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Medicine

Uso di un modello di maiale per lo studio della neurotossicità dello sviluppo sviluppato da anestetici (AIDN): un approccio di neuroscienza transazionale

Published: June 11, 2017 doi: 10.3791/55193

Summary

La ricerca sulla neurotossicità dello sviluppo sviluppata da anestesia (AIDN) si è concentrata sui roditori, che non sono generalmente applicabili agli esseri umani. I modelli primati non umani sono più rilevanti, ma sono proibitivi e difficili da utilizzare per la sperimentazione. Il maiale, al contrario, è un modello animale clinicamente rilevante e pratico ideale per lo studio della neurotossicità anestetica.

Abstract

L'anestesia non può essere evitata in molti casi quando è richiesta la chirurgia, in particolare nei bambini. Recenti indagini sugli animali hanno suscitato preoccupazioni che l'esposizione dell'anestesia può portare all'apoptosi neuronale, nota come neurotossicità dello sviluppo (AIDN) indotta da anestesia. Inoltre, alcuni studi clinici nei bambini hanno suggerito che l'esposizione di anestesia può portare a deficit neurodevelopmental più tardi nella vita. Tuttavia, un modello animale ideale per lo studio preclinico deve ancora essere sviluppato. Il porcellino neonatale rappresenta un modello prezioso per lo studio preclinico, in quanto condivide un numero impressionante di somiglianze di sviluppo con gli esseri umani.

L'anatomia e la fisiologia dei suinetti permettono l'attuazione di rigorose condizioni perioperatorie umane sia nelle procedure di sopravvivenza che di sopravvivenza. La cateterizzazione dell'arteria femorale consente un monitoraggio stretta, consentendo così una rapida correzione di qualsiasi deviazione dei segni vitali e delle sostanze chimiche del porcellino. ioInoltre, esistono molteplici similitudini di sviluppo tra i suinetti ei neonati umani. Le tecniche necessarie per utilizzare i suinetti per la sperimentazione richiedono l'esperienza di padroneggiare. Un anestesista pediatrico è un membro critico della squadra investigativa. Descriviamo, in senso generale, l'uso appropriato di un modello di porcellino per lo studio neurodevelopmental.

Introduction

Ogni anno, milioni di bambini negli USA ricevono anestesia generale, molti dei quali sotto i 4 anni 1 . La neurotossicità dello sviluppo sviluppata da anestetici (AIDN) è diventata un punto focale della ricerca sull'anestesia pediatrica, poiché è diventato imperativo acquisire una comprensione degli effetti dell'anestesia su cervelli immaturi. Precedenti ricerche hanno dimostrato che anestetici comunemente usati, come l'isoflurano, possono causare una maggiore apoptosi neuronale nei cervelli dei giovani animali. Gli studi nei bambini hanno dato risultati equivocali 2 . Comprendere la patogenesi di AIDN, individuare potenziali bersagli terapeutici per la sua prevenzione o miglioramento e descrivere i regimi più anestetici disponibili sono diventati obiettivi urgenti della comunità di anestesia pediatrica. Lo scopo primario di questo studio era quello di sviluppare un modello e un metodo di animazione ottimali per quantificare gli effetti degli anestetici sul cervello in via di sviluppo e stimolare con attenzioneStudiato sulla sicurezza degli anestetici attualmente ampiamente utilizzati.

In una recente revisione sistematica del corpo attuale della letteratura preclinica su AIDN, gli autori hanno rilevato un'eterogeneità metodologica significativa in oltre 900 studi 3 . Molti considerarono questo un invito ad un modello preclinico clinicamente rilevante e ben progettato, che non esiste ancora nonostante diversi anni di ricerca su questo argomento. La maggior parte dei modelli di roditori, per necessità, utilizza un approccio che non consente rigoroso monitoraggio fisiologico, campionamento del sangue o ventilazione meccanica. Dal momento che il cervello è squisitamente sensibile ai derangimenti fisiologici, è difficile fare affidamento sui risultati di tali modelli. Un obiettivo primario per lo sviluppo di questo modello è stato quello di progettarlo in modo che tutte le variabili fisiologiche quali i parametri del gas sangue, la temperatura corporea, i parametri respiratori, ecc. Siano monitorati e corretti quando necessario.

4 . Il modello di pigleta traslatoria fornisce il livello di rilevanza clinica richiesto in queste revisioni e redazioni, in quanto è stato progettato per affrontare questa necessità di dati preclinici pertinenti che possono informare i futuri studi clinici.

Isoflurane, un agonista del recettore GABA tipo A (GABA A ) e recettore debole del recettore NMDA, è un anestetico inalato comunemente usato nella pratica clinica in tutto il mondo. Anestetici come l'isoflurano sono stati considerati sicuri finché non inducono ipotensione o ipossia; Tuttavia, possono verificarsi effetti più sottili. Quando il cervello è esposto ad anestesia generale, l'equilibrio di GABA aIl gonismo e l'antagonismo del NMDA sono interrotti, provocando alterazioni nell'architettura cellulare, nella connettività e nella funzione. Inoltre, mentre GABA è generalmente un neurotrasmettitore inibitorio, è noto essere eccitatorio nei cervelli immaturi 5 . Proprio quando la transizione da GABA da eccitatorio a inibitore non è ben capita, ed è probabilmente dipendente dalla specie.

Quando uno squilibrio tra input eccitatorio e inibitorio nel cervello si verifica durante il cosiddetto "spurt di crescita del cervello", la conseguente disfunzione eccitotossica dei percorsi molecolari critici può portare a neurodevelopment anormale, come la neurodegenerazione apoptotica. Oltre all'aumentata apoptosi, può anche essere indotto lo stress ossidativo e l'infiammazione, mentre la proliferazione cellulare neuronale, la migrazione neuronale e l'arborizzazione assonale diventano soppressi o disregolati 6 . Il risultato netto è disturbi neurocognitivi che possono persistere in adulTamburo 2 .

Per misurare direttamente gli effetti neurotossici dell'isoflurano nei giovani mammiferi, vengono utilizzati suinetti neonatali. Le porcellini condividono altre somiglianze con gli esseri umani rispetto a qualsiasi altro mammifero e, in quanto tali, le loro somiglianze neurodevelopmentali e neuroanatomiche li rendono un animale ideale per un modello mammifero clinicamente rilevante di AIDN. Sia gli esseri umani che i suinetti hanno cervello cerebrale, condividendo somiglianze nel carattere e nella distribuzione del cervello, della materia grigia e della materia bianca. L'ippocampo dei porcellini, i gangli basali e il tronco cerebrale sono anche topograficamente simili a quelli dell'uomo 7 . Sviluppamente, i suinetti sono uno dei pochi mammiferi non umani che subiscono la crescita e la mielinazione del cervello perinatale 8 . Nell'utero, sia il cervello umano che il porcellino subiscono una crescita significativa durante la gestazione del trimestre trimestrale. In correlazione, alla nascita, i cervelli umani e porcellini sono rispettivamente del 27% e del 25% dei cervelli adulti. La formazione di immagini di risonanza magnetica ha rivelato che un cervello di porcellino di una settimana è circa equivalente a un cervello umano di un mese in termini di maturazione neuronale e arborizzazione dendritica 9 . Inoltre, il porcellino e il cervello umano condividono numerose somiglianze rispetto agli schemi del neurodevelopment. Ad esempio, l'espressione e la sequenza mRNA di reelin 10 , la distribuzione topografica dei neuroni 5-HT 11 e la chiusura del tubo neurale 12 sono tutte parallele a quelle che si vedono negli esseri umani. Inoltre, esiste un'ampia omologia tra i genomi dei suinetti e degli esseri umani 13 .

La rilevanza di un modello animale deve essere intesa nel contesto della patologia umana, in particolare in relazione alla maturità cerebrale e alla pathobiologia del bambino umano. La maggior parte degli studi sull'anestesia esistente utilizza un modello di roditore, con pochi utilizzatori non umaniModelli primati. Tuttavia, i roditori ei primati non possono essere gli animali ideali per indagare l'AIDN.

Anche se ampiamente usati, i cervelli del roditore sono molto diversi da quelli dell'uomo durante lo sviluppo. In particolare, i roditori hanno cervello lissencephalic (o liscio). Il cervello del roditore manca di gyri e sulci che sono caratteristici di organismi complessi più neurologicamente complessi. Il cervello del roditore subisce anche una crescita di cervello postnatale 14 , diverso dagli umani e dai suinetti. È stato osservato che esistono variazioni nella vulnerabilità delle diverse regioni del cervello all'anestesia inalata 15 . Pertanto, dovrebbe essere importante che il modello animale per lo studio di AIDN possieda un cervello neurodevelopmentally e neuroanatomically simile a quello di un essere umano, in modo da modellare al meglio le alterazioni cerebrali indotte da anestesia che si possono vedere nei pazienti pediatrici. Come descritto in precedenza, i suinetti hanno un cervello che iS molto più adatto per questo ruolo. Inoltre, le forme comuni di sperimentazione neurocognitiva dei roditori, come l'apprendimento spaziale e la memoria valutata nel labirinto dell'acqua di Morris, non sono direttamente rilevanti o paragonabili alle valutazioni neurocognitive nei bambini piccoli 16 . Uno dei vantaggi dell'utilizzo di suinetti per la neuroscienza allo sviluppo è che sono estremamente adatti ai test neurocognitivi, anche in età precoce. Numerosi test neurocognitivi ritenuti utili per altre specie di mammiferi sono stati utilizzati con successo e validati nei suini. Mentre è ancora un campo in continua evoluzione, la valutazione neurocognitiva nei suinetti comprende test più complessi che meglio imitano i deficit umani, come un test a motori a inclinazione 17 , 18 e la prova di coscienza spaziale 19 . La prova del motore con il fascio inclinato, come parte dello studio traumatico di lesioni cerebrali nei suinetti, mostra un'elevata affidabilità nella valutazioneDella funzione motore. Il test dello specchio dimostra la memoria dell'ambiente circostante e il riconoscimento e l'utilizzo di un'immagine riflessa per cercare la ricompensa alimentare.

D'altra parte, i primati non umani possono essere un modello più appropriato per gli studi di anestesia pediatrica, ma ci sono una serie di fattori proibitivi, compresi i costi e la difficoltà di utilizzo. Inoltre, essi sono estremamente sensibili alle condizioni di allevamento precoce, in particolare lo stress e la separazione materna 20 . I fattori importanti per lo studio di AIDN, come i modulatori allosterici, le affinità dei recettori-ligandi, le modificazioni post-traduzionali, le composizioni di subunità di recettori e le varianti di splicing alternative, sono ignoti nel caso dei primati. Questo perché i geni rilevanti per tali concetti non sono stati clonati. Al contrario, sono stati clonati nei suini. In quanto tale, è stato fatto solo un lavoro limitato nei primati non umani 21 , 22

Il modello di maiale capitalizza i vantaggi dei modelli primati di roditore e non umano: è conveniente, facile da usare rispetto agli studi primati non umani ed è neuroanatomicamente e neurofisiologicamente simile al cervello umano pediatrico. Negli ultimi anni l'impiego del porcellino nella ricerca di neuroscienze è cresciuto, tra cui alcuni studi che hanno esaminato le condizioni neuroinfiammatori pediatriche. Gli effetti dell'infezione virale respiratoria sull'ippocampo e sull'apprendimento spaziale 23 , riducendo la morte delle cellule cerebrali dopo l'ictus 24 , la neurogenesi dopo la lesione traumatica del cervello 25 e l'attività enzimatica durante le crisi 26 sono alcuni degli studi che hanno utilizzato suinetti neonatali. Questo materiale sostanziale e crescente di letteratura attribuisce forza all'adeguatezza e alla sostenibilità del modello pigletico clinicamente rilevante e altamente riproducibile per lo studio dell'anestemaSia neurotossicità indotta.

Protocol

Suini sani, domestici ( Sus scrofa) sono ottenuti da una fattoria approvata dal Comitato Istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Ohio State University. Tutte le sperimentazioni sugli animali vengono eseguite in conformità con l'Ohio State University IACUC, dopo l'approvazione del protocollo.

1. Animali e movimentazione animale

  1. Usa i maiali maschi in questo esperimento per eliminare i potenziali effetti confondenti del sesso. NOTA: Se gli obiettivi sperimentali includono la valutazione degli effetti dell'esperimento sugli animali, nel periodo di massima crescita del cervello, non utilizzare maiali di età superiore ai 14 giorni.
  2. Pianificare i porcellini per arrivare nel vivarium almeno 24 ore prima della sperimentazione per consentire l'acclimatazione all'ambiente.
    NOTA: i tecnici veterinari addestrati sotto la supervisione dei veterinari autorizzati forniscono una cura di routine per gli animali.
    1. Mantenere i suinetti in gabbie individuali controllate dalla temperatura e dare un nutritioNally completa, sostituzione del latte di maiale commerciale ad libitum. Fornire gli animali con una coperta e un giocattolo. Monitorare continuamente la temperatura nelle casse per animali.
  3. Per questo studio preliminare di fattibilità, sono stati utilizzati 18 suinetti per il braccio isoflurano e 22 suinetti per il braccio di controllo. Esegui i calcoli della dimensione del campione in base al disegno dello studio quando possibile. Randomizzare i suinetti disponibili per il gruppo di controllo o di esposizione per la durata appropriata di esposizione. Dall'esperienza, anche con più investigatori, si aspettano di essere in grado di eseguire non più di 2 esperimenti al giorno (2 animali totali).

2. Controlli gli animali

  1. Non eseguire interventi sperimentali sugli animali di controllo.
  2. Indurre un'anestesia generale profonda attraverso la maschera cono per la procedura di perfusione e di raccolta dei tessuti. In particolare, dopo il periodo di acclimatazione di 24 ore, anestetizzano i suinetti con 5% isoflurano o 8% sevoflurano in 100% ossigeno <Em> tramite la maschera cono. Non utilizzare desflurane per l'induzione.
    NOTA: Il tempo tra l'induzione dell'anestesia e l'istituzione di perfusione a freddo di PBS dovrebbe essere il più breve possibile. I tecnici esperti possono completare questo processo in meno di 5 minuti.
    1. Confermare l'adeguata profondità dell'anestesia per mancanza di riflesso dewclaw-pinch utilizzando un morsetto chirurgico.
    2. Per evitare insulti ipossici / ischemici al cervello, controllare il porcellino utilizzando un impulso ossimetrico per garantire la manutenzione di una adeguata ossigenazione, ventilazione e uscita cardiaca fino alla perfusione della salina fredda fosfata tamponata (PBS).
      NOTA: Per fornire una protezione aggiuntiva contro i danni ai tessuti, imballare l'animale (compreso il capo) in ghiaccio dopo l'induzione dell'anestesia.
  3. Effettuare una perfusione transcardia.
    NOTA: perché viene utilizzata la paraformaldeide, la procedura di perfusione deve essere eseguita sotto una cappa di fumo o su un tavolo downdraft.
    1. Fare una craniocaudale iNcision lungo la lunghezza dello sternum usando un bisturi. La profondità dell'incisione dovrebbe essere sufficiente per esporre lo sterno.
    2. Attentamente, eseguire una sternotomia di midline con un paio di forte forbici pesanti, evitando danni al cuore, ai polmoni o al diaframma. Se necessario, posizionare un dito posto tra l'aspetto posteriore dello sternum e il contenuto intrathoracico per evitare lesioni. Manovrare un dito nel mediastino facendo una piccola incisione (dito-misura) nel diaframma.
    3. Dopo aver inserito la cavità toracica, tenere la gabbia della cavità aperta usando un retrattore di autoritratto.
    4. Incise il pericardio con pinze e un paio di forbici, esponendo il cuore battente. Usare cautela per non danneggiare il cuore.
    5. Identificare il ventricolo sinistro e posizionare con cura un cannula (ad esempio un angiotetro 14 G) attraverso l'apice del ventricolo. Rimuovere l'ago lasciando il catetere in posizione.
      NOTA: Fare attenzione a non forare la parete posteriore del ventricolo.Il ritorno di sangue pulsato dal catetere indica che è correttamente posizionato. Il sangue può essere facilmente prelevato dall'animale a questo punto.
    6. Dopo aver identificato l'atrio corretto, eseguire un'atriotomia facendo una grande incisione nell'atrio con forbici per consentire l'espansione e la fuga del perfusato.
      NOTA: L'isluranio per via inalatoria deve essere continuato fino alla conferma della morte cardiaca. La morte cardiaca è confermata dalla mancanza diretta della produzione cardiaca.
  4. Perfuse il porcellino utilizzando un perfusato costituito da freddo (4 ° C) salina fosfato-tamponata (PBS) contenente eparina a una concentrazione di 5 unità per ml. Perfusione a 300 mL per min per 5 minuti o fino a quando la soluzione scorre chiara.
    1. Usate cautela che la cannula di perfusione non diventa dislocata durante la perfusione. Utilizzare una pompa peristaltica commercialmente disponibile per questa e per tutte le altre perfusioni.
  5. Effettuare una hemicraniectomy per reSpostare un emisfero del cervello per l'analisi dei tessuti freschi.
    NOTA: Questo protocollo consente di recuperare un emisfero di nuovi tessuti cerebrali. L'altro emisfero è fisso. Se non è necessario un tessuto fresco, passare al punto 2.6.
    1. Durante questa procedura, continuare la circolazione di PBS ghiacciata a una velocità di 50 ml all'ora per assicurare che il cervello rimanga freddo.
    2. Effettuare un'incisione longitudinale nel cuoio capelluto lungo la lunghezza della sutura sagittale fino al foro magnum usando un bisturi. Durante il processo, utilizzare una solida pressione per creare un punteggio nel cranio. Riflettere il cuoio capelluto per esporre l'intero cranio.
    3. Utilizzando i rongeurs e cominciando dal foramen magnum, rimuovere il cranio da un lato inserendo i rongeurs tra il cranio e il dura mater, prendendo attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale sottostante. Rimuove l'osso in pezzi, usando i rongeurs per farla allontanare dal parenchima del cervello.
    4. Una volta che il cranio è stato rimosso, incise e rimuove il duRa mater usando le pinze e le forbici, facendo ancora attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale sottostante.
    5. Mettere una lama di bisturi tra i due emisferi per dividere con cautela il callosum corpus.
    6. Utilizzando uno strumento piatto come l'estremità del manico della pinza, ritirare delicatamente il lobo frontale, gradualmente tagliando i nervi cranici, lavorando anteriormente alla parte posteriore. All'aspetto più posteriore dell'emisfero, utilizzare un bisturi per tagliare il midollo spinale. Rimuove l'emisfero in blocco.
      NOTA: Il tessuto cerebrale non fisso è fragile. Usare cautela quando si rimuove l'emisfero per prevenire la rottura dell'alimentazione sanguigna dell'emisfero residuo.
    7. Sezione l'emisfero rimosso. Se indicato, immediatamente congelare il flash in 2-metilbutano raffreddato a -160 ° C in un bagno di azoto liquido per evitare la rottura del tessuto e immagazzinare immediatamente a -80 ° C per ulteriori analisi.
      NOTA: Raccomandiamo la sezione coronale del cervello in incrementi di 2 mm utilizzando una matrice, ma dettagli specificiLa sezione di sezione dipenderà da specifici obiettivi sperimentali.
  6. Cambiare il perfusato al 4% di paraformaldeide (PFA). Continuare la perfusione PFA a 300 ml al minuto per almeno 5 minuti.
    ATTENZIONE! PFA è tossico, evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. Non inalare i fumi PFA.
  7. Aspetta che il corpo del porcellino si irrigidisca a causa della formazione di crogioli di aldeide che si creano nel muscolo. Una volta completata la perfusione del PFA, rimuovere l'emisfero rimanente in modo identico a quello descritto al passaggio 2.5.5.
    NOTA: Il cervello perfettamente perfuso sarà pallido e completamente espirato.
    1. Posizionare l'emisfero residuo in un piccolo contenitore con PFA fresco al 4% a 4 ° C. Mantenere l'emisfero in PFA per 24-48 h per completare il processo di fissaggio.
    2. Dopo 24-48 h, spostare il cervello fisso in una soluzione di PBS contenente 0,1% di sodio azide, in quanto è essenziale per prevenire l'eccesso di fissazione. La sovra-fissazione potrebbe provocare un massaggioRe dell'epitopo o forti colorazioni non specifiche di fondo. L'aggiunta di sodio azide impedisce la crescita batterica.
      NOTA: Il tessuto può essere conservato fino a un mese a 4 ° C.

3. Animali Isoflurane (Sperimentali)

NOTA: può essere utilizzato qualsiasi anestetico o intervento, ma non si consiglia desflurane per l'induzione di inalazione.

  1. Induzione e manutenzione dell'anestesia:
    1. Eseguire l'anestesia usando una stazione di lavoro di anestesia clinica dotata di un ventilatore pediatrico e di dispositivi di monitoraggio.
    2. Dopo il periodo di acclimatazione di 24 ore, anestetizza i suinetti con 8% di sevoflurano in 100% O 2 tramite la maschera a cono.
    3. Monitorare continuamente l'ossimetria dell'impulso, la pressione sanguigna non invasiva, l'elettrocardiografia e la temperatura durante il periodo di induzione e in ogni momento durante la procedura di studio.
    4. Dopo l'induzione, titolare sevoflurano o isofluRana a una concentrazione che permette una adeguata profondità di anestesia, garantendo una resistenza spontanea sostenuta (tipicamente a una concentrazione del 3-4%).
    5. Mettere un catetere intravenoso periferico 24 G nella vena marginale dell'orecchio ( Figura 1 ).
    6. Posizionare il porcellino nella posizione di recupero dorsale per l'intubazione tracheale ( Figura 2 , pannello A). Utilizzare una lama Miller # 1 o # 1.5 per facilitare la strumentazione dell'ipofaringe e dell'intubazione della trachea. NOTA: Durante la laringoscopia sono necessari un operatore e un assistente esperti.
      1. Avere un assistente spostare la lingua dell'animale usando una garza secca per facilitare l'esposizione della laringe e la visualizzazione delle corde vocali ( Figura 2 B ).
        NOTA: L'epiglotta del porcellino è morfologicamente simile a quella dell'uomo ( Figura 2 C ). Il vocal corpDs può essere difficile da visualizzare in quanto sono diversi millimetri profondamente all'interno dell'entrata laringea ( Figura 2 D ).
      2. Spostare l'epiglotta: posizionare la punta della laringoscopia sotto l'epiglotta e sollevare la lama verso l'alto per esporre la laringe.
      3. Prima di posizionare il tubo nella trachea, spruzzare le corde vocali con 0.5 mL di lidocaina al 2% per prevenire il laringospasmo durante il passaggio del tubo endotracheale, poiché i suinetti sono particolarmente inclini al laringoscasmo.
    7. Posizionare e fissare un tubo tracheale a cuffia da 3,0 mm.
      1. Assicurare il suono bilaterale e l'anidride carbonica sostenuta con l'ausculazione del petto con uno stetoscopio e un monitoraggio di EtCO 2 .
      2. Gonfiare i polmoni del porcellino a una pressione continua della via aerea di 20 cm H 2 O. Quindi, gonfiare il bracciale del tubo endotracheale alla pressione minima necessaria per prevenire perdite d'aria ad una pressione di 20 cm H NOTA: questo è importante per prevenire l'ischemia della mucosa durante la ventilazione a pressione positiva intermittente.
      3. Normossia e normocarbia sono mantenute durante l'anestesia.
    8. Avviare la somministrazione di 2% di isoflurano in 50% di ossigeno / 50% di aria. Titra ossigeno per mantenere PaO 2 di 90-100 mmHg. Continuare per 3 ore (o desiderata durata sperimentale).
    9. Applicare unguento oculare sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  2. Iniziare la cateterizzazione dell'arteria femorale dopo l'inizio del 2% isoflurano.
    1. Amministrare pre-incisione di antibiotici ad ampio spettro (cefazolina, 25 mg / kg) attraverso la linea endovenosa periferica per prevenire l'infezione del sito chirurgico.
    2. Sterilizzare entrambi gli intestini usando la chlorhexidine colorata per garantire il corretto campo sterile e mettere un appropriato tetto sterile ( Figura 3 B ). Al minimo, il personale che partecipa alla chirurgia di sopravvivenza deve indossare un tappo chirurgico, maschera, guanti sterili e protezione agli occhi.
    3. Palpate l'impulso femorale alla piega inguinale utilizzando l'indice e le dita medie.
    4. Fai un'incisione superficiale, 1,5 cm, craniocaudale usando un bisturi ( Figura 3 C ).
    5. Il cervello tra le due teste del muscolo gracilis usando uno strumento sbilanciato, come l'emostato chirurgico o forbici a punta smussata ( Figura 3 D ).
      NOTA: Il fascio neurovascolare femorale si trova in genere tra due muscoli. ( Figura 4 A ).
    6. Usando gli anelli vascolari oi legami di seta, isolare l'arteria in prossimità e distale. Utilizzare il ciclo per tirare l'arteria fino al livello della pelle distalmente ( Figura 4 B ).
    7. MentrePosizionando la trazione sul legame prossimale sufficiente a interrompere il flusso sanguigno, fanno una piccola arteriotomia con una coppia di forbici tenotomiche.
      1. Prestare attenzione a non attraversare l'arteria. Una piccola arteriotomia è sufficiente. In alternativa, utilizzare un approccio a ago e filo per accedere all'arteria ( Figura 4 C ).
      2. La trazione dolce sulla cravatta prossimale impedirà una perdita di sangue eccessiva in qualsiasi punto durante questa parte della procedura. Se si utilizza l'approccio a filo e ago, passare il cavo di guida (fornito con il kit o ottenuto separatamente) attraverso l'ago e nell'arteria fino a 5 cm.
      3. Prestare attenzione a non far avanzare il filo in quanto può causare ectopatie ventricolari. Se questo si verifica, estrarre immediatamente il filo da 1-2 cm.
    8. Rimuovere l'ago dalla vasca, facendo attenzione a lasciare il filo di guida nella vasca. Passare delicatamente il catetere sul filo e nel recipiente ( Figura 4
    9. Utilizzare un catetere da 3 cm, 8 centimetri per la cateterizzazione dell'arteria femorale. Aspetta una resistenza lieve quando la punta del catetere entra per la prima volta nella parete superficiale della vasca.
  3. Se si utilizza l'approccio arteriotomia, avanzare il catetere o il tubo in polietilene direttamente nel vaso. Il ritorno di sangue deve essere osservato immediatamente.
  4. Collegare immediatamente il catetere collegato a un trasduttore di pressione. Lavare il catetere con una normale soluzione salina per mantenere la catenaria.
    1. Posizionare le suture per fissare il catetere in posizione. Coprire l'incisione con garza sterile per evitare contaminazioni. Utilizzare un approccio percutaneo alla cateterizzazione delle arterie femorali.
      NOTA: Assicurarsi che l'ultrasuono sia eseguito da un tecnico esperto.
  • Condizioni intraoperatorie e monitoraggio:
    1. Lavare attivamente il porcellino con un dispositivo di riscaldamento a pressione forzata e monitorare continuamenteTemperatura rettale ( Figura 3 A ).
    2. Infondere il liquido isotonicico contenente dextrose (5% di dextrose nel lattato di Ringer o in soluzione salina normale) a tasso di mantenimento (4 volte il peso del pettorale in chilogrammi, ml / h).
    3. Monitorare i segni vitali per le perturbazioni (ipotensione, aritmia, ipo / ipertermia, ipossia)
      NOTA: Le tabelle di segni vitali normali e la corrispondente gestione suggerita in caso di anomalie sono riassunte nella tabella 1 .
    4. Utilizzando un sistema di analisi del sangue disponibile in commercio, misurare i gas ematici arteriosi (pH arterioso, pCO 2 , pO 2 ), elettroliti (bicarbonato, eccesso / deficit di base, sodio, potassio, calcio ionizzato), emoglobina e glucosio almeno durante l'esame sperimentale periodo. Disegna il campione di sangue arterioso dal catetere dell'arteria femorale.
      NOTA: Valori normali di acido-base e elettroliti insieme a raccomandazioni per la correzione se si osservano anomalie aRi riassunti nella tabella 1 .
  • Dopo 3 ore di esposizione isoflurana, rimuovere il catetere dell'arteria femorale.
    1. Attenersi accuratamente alla seta vascolare prossimale per occludere permanentemente l'arteria femorale per evitare sanguinamenti. In alternativa, utilizzare una clip vascolare.
    2. Assicurare l'emostasi completa prima di chiudere l'incisione. Irrigare l'incisione con 10-20 ml di soluzione salina sterile per prevenire l'infezione.
  • Alla conclusione dell'esperimento, chiudere l'incisione cutanea con suture semplici e interrotte usando un materiale da sutura non assorbibile da 3-0.
    1. Infiltrare la ferita usando 0.5-1 mL / kg di bupivacaine 0.25% con 1: 200.000 epinefrina per il controllo del dolore. Indossare l'incisione con un adesivo cutaneo sterile e chirurgico.
      NOTA: Non è necessaria alcuna vestizione.
  • Interrompere l'anestetico e lasciare che il maiale si risveglia.
  • Rimuovere il tubo endotracheale sui segni di awa(Apertura degli occhi, tentativi di stare, calci, apertura e chiusura della bocca), con segni di emodinamica stabile, adeguata ossigenazione e adeguata ventilazione.
  • Dopo l'estubazione, alimentare l'ossigeno supplementare attraverso il cono di faccia fino ad assicurare un'adeguata ossigenazione e ventilazione.
  • Amministrare buprenorfina 0.05 mg / kg sottocutanea per un ulteriore controllo del dolore. In alternativa, può essere utilizzato fentanil transdermico.
  • Se necessario, riportare il maiale alla sua gabbia. Non lasciare il porcellino incustodito finché non ha ripreso sufficiente coscienza per mantenere la ricostruzione sternale. Non restituire un animale ad una gabbia con altri animali fino a quando non sia completamente recuperato dall'anestesia.
    1. Attivamente riscaldare la gabbia privata con una luce di riscaldamento.
    2. Monitorare attentamente l'animale dopo anestesia da personale veterinario o ricercato. Fornire il sostituitore del latte di maiale.
  • Lasciare che i suinetti si riprendanoPer 48-72 h, a seconda degli obiettivi sperimentali.
    1. Iniettare i suinetti con buprenorfina sottocutanea ad una dose appropriata, ogni tre ore come necessario per assicurare il controllo del dolore, a discrezione del personale addetto alla cura degli animali sperimentato per controllare il disagio post-chirurgico negli animali.
    2. Monitorare i suinetti ogni ora per i primi 6 h dopo la chirurgia e successivamente ogni 4 h. Eseguire il sacrificio animale e l'acquisto di tessuti in modo identico per controllare gli animali, descritti in precedenza.
  • Representative Results

    Sono stati studiati quaranta porcellini (18 isoflurane, 22 controlli). Le procedure di studio sono state ben tollerate da tutti gli animali. Tutti i suinetti studiati erano maschi. Non esisteva alcuna differenza significativa tra i gruppi rispetto all'età o al peso ( Tabella 2, Figura 5 ). I valori medi di laboratorio durante la sperimentazione nel gruppo isoflurano sono riportati nella tabella 3 . Questi valori dimostrano che il protocollo sperimentale possiede consistenza e riproducibilità interna, in quanto abbiamo avuto più tecnici che eseguono l'intervento nel corso di due anni. Non citati da questi numeri sono le molte regolazioni e correzioni che abbiamo dovuto eseguire durante gli interventi chirurgici per mantenere l'emostasi fisiologica. La ritenzione di CO 2 , la bassa temperatura corporea e l'ipoglicemia sono alcuni dei molti confondenti che abbiamo evitato attraverso un monitoraggio completo e un adeguamento, se necessario.

    T "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 1
    Figura 1:. Posizionamento della linea intravenosa periferica. Un catetere endovenoso 24 G è posto nella vena marginale dell'orecchio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2: Sequenza di eventi in Intubazione dei Piglet. ( A ) Le maialine sono posizionate nella posizione di recupero laterale per l'intubazione. Sono posizionati i monitor standard. ( B ) Un assistente ha spostato la lingua dalla cavità orale mentre il laringoscopio esegue la laringoscopia. ( C ) L'epiglotta è morfologicamente simile a quella di un essere umano. In questa grafica, la punta della thLa lama è nella vallecula. ( D ) L'anatomia laringea porcina è distintamente diversa da quella dell'uomo; Le corde vocali sono diversi millimetri profondamente all'entrata laringea. In questa grafica, la punta della lama ha spostato l'epiglotta, esponendo la laringe. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3: Approccio dell'arteria femorale. ( A ) La temperatura animale viene mantenuta usando un dispositivo di riscaldamento a fuoco forzato. Il monitoraggio viene utilizzato per tutta la procedura. Viene preparato un ampio campo sterile con cloressina colorata e l'animale è coperto da un tetto sterile fenestrato. ( B ) La palpazione alla piega inguinale rivela l'impulso femorale. ( C ) Un crL'incisione cutanea aniocaudale, approssimativamente perpendicolare alla piega inguinale e circa 1,5 cm di lunghezza, viene eseguita sovrastando l'impulso femorale. ( D ) Si ottiene una dissezione stretta per esporre il fascio neurovascolare femorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: Cannulazione dell'arteria femorale. ( A ) Dal lato laterale al mediale, il fascio neurovascolare contiene il nervo femorale, l'arteria e la vena. ( B ) L'arteria femorale è isolata usando gli anelli e / o la sutura dei vasi. La tensione sostenuta sulla cravatta prossimale impedisce la perdita di sangue eccessiva mentre l'arteria viene forata (vedi sbiancamento del vaso). ( C ) Un ago viene usato per puntare il femore aRtery, evitando la perforazione della parete posteriore dell'arteria. Quando il sangue ritorna, un guidewire viene avanzato nell'arteria attraverso l'ago. ( D ) L'ago viene rimosso e il catetere viene avanzato sul cavo guida nella arteria femorale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5: confronto del peso medio e dell'età del controllo e Porcellini trattati con Isoflurane. Le barre di errore rappresentano +/- 1 deviazione standard, con il valore di deviazione standard rilevato sopra ogni barra di errore.

    Tabella 1
    Tabella 1: Sintesi dei segni vitali del maiale, ArteriAl Blood Gas e Valori elettrolitici del siero con i metodi di correzione suggeriti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.

    Tavolo 2
    Tabella 2: Sintesi del peso medio e dell'età del controllo contro i porcini trattati con isofluoro. È stato eseguito un test T di due tailed unpaired, che non mostrava alcuna differenza significativa tra i due gruppi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.

    Tabella 3
    Tabella 3: Segni vitali medi e valori di laboratorio degli animali trattati con isofluoro. Durante il corso di thGli interventi chirurgici, le deviazioni dei segni vitali e dei valori di laboratorio dalle gamme normali vengono tempestivamente corretti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa tabella.

    Discussion

    Procedimento / risoluzione dei problemi di protocollo critico

    Come inizia l'esperimento, il monitoraggio dei segni vitali non invasivi dovrebbe iniziare con l'induzione. La pressione sanguigna, la frequenza cardiaca, la saturazione dell'ossigeno e la temperatura rettale possono essere facilmente ottenute e monitorate. Il porcellino deve essere sotto un dispositivo di riscaldamento dell'aria per mantenere una temperatura corporea adeguata, poiché questi animali possono diventare rapidamente ipotermici in anestesia generale. Il posizionamento rapido di un catetere periferico intravenoso consente il trattamento di emergenze se sorgono durante l'induzione. È importante monitorare continuamente il porcellino, non invasivo o invasivo, per tutta la procedura isoflurana e la procedura di sacrificio. Il porcellino può sperimentare la desaturazione dell'ossigeno arterioso molto rapidamente durante più passaggi durante tutto il protocollo, soprattutto durante la gestione delle vie aeree e l'intubazione. Usiamo l'8% di sevoflurano per indurre l'anestesia per replicare la pratica pediatrica umana e per speeD induzione. Tuttavia, il 5% di isoflurano è stato utilizzato con successo ed è appropriato. Dato le differenze nell'anatomia e una predisposizione per il laringospasmo, il porcellino può essere difficile da intubare. Se il porcellino inizia a desaturare durante l'induzione e / o la gestione delle vie aeree, l'ossigeno al 100% e il sevoflurano devono essere somministrati immediatamente mediante cono a faccia per ristabilire un livello di saturazione sicuro dell'ossigeno e una profonda profondità di anestesia. Tieni presente che mentre il piano di anestesia deve essere abbastanza profondo per consentire l'intubazione, l'anestesia eccessiva può portare all'apnea. È necessaria una vigilanza continua rispetto alla ventilazione e all'ossigenazione dell'animale, con la titolazione di anestetico inalato di conseguenza. L'intubazione può essere quindi ripetuta dopo che l'ossigenazione viene ripristinata e un'adeguata anestesia è stata raggiunta. La ventilazione positiva della pressione attraverso il cono del viso può essere tentata, ma di solito non è riuscita. Se si verifica laringospasmo, si applica direttamente la soluzione lidocaina al vocI cavi sono indicati per consentire l'intubazione tracheale.

    I farmaci di emergenza devono sempre essere disponibili e devono essere somministrati come necessario durante le porzioni critiche del protocollo per correggere i disturbi fisiologici. Mentre una discussione approfondita sull'uso di droghe di anestesia e di emergenza nei suinetti non rientra nell'ambito di questo manoscritto, Swindle's "Saba nel laboratorio: Chirurgia, Anestesia, Imaging e Tecniche Sperimentali" è una risorsa eccellente. 27

    Allo stesso modo, il porcellino può cominciare a desaturarsi rapidamente durante il sacrificio, dopo aver aperto la cavità toracica durante la sternotomia della linea mediana. L'operatore dovrebbe lavorare rapidamente ma in modo sicuro per esporre il cuore e inserire l'angiocatetter per avviare il freddo PBS. È necessaria una perfetta perfusione di PBS a freddo (e una rapida fissazione con PFA, se indicata) per prevenire danni ischemici al cervello.

    Una volta intubato il porcellino, respiIl tasso di riabilitazione e l'inseguimento di biossido di carbonio terminale ( Tabella 1 ). Stabilizzare l'ossigenazione e la ventilazione end-tidal del porcellino titolando il supporto del ventilatore pur mantenendo un'adeguata anestesia. Utilizziamo la ventilazione meccanica per imitare ciò che viene usato nell'uomo quanto più possibile. L'iperossia deve essere evitata per minimizzare la possibilità di stress ossidativo.

    I suinetti isofluranici subiscono una cannulazione dell'arteria femorale per due motivi: monitorare continuamente la pressione arteriosa; E di prelevare sangue arterioso per la valutazione dello stato acido-base, dei gas ematici e degli elettroliti durante tutta la procedura. La cannulazione dell'arteria femorale può essere impegnativa. Si prega di vedere il video per i dettagli completi. Per esperimenti di sopravvivenza, questa procedura dovrebbe essere effettuata in un ambiente operativo sterile in condizioni sterili. Dopo la cannulazione dell'arteria femorale, iniziare il monitoraggio orario del gas sanguigno arterioso e degli elettroliti sierici, correggendo, se necessario,Mantenere l'omeostasi ( tabella 1 ). Il porcellino deve ricevere fluido isotonica continuo contenente dextrose per mantenere un adeguato glucosio nel sangue. Durante l'esperimento, l'animale dovrebbe essere monitorato continuamente per la normotermia, e il riscaldamento a fuoco forzato dovrebbe essere fornito se necessario. È altrettanto importante evitare l'ipotermia e l'ipertermia.

    Mentre questo protocollo fornisce un emisfero di cervello "fresco" e un emisfero di tessuto neurale fisso, questo può essere facilmente adattato per accogliere disegni di studio alternativi. Ulteriori campioni possono essere raccolti anche dal porcellino. Il CSF può essere ottenuto dopo l'anestesia del porcellino, con o senza guida di fluoroscopia. Il sangue può anche essere raccolto dal porcellino in varie fasi del protocollo, compreso il catetere dell'arteria femorale, nonché direttamente dal ventricolo sinistro attraverso l'angiotetro immediatamente prima della perfusione. Il periodo di convalescenza può anche essere prolungato o sh Ortened, per l'esame della risposta cronica o acuta, rispettivamente.

    Limitazioni della tecnica

    Questo protocollo e il modello sono tecnicamente impegnativi. È richiesto un esperto investigatore e una suite operativa completamente fornita, in particolare per esperimenti di sopravvivenza. Il ricercatore (e l'assistente, per determinate porzioni del protocollo) deve essere a proprio agio con entrambi i componenti chirurgici ed anestetici di questo protocollo, che possono richiedere l'addestramento e l'esperienza da padroneggiare. Altre limitazioni includono la spesa dei suinetti relative ai modelli di roditore, anche se il modello di maiale è molto meno costoso rispetto ai primati non umani. Mentre i costi dei suinetti variano a seconda della regione e dell'azienda da cui vengono ottenuti gli animali, si può prevedere che il costo per animali sia inferiore a 500 dollari, mentre i primati non umani possono essere migliaia di dollari per animale. Nella nostra esperienza, il costo medio per animale è di solito circa $ 200.

    Infine, poiché lo scopo del modello di suinetti è quello di simulare il cervello umano in sviluppo, bisogna utilizzare solo suinetti neonatali. Il sistema nervoso centrale è più vulnerabile durante il periodo di rapida crescita e nei suinetti questo periodo si estende da Sei settimane prima della nascita a cinque settimane dopo la nascita 8. L'impiego di suini più vecchi più lontani dalla loro data di ritardo portano il rischio di indebolire la rilevanza clinica del modello di porcellino. Mentre esistono controversie significative per quanto riguarda l'"equivalenza" dello sviluppo del cervello di Quello di un nuovo neonato umano, ci sono analogie sorprendenti quando si confronta il primo sviluppo del cervello postnatale tra umani e suini. Nascono i cervelli degli uomini e dei suini rispettivamente del 27% e del 25% del peso degli adulti. 14 Sulla base dell'opera di Johnson E colleghi, possiamo dedurre che una settimana di porcellino è equivalente a un mese umano. Questi risultati, basati su wh Ole-cervello, sono stati convalidati dal lavoro di Workman e colleghi. 28 Abbiamo selezionato i maialini da 7-14 giorni per approssimare un umano di 1-2 mesi di età. Tuttavia, può essere prudente l'uso di animali più giovani (1-5 giorni) se l'obiettivo sperimentale è quello di imitare lo zenit dello spruzzo di crescita cerebrale del porcellino. Questo è possibile, poiché i suinetti possono essere svezzati alla nascita. Il nostro uso del modello di maiale si adatterà in quanto nuovi dati divengono disponibili rispetto ai parallelismi tra lo sviluppo del cervello postnatale umano e maiale.

    Significato della tecnica nel rispetto dei metodi alternativi / esistenti

    Il porcellino possiede simili somiglianze ai neonati umani, inclusi i paralleli critici nello sviluppo del cervello e nelle risposte patofisiologiche. È quindi un modello mammifero clinicamente rilevante e lo studio di prova concreta indica che il porcellino è un modello idoneo per lo studio della neurotossicità anesteticaIl modello è stato progettato per indagare, con autorità scientifica, l'estensione e il meccanismo dell'AIDN minimizzando le preoccupazioni che i confondenti, come l'ipossia o l'ipercarbia, sono in grado di essere facilmente adattati ad altri tipi di ricerca neuroscienze allo sviluppo. Causando danni neurologici che potrebbero essere interpretati erroneamente come indotto da anestesia. Per far ciò, il porcellino viene trattato con le stesse condizioni perioperatorie chirurgiche ed anestetiche e il monitoraggio sperimentato da pazienti pediatrici.

    Future Direzioni e Applicazioni Dopo aver masterizzato la tecnica

    Andando avanti, i suinetti sono anche molto adatti ai test neurocognitivi 17 . Questo attributo permetterà una valutazione complessa e completa del risultato neurocognitivo dopo l'esposizione anestetica negli esperimenti futuri. Va inoltre sottolineato che in ambito clinico, i bambini vengono spesso sottoposti ad anestesiaLa procedura fisiologicamente stressante (chirurgia). Le interazioni tra l'anestesia e l'infiammazione post-chirurgica, nonché il danno neuronale risultante e / o la tossicità (come si osservano nei roditori e nei primati) meritano ulteriore esplorazione e considerazione significativa. Il porcellino neonatale fornisce un modello di linea basale clinicamente rilevante per gli effetti degli anestetici sul cervello in via di sviluppo senza l'influenza confondente dell'intervento (che simula scenari clinici comuni nei bambini). L'impatto di diversi tipi di chirurgia o di altri confondenti (ischemia, lesioni cerebrali, predisposizione genetica, ecc. ) Possono ora essere testati in modo affidabile utilizzando questo modello.

    In laboratorio, intendiamo utilizzare metodi elettrofisiologici e elettrochimici multipli per studiare ulteriormente i meccanismi di anestesia e AIDN in circuiti neurali intatti. Queste tecniche comprendono la misurazione in vivo dell'attività di neurotrasmettitore, le registrazioni patch-clamp intere cellule, la neuroimaging eIndagini neurofisiologiche nelle fette del cervello. Per quanto riguarda la neuroscienza nel cervello immaturo, i suinetti sono più rilevanti per gli esseri umani rispetto ai modelli murini con pochissimi degli inconvenienti presenti con i primati non umani. Con ulteriore sviluppo, i suinetti possono essere il modello ideale per la ricerca umana dello sviluppo neuroscienze.

    Disclosures

    Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

    Acknowledgments

    Gli autori vorrebbero riconoscere i contributi dell'Orhiv State University Laboratory Animal Resource Center (ULAR).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Liqui-Wean Milk Specialities 454836
    Piglet Anesthesia Face-Cone Mask VetEquip 921428
    Masterflex L/S Peristaltic Pump Cole-Parmer EW-77916-20 Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved
    Masterflex L/S Pump Tubing, 25 ft Cole-Parmer EW-96410-24
    14 G angiocatheter Becton-Dickson 381164
    10x PBS Thermo-Fisher Scientific
    Paraformaldehyde powder Sigma-Aldrich P6148-5KG Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased.
    2-methylbutane Sigma-Aldrich M32631-4L
    Needle holder Teleflex 152720
    Right angle clamp Teleflex 496217
    Rongeurs Teleflex 028120
    Tenotomy scissors Teleflex 423480
    Stitch scissors Teleflex 423440
    McPherson Tying Forceps Teleflex 425200
    Adson Tissue Forceps Teleflex 181223
    3-0 nylon suture Medline ETH627H
    Integra SL Anesthesia Workstation DRE Veterinary 2350 This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention.
    Laryngoscope handle Teleflex 8710000
    Miller 1 Laryngoscope blade Teleflex 2216100
    Bair Hugger 3M 750
    Bair Hugger Torso Blanket 3M 540
    iStat Handheld Abbott Point of Care 300 Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used
    iStat Cartridges Abbott Point of Care CG8+
    Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive Ethicon DNX6
    LMA Laryngotracheal Atomization Device Teleflex MAD720 A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used
    Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube Teleflex 5-10106 This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment
    Pediatric Intubation Stylet Smiths Medical 100/120/100
    24 G angiocatheter Becton-Dickson 381112
    #10 Disposable Scalpel Ted Pella, Inc 549-9-10
    Arterial Pressure Monitoring Kit
    (3 French, 8 cm catheter)
    Cook Medical C-PMSY-300-FA Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used
    Intramedic PE90 Polyethylene tubing Fisher Scientific 14-170-12D
    Monoject Blunt Cannula VWR International 15141-144

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    References

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    Medicina Numero 124 Porcellini neurotossicità anestesia neuroinflamazione esito neurocognitivo neurodevelopment isoflurano ippocampo
    Uso di un modello di maiale per lo studio della neurotossicità dello sviluppo sviluppato da anestetici (AIDN): un approccio di neuroscienza transazionale
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    Whitaker, E. E., Zheng, C. Z.,More

    Whitaker, E. E., Zheng, C. Z., Bissonnette, B., Miller, A. D., Koppert, T. L., Tobias, J. D., Pierson, C. R., Christofi, F. L. Use of a Piglet Model for the Study of Anesthetic-induced Developmental Neurotoxicity (AIDN): A Translational Neuroscience Approach. J. Vis. Exp. (124), e55193, doi:10.3791/55193 (2017).

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