Summary
Endotheliale voorlopercellen (EPC's) zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. Deze werkwijze beschrijft de isolatie van humane EPC uit perifeer bloed, maar ook de identificatie van het trekkende bieden tegen sera van patiënten die hartchirurgie ondergaan.
Abstract
Endotheliale voorlopercellen (EPC's) worden gerekruteerd uit het beenmerg onder pathologische omstandigheden, zoals hypoxie en zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. De oorsprong, classificatie en karakterisering van EPC's zijn complex; Desondanks hebben twee prominente subtypes van EPC's vastgesteld: de zogenaamde "early" EPC's (later aangeduid als vroeg-EPC's) en late-uitgroei EPC's (late-EPC's). Ze kunnen worden ingedeeld biologische eigenschappen en hun verschijning in in vitro kweek. Terwijl "vroege" EPC's verschijnen in minder dan een week na het kweken van perifere bloed afgeleide mononucleaire cellen in EC-specifieke media, kan late-uitgroei EPC's worden na 2-3 weken. Late-uitgroei EPC's zijn erkend als rechtstreeks betrokken zijn bij neovascularisatie, voornamelijk door hun vermogen om te differentiëren in mature endotheelcellen, terwijl "vroege" EPC's te uiten verschillende angiogene factoren als endogenelende lading angiogenese te bevorderen in een paracriene manier. Tijdens myocardiale ischemie / reperfusie (I / R), verschillende factoren beheersen de homing van EPC regio's van bloedvatvorming.
Macrofaag migratie-remmende factor (MIF) is een chemokine-achtige pro-inflammatoire en alomtegenwoordig uitgedrukt cytokine en werd onlangs beschreven als de belangrijkste regulator van de EPC's migratie functioneren bij fysiologische concentraties 1. Interessant MIF opgeslagen in intracellulaire pools en kan snel worden vrijgegeven in de bloedstroom na enkele stimuli (bijvoorbeeld myocardinfarct).
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de betrouwbare isolatie en kweek van vroege EPC van volwassen menselijk perifeer bloed gebaseerd op CD34-positieve selectie met daaropvolgende kweek in medium dat endotheliale groeifactoren op met fibronectine beklede platen voor toepassing bij in vitro migratie assays tegen serummonsters van cardiale chirurgische patiënten. Bovendien is detrekkende invloed van MIF op chemotaxis van EBV in vergelijking met andere bekende angiogenese-stimulerende cytokinen wordt aangetoond.
Introduction
Endotheliale progenitor cellen (EPC) circuleren in het menselijk bloed en hebben het vermogen om te differentiëren in endotheliale cellen 2. Zij deelnemen aan vasculogenese en kunnen minimaliseren van de schade veroorzaakt door ontsteking en ischemie / reperfusie (I / R) letsel op verschillende wijzen 3, 4. Bijvoorbeeld EBV tonen verhoogde intracellulaire antioxidant enzymen zoals catalase, glutathion peroxidase of mangaan superoxide dismutase (MnSOD) 5. De verhoogde weerstand tegen oxidatieve stress laat EPC functioneren in micro-omgevingen met verhoogde reactive oxygen species (ROS) na ischemisch letsel 6. Eerdere studies gaven ook aan dat het aantal EBV kan worden gecorreleerd aan vasculaire hersteld en dat een verminderd aantal circulerende EPC voorspelt het optreden van cardiovasculaire gebeurtenissen 7,class = "xref"> 8. Echter, een duidelijke definitie van een EPC is nog niet gevonden. Tot nu toe is er geen specifieke celoppervlak merker of consistente fenotype voor EBV en deze cellen zijn zeer zeldzaam in het perifere bloed 9. Een menselijke EPC moet worden beschouwd als een circulerende cel met het vermogen bij te dragen tot de reconstructie van de gewonden endotheel en nieuwe vasculaire structuren.
Een manier om het isoleren en karakteriseren van EPC's is door middel van hechting aan fibronectine. Daardoor wordt de capaciteit van deze cellen gebruikt om een superieure hechting zien aan beklede schalen in vergelijking met type 1 collageen, bijvoorbeeld 3, 10, 11 fibronectine. Maar anderen vonden dat plating mononucleaire cellen op met fibronectine beklede schalen zonder enige verdere zuivering of stap leidt tot kolonies waaronder myeloïde progenitorcellen, monocyten en T-lymfocyten 12, 13, 14. Bovendien is in dit geval bloedplaatjes kan verontreinigen mononucleaire cellen (MNC) fractie en daardoor plasmamembraaneiwitten aan enige hechtende cellen 15.
Naast karakterisatie door middel van in vitro hechting assays, is een combinatie van verschillende celoppervlak markers gebruikt om een celtype beschouwd als EPC beschrijven. In dit geval, na fibronectine-gemedieerde adhesie worden de cellen geanalyseerd met betrekking tot hun endotheel-achtige kenmerken. Hierbij twee endotheliale cel-geassocieerde markers, geacetyleerd-low density lipoproteïne (AcLDL) en vasculaire endotheliale groeifactor receptor 2 (VEGFR-2, KDR), een rol spelen. Endotheelcellen en macrofagen is aangetoond dat specifiek nemen AcLDL een proces genaamd "scavenger cel pathway" 16. Andere merkereiwit KDR als belangrijkste VEGF receptor op endotheliale17 cellen. Zoals EPC in het algemeen gekweekt in media waaraan endotheliale groeifactoren en foetaal kalfserum, is het mogelijk dat macrofagen, wat kan ook zijn ongeluk geïsoleerd, vertonen een endotheel-achtige merkerprofiel. Zoals eerder getoond, indien gekweekt in een endotheliaal geconditioneerd medium, macrofagen express "endotheel-specifieke" 18 eiwitten.
In het algemeen zijn er twee categorieën van EBV in meer subtypen, die kan worden gevonden in het bloed of in vitro worden gekweekt. Late-uitgroei EPC's (late-EPC's) verschijnen na 2-3 weken van de cultuur. Deze cellen sneller geïntegreerd in een monolaag van humane navelstrengader endotheelcellen en kunnen capillaire buizen 19 vormen. Daarnaast zogenaamde "early-EBV" circuleren in het bloed gedurende een week en handelen passieve doorgang leveren angiogene moleculen, zoals vasculaire endotheelgroeifactorfactor (VEGF), of CXCL8 19. Patiënten met coronaire hartziekte (CAD) vertoonden significant lagere hoeveelheden vroegtijdige EBV vergeleken met een controlegroep zonder CAD 20. Interessant dezelfde groep vertoonden hogere hoeveelheden late-EBV vergeleken met een controlegroep. Een andere studie toonde aan dat vroege EPC's te beschermen gedifferentieerde EPC's van apoptose onder oxidatieve omstandigheden in een paracriene wijze 6. Daarom zou vroege EPC relevante beschermende effecten door de migratie van andere cellen in een auto- of paracriene manier binnen het perifere bloed te voorzien.
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor vroegtijdige EPC zuiveren door eerst het isoleren van de PBMC-fractie uit menselijk perifeer bloed en vervolgens het isoleren van CD34 + cellen uit de PBMC-fractie deze celsuspensie tegen ongewenste cellen te verwijderen. CD34 is een marker, die wordt gebruikt voor de isolatie van humane hematopoietische stamcellen 9 + cellen gekweekt op met fibronectine gecoate weefselkweek oppervlakken. Na drie dagen wordt het medium vervangen, waarbij alle niet-hechtende cellen te verliezen. Tenslotte worden geïsoleerd EBV gekleurd om de opname van AcLDL en de aanwezigheid van KDR als endotheelcel-merker door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te controleren. Als extra marker, analyseerden we bloedplaatjes endotheel adhesiemolecuul (PECAM-1, CD31), die ook voorkomt op endotheliale cellen.
Herstel van beschadigde of geïnfarceerde hartspierweefsel door verbeterde werving van EPC's behoort tot de intensief onderzocht behandelingsstrategieën in hart- en vaatziekten. De vertaling van experimentele resultaten in de klinische praktijk is nog uitdagend, gezien de complexe cellulaire interactie in het menselijk lichaam in verschillende pathofysiologische omstandigheden. Verder myocardiale I / R letsel veroorzaken een overmatige afscheiding van verschillende cytokinen, hormonen en groei fac tors, die de homing van EPC's controleren om gebieden van bloedvatvorming 13. Zoals reeds aangetoond, CXCL8, stromale cel-afgeleide factor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF en macrofaag migratie-remmende factor (MIF) zijn aanzienlijk toegenomen in serummonsters na myocard I / R schade 1. Tot deze factoren behoren, MIF is een pleiotrope chemokine-achtige cytokine met overwegend pro-inflammatoire eigenschappen. In tegenstelling tot de historische naam MIF heeft pro-migrerende functioneert, als een echte chemokine bij verschillende celtypen 1, 21, 22. MIF-gemedieerde wervingsprocessen zijn gekoppeld aan de chemokine-receptoren CXCR4 en CXCR2, die MIF bindt aan en activeert een niet-verwante wijze 21. Van de nota, EPC's uitdrukken beide van deze receptoren op hun oppervlak, die bovendien up-gereguleerd worden onder hypoxische conditiesass = "xref"> 23, 24. Bovendien accumuleren aanwijzingen dat MIF een totale cardio-beschermend effect tijdens I / R schade van het hart 22, 25, 26. In deze context, is verder gebleken dat MIF de vorming van nieuwe bloedvaten tijdens hypoxische stress die is van bijzonder belang, wanneer gezien de beperkte herstel mechanismen van de benadeelde myocard 27 kan ondersteunen. Vorige in vitro studies en experimenten in pre-klinische muismodellen verstrekt eerste bewijs over de rol van MIF in EPC recruitment 4. Van de nota, MIF is ook een prominent cargo eiwit van EPC's die tijdens de EPC werving binnen ischemische plaatsen 28 kan worden vrijgegeven. Studies in klinische settings name in vergelijking met andere (angiogene) serum cytokines blijft ongrijpbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bloed voor de isolatie van EBV werd verkregen van gezonde vrijwilligers na geïnformeerde toestemming overeenkomstig de lokale ethische commissie. Serummonsters gebruikt in migratie assays werden verkregen van patiënten die conventionele hartchirurgie ondergingen met behulp van cardiopulmonaire bypass (CPB). Uitsluitingscriteria waren noodoperaties, bekende of vermoedelijke zwangerschap, patient`s leeftijd jonger dan 18 jaar, en het niet geïnformeerde toestemming te verkrijgen. Serummonsters werden getrokken naast klinische routinemetingen (onmiddellijk voor de operatie en vlak na myocardiale reperfusie / opening van aorta kruis-klem) en vervolgens bij -80 ° C totdat uiteindelijk opgeslagen. De Institutional Review Board (ethische commissie, RWTH Aachen University) goedgekeurd deze studie. De patiënten vertoonden een gemiddelde leeftijd van 68,6 jaar en een gemiddeld gewicht van 81,7 kg. Reeds bestaande ziekten omvatten: hypertensie (65%), chronische longziekten (19%), extra cardiale arteriopathie (16%), cerebrale stoornissen (6%), instabiele angina (3%), recent hartinfarct (28% binnen 90 d), chronische nierziekte (14%), leverziekte (2%) en diabetes (34%).
1. Coating van T75 Fles:
- Bereid 5 ml fibronectine-oplossing (1 mg menselijk fibronectine verdund in 15 ml ultrapuur water) per T75 fles.
- Voeg de oplossing voor een T75 kolf en wachten tot het water is verdampt. Om onnodige onderbrekingen tijdens de isolatiewerkwijze door de verdamping te voorkomen, mag dit proces vooraf (bijvoorbeeld 's nachts) en bij kamertemperatuur. Deze oplossing geeft 4,44 g fibronectine / cm 2.
- Bereid de endotheliale celgroei medium MV2 door daaraan MV2 basaal medium met groeifactor leverden de fabrikant.
2. Isolatie van endotheliale voorlopercellen (EPC's) van 60 ml bloed:
LET OP: Als de CD34-positieve selectie cocktail and de magnetische kralen zijn commercieel verkrijgbaar in een kit gecombineerde selectie, er geen concentraties van de fabrikant. Echter, ongeveer 100 pl van het antilichaam voldoende voor verwerking tot 5 x 10 8 cellen. De magnetische korrels worden opgelost in water, dextran beklede en ongeveer 5,000x kleiner in vergelijking met andere commercieel verkrijgbare parels. Voor meer informatie, zie instructies van de fabrikant.
- Meng het bloed (met of zonder anticoagulantia) 1: 1 met Ca 2+ Mg 2 + -vrij PBS.
- Voeg 15 ml dichtheidsgradiënt oplossing per 50 ml buis. Voor meer informatie, zie instructies van de fabrikant.
- Langzaam laag het verdunde bloed bovenop de dichtheidsgradiënt oplossing.
- Centrifuge monsters bij 2500 g gedurende 30 min met langzame acceleratie en zonder remmen.
- Zorgvuldig verzamelen bufferlaag van elke buis (figuur 1) met een steriele pipet van kunststof en het in een andere buis.Vermijd collectie van de dichtheidsgradiënt oplossing. De verwachte PBMC opbrengst bedraagt ongeveer 3-4 x 10 6 cellen / ml bloed.
Figuur 1: dichtheidsgradiëntcentrifugatie van Coat op Ficoll Solution Bbuffy. Getoond wordt het resultaat van de dichtheidsgradiënt centrifugatie bij 2500 xg gedurende 30 min op de dichtheidsgradiënt oplossing. Afgebeeld zijn erytrocyten en granulocyten (rood), de fractie mononucleaire cel (witte laag), plasma (geel), en de dichtheid gradiënt-oplossing (wittig). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verdun het perifere bloed mononucleaire celfractie met ten minste 3 volumina PBS en meng. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 15 min bij 200 x g.
- Herhaal stap 2.6 twee keer. </ Li>
- Zuig het supernatant en resuspendeer celpellet in 5 ml MV2 medium.
- Voeg 100 ul van humaan CD34 antilichaam (voldoende voor verwerking tot 5 x 10 8 cellen) per gebruikte bufferlaag en roteer gedurende 15 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.
- Voeg 50 ul van dextran-beklede magnetische korrels per gebruikte bufferlaag en roteer gedurende 10 minuten bij 37 ° C met 5% CO2.
- Na incubatie de suspensie in FACS buisjes met een maximum van 3 ml per buis. Hogere bedragen zal niet toegestaan met de magneet.
- Plaats FACS buis (s) in de magneet (s) en wacht 5 min.
- Gooi supernatant zonder uit de magneet trekt de FACS buizen.
- Resuspendeer de cellen in elk FACS buis met 3 ml MV2 medium buiten de magneet.
- Herhaal stap 2,12-2,14 tweemaal.
- Trek de FACS buizen uit de magneten en resuspendeer de cellen in 3 ml MV2 medium.
- Breng de celsuspensie in pre-gecoate T75 flasks en voeg 17 ml MV2 medium per fles.
OPMERKING: Het medium moet worden veranderd na 3 dagen. Na een week, cellen vertonen spindel-achtige structuren (figuur 2) en zijn klaar voor gebruik. Voor een over het hoofd van de isolatie zie figuur 3.
Figuur 2: Microscopisch Beeld van Geïsoleerde EPC's. Getoond wordt een representatief beeld van de geïsoleerde vroeg EPC's in een T75 kolf voorafgaand aan de onthechting. Schijnbaar is de spil-achtige structuur van het EPC. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stroomschema Het tonen van de EPC Isolation Procedure. Afgebeeld is een regeling, tonening de afzonderlijke stappen van de EPC-isolatie protocol. Voor een meer gedetailleerd protocol zie punt 2 in de sectie protocol.
3. Migratie Assay
- Verwijder het medium uit EBV in de T75 kolf.
- Was met 5 ml PBS door het voorzichtig schudden.
- Verwijder PBS en voeg 5 ml commerciële cel onthechting oplossing. Wacht tot de cellen zijn vrijstaand (check onder een microscoop). Versnel het losmaken door voorzichtig de bodem van de fles te tikken.
- Wanneer de cellen losgemaakt, snel voeg 5 ml MV2 compleet medium en breng de celsuspensie in een andere buis.
- Centrifugeer bij 2000 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer cellen in 5-10 ml PBS en centrifugeer opnieuw bij 2000 xg gedurende 5 minuten.
- Herhaal stap 3.6.
- Resuspendeer de cel pellet in MV2 uitgehongerd medium (50.000 cellen in 75 ul per transmigratie ook nodig zijn).
OPMERKING: Welke migratie systeem nodig is afhankelijk van het type cel en assay. Er zijn diff Erent poriediameters en plaat maten (aantal putten). Voor EPC een poriegrootte van 5 urn 96 bronsysteem optimaal. - Bereid de migratie plaat door toevoeging van 235 pi van de serum monster (serum verdund 1: 5 in MV2 uitgehongerd medium) in de onderste kamer (figuur 4).
Figuur 4: Migratie Assay in een gewijzigde Boyden Kamer. Getoond wordt het algemene ontwerp van een gemodificeerde Boyden-kamer. De celkweek inserts (= bovenste kamer) zijn aangegeven in donkerblauw en in de onderste kamer zijn geplaatst. De onderste (maar niet de wanden) inleggen vertegenwoordigt het filtersysteem met inbegrip van de poriën. (A) Geeft de setup op tijdstip nul. (B) Na een gekozen tijdstip, worden cellen gemigreerd door het filter naar een stimulus.fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voeg het inzetstuk kort voor het toevoegen van de celoplossing.
- Voeg 75 ul van de cel-oplossing (= 50.000 cellen) in de bovenste kamer.
- Laat de EPC migreren gedurende 3 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 (migratie is afhankelijk van celtype en systeem).
- Serum auto-fluorescentie artefacten te voorkomen, te kwantificeren gemigreerd cellen door het nemen van foto's van de put onder een microscoop en tel de cellen met behulp van de semi-automatische software "ImageJ".
- Verwijder de bovenste kamer (dat alle niet-gemigreerde cellen).
- Voeg 70 ul 3,6% paraformaldehyde oplossing, met inbegrip van Hoechst kleurstof (verdund 1: 1000). De plaat kan worden opgeslagen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de nacht.
- Centrifugeer de plaat kort om alle cellen in dezelfde focal plane krijgen bij 2.000 xg gedurende 1-2 min.
- Take 5 beelden per well (Figuren 5 en 6) met een 100x vergroting.
Figuur 5: Regeling die de positie van de genomen foto's. Het schema geeft de plaats van de vijf gemaakte beelden, die nodig zijn voor het bepalen van gemigreerde cellen ten opzichte van de put. De foto's zijn genomen om de cellen te tellen en het berekenen van een gemiddelde waarde voor elke goed. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Microscopische Image for Cell kwantificering. Getoond wordt een representatief beeld, dat is gemaakt voor mobiele kwantificering. De cellen werden gekleurd en gefixeerd USIng Hoechst kleurstof in 3,6% paraformaldehyde. De stippen stellen gefixeerd en endotheliale progenitorcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Tellen de gemigreerde cellen met behulp van de semi-automatische software "ImageJ" door het National Institute of Health.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering van geïsoleerde endotheliale voorlopercellen
Ten eerste, de opname van AcLDL werd gecontroleerd, evenals de expressie van KDR en CD31 op het oppervlak van de geïsoleerde celpopulatie. Zoals figuur 7a toont, 85,1% van de geïsoleerde EPC's toonde een opname van AcLDL en uitgedrukt CD31. Figuren 7b en 7c tonen verder een homogene verdeling van beide markers, alhoewel dit een kleinere populatie, negatief voor beide markers. In een tweede stap, FACS analyse van AcLDL in combinatie met KDR werd uitgevoerd. Figuur 8a toont dat meer dan 80% van de geïsoleerde cellen vertoonden een opname van AcLDL en de expressie van KDR op hun oppervlak. Figuren 8b en 8c tonen de homogeniteit van deze merkers.
Om de importanc controlerene van met fibronectine beklede schalen in kweekduur, een vergelijking van de drie markeringen tussen geïsoleerde cellen na twee dagen kweken op met fibronectine gecoate oppervlak met geïsoleerde EPC na zeven dagen kweek op met fibronectine beklede schalen (zoals in ons protocol) werd uitgevoerd zowel met eerdere CD34 + -selectie. Zoals getoond in figuur 9a, slechts 46,4% van tweedaagse gekweekte cellen vertoonden een opname van AcLDL en uitdrukking van CD31 op hun oppervlak, vergeleken met 85% van de cellen na zeven dagen kweken op fibronectine. Bovendien, de histogrammen (figuur 9b en 9c) vertonen minder intensiteit van beide markers na twee dagen kweken in vergelijking met zeven dagen (figuren 7b en 7c). Hetzelfde geldt voor een combinatie van de markers AcLDL en KDR. Na twee dagen kweken op fibronectine, slechts 68,0% van alle cellen vertoonden een opname van AcLDL en uitdrukking van KDR op hun oppervlak (zies 10a-10c). Na zeven dagen kweken op fibronectine, 83,6% van de cellen vertoonden een opname van AcLDL en expressie van KDR op hun oppervlak (figuren 8a-8c).
In een volgende stap, het belang van de CD34 + -selectie tijdens de isolatie van EPC geëvalueerd. Daarom cellen geselecteerd in overeenstemming met het huidige protocol, met inbegrip van dichtheidsgradiënt centrifugeren en zeven dagen van cultuur op fibronectine, maar die de CD34 + -selectie werden geïsoleerd gemist. Zoals getoond in figuur 10a, meer dan 18% van die cellen niet express CD31 noch tonen een opname van AcLDL, vergeleken met minder dan 8% na CD34 + -selectie, die een CD31 expressie en een opname van AcLDL tonen (figuur 7a) . Bovendien, figuren 11b en 11c tonen dat de geïsoleerde cellen zeer inhomogeen over beide markeerders opzichte van de betreffende
Serum cytokine Levels tijdens hartchirurgie
Om de invloed van hartchirurgie na myocardiale I / R van de concentratie van circulerende serumspiegels van MIF, CXCL12, CXCL8 en VEGF te identificeren, werden serummonsters voor en tijdens de operatie voor de daaropvolgende analyse getrokken door commercieel verkrijgbare ELISA (Figuur 12) . Serum niveaus van MIF toonden een significante intra-operatieve stijging ten opzichte van de uitgangswaarden (100,3 ng / mL versus 127,4 ng / ml, p = 0,027). Evenzo CXCL12 niveaus vertoonden een significante verhoging van het serum tijdens chirurgie (0,101 ng / ml versus 0,198 ng / ml, p = 0,011). Soortgelijke MIF en CXCL12, CXCL8 aanzienlijk toegenomen tijdens chirurgie (0,15 ng / ml vs. 0,3 ng / ml, p = 0,022). in contrast, VEGF concentraties leverde geen significante veranderingen tijdens de observatieperiode weer te geven (0,154 ng / mL versus 0,134 ng / ml, p = 0,583) 1.
Migratie capaciteit van endotheliale voorlopercellen
Om de rechtstreekse werking van patients serummonsters te onderzoeken en de daarin opgenomen cytokines / chemokines / angiogene factoren op EPC migratie, een ex vivo migratie test met behulp van serum monsters, die werden getrokken voorafgaand en tijdens de operatie werd uitgevoerd. EPC werden geïsoleerd uit gezonde vrijwilligers. Zoals weergegeven in figuur 13, EPC migratiecijfer aanzienlijk verhoogd naar de intra-operatief genomen monsters vergeleken met preoperatief genomen monsters (+ 35% vergeleken met de uitgangswaarde, p = 0,047).
Omdat eerdere studies al dat ik bewezen / R veroorzaakt een afscheiding van SEVrale cytokinen die leukocyten chemotaxis en migratie, migratie testen met behulp van deze potentiële chemoattractants, met inbegrip van MIF, CXCL12, CXCL8 en VEGF moduleren werden uitgevoerd. Om een beter begrip van de invloed van deze cytokinen op EPC rekrutering in vivo, in vitro migratie aanvullende experimenten krijgen, de toepassing fysiologisch gemeten concentraties van de bovengenoemde cytokinen aan de onderste kamer van de migratie inrichtingen werden uitgevoerd, ook.
Aangezien MIF serum concentraties van 100 en 130 ng / mL werd gemeten (figuur 12), een concentratie van 100 ng / ml recombinant MIF werd gebruikt, wat leidde tot een> 6-voudige toename in EPC migratie vergeleken met de mediumcontrole ( figuur 14). In tegenstelling, de serumconcentraties van CXCL12, CXCL8 en VEGF werden in de range van 150-300 pg / ml. Van de nota, had deze concentraties geen invloed op EPC migratie in vitro te bemiddelen(Figuur 14). Het is derhalve denkbaar dat onder deze vier cytokinen, MIF vertoont ten sterkste invloed op EPC migratie in vivo 1.
Figuur 7: FACS analyse van geïsoleerde EPC's op dag 7 (a) Getoond wordt de opname van AcLDL en CD31 celoppervlak expressie van geïsoleerde EPC na CD34 + selectie en 7 dagen kweekperiode on-fibronectine gecoate gerechten. Linksboven: Cellen tonen opname van AcLDL, maar spreken zich niet uit CD31. Rechtsboven: Cellen tonen opname van AcLDL en express CD31. Linksonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL en spreken zich niet uit CD31. Rechtsonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL, maar uiten CD31. (B) ziet het histogram van PE-geconjugeerde AcLDL na opname door geïsoleerde EPC's. (C) Getoond wordt het histogram van FITC-conjugated CD31 antilichaam na binding aan celoppervlak CD31 van geïsoleerde EPC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: FACS analyse van geïsoleerde EPC's op dag 7 (a) Getoond wordt de opname van AcLDL en KDR celoppervlak expressie van geïsoleerde EPC na CD34 + selectie en 7 dagen kweekperiode on-fibronectine gecoate gerechten. Linksboven: cellen vertonen opname van AcLDL, maar spreken zich niet uit KDR. Rechtsboven: Cellen tonen opname van AcLDL en express KDR. Linksonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL en spreken zich niet uit KDR. Rechtsonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL, maar drukken KDR. (B) ziet het histogram van PE-geconjugeerde AcLDL na opname door geïsoleerde EPC's. (C) Getoond wordt dehistogram van FITC-geconjugeerd KDR antilichaam na binding aan celoppervlak KDR van geïsoleerde EPC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: FACS analyse van geïsoleerde EPC's op dag 2. (a) Getoond wordt de opname van AcLDL en CD31 celoppervlak expressie van geïsoleerde EPC na CD34 + selectie en 2 dagen kweekperiode on-fibronectine gecoate gerechten. Linksboven: cellen vertonen opname van AcLDL, maar spreken zich niet uit CD31. Rechtsboven: Cellen tonen opname van AcLDL en express CD31. Linksonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL en spreken zich niet uit CD31. Rechtsonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL, maar uiten CD31. (B) ziet het histogram van PE-geconjugeerde AcLDL na opname door geïsoleerde EPC's. (
Figuur 10: FACS analyse van geïsoleerde EPC's op dag 2. (a) Getoond wordt de opname van AcLDL en KDR celoppervlak expressie van geïsoleerde EPC na CD34 + selectie en 2 dagen kweekperiode on-fibronectine gecoate gerechten. Linksboven: cellen vertonen opname van AcLDL, maar spreken zich niet uit KDR. Rechtsboven: Cellen tonen opname van AcLDL en express KDR. Linksonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL en spreken zich niet uit KDR. Rechtsonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL, maar drukken KDR. (B) ziet het histogram van PE-geconjugeerde AcLDL na opnamedoor geïsoleerde EPC's. (C) ziet het histogram van FITC-geconjugeerd KDR antilichaam na binding aan celoppervlak KDR van geïsoleerde EPC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: FACS analyse van geïsoleerde EPC's op dag 7 (a) Getoond wordt de opname van AcLDL en CD31 celoppervlak expressie van geïsoleerde EPC's zonder voorafgaande CD34 + selectie, maar met inbegrip van 7 dagen kweekperiode on-fibronectine gecoate gerechten. Linksboven: Cellen tonen opname van AcLDL, maar spreken zich niet uit CD31. Rechtsboven: Cellen tonen opname van AcLDL en express CD31. Linksonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL en spreken zich niet uit CD31. Rechtsonder: Cellen tonen geen opname van AcLDL, maar uiten CD31. (B) getoondis het histogram van PE-geconjugeerde AcLDL na opname door geïsoleerde EPC's. (C) ziet het histogram van FITC-geconjugeerd CD31 antilichaam na binding aan celoppervlak CD31 van geïsoleerde EPC's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Serum cytokine Levels tijdens hartchirurgie. Meting van serumconcentraties van CXCL8, VEGF, CXCL12 en MIF patiënten die hartchirurgie ondergaan middels ELISA. Getoond worden gemiddelde waarden van preoperatieve vergelijking met intra-operatieve concentraties ± SEM (*: p <0,05, versus pre-OP)
Figuur 13: In Vitro Migratie van EPC's Towards Patient Serum. Getoond wordt het intra-operatieve toename EPC migratie van gezonde vrijwilligers aan serummonsters van patiënten die hartchirurgie ondergaan. 50.000 cellen per putje in MV2 serum onthouden medium werd toegevoegd aan de bovenste kamer van een Transwell systeem. De serummonsters in de onderste kamer werd verdund 1: 5 met hetzelfde medium. De cellen gemigreerd 3 uur bij 37 ° C en 5% CO 2 door een 5 urn membraan. De staven geven gemiddelde waarden ± SEM (*: p <0,05)
Figuur 14: In Vitro Migratie van EPC's Towards Recombinant cytokines. Getoond wordt de migratie van EPC's in de richting van de representatieve concentraties van recombinant CXCL8, CXCL12, VEGF, en MIF vergeleken met serum uitgehongerde medium (= Baseline). Alleen MIF was in staattot een verhoogde EPC migratie op fysiologisch gemeten concentraties bemiddelen. De recombinante cytokinen werden verdund in serum onthouden MV2 medium. De cellen gemigreerd 3 uur door een 5 urn membraan. De staven geven gemiddelde waarden ± SEM (**: p <0,01 versus serum onthouden medium)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het eerste deel van deze studie omvatte de isolatie van humane EPC's uit het perifere bloed van gezonde vrijwilligers om een grondige evaluatie van het bloed van cardiochirurgische patiënten mogelijk te maken. Daarom werd een dichtheidsgradiënt centrifugatie uitgevoerd om de PBMC fractie uit plasma, granulocyten en erytrocyten te scheiden. De meeste verontreinigende bloedplaatjes te verwijderen, was dit celfractie onderworpen aan korte en langzame wasstappen 29, 30. Vervolgens werden CD34 + cellen geïsoleerd uit de resterende fractie om progenitorcellen te scheiden van de overige lymfocyten en monocyten. Tenslotte werd de celsuspensie gekweekt op met fibronectine beklede schalen in een commercieel verkrijgbare endotheliale celgroei medium voor endotheliale cellen te scheiden van andere (voorloper) cellen van de myeloïde lijn 3. Van de nota wordt besproken dat bloedplaatjes een CD34 celoppervlak express kunnen vertonenion, ook. Hoewel eerdere studies toonden binding van sommige anti-CD34 antilichamen tegen bloedplaatjes, kan dit een artefact als gevolg van de aggregatie van plaatjes met andere (CD34-positieve) cellen 31, 32. Echter, kunnen de meeste bloedplaatjes worden gescheiden door herhaald langzame wasstappen. Naast bloedplaatjes, hun voorlopers - megakaryocyten - expressie brengen deze hematopoietische voorlopercellen antigen en kunnen aanwezig zijn in perifeer bloed, hoewel ze voornamelijk gevonden in het beenmerg 33, 34. Bovendien is het ook beschreven dat het celoppervlak merker CD34, die in dit protocol wordt uitgedrukt in zeer lage niveaus op rijpe endotheelcellen 35. Daarom is het belangrijk om zorgvuldig overwegen een mogelijke verontreiniging met bloedplaatjes / megakaryocyten of rijpe endotheelcellen, bij het isoleren EPC. Vandaar, stap 2.6 is met name van belang tijdens de isolation van de EPC's aan bloedplaatjes te verwijderen.
Om het belang van het kweken van de geïsoleerde cellen aan met fibronectine beklede schalen, celpopulaties na twee dagen en zeven dagen kweek op fibronectine verduidelijken werden beide met eerdere CD34-positieve selectie vergeleken. Op dag twee minder dan de helft van de geïsoleerde cellen vertoonden een opname van AcLDL en gelijktijdige expressie van CD31 op hun oppervlak. Bovendien zou een minder intense expressie van beide merkers op het betreffende histogrammen te zien. Deze gegevens tonen dat zeven dagen kweken op fibronectine in de endotheelcel-specifiek medium nodig om EBV tonen kenmerkende endotheelcellen expressiepatronen krijgen. In deze stap is het belangrijk om de juiste concentratie / hoeveelheid fibronectine gebruiken. Wijelath en collega eerder aangetoond dat fibronectine bevordert de expressie van endotheelcel-achtige patronen, waarschijnlijk in combinatie met VEGF 36.
In de volgende step van het protocol, het belang van de CD34 + -selectie van de celsuspensie werd onderzocht, het vergelijken van cellen geïsoleerd na 7 dagen van de cultuur op met fibronectine gecoate gerechten, met en zonder voorafgaande CD34 + -selectie. De hoeveelheid cellen missen beide markeerders (AcLDL opname en CD31 expressie) was veel hoger na celisolatie zonder voorafgaande CD34 + -selectie opzichte isolatie waaronder deze stap. Interessant na zeven dagen kweken op fibronectine, cellen missen CD34 + -selectie laat een minder homogene celpopulatie, zoals aangegeven door de inhomogene expressie van CD31 ten opzichte van cellen, geïsoleerd met CD34 + -selectie. Deze gegevens tonen dat CD34 + -selectie moet uitzoeken EPC op alle monocyten / macrofagen. Tijdens de invoering van dit protocol bleek dat CD34 + -selectie MV2 in medium bij 37 ° C leidt tot een verhoogd aantal overlevende cellen, in vergelijking met veel lagere temperatures, die dient voorzichtig te worden onderzocht in toekomstige studies. We moeten erkennen dat bij de toepassing van dit protocol, het antilichaam incubatie in calcium bevattend medium bij 37 ° C kan leiden tot niet-specifieke interacties en binding. In de toekomst moet buffersystemen weinig calcium bij lagere temperaturen worden getest en vastgesteld dit potentieel verstorende factor voorkomen.
Met name tijdens onze voorlopige analyse van celmigratie experimenten met serummonsters metingen werden eerst uitgevoerd met een fluorescentie microplaat reader en calceïne kleuring van de cellen, zoals eerder beschreven voor verschillende celtypen (bijvoorbeeld humane navelstrengader endotheelcellen, HUVEC) 37. De verschillende extinctiewaarden tussen maakten duidelijk dat niet alleen de serummonsters alleen, maar ook het medium al een opmerkelijke invloed op de gemeten fluorescentie, die moet voorzichtig worden gehanteerd. Daarom we aangepast ons protocol overgegaan op een meetsysteem waarin de cellen via lichtmicroscopie worden waargenomen en geteld door een semi automatische software.
Terwijl EPC vertegenwoordigen ongeveer 0,1% van cellen in het perifere bloed en het is moeilijk om deze specifieke cellen 38 te isoleren, een indrukwekkend aantal studies aangetoond dat EBV positieve effecten kunnen worden en het weefsel vascularisatie na ischemische gebeurtenissen in de ledematen en in het myocardium 39 , 40. Toch is het nog steeds een voortdurende uitdaging om deze bevindingen tot klinische praktijk en de klinische toepasbaarheid. De redenen kan worden veroorzaakt door de invloed van verschillende factoren op de PO secretie van verschillende chemoattractants, die eerder 22, 41 is getoond. Daarom is in het tweede deel van deze studie, de rol van verschillende cytokines voor de migratie van EBV in de omgeving van myocardiale I / R geëvalueerd. Daarom is de serumconcentraties van cytokinen bij hartchirurgie patiënten gemeten. MIF, alsmede CXCL12 en CXCL8 een significante intra-operatieve verhogen. Bij het vertalen van deze bevindingen terug in de in vitro experimenten, huidige resultaten toonden aan dat er noch een CXCL12- nor-CXCL8 gemedieerde effect op de EPC migratie op de gemeten fysiologische concentraties in vitro. Met behulp van de beschreven EPC isolatie model en de daaropvolgende migratie assay, werd MIF geïdentificeerd als een overheersende mediator van EPC migratie 42. In dit verband Kanzler et al. aangetoond in een experimenteel muizenmodel dat MIF en VEGF worden de sterkste invloed op EPC migratie onder hypoxie 23. Interessant metingen van VEGF blijkt dat er geen significante intra-operatieve wijziging van VEGF bloedspiegels, die kan binden of VEGF aan de intra-operatieve gestandaardiseerde toepassing van heparine. Daarom kan MIF een overheersende rol bij het angiogene chemokinen spelen bij de rekrutering van EBV hartchirurgie patiënten en kunnen initiëren en bijdragen aan het genezingsproces na myocardiale I / R tot transport van EBV tot de plaats van letsel 43, 44 Maar zoals MIF niveaus verhoogd onmiddellijk na myocardiale I / R, is speculatief blijft of het MIF-gemedieerd effect op de rekrutering van EPC remodellering en angiogenese, die belangrijke gevolgen bij de preventie van hartfalen na myocardiaal I / R 23 moeten beïnvloeden. Echter, alvorens naar dergelijke analyse is het belangrijk om de verschillende subtypes van EBV te karakteriseren en om zijn functionele rol in humane biologie evalueren. In dit verband verschaft de onderhavige protocol verschaft een betrouwbare methode voor het isoleren van voor EBV humaan perifeer bloed i inschakelents verder uitgebreide karakterisering en toekomstige studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs hebben geen bevestigingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
References
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
