Summary
Эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) имеют решающее участие в неоваскуляризации ишемических тканей. Этот метод описывает выделение человека ЕРС из периферической крови, а также выявление их миграционного потенциала в отношении образцов сыворотки хирургических больных сердечными.
Abstract
Эндотелиальные клетки-предшественники (ЕРС) набираются из костного мозга при патологических состояниях, как гипоксии и в решающей степени участвуют в неоваскуляризации ишемических тканей. Происхождение, классификация и характеристика ЕРС являются сложными; Несмотря на это, два известных подтипов ЕРС были созданы: так называемые "ранние" ЕРС (впоследствии называют раннего EPCs) и поздним вырост ЕРС (позднего EPCs). Они могут быть классифицированы по биологическим свойствам, а также по их внешнему виду в процессе культивирования в лабораторных условиях . В то время как "ранние" ЕРС появляются в менее чем через неделю после того, как культуры периферических мононуклеарных клеток крови, полученных в ЕС конкретных средств массовой информации, в конце-отросток ЕРС можно найти через 2-3 недели. Поздний вырост ЕРС были признаны непосредственно участвовать в неоваскуляризации, в основном за счет их способности дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки, в то время как "ранние" ЕРС выражают различные ангиогенные факторы, как эндогенныхOUs грузов для содействия ангиогенеза в паракринной образом. Во время ишемии миокарда / реперфузии (I / R), различные факторы управления хоминг ЕРС в регионах формирования кровеносных сосудов.
Макрофагами фактор ингибирования миграции (MIF) представляет собой хемокин подобный провоспалительных и повсеместно экспрессируется цитокин и недавно был описан функционировать в качестве ключевого регулятора миграции ЕРС при физиологических концентрациях 1. Интересно отметить , что MIF хранится в внутриклеточных пулов и может быстро высвобождаться в кровоток после нескольких раздражителей (например , инфаркт миокарда).
Этот протокол описан способ надежной изоляции и культуры раннего ЕРС от взрослых периферической крови человека на основе CD34-позитивной селекции с последующей культуры в среде , содержащей эндотелиальные факторы роста на покрытой фибронектином пластин для использования в ин витро миграции анализов против образцов сыворотки хирургических больных сердечными. Кроме того,мигрирующий влияние MIF на хемотаксис ЕРС по сравнению с другими известными ангиогенеза-стимулирующего цитокинов продемонстрирована.
Introduction
Эндотелиальные клетки - предшественники (ЕРС) циркулируют в крови человека и обладают способностью дифференцироваться в эндотелиальные клетки 2. Они участвуют в васкулогенезе и способны минимизировать повреждения , вызванные воспалением и ишемии / реперфузии (I / R) травм различными способами 3, 4. Например, ЕРС показывают повышенные уровни внутриклеточных антиоксидантных ферментов , таких как каталазы, глутатионпероксидазы или марганца супероксиддисмутаза (MnSOD) 5. Повышенная устойчивость к окислительному стрессу позволяет ЕРС функционировать в микросреды с повышенными активных форм кислорода (ROS) после ишемического повреждения 6. Предыдущие исследования также показали , что количество ЕРС может быть соотнесена с сосудистой ремонта и что снижается количество циркулирующих ЕРС предсказывает возникновение сердечно - сосудистых событий 7,класс = "Xref"> 8. Однако четкое определение EPC еще не найден. До сих пор нет никакой конкретной клеточной поверхности маркер или последовательным фенотип для ЕРС и эти клетки очень редки в периферической крови 9. У человека EPC следует рассматривать как циркулирующей клетки с возможностью способствовать восстановлению поврежденного эндотелия и новых сосудистых структур.
Один из способов выделения и характеризующий ЕРС через адгезию к фибронектина. Таким образом, пропускная способность этих клеток используется , чтобы показать превосходную адгезию с фибронектином посуду с покрытием по сравнению с 1 типа коллагена, например , 3, 10, 11. Тем не менее, другие обнаружили , что покрытие мононуклеаров на покрытой фибронектином блюда без предварительной или последующей стадии очистки приводит к колонии в том числе миелоидных клеток - предшественников, моноцитов и Т - лимфоцитов 12, 13, 14. К тому же , в этом случае, тромбоциты могут контаминировать мононуклеарных клеток (МНК) фракции и , таким образом , передача белков плазматической мембраны в каких - либо прилипшие клетки 15.
Помимо определения характеристик с помощью анализов адгезии в пробирке, сочетание различных маркеров клеточной поверхности используется для описания типа клеток рассматривается как EPC. В этом случае, после того, как фибронектин-опосредованной адгезии, клетки проанализированных в отношении их эндотелий как атрибуты. В этом процессе две эндотелиальных клеток-ассоциированных маркеров, липопротеин ацетилированный-низкой плотности (AcLDL) и сосудистый эндотелиальный фактор роста рецептора 2 (VEGFR-2, KDR), играют определенную роль. Эндотелиальные клетки и макрофаги было показано, в частности , занимают AcLDL в процессе , называемом "поглотитель клеток путь" 16. Другой маркер белок KDR в качестве основного рецептора VEGF на эндотелиальные17 клетки. Тем не менее, в качестве ЕРС в целом, культивируют в среде с эндотелиальными факторами роста и фетальной сыворотки теленка, то возможно, что макрофаги, которые, возможно, также были ошибочно изолированы, проявляют профиль маркера эндотелиальной типа. Как было показано ранее, если культивировали в эндотелиальной-кондиционированной среды, макрофаги экспресс "эндотелиальные специфические белки" 18.
В общем, есть две категории ЕРС в рамках более подтипов, которые могут быть найдены в крови или быть выращены в лабораторных условиях . Поздние-вырост ЕРС (позднего ЕРС) появляются через 2-3 недели культуры. Эти клетки интегрируются быстрее в монослой эндотелиальных клеток пупочной вены человека и могут образовывать капиллярные трубки 19. К тому же, так называемый "ранний-ЕРС" циркулируют в крови в течение приблизительно одной недели и действовать более пассивным способом посредством доставляющих ангиогенных молекул, таких, как сосудистый эндотелиальный ростфактор (VEGF), или CXCL8 19. У пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) показали значительно меньшее количество раннего ЕРС по сравнению с контрольной группой без CAD 20. Интересно отметить, что та же группа исследователей показала более высокие количества позднемагматического ЕРС по сравнению с контрольной группой. Другое исследование показало , что раннее-ЕРС защитить дифференцированные ЕРС от апоптоза в окислительных условиях в паракринной образом 6. Таким образом, ранние ЕРС могли бы обеспечить соответствующие защитные эффекты через миграцию других клеток в авто- или паракринной образом в периферической крови.
Этот протокол описывает метод для очистки раннего ЕРС сначала выделением РВМС фракции из периферической крови человека , а затем выделения клеток CD34 + из РВМС фракции , чтобы очистить эту суспензию клеток от нежелательных клеток. CD34 представляет собой маркер, который используется для выделения человеческих гемопоэтических стволовых клеток 9 + клетки культивировали на покрытой фибронектином поверхностей для культивирования тканей. Через три дня, среда изменяется, тем самым теряя все, не прилипшие клетки. И, наконец, изолированные ЕРС окрашивают, чтобы проверить поглощение AcLDL и присутствие KDR как эндотелиальные клетки-маркера с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток (FACS). В качестве дополнительного маркера, мы проанализировали тромбоцитов эндотелиальной молекулы клеточной адгезии (РЕСАМ-1, CD31), который также имеет место на эндотелиальных клетках.
Восстановление поврежденных или инфарктом миокарда ткани повышенной вербовке ЕРС относится к интенсивно изучаемых стратегий лечения в сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, перевод экспериментальных результатов в клиническую практику до сих пор сложной задачей, учитывая сложный клеточный взаимодействие в организме человека в процессе различных патофизиологических условиях. Кроме того, инфаркт I / травмы R вызывают чрезмерную секрецию различных цитокинов, гормонов и FAC роста торы, которые контролируют хоминг ЕРС в районы формирования кровеносных сосудов 13. Как уже было показано, CXCL8, стромальных клеток , полученных фактор 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF и фактор , ингибирующий миграцию макрофагов (MIF) значительно увеличены в образцах сыворотки после инфаркта I / R травмы 1. Среди этих факторов, MIF является плейотропных хемокин-цитокина с преимущественно провоспалительных характеристиками. В отличие от своего исторического названия, MIF имеет про-миграционные функции, действуя как истинный хемокина на различных типах клеток 1, 21, 22. MIF-опосредованные процессы подбора кадров клеток были связаны с рецепторов хемокинов CXCR2 и CXCR4, который MIF связывается и активирует в не родственным образом 21. Следует отметить, что ЕРС выражают оба этих рецепторов на их поверхности, что дополнительно становятся повышающей регуляции в условиях гипоксиипопка = "Xref"> 23, 24. Кроме того, накапливая данные свидетельствуют о том, что MIF имеет общую кардио-защитный эффект в течение I / R повреждения сердца 22, 25, 26. В этом контексте было далее показано , что MIF может поддерживать неоваскуляризации во время гипоксического стресса , что имеет особое значение при рассмотрении вопроса ограниченные механизмы восстановления травмированной миокарда 27. Предыдущие исследования в пробирке и эксперименты в доклинических моделях мышей при условии , первые свидетельства о роли MIF в ЕРС наборе 4. Следует отметить, что MIF также является видным грузовой белок ЕРС , которые могут быть освобождены в ходе ЕРС набора в пределах ишемических участков 28. Тем не менее, исследования в клинических условиях, в частности, по сравнению с другими (ангиогенеза) в сыворотке крови цитокинов остаются неуловимыми.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Кровь для выделения ЕРС был получен от здоровых добровольцев после информированного согласия в соответствии с местным комитетом по этике. Образцы сыворотки, используемые в анализах миграции были получены от пациентов, которые перенесли обычную кардиохирургии с использованием искусственного кровообращения (CPB). Критерии исключения чрезвычайных операций, известных или подозреваемых беременности, patient`s возраст менее 18 лет, а также невозможность получения информированного согласия. Образцы сыворотки были разработаны в дополнение к клинической практике измерений (непосредственно перед операцией и сразу после реперфузии миокарда / открытия аортального поперечного зажима), а затем хранили при -80 ° С до окончательного анализа. Институциональный наблюдательный совет (Комитет по этике, Университет Аахена) одобрил данное исследование. Пациенты показали, средний возраст 68,6 лет, и средний вес 81,7 кг. Предварительно существующие заболевания относятся: артериальная гипертензия (65%), хронические заболевания легких (19%), дополнительные сердца артериопатия (16%), церебральной дисфункции (6%), нестабильная стенокардия (3%), недавно перенесенный инфаркт миокарда (28% в течение 90 D), хронические заболевания почек (14%), заболевания печени (2%) и сахарный диабет (34%).
1. Покрытие T75 Настой:
- Приготовьте 5 мл раствора фибронектина (1 мг человеческого фибронектина, разбавленного в 15 мл сверхчистой воды) в расчете на колбу Т75.
- Добавьте раствор в колбу Т75 и подождать, пока вода не испарится. Для того, чтобы избежать каких - либо ненужных перерывов во время процесса выделения из - за испарения, выполнить этот процесс заранее (например , на ночь) и при комнатной температуре. Это решение дает 4,44 мкг фибронектина / см 2.
- Приготовьте эндотелиальной роста клеток среды MV2 путем дополнения базальную MV2 среду с добавками фактора роста, предоставляемых производителем.
2. Выделение эндотелиальных клеток-предшественников (ЭПК) в диапазоне от 60 мл крови:
Примечание: В качестве CD34-позитивной селекции коктейлюе магнитные шарики коммерчески доступны в комбинированном наборе выбора, нет концентрации, предоставленные изготовителем. Тем не менее, около 100 мкл антител достаточно для обработки до 5 х 10 8 клеток. Магнитные шарики, разведенные в воде, покрытой декстраном и около 5,000x меньше по сравнению с другими коммерчески доступными бусинок. Для получения дополнительной информации см указания производителя.
- Смешайте кровь (с или без антикоагулянтов) 1: 1 с Ca 2+ -Mg 2+ -Free PBS.
- Добавить 15 мл плотности раствора градиента на 50 мл пробирку. Для получения дополнительной информации см указания производителя.
- Медленно слой разбавленного кровь на верхней части раствора в градиенте плотности.
- Центрифуга образцов при 2500 мкг в течение 30 мин с медленным ускорением и без торможения.
- Осторожно собрать охристые пальто слой каждой трубы (рисунок 1) с использованием стерильной пластиковой пипетки и поместить его в другую пробирку.Избегайте сбора раствора в градиенте плотности. Ожидаемый выход РВМС составляет примерно 3-4 × 10 6 клеток / мл крови.
Рисунок 1: Плотность Градиент Центрифугирование Bbuffy Coat на Ficoll Solution. Показанный результат градиента плотности центрифугирования при 2500 х г в течение 30 мин на растворе с градиентом плотности. Изображенный являются Эритроциты и гранулоциты (красный), фракцию мононуклеарных клеток (белый слой), плазму (желтый) и раствор градиента плотности (беловатый). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Развести фракции мононуклеарных клеток периферической крови, по меньшей мере, 3 объемами PBS и перемешать. Центрифуга при комнатной температуре в течение 15 мин при 200 х г.
- Повторите шаг 2,6 раза. </ Li>
- Аспирируйте осадок клеток супернатант и ресуспендируют в 5 мл среды MV2.
- Добавьте 100 мкл антитела CD34 человека ( в достаточном для обработки до 5 х 10 8 клеток) в используемой лейкоцитарной пленки и вращаться в течение 15 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
- Добавить 50 мкл покрытого декстраном магнитных шариков на используемый лейкоцитарной пленки и вращаться в течение 10 мин при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
- После инкубации перенести суспензию до FACS труб с максимум 3 мл в каждую пробирку. Более высокие количества не будут допустимы с магнитом.
- Вставьте FACS трубку (ы) в магнит (ы) и ждать в течение 5 мин.
- Удалите супернатант без потянув трубки FACS из магнита.
- Ресуспендируют клеток в каждой пробирке FACS с 3 мл MV2 среды за пределами магнита.
- Повторите шаги 2.12-2.14 дважды.
- Протяните трубы FACS из магнитов и ресуспендирования клеток в 3 мл MV2 среды.
- Передача клеточной суспензии в предварительно покрытых T75 Flasks и добавляют 17 мл MV2 среды в колбу.
Примечание: Среда должна быть изменена после того, как 3-х дней. Через одну неделю клетки показывают шпиндель-подобные структуры (рисунок 2) и готовы к использованию. Для смотровой вычленения смотри рисунок 3.
Рисунок 2: микроскопическое изображение изолированных ЕРС. Показан представитель изображение изолированных раннего ЕРС в T75 колбу предварительного отслоения. Видимое является шпиндель, как структура ЕРС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Отображение Flowchart Процедура EPC изоляции. Изображенные представляет собой схему, шоуИнг Отдельные стадии протокола изоляции EPC. Для более детального протокола смотрите Раздел 2 в разделе протокола.
3. Анализ миграции
- Извлеките носитель из ЕРС в T75 колбу.
- Мытье с 5 мл PBS, осторожно встряхивая.
- Удалить PBS и добавьте 5 мл раствора коммерческого открепления клеток. Подождите, пока клетки отделяются (проверить под микроскопом). Ускорение отряд осторожно нажав на нижнюю часть колбы.
- Когда клетки отделяют, быстро добавляют 5 мл полной среды MV2 и передачи клеточной суспензии в другую пробирку.
- Центрифуга при 2000 х г в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в 5-10 мл PBS и центрифуга снова при 2000 мкг в течение 5 мин.
- Повторите шаг 3.6.
- Ресуспендируют осадок клеток в MV2 голодали среде (50000 клеток в 75 мкл на лунку переселения необходимы).
Примечание: Какая система миграции необходима, зависит от типа клеток и анализа. Есть Diff диаметры пор и различны размеры пластин (количество скважин). Для ЕРС размер пор 5 мкм в 96-луночный система оптимальна. - Подготовьте миграционную пластину путем добавления 235 мкл образца сыворотки (сыворотку разводили 1: 5 в MV2 голодали среды) в нижнюю камеру (рисунок 4).
Рисунок 4: Анализ миграции в модифицированном Бойденом палате. Показана общая конструкция модифицированного Бойденом камеры. Вставки для культивирования клеток (= верхняя палата) обозначены темно-синим цветом и вставляются в нижнюю камеру. Дно (но не стены) из этих вставок представляет собой систему фильтрации, включая поры. (А) показана установка в нулевой момент времени. (Б) После того, как выбранный момент времени, клетки мигрируют через фильтр в направлении стимула.fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Добавить вставку незадолго перед добавлением раствора клеток.
- Добавьте 75 мкл раствора клеточного (= 50000 клеток) в верхнюю часть камеры.
- Пусть ЕРС мигрируют в течение 3 ч при температуре 37 ° С и 5% CO (зависит от типа клеток и системы время миграции) 2.
- Чтобы избежать сыворотки автофлуоресценции артефактов, количественно мигрировавших клеток путем фотографирования скважины под микроскопом и подсчет клеток с использованием полуавтоматического программного обеспечения "ImageJ".
- Снимите верхнюю камеру (содержащую все неперемещенных клетки).
- Добавить 70 мкл 3,6% раствора параформальдегида, в том числе красителя Hoechst (разбавленное 1: 1000). Пластину можно хранить при температуре 37 ° С и 5% CO 2 в течение ночи.
- Центрифуга пластину вскоре, чтобы получить все клетки в той же фокальной плоскости при 2000 мкг в течение 1-2 мин.
- Возьмите 5 кадров в жELL (рисунки 5 и 6) с 100 - кратном увеличении.
Рисунок 5: Схема Отображение Положение после съемки. Схема изображает положение пяти выполненных снимков, которые необходимы для определения мигрировавших клеток, по отношению к колодцу. Сфотографированы для подсчета клеток и вычислить среднее значение для каждой скважины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6: Микроскопическое изображение для сотовых Количественное. Показанный является представителем образ, который был взят для клеток количественной оценки. Клетки окрашивали и фиксировали USIнг Hoechst красителя в 3,6% параформальдегида. Точки представляют фиксировали и окрашивали эндотелиальные клетки-предшественники. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Граф мигрировавших клеток с помощью полуавтоматического программного обеспечения "ImageJ" Национальным институтом здравоохранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристика изолированных эндотелиальных клеток-предшественников
Во-первых, поглощение AcLDL верифицирован, а также выражение KDR, и CD31 на поверхности популяции клеток изолированной. Как показано на фиг.7А, 85,1% из выделенных ЕРС показал поглощение AcLDL и выразил CD31. На рисунках 7b и 7с дополнительно демонстрируют равномерное распределение обоих маркеров, хотя, кажется, меньше населения, негативные для обоих маркеров. На втором этапе, FACS-анализ AcLDL в сочетании с KDR была выполнена. На рисунке 8а показано , что более 80% из выделенных клеток , показал поглощение AcLDL и экспрессию KDR на их поверхности. Фигуры 8Б и 8В показывают однородность этих маркеров.
Для проверки importancе фибронектина покрытием блюд во время культивирования, сравнение трех маркеров между изолированных клеток после двух дней культивирования на покрытой фибронектином поверхности с изолированными ЕРС после семи дней культивирования на фибронектин покрытием блюда (как указано в нашем протоколе) была выполнена, как с предыдущим CD34 + -выборки. Как показано на рисунке 9а, только 46,4% от двухдневной культивируемых клеток показал поглощение AcLDL, а также выражение CD31 на их поверхности, по сравнению с 85% клеток после семи дней культивирования на фибронектина. Кроме того, гистограмм (рис 9В и 9С) , показывают меньшую интенсивность обоих маркеров после двух дней культивирования по сравнению с семи дней (цифры 7В и 7С). То же самое верно для комбинации маркеров AcLDL и КДР. После двух дней культуры на фибронектин, только 68,0% всех клеток показал поглощение AcLDL, а также выражение KDR на их поверхности (рисs 10a-10c). После семи дней культивирования на фибронектин, 83,6% клеток показали поглощение AcLDL и экспрессии KDR на их поверхности (фиг.8а-8с).
На следующем этапе, оценивали важность CD34 + -подбор во время выделения ЭПК. Таким образом, клетки выбраны в соответствии с настоящим Протоколом, включая центрифугирования в градиенте плотности и семь дней культивирования на фибронектин, но пропустил CD34 + -подбор были изолированы. Как показано на фиг.10а, более 18% всех выделенных клеток делают ни экспресс - CD31 , ни демонстрируют поглощение AcLDL, по сравнению с менее чем 8% , после CD34 + -подбор, которые показывают экспрессию CD31 и поглощение AcLDL (рис 7а) , Кроме того, рисунки 11b и 11с показывают , что изолированные клетки очень неоднородна в отношении обоих маркеров по сравнению с относящиеся
Сыворотка цитокинового уровни во время кардиохирургии
Для того, чтобы определить влияние кардиохирургии после инфаркта I / R от концентраций циркулирующих уровней сывороточного MIF, CXCL12, CXCL8 и VEGF, образцы сыворотки были сделаны до и во время операции для последующего анализа с помощью коммерчески доступного ELISA (рисунок 12) , Сывороточные уровни MIF показали значительное увеличение интраоперационной по сравнению с исходными значениями (100,3 нг / мл по сравнению с 127,4 нг / мл, р = 0,027). Подобным же образом, уровни CXCL12 показал значительное увеличение в сыворотке во время операции (0,101 нг / мл по сравнению с 0,198 нг / мл, р = 0,011). Подобно MIF и CXCL12, CXCL8 значительно увеличена во время операции (0,15 нг / мл по сравнению с 0,3 нг / мл, р = 0,022). В продолжениеРаст, концентрации VEGF не показали каких - либо существенных изменений в течение периода наблюдения (0,154 нг / мл по сравнению с 0,134 нг / мл, р = 0,583) 1.
Миграция потенциала эндотелиальной клетки-предшественники
Для того, чтобы исследовать прямое влияние patients' образцов сыворотки и содержащиеся в ней цитокины / хемокины / ангиогенные факторы миграции на EPC, экс естественных условиях анализа миграции с использованием образцов сыворотки, который были сделаны до и во время операции, была выполнена. ЕРС были изолированы от здоровых добровольцев. Как показано на рисунке 13, скорость миграции EPC значительно возросла в сторону интраоперационно отобранных проб по сравнению с дооперационном отобранных проб (+ 35% по сравнению с исходным уровнем, р = 0,047).
Так как предыдущие исследования уже показали, что I / R вызывает секрецию SEVEral цитокины, которые модулируют хемотаксис лейкоцитов и миграции, анализы миграции с использованием этих потенциальных хемоаттрактанты, включая MIF, CXCL12, CXCL8 и VEGF были выполнены. Чтобы получить более полное представление о влиянии этих цитокинов на наборе EPC в естественных условиях, дополнительные в пробирке эксперименты миграции, применяя физиологически измеренные концентрации указанных цитокинов в нижнюю палату миграции были выполнены устройства, тоже.
Поскольку концентрации MIF в сыворотке составляет от 100 до 130 нг / мл были измерены (рисунок 12), в концентрации 100 нг / использовали мл рекомбинантного MIF, что привело к> 6-кратному увеличению миграции EPC по сравнению с контрольной среды ( Рисунок 14). В противоположность этому, концентрации в сыворотке CXCL12, CXCL8 и СЭФР находились в диапазоне 150 - 300 пг / мл. Следует отметить, что эти концентрации не посредничать никакого влияния на EPC миграции в пробирке(Рисунок 14). Поэтому вполне возможно , что среди этих четырех цитокинов, MIF проявляет относительную сильное влияние на миграцию в естественных условиях EPC 1.
Рисунок 7: FACS Анализ изолированных ЕРС на День 7. (а) Показана поглощение клеточной поверхности экспрессии AcLDL и CD31 изолированных ЕРС после CD34 + и выбора периода культивирования 7 дней на фибронектин покрытием блюда. В левом верхнем углу: Клетки показывают поглощение AcLDL, но не выражают CD31. В правом верхнем углу: Клетки показывают поглощение AcLDL и выразить CD31. Внизу слева: Клетки не проявляют поглощение AcLDL и не выражают CD31. Внизу справа: Клетки не проявляют поглощение AcLDL, но выразить CD31. (Б) Показана гистограмма PE-конъюгированного AcLDL после поглощения изолированными ЕРС. (С) Показана гистограмма FITC-Conjugated CD31 антитела после связывания с клеточной поверхности CD31 изолированных ЕРС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8: FACS Анализ изолированных ЕРС на День 7. (а) Показана поглощение клеточной поверхности экспрессии AcLDL и KDR изолированных ЕРС после CD34 + и выбора периода культивирования 7 дней на фибронектин покрытием блюда. В левом верхнем углу: клетки показывают поглощение AcLDL, но не выражают KDR. В правом верхнем углу: Клетки показывают поглощение AcLDL и выразить KDR. Внизу слева: Клетки не проявляют поглощение AcLDL и не выражают KDR. Внизу справа: Клетки не проявляют поглощение AcLDL, но выразить KDR. (Б) Показана гистограмма PE-конъюгированного AcLDL после поглощения изолированными ЕРС. (С) ПоказанаГистограмма FITC-конъюгированного антитела KDR после связывания с клеточной поверхности КДР изолированных ЕРС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9: FACS Анализ изолированных ЕРС на День 2. (а) Показана поглощение клеточной поверхности экспрессии AcLDL и CD31 изолированных ЕРС после CD34 + и выбора периода культивирования 2 дня на фибронектин покрытием блюда. В левом верхнем углу: клетки показывают поглощение AcLDL, но не выражают CD31. В правом верхнем углу: Клетки показывают поглощение AcLDL и выразить CD31. Внизу слева: Клетки не проявляют поглощение AcLDL и не выражают CD31. Внизу справа: Клетки не проявляют поглощение AcLDL, но выразить CD31. (Б) Показана гистограмма PE-конъюгированного AcLDL после поглощения изолированными ЕРС. (
Рисунок 10: FACS Анализ изолированных ЕРС на День 2. (а) Показана поглощение клеточной поверхности экспрессии AcLDL и KDR изолированных ЕРС после CD34 + и выбора периода культивирования 2 дня на фибронектин покрытием блюда. В левом верхнем углу: клетки показывают поглощение AcLDL, но не выражают KDR. В правом верхнем углу: Клетки показывают поглощение AcLDL и выразить KDR. Внизу слева: Клетки не проявляют поглощение AcLDL и не выражают KDR. Внизу справа: Клетки не проявляют поглощение AcLDL, но выразить KDR. (Б) Показана гистограмма PE-конъюгированного AcLDL после поглощенияизолированными ЕРС. (С) Показана гистограмма FITC-конъюгированного антитела KDR после связывания с клеточной поверхности КДР изолированных ЕРС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 11: FACS Анализ изолированных ЕРС на День 7. (а) Показана поглощение клеточной поверхности экспрессии AcLDL и CD31 изолированных ЕРС без предварительного отбора CD34 +, но в том числе 7 - дневного периода культивирования на фибронектин покрытием блюда. В левом верхнем углу: Клетки показывают поглощение AcLDL, но не выражают CD31. В правом верхнем углу: Клетки показывают поглощение AcLDL и выразить CD31. Внизу слева: Клетки не проявляют поглощение AcLDL и не выражают CD31. Внизу справа: Клетки не проявляют поглощение AcLDL, но выразить CD31. (Б) показанявляется гистограмма PE-конъюгированного AcLDL после поглощения изолированными ЕРС. (С) Показана гистограмма FITC-конъюгированных CD31 антитела после связывания с клеточной поверхности CD31 изолированных ЕРС. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 12: Сыворотка цитокинового уровни во время кардиохирургии. Измерение концентрации сыворотки CXCL8, VEGF, CXCL12 и MIF пациентов, которые перенесли операцию на сердце с помощью ELISA. Показаны средние значения дооперационная по сравнению с интраоперационными концентрации ± SEM (*: р <0,05; по сравнению с пре-OP)
Рисунок 13: Ян Vitro Миграция ЕРС На пути сыворотки пациента. Показана интраоперационный увеличение ЕРС миграции здоровых добровольцев по отношению к образцам сыворотки пациентов, перенесших операции на сердце. 50000 клеток на лунку в объеме MV2 с недостатком сыворотки среды добавляли в верхнюю камеру системы Transwell. Образцы сыворотки в нижней камере разводили 1: 5 с той же средой. Клетки мигрировали в течение 3 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2 через мембрану с размером 5 мкм. Столбики представляют средние значения ± SEM (*: р <0,05)
Рисунок 14: In Vitro миграции ЕРС На пути к рекомбинантным цитокинам. Показана миграция ЕРС по отношению к репрезентативных концентраций рекомбинантного CXCL8, CXCL12, VEGF и MIF по сравнению с недостатком сыворотки среды (= Baseline). Только MIF был в состояниипосредничать повышенную миграцию EPC в физиологически измеренных концентраций. Рекомбинантные цитокины разбавляли в МВ2 с недостатком сыворотки среде. Клетки мигрировали в течение 3 ч через мембрану с размером 5 мкм. Столбики представляют средние значения ± SEM (**: р <0,01 по сравнению с сывороткой голодали среды)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Первая часть этого исследования включали в себя изоляцию человека ЕРС из периферической крови здоровых добровольцев, чтобы дать всестороннюю оценку крови больных кардиохирургии. Таким образом, градиент плотности проводили центрифугирование для отделения фракции РВМС из плазмы, гранулоцитов и эритроцитов. Чтобы удалить большую часть загрязняющих тромбоцитов, эта клетка фракцию подвергали короткой и медленной стадии промывки 29, 30. Далее, CD34 + клетки выделяли из оставшейся фракции , чтобы отделить клетки - предшественники из остальных лимфоцитов и моноцитов. Наконец, суспензию клеток культивировали на покрытой фибронектином блюда в коммерчески доступного среде роста эндотелиальных клеток , чтобы отделить эндотелиальные клетки - предшественники из других (прогениторных) клеток миелоидного происхождения 3. Следует отметить, что это обсуждается, что тромбоциты могут показать CD34 клеточной поверхности экспрессиона, тоже. Хотя предыдущие исследования показали , связывание некоторых анти-CD34 антител к тромбоцитам, это может быть артефактом из - за агрегации тромбоцитов с другими (CD34-положительных) клеток 31, 32. Тем не менее, большинство тромбоциты могут быть разделены с помощью повторных медленных стадий промывки. Кроме тромбоцитов, их предшественники - мегакариоциты - действительно выражают этот антиген гемопоэтических клеток - предшественников и может присутствовать в периферической крови, хотя они в основном встречаются в костном мозге 33, 34. Кроме того, также описано , что маркера клеточной поверхности CD34, используемый в данном протоколе выражается в очень низких уровней на зрелых эндотелиальных клеток 35. Поэтому, важно, чтобы осторожно рассмотреть возможность загрязнения тромбоцитами / мегакариоцитов или зрелых эндотелиальных клеток, при выделении ЕРС. Следовательно, шаг 2.6 имеет особое значение при isolatioп ЕРС для удаления тромбоцитов.
Для разъяснения важности культивирования изолированных клеток на покрытой фибронектином блюда, клеточных популяций после двух дней и семь дней культивирования на фибронектин сравнивали как с предыдущей селекции CD34-положительными. На второй день, менее половины из выделенных клеток показал поглощение AcLDL и одновременное экспрессию CD31 на их поверхности. Кроме того, менее интенсивная экспрессия обоих маркеров на относительно гистограмм можно было увидеть. Эти данные показывают, что семь дней культуры на фибронектина в клеточно-специфической среде эндотелиальной необходимы, чтобы получить ЕРС, показывающие характерные модели эндотелиальные экспрессии. На этом этапе, это имеет важное значение для использования правильной концентрации / количество фибронектина. Wijelath и его коллеги ранее показали , что фибронектин способствует экспрессии эндотелиальных клеток-подобных моделей, скорее всего , в комбинации с VEGF 36.
В следующем гоер протокола, важность CD34 + -подбор клеточной суспензии исследовали, сравнивая клетки , выделенные после 7 дней культивирования на фибронектин покрытием блюда, с и без предыдущего CD34 + -подбор. Количество клеток без вести оба маркера (поглощение AcLDL и экспрессия CD31) была значительно выше после выделения клеток без предварительного CD34 + -подбор по сравнению с изоляцией , включая этот шаг. Интересно отметить , что после семи дней культивирования на фибронектин, клетки отсутствует CD34 + -подбор показал менее гомогенную популяцию клеток, как указано неоднородным экспрессией CD31 по сравнению с клетками, изолированными с CD34 + -выборки. Эти данные показывают , что CD34 + -подбор необходимо разобраться в ЕРС из других моноцитов / макрофагов. Во время установления этого протокола, мы обнаружили , что CD34 + -подбор в MV2 среде при температуре 37 ° С приводит к увеличению числа выживших клеток, по сравнению с намного более низкой Тсmperatures, который должен быть осторожно исследован в будущих исследованиях. Мы должны признать, что при применении этого протокола инкубацию антитела в кальцийсодержащих среде при температуре 37 ° С может привести к неспецифическим взаимодействия и связывания. В будущем, буферные системы, не имеющие кальция при более низких температурах, должны быть проверены и установлены, чтобы избежать этого потенциального сбивающий фактор.
Следует отметить, что во время нашего предварительного анализа миграции клеток экспериментов с образцами сыворотки, измерения впервые были выполнены с использованием флуоресцентном счетчике для микропланшетов и кальцеином окрашивания клеток, как описано выше для различных типов клеток (например , эндотелиальных клеток пупочной вены человека, HUVEC) 37. Различные значения оптических плотностей между камерами показали, что не только образцы сыворотки в одиночку, но и среда уже оказывают значительное влияние на измеренной флуоресценции, которую необходимо рассматривать с осторожностью. Поэтому, ше адаптировать наш протокол и перешел к измерительной системе, в которой клетки можно наблюдать с помощью световой микроскопии и подсчитывают с помощью полуавтоматической программного обеспечения.
В то время как ЕРС приходится около 0,1% клеток в периферической крови и трудно выделить эти специфические клетки 38, внушительное число исследований показали , что ЕРС может оказывать благотворное воздействие и улучшить васкуляризации ткани после ишемических событий в конечностях и в миокарде 39 , 40. Тем не менее, она по-прежнему является постоянной проблемой, чтобы перевести эти данные в клиническую практику и оценить ее клиническую значимость. Причины могут быть в связи со значительным влиянием многих факторов периоперационным на секрецию различных хемоаттрактанты, которое было показано ранее 22, 41. Таким образом, во второй части этого исследования, роль различных Cytokines на миграцию ЕРС в проточных миокарда I / R были оценены. Таким образом, были измерены концентрации в сыворотке крови цитокинов у кардиохирургических больных. МВС, а также CXCL12 и CXCL8 показали значительное интраоперационной увеличение. При переводе этих результатов обратно в экспериментах в пробирке, настоящие результаты показали , что не существует ни CXCL12- , ни CXCL8-опосредованный эффект на миграцию EPC на измеренных физиологических концентрациях в пробирке. Используя описанную модель изоляции EPC и последующего анализа миграции, MIF был идентифицирован как преобладающего медиатора EPC миграции 42. В этом контексте, Kanzler и др. продемонстрировано в экспериментальной модели на мышах , что MIF и СЭФР обеспечивают наиболее сильное влияние на миграцию ЕРС при гипоксии 23. Интересно отметить, что измерения СЭФР показывают, что не существует значительного интраоперационный изменения в крови концентрации VEGF, которые могут возникнуть в результате связывания Oе VEGF к интраоперационной стандартизированного применения гепарина. Таким образом, MIF может играть доминирующую роль среди ангиогенных хемокинов при наборе ЕРС у кардиохирургических больных и может инициировать и вносить свой вклад в процесс заживления после инфаркта I / R через торговлю ЕРС к месту травмы 43, 44 Между тем, как уровни MIF увеличился сразу после инфаркта I / R, остается спекулятивным ли MIF-опосредованный эффект на наборе ЕРС может влиять на ремоделирования сердца и кровеносных сосудов, которые имеют существенное значение в профилактике сердечной недостаточности после инфаркта I / R 23. Тем не менее, прежде чем перейти к такому анализу, важно, чтобы в дальнейшем характеризуют различные подтипы ЭПК и оценить его функциональную роль в биологии человека. В связи с этим, настоящее протокол обеспечивает надежный способ, как изолировать ЕРС из периферической крови человека, с тем чтобы ят.с. дополнительно комплексную характеристику и будущих исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы не имеют никаких подтверждений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibronectin | Biochrom AG | L7117 | Coating of T-75 flasks |
| Aqua ad iniectabilia | Fresenius Kabi | ||
| Endothelial cell growth medium MV2 | Promo Cell | C-22221 | |
| Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix | Promo Cell | C-39226 | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | Density centrifugation |
| EasySep human CD34 positive Selection Kit | Stemcell Technologies | 18056 | Isolation of CD34+ cells |
| EasySep magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Detachment of cells |
| Corning HTS transwell 96 well permeable supports | Sigma-Aldrich | CLS3387-8EA | Migration system |
| Hoechst solution | ThermoFisher | 33342 | Staining of migrated cells |
| ImageJ | National institutes of health | xxx | Counting of migrated cells |
References
- Emontzpohl, C., et al. Key role of MIF in the migration of endothelial progenitor cells in patients during cardiac surgery. Int J Cardiol. 181C, 284-287 (2014).
- Smadja, D. M., et al. Interleukin 8 is differently expressed and modulated by PAR-1 activation in early and late endothelial progenitor cells. J Cell Mol Med. 13 (8B), 2534-2546 (2009).
- Asahara, T., et al. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science. 275 (5302), 964-967 (1997).
- Simons, D., et al. Hypoxia-induced endothelial secretion of macrophage migration inhibitory factor and role in endothelial progenitor cell recruitment. J Cell Mol Med. 15 (3), 668-678 (2011).
- Dernbach, E., et al. Antioxidative stress-associated genes in circulating progenitor cells: evidence for enhanced resistance against oxidative stress. Blood. 104 (12), 3591-3597 (2004).
- Yang, Z., et al. Paracrine factors secreted by endothelial progenitor cells prevent oxidative stress-induced apoptosis of mature endothelial cells. Atherosclerosis. 211 (1), 103-109 (2010).
- Asahara, T., Kawamoto, A., Masuda, H. Concise review: Circulating endothelial progenitor cells for vascular medicine. Stem Cells. 29 (11), 1650-1655 (2011).
- Schmidt-Lucke, C., et al. Reduced number of circulating endothelial progenitor cells predicts future cardiovascular events: proof of concept for the clinical importance of endogenous vascular repair. Circulation. 111 (22), 2981-2987 (2005).
- Yoder, M. C. Human endothelial progenitor cells. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006692 (2012).
- Ito, H., et al. Endothelial progenitor cells as putative targets for angiostatin. Cancer Res. 59 (23), 5875-5877 (1999).
- Hill, J. M., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function, and cardiovascular risk. N Engl J Med. 348 (7), 593-600 (2003).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Rohde, E., et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells. Stem Cells. 24 (2), 357-367 (2006).
- Rohde, E., et al. Immune cells mimic the morphology of endothelial progenitor colonies in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1746-1752 (2007).
- Prokopi, M., et al. Proteomic analysis reveals presence of platelet microparticles in endothelial progenitor cell cultures. Blood. 114 (3), 723-732 (2009).
- Voyta, J. C., Via, D. P., Butterfield, C. E., Zetter, B. R. Identification and isolation of endothelial cells based on their increased uptake of acetylated-low density lipoprotein. J Cell Biol. 99 (6), 2034-2040 (1984).
- Koch, S., Claesson-Welsh, L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006502 (2012).
- Hirschi, K. K., Ingram, D. A., Yoder, M. C. Assessing identity, phenotype, and fate of endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (9), 1584-1595 (2008).
- Hur, J., et al. Characterization of two types of endothelial progenitor cells and their different contributions to neovasculogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (2), 288-293 (2004).
- Tagawa, S., et al. Determination of Early and Late Endothelial Progenitor Cells in Peripheral Circulation and Their Clinical Association with Coronary Artery Disease. Int J Vasc Med. , 2015 (2015).
- Bernhagen, J., et al. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13 (5), 587-596 (2007).
- Stoppe, C., et al. Interaction of MIF Family Proteins in Myocardial Ischemia/Reperfusion Damage and Their Influence on Clinical Outcome of Cardiac Surgery Patients. Antioxid Redox Signal. 23 (11), 865-879 (2015).
- Kanzler, I., et al. Differential roles of angiogenic chemokines in endothelial progenitor cell-induced angiogenesis. Basic Res Cardiol. 108 (1), 310 (2013).
- Walenta, K. L., Bettink, S., Bohm, M., Friedrich, E. B. Differential chemokine receptor expression regulates functional specialization of endothelial progenitor cell subpopulations. Basic Res Cardiol. 106 (2), 299-305 (2011).
- Rassaf, T., Weber, C., Bernhagen, J. Macrophage migration inhibitory factor in myocardial ischaemia/reperfusion injury. Cardiovasc Res. 102 (2), 321-328 (2014).
- Stoppe, C., et al. High postoperative blood levels of macrophage migration inhibitory factor are associated with less organ dysfunction in patients after cardiac surgery. Mol Med. 18, 843-850 (2012).
- Amin, M. A., et al. Migration inhibitory factor mediates angiogenesis via mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol kinase. Circ Res. 93 (4), 321-329 (2003).
- Kupatt, C., et al. Embryonic endothelial progenitor cells expressing a broad range of proangiogenic and remodeling factors enhance vascularization and tissue recovery in acute and chronic ischemia. FASEB J. 19 (11), 1576-1578 (2005).
- Colotta, F., et al. Expression of a monocyte chemotactic cytokine by human mononuclear phagocytes. J Immunol. 148 (3), 760-765 (1992).
- Casale, T. B., Kaliner, M. A rapid method for isolation of human mononuclear cells free of significant platelet contamination. J Immunol Methods. 55 (3), 347-353 (1982).
- Lewandowska, K., Kaplan, D., Husel, W. CD34 expression on platelets. Platelets. 14 (2), 83-87 (2003).
- Stellos, K., et al. Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. Circulation. 117 (2), 206-215 (2008).
- Thornton, M. A., Poncz, M. In vitro expansion of megakaryocytes from peripheral blood hematopoietic progenitors. Methods Mol Med. 31, 337-345 (1999).
- Ivetic, N., et al. Producing megakaryocytes from a human peripheral blood source. Transfusion. 56 (5), 1066-1074 (2016).
- Friedrich, E. B., Walenta, K., Scharlau, J., Nickenig, G., Werner, N. CD34-/CD133+/VEGFR-2+ endothelial progenitor cell subpopulation with potent vasoregenerative capacities. Circ Res. 98 (3), e20-e25 (2006).
- Wijelath, E. S., et al. Novel vascular endothelial growth factor binding domains of fibronectin enhance vascular endothelial growth factor biological activity. Circ Res. 91 (1), 25-31 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Yao, E. H., et al. Effects of the antioxidative beta-blocker celiprolol on endothelial progenitor cells in hypertensive rats. Am J Hypertens. 21 (9), 1062-1068 (2008).
- Takahashi, T., et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat Med. 5 (4), 434-438 (1999).
- Kawamoto, A., et al. Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation. 103 (5), 634-637 (2001).
- Kim, B. S., et al. Myocardial Ischemia Induces SDF-1alpha Release in Cardiac Surgery Patients. J Cardiovasc Transl Res. 9 (3), 230-238 (2016).
- Frangogiannis, N. G., Smith, C. W., Entman, M. L. The inflammatory response in myocardial infarction. Cardiovasc Res. 53 (1), 31-47 (2002).
- Zernecke, A., Bernhagen, J., Weber, C. Macrophage migration inhibitory factor in cardiovascular disease. Circulation. 117 (12), 1594-1602 (2008).
- White, D. A., et al. Pro-inflammatory action of MIF in acute myocardial infarction via activation of peripheral blood mononuclear cells. PLoS One. 8 (10), e76206 (2013).
