi, che hanno implicazioni significative nella prevenzione dello scompenso cardiaco dopo infarto I / R 23. Tuttavia, prima di passare a tale analisi, è importante caratterizzare ulteriormente i diversi sottotipi di EPC e valutare il suo ruolo funzionale nella biologia umana. A questo proposito, la presente protocollo fornisce un metodo affidabile su come isolare EPC da sangue periferico umano per abilitare its caratterizzazione più completa e studi futuri.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori non hanno riconoscimenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibronectin Biochrom AG L7117 Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2 Promo Cell C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix Promo Cell C-39226
Ficoll-Paque plus GE Healthcare 17-1440-03 Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit Stemcell Technologies 18056 Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet Stemcell Technologies 18000
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports Sigma-Aldrich CLS3387-8EA Migration system
Hoechst solution ThermoFisher 33342 Staining of migrated cells
ImageJ National institutes of health xxx Counting of migrated cells

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Medicina cellule progenitrici endoteliali protocollo di isolamento migrazione di macrofagi fattore inibitorio cardiochirurgia test di migrazione
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Emontzpohl, C., Simons, D., Kraemer, S., Goetzenich, A., Marx, G., Bernhagen, J., Stoppe, C. Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery. J. Vis. Exp. (120), e55192, doi:10.3791/55192 (2017).

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