Summary
Исследования, направленные на развитие нейротоксичности (AIDN), вызванные анестезией, были сосредоточены на грызунах, которые в широком смысле не применимы к людям. Модели приматов, не связанные с человеком, более актуальны, но являются дорогостоящими и сложными в использовании для экспериментов. Порошок, напротив, представляет собой клинически значимую, практичную модель для животных, идеальную для изучения анестезирующей нейротоксичности.
Abstract
Анестезию нельзя избежать во многих случаях, когда требуется хирургическая операция, особенно у детей. Недавние исследования на животных вызвали опасения, что воздействие анестезии может привести к апоптозу нейронов, известному как нейротоксичность развития, вызванная анестезией (AIDN). Кроме того, некоторые клинические исследования у детей предположили, что воздействие анестезии может привести к дефициту нейродеструкции позже в жизни. Тем не менее, идеальная модель животных для доклинического исследования еще не разработана. Неонатальный поросенок представляет собой ценную модель для доклинического исследования, поскольку они имеют поразительное количество сходств развития с людьми.
Анатомия и физиология поросят позволяют осуществлять строгие человеческие периоперационные состояния как в процедурах выживания, так и при отсутствии выживания. Катетеризация половых артерий позволяет проводить тщательный мониторинг, что позволяет оперативно корректировать любые отклонения жизненных признаков и химиотерапии поросят. яКроме того, между поросятами и новорожденными человека существует множественное сходство в развитии. Методы, необходимые для использования поросят для экспериментов, потребуют опыта для освоения. Педиатрический анестезиолог является критическим членом следственной группы. В общем случае мы описываем подходящее использование модели поросенка для исследования нейроразвития.
Introduction
Каждый год миллионы детей в США получают общую анестезию, многие из которых моложе 4 лет. Анестезирующая нейротоксичность развития (AIDN) стала предметом исследования детской анестезии, поскольку стало необходимо понять влияние анестезии на незрелые мозги. Предыдущие исследования показали, что обычно используемые анестетики, такие как изофлуран, могут приводить к увеличению апоптоза нейронов в мозге молодых животных. Исследования у детей дали двусмысленные результаты 2 . Понимание патогенеза AIDN, определение потенциальных терапевтических целей для его профилактики или улучшения, а также описание наиболее безопасных режимов анестезии стали неотложными задачами сообщества педиатрической анестезии. Основная цель этого исследования заключалась в разработке оптимальной модели и метода животных для количественной оценки эффектов анестетиков на развивающийся мозг и тщательного стимулированияРазработал исследование безопасности широко используемых анестетиков.
В недавнем систематическом обзоре существующей структуры доклинической литературы по AIDN авторы отметили значительную методологическую гетерогенность в более чем 900 исследованиях 3 . Многие считают, что это призыв к клинически актуальной, хорошо продуманной доклинической модели, которая еще не существует, несмотря на несколько лет исследований по этому вопросу. Большинство моделей грызунов, по необходимости, используют подход, который не допускает тщательного физиологического мониторинга, отбора проб крови или механической вентиляции. Поскольку мозг изящно чувствителен к физиологическим расстройствам, трудно полагаться на результаты таких моделей. Первичной целью разработки этой модели было ее проектирование таким образом, чтобы все физические параметры, такие как параметры газового газа, температура тела, параметры дыхания и т . Д., Контролировались и корректировались, когда это необходимо.
4 . Модель трансляционного поросенка обеспечивает уровень клинической значимости, который требуется в этих обзорах и редакционных статьях, поскольку он предназначен для решения этой проблемы для соответствующих доклинических данных, которые могут информировать о будущих клинических исследованиях.
Изофлуран, агонист рецептора GABA типа A (GABA A ) и слабый антагонист NMDA-рецептора, является широко используемым ингаляционным анестетиком в клинической практике во всем мире. Анестетики, такие как изофлуран, считаются безопасными до тех пор, пока они не вызывают гипотонии или гипоксии; Тем не менее, возможны более тонкие эффекты. Когда мозг подвергается общей анестезии, баланс ГАМК aГонизм и антагонизм NMDA, что приводит к изменениям в клеточной архитектуре, связности и функции. Кроме того, хотя ГАМК обычно является ингибирующим нейромедиатором, он, как известно, является возбуждающим в незрелых мозгах 5 . Именно, когда переход ГАМК от возбуждающего к ингибирующему действию не совсем понятен и, вероятно, зависит от вида.
Когда дисбаланс между возбуждающим и тормозящим введением в мозг происходит во время так называемого «роста роста мозга», возникающая в результате экситотоксическая дисрегуляция критических молекулярных путей может привести к аномальной нейродеструкции, такой как апопетическая нейродегенерация. В дополнение к увеличению апоптоза могут также индуцироваться окислительный стресс и воспаление, тогда как пролиферация нейронных клеток, миграция нейронов и аксональная арбонизация становятся подавленными или дисрегуляционными 6 . Конечным результатом являются нейрокогнитивные нарушения, которые могут сохраняться в adulМолот 2 .
Для непосредственного измерения нейротоксических эффектов изофлурана у молодых млекопитающих используются неонатальные поросята. Поросенки больше похожи на CNS с людьми, чем с любым другим млекопитающим, и поэтому их нейроразвитие и нейроанатомическое сходство делают их идеальным животным для клинически значимой модели млекопитающих AIDN. Как у людей, так и у поросят есть гиренцефалические мозги, которые имеют сходство в характере и распределении мозговых гири, серого вещества и белого вещества. Поросенок-гиппокамп, базальные ганглии и стволы головного мозга также топографически подобны таковым у людей 7 . С точки зрения развития поросят являются одним из немногих нечеловеческих млекопитающих, которые подвергаются перинатальному росту мозга и миелинизации 8 . В утробе мозг человека и поросят испытывает значительный рост во время беременности в конце триместра. В корреляции, при рождении, мозг человека и поросят составляет 27% и 25% взрослого мозга соответственно, Магнитно-резонансная томография показала, что один недельный мозг поросенка примерно эквивалентен месячному мозгу человека с точки зрения созревания нейронов и дендритной арборизации 9 . Кроме того, поросенок и человеческий мозг имеют большое сходство в отношении моделей нейроразвития. Например, экспрессия и последовательность мРНК reelin 10 , топографическое распределение нейронов 5-HT 11 и закрытие 12 нервной трубки все параллельны тому, что наблюдается у людей. Кроме того, существует обширная гомология между геномами поросят и людей 13 .
Уместность модели животного следует понимать в контексте патологии человека, особенно в отношении зрелости мозга и патобиологии человеческого младенца. Большинство существующих исследований токсичности анестезии используют модель грызунов, а некоторые используют нечеловеческиеМодели приматов. Однако грызуны и приматы не могут быть идеальными животными для исследования AIDN.
Хотя они широко используются, мозг грызунов сильно отличается от мозга людей на протяжении всего развития. Наиболее заметно, что грызуны обладают лиссенцефальными (или гладкими) мозгами. В мозге грызунов отсутствуют гири и сульчи, характерные для более неврологически сложных организмов. Мозг грызунов также подвергается постнатальному отростку 14 роста мозга, отличающемуся от людей и поросят. Было отмечено, что существуют различия в уязвимости различных областей мозга к ингаляционной анестезии 15 . Поэтому важно, чтобы модель животных для изучения AIDN обладала мозгом, который является неврологически и нейроанатомически подобным мозгу, с тем чтобы лучше всего моделировать изменения, вызванные анестезией, которые могут быть замечены у педиатрических пациентов. Как описано выше, поросята обладают мозгом, что iГораздо лучше подходит для этой роли. Кроме того, общие формы нейрокогнитивного тестирования грызунов, такие как пространственное обучение и память, оцененные в водном лабиринте Морриса, не имеют прямого отношения к нейрокогнитивным оценкам у маленьких детей 16 . Одним из преимуществ использования поросят для развития нейронауки является то, что они чрезвычайно чувствительны к нейрокогнитивному тестированию даже в раннем возрасте. Многочисленные нейрокогнитивные тесты, которые считаются полезными для других видов млекопитающих, успешно используются и подтверждены у свиней. Хотя все еще развивающаяся область, нейрокогнитивная оценка у поросят включает более сложные тесты, которые лучше имитируют человеческий дефицит, такой как тест 17 , 18 наклонного луча , а также тест на пространственную информированность 19 . Испытания двигателя с наклонным лучом в рамках травматического исследования повреждений головного мозга у поросят показывают высокую надежность оценкиФункции двигателя. Зеркальный тест демонстрирует память об окружающей среде, а также признание и использование отраженного изображения для поиска награды за питание.
С другой стороны, не-человеческие приматы могут быть более подходящей моделью для исследований детской анестезии, но существует ряд непомерно высоких факторов, включая стоимость и трудность использования. Кроме того, они чрезвычайно чувствительны к условиям раннего выздоровления, особенно к разделению стресса и материнства. Факторы, важные для изучения AIDN, такие как аллостерические модуляторы, аффинности рецептор-лиганд, посттрансляционные модификации, рецепторные субъединичные композиции и альтернативные варианты сплайсинга, неизвестны в случае приматов. Это связано с тем, что гены, имеющие отношение к таким понятиям, не были клонированы. Напротив, они были клонированы у свиней. Таким образом, для приматов нечеловека были выполнены лишь ограниченная работа 21 , 22
Модель поросенца использует преимущества моделей приматов грызунов и нечеловеков: она экономична, проста в использовании по сравнению с исследованиями приматов, отличных от человека, и нейроанатомически и нейрофизиологически похожа на педиатрический мозг человека. В последние годы использование поросят в исследованиях нейронауки выросло, в том числе ряд исследований, в которых изучались педиатрические нейровоспалительные состояния. Воздействие респираторной вирусной инфекции на гиппокамп и пространственное обучение 23 , уменьшение смерти клеток головного мозга после инсульта 24 , нейрогенез после травматического повреждения мозга 25 и активность ферментов во время судорог 26 являются некоторыми исследованиями, которые использовали неонатальных поросят. Этот значительный и растущий объем литературы придает силу пригодности и устойчивости клинически значимой и сильно воспроизводимой модели поросят для изучения анестезииSia-индуцированная нейротоксичность.
Protocol
Здоровые домашние поросят ( Sus scrofa) получают на ферме, одобренной Институтом по уходу и использованию животных штата Огайо (IACUC). Все эксперименты с животными проводятся в соответствии с политикой IACUC Государственного университета штата Огайо после утверждения протокола.
1. Животные и животные
- Используйте мужской поросят в этом эксперименте, чтобы устранить потенциальные смешающие эффекты секса. ПРИМЕЧАНИЕ. Если экспериментальные цели включают оценку эффектов эксперимента на животных, а в период максимального роста головного мозга, не используйте поросят старше 14 дней.
- Запланируйте поросятам прибыть в вивариум по крайней мере за 24 часа до эксперимента, чтобы обеспечить акклиматизацию окружающей среды.
ПРИМЕЧАНИЕ. Обученные ветеринарные техники, находящиеся под наблюдением лицензированных ветеринаров, обеспечивают регулярный уход за животными.- Держите поросят в отдельных клетках с контролируемым температурным режимом и дайте питательное веществоПолностью законченный, коммерческий заменитель заменителя пигмента ad libitum. Поставьте животных одеялом и игрушкой. Постоянно контролируйте температуру в корпусах животных.
- Для этого предварительного технико-экономического обоснования использовали 18 поросят для изофлуранового рукава и 22 поросят для контрольной руки. Выполняйте расчет размера выборки, основываясь на структуре исследования, когда это возможно. Рандомизируйте доступные поросяты для контроля или экспозиции для соответствующей длины экспозиции. По опыту, даже с несколькими исследователями, ожидают, что смогут выполнять не более 2 экспериментов в день (всего 2 животных).
2. Контрольные животные
- Не выполняйте экспериментальное вмешательство на контрольных животных.
- Вызывают глубокую общую анестезию с помощью лицевой конусной маски для процедуры перфузии и сбора тканей. В частности, после 24-часового периода акклиматизации обезболивают поросят с 5% изофлураном или 8% севофлюрана в 100% кислороде <Em> через маску лицевого конуса. Не используйте десфлуран для индукции.
ПРИМЕЧАНИЕ. Время между индукцией анестезии и установкой перфузии PBS на холоде должно быть как можно короче. Опытные техники могут завершить этот процесс менее чем за 5 мин.- Подтвердите достаточную глубину анестезии из-за отсутствия рефлекса с помощью хирургического зажима.
- Чтобы избежать гипоксических / ишемических оскорблений головного мозга, следите за поросенком с помощью пульсоксиметра, чтобы обеспечить поддержание адекватной оксигенации, вентиляции и сердечного выброса до тех пор, пока не начнется перфузия забуференного фосфатом солевого раствора (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы обеспечить дополнительную защиту от повреждения тканей, упакуйте животное (включая голову) во время льда после индукции анестезии.
- Выполните транскрипционную перфузию.
ПРИМЕЧАНИЕ: поскольку используется параформальдегид, процедура перфузии должна выполняться под вытяжным шкафом или на нисходящем столе.- Сделать craniocaudal iNcision вдоль длины грудины с помощью скальпеля. Глубина разреза должна быть достаточной для обнажения грудины.
- Внимательно выполняйте стандартизованную стернотомию с помощью пары острых тяжелых ножниц, избегая повреждения сердца, легких или диафрагмы. При необходимости поместите палец между задним участком грудины и внутригрудным содержимым, чтобы избежать травм. Маневрируйте пальцем в средостение, сделав небольшой (пальцевый) разрез в диафрагме.
- После входа в грудную полость держите грудную клетку открытой, используя самозатягивающийся ретрактор.
- Поднимите перикард с помощью щипцов и ножниц, обнажив сердцебиение. Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить сердце.
- Определите левый желудочек и аккуратно поместите канюлю (например, 14 г ангиокатетера) через вершину желудочка. Удалите иглу, оставив катетер на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ. Соблюдайте осторожность, чтобы не проколоть заднюю стенку желудочка.Пульсирующий возврат крови из катетера указывает, что он правильно размещен. В этот момент кровь легко отбирается у животного. - После определения правого предсердия выполните атриотомию, сделав большой надрез в атриуме с помощью ножниц, чтобы обеспечить кровотечение и побег перфузата.
ПРИМЕЧАНИЕ. Изофлюран через ингаляцию следует продолжать до подтверждения сердечной смерти. Сердечная смерть подтверждается прямым наблюдаемым отсутствием сердечного выброса.
- Перфузируйте поросенка, используя перфузат, состоящий из холода (4 ° C) забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), содержащий гепарин в концентрации 5 единиц на мл. Перфузируйте при 300 мл в минуту в течение 5 мин или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
- Соблюдайте осторожность, чтобы перфузионная канюля не удалялась во время перфузии. Для этого и всех других перфузий используйте коммерчески доступный перистальтический насос.
- Выполните гемикраниэктомиюПереместите одно полушарие мозга для анализа свежих тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот протокол позволяет извлекать одно полушарие свежей ткани головного мозга. Другое полушарие фиксировано. Если новая ткань не требуется, перейдите к шагу 2.6.- Во время этой процедуры продолжайте циркуляцию охлажденного льдом PBS со скоростью 50 мл / час, чтобы гарантировать, что мозг остается холодным.
- Сделайте продольный разрез в волосистой части головы вдоль длины сагиттального шва до появления отверстия с помощью скальпеля. Во время процесса используйте твердое давление, чтобы создать счет в черепе. Отразите кожу головы, чтобы выставить весь череп.
- Используя rongeurs и начиная с отверстия, выньте череп с одной стороны, вставив рогов между черепом и твердой мозговой оболочкой, с осторожностью, чтобы не повредить основную ткань головного мозга. Удалите кость на кусочки, используя рогов, чтобы вырвать ее из паренхимы мозга.
- После удаления черепа вырезайте и удалите дюС использованием щипцов и ножниц, снова с осторожностью, чтобы не повредить основную ткань мозга.
- Поместите лезвие скальпеля между двумя полушариями, чтобы тщательно разделить мозолистое тело.
- Используя плоский инструмент, такой как широкий конец щипцов, осторожно втягивайте лобную долю, постепенно отделяя черепные нервы, работая спереди и сзади. В самом заднем аспекте полусферы используйте скальпель для резания спинного мозга. Удалите полушарие en bloc.
ПРИМЕЧАНИЕ. Нефиксированная ткань головного мозга является хрупкой. Соблюдайте осторожность при удалении полусферы, чтобы предотвратить нарушение кровоснабжения оставшегося полушария. - Разделите удаленное полушарие. Если указано, немедленно замораживают замораживание в 2-метилбутане, охлажденном до -160 ° С в ванне с жидким азотом, чтобы избежать разрушения ткани и сразу же хранят при -80 ° C для последующего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы рекомендуем секвенировать мозг коронально с шагом 2 мм с использованием матрицы, но конкретный detaiСекция будет зависеть от конкретных экспериментальных целей.
- Измените перфузат до 4% параформальдегида (PFA). Продолжайте перфузию PFA со скоростью 300 мл в минуту в течение не менее 5 мин.
ВНИМАНИЕ! PFA токсичен, избегайте контакта с кожей, глазами или слизистыми оболочками. Не вдыхайте пары PFA. - Ожидайте, чтобы тело поросенка усилилось из-за образования альдегидных поперечных связей, создаваемых в мышцах. После того, как перфузия PFA завершена, удалите оставшееся полушарие так же, как описано на шаге 2.5.5.
ПРИМЕЧАНИЕ. Правильно перфузируемый мозг будет бледным и полностью обескровленным.- Поместите оставшееся полушарие в маленький контейнер со свежим 4% PFA при 4 ° C. Держите полушарие в PFA в течение 24-48 часов, чтобы завершить процесс фиксации.
- Через 24-48 ч перенесите фиксированный мозг в раствор PBS, содержащий 0,1% азида натрия, так как необходимо предотвратить чрезмерную фиксацию. Чрезмерная фиксация может привести кКороль эпитопа или сильное неспецифическое окрашивание фона. Добавление азида натрия предотвращает рост бактерий.
ПРИМЕЧАНИЕ. Ткань можно хранить в течение одного месяца при температуре 4 ° C.
3. Изофлуран (экспериментальный) Животные
ПРИМЕЧАНИЕ. Любая анестезия или вмешательство могут быть использованы, но мы не рекомендуем десфлуран для ингаляционной индукции.
- Индукция и поддержание анестезии:
- Проведите анестезию с помощью клинической рабочей станции для анестезии, оснащенной педиатрическим вентилятором и контрольно-измерительными приборами.
- После 24-часового акклиматизационного периода обезболивают поросят с 8% севофлюраном в 100% O 2 с помощью лицевой конической маски.
- Постоянно контролируйте пульсоксиметрию, неинвазивное кровяное давление, электрокардиографию и температуру в течение индукционного периода и всегда во время процедуры исследования.
- После индукции титруют севофлуран или изофлуRane до концентрации, которая обеспечивает достаточную глубину анестезии при одновременном обеспечении спонтанного дыхания (обычно при концентрации 3-4%).
- Поместите периферический внутривенный катетер 24 G в краевой ушной вене ( рис. 1 ).
- Поместите поросенка в положение спинного лежания для интубации трахеи ( рис. 2 , панель A). Используйте лезвие Miller # 1 или # 1.5, чтобы облегчить диагностику гипофаринкса и интубацию трахеи. ПРИМЕЧАНИЕ. Во время ларингоскопии необходим опытный оператор и помощник.
- Попросите помощника вытеснить язык животного, используя сухую марлю, чтобы облегчить экспозицию гортани и визуализацию голосовых связок ( рисунок 2 B ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Поглотистый надгортанник морфологически подобен морскому организму человека ( рисунок 2 C ). Поросенок вокалаDs может быть трудно визуализироваться, так как они находятся на глубине нескольких миллиметров внутри входа гортани ( рис. 2 D ). - Сместите надгортанник: поместите кончик ларингоскопического лезвия под надгортанником и поднимите лезвие вверх, чтобы открыть гортань.
- Перед размещением трубки в трахею распылите голосовые связки на 0,5 мл 2% лидокаина, чтобы предотвратить ларингоспазм во время прохождения эндотрахеальной трубки, поскольку поросят особенно подвержены ларингоспазму.
- Попросите помощника вытеснить язык животного, используя сухую марлю, чтобы облегчить экспозицию гортани и визуализацию голосовых связок ( рисунок 2 B ).
- Поместите и закрепите трубку с трафаретом в 3,0 мм.
- Обеспечьте двусторонние звуки дыхания и устойчивый конец приливного углекислого газа, используя аускультацию сустава с помощью стетоскопа и мониторинга EtCO 2 .
- Надуйте легкие поросенка на непрерывное давление в дыхательных путях 20 см H 2 O. Затем надуйте манжету эндотрахеальной трубки до минимального давления, необходимого для предотвращения утечки воздуха под давлением 20 см H
- Нормоксия и нормокарбия поддерживаются во время анестезии.
- Начните введение 2% изофлурана в 50% кислорода / 50% воздуха. Титровать кислород для поддержания PaO 2 от 90 до 100 мм рт.ст. Продолжайте в течение 3 часов (или желаемую продолжительность эксперимента).
- Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Начинайте катетеризацию бедренной артерии после начала 2% изофлурана.
- Администрируйте предварительный разрез антибиотиков широкого спектра действия (цефазолин, 25 мг / кг) через периферическую внутривенную линию для предотвращения инфицирования хирургическим сайтом.
- Стерилизуйте оба паха, используя тонированный хлоргексидин, чтобы обеспечить надлежащее стерильное поле, и поместите подходящую стерильную драпу ( рисунок 3 B ). Как минимум, персонал, участвующий в операции по выживанию, должен носить хирургический колпачок, маску, стерильные перчатки и средства защиты глаз.
- Пальпируйте бедренный пульс при паховой складке с помощью указательного и среднего пальцев.
- Сделайте поверхностный, 1,5 см, разрез краниокаудаля, используя скальпель ( рисунок 3 C ).
- Рассеивайте между двумя головами мышцы gracilis, используя тупой инструмент, такой как хирургический гемостат или ножницы с тупым наконечником ( рисунок 3 D ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Бедренный нейрососудистый пучок обычно находится между этими двумя мышцами и только глубоко. ( Рисунок 4 A ). - Используя сосудистые петли или шелковые галстуки, выделите артерию на проксимальном и дистальном концах. Используйте петлю, чтобы вытянуть артерию до уровня кожи дистально ( рисунок 4 B ).
- В то время какПрикладывая тягу к проксимальной галстуке, достаточной для прерывания кровотока, делайте небольшую артериотомию с помощью пары ножниц с тенотомией.
- Будьте осторожны, чтобы не перерезать артерию. Достаточна небольшая артериотомия. Альтернативно, используйте игольчатый и проводный подход для доступа к артерии ( рисунок 4 C ).
- Нежная тяга на проксимальном галстуке предотвратит чрезмерную потерю крови в любой момент во время этой части процедуры. Если вы используете иглу и провод, пройдите проволочный направитель (поставляемый с комплектом или полученный отдельно) через иглу и в артерию до 5 см.
- Будьте осторожны, чтобы не продвигать провод дальше, так как это может вызвать эктопию желудочков. Если это произойдет, выведите провод сразу на 1-2 см.
- Удалите иглу с сосуда, следя за тем, чтобы оставить направляющий провод в сосуде. Аккуратно проведите катетер над проводом и в сосуд ( рис. 4
- Используйте 3-французский катетер на 8 сантиметров для катетеризации бедренной артерии. Ожидайте слабое сопротивление, когда кончик катетера сначала входит в поверхностную стенку сосуда.
- Если вы используете артериотомический подход, продвиньте катетер или полиэтиленовую трубку непосредственно в сосуд. Возвращение крови следует наблюдать немедленно.
- Немедленно присоедините катетер, прикрепленный к датчику давления. Промойте катетер с нормальным физиологическим раствором для поддержания проходимости катетера.
- Поместите швы, чтобы закрепить катетер. Накройте разрез стерильной марлей, чтобы предотвратить загрязнение. Используйте чрескожный подход к катетеризации бедренной артерии.
ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, что ультразвук выполнен опытным специалистом.
- Поместите швы, чтобы закрепить катетер. Накройте разрез стерильной марлей, чтобы предотвратить загрязнение. Используйте чрескожный подход к катетеризации бедренной артерии.
- Активно нагревайте поросенца с помощью устройства для подогрева воздуха и постоянного контроляРектальной температуры ( рисунок 3 A ).
- Инфузируйте содержащую декстрозу изотоническую жидкость (5% -ную декстрозу в лактате Рингера или физиологический раствор) с поддерживающей скоростью (в 4 раза больше веса поросят в килограммах, мл / ч).
- Мониторинг жизненно важных признаков для нарушений (гипотония, аритмия, гипо / гипертермия, гипоксия)
ПРИМЕЧАНИЕ. Нормативные диапазоны жизненно важных знаков и соответствующее предлагаемое управление в случае аномалий суммированы в таблице 1 . - Используя коммерчески доступную систему анализа крови, измерьте газы артериальной крови (артериальный рН, pCO 2 , pO 2 ), электролиты (бикарбонат, избыток / дефицит основания, натрий, калий, ионизированный кальций), гемоглобин и глюкозу, по крайней мере, ежечасно во время эксперимента период. Проведите образец артериальной крови из катетера бедренной артерии.
ПРИМЕЧАНИЕ. Нормальные значения кислотной основы и электролита вместе с рекомендациями по коррекции, если наблюдаются аномалииПриведенные в таблице 1 .
- Тщательно свяжите проксимальный сосудистый шелк, чтобы надолго закупорить бедренную артерию, чтобы предотвратить кровотечение. Альтернативно, используйте сосудистый клип.
- Обеспечьте полный гемостаз перед закрытием разреза. Орошайте разрез 10-20 мл стерильного солевого раствора, чтобы предотвратить заражение.
- Проникните рану, используя 0,5-1 мл / кг 0,25% бупивакаина с адреналином 1: 200 000 для контроля боли. Покройте разрез стерильным хирургическим клеем для кожи.
ПРИМЕЧАНИЕ. Не требуется переодевание.
- Активно согрейте частную домашнюю клетку теплым светом.
- Тщательно следить за животным после анестезии у подготовленного ветеринарного или исследовательского персонала. Обеспечьте заменитель молока поросенка.
- Инъецировать поросят с бупренорфином подкожно при соответствующей дозе, каждые три часа, по мере необходимости, для обеспечения контроля боли, по усмотрению персонала по уходу за животными, которому приходилось контролировать постхирургический дискомфорт у животных.
- Следите за поросенками каждый час в течение первых 6 часов после операции и каждые 4 часа после этого. Выполняйте жертвоприношение животных и закупку тканей таким же образом, чтобы контролировать животных, описанных выше.
Representative Results
Изучали 40 поросят (18 изофлуран, 22 контрольных). Все процедуры были хорошо переносимы. Все исследованные поросят были мужчинами. Не было существенной разницы между группами по возрасту или весу ( таблица 2, рисунок 5 ). Средние лабораторные значения во время экспериментов в изофлурановой группе приведены в таблице 3 . Эти значения демонстрируют, что экспериментальный протокол обладает внутренней согласованностью и воспроизводимостью, так как у нас было несколько техников, которые выполняли операцию в течение двух лет. Невысказанные этими числами - это многочисленные корректировки и исправления, которые мы должны были выполнять во время операций по поддержанию физиологического гемостаза. Сохранение СО 2 , низкая температура тела ядра и гипогликемия являются некоторыми из многих факторов, которые мы предотвратили путем комплексного мониторинга и корректировки по мере необходимости.
T "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Рисунок 1:. Размещение периферийной внутривенной линии. В периферическую ушную вену помещают 24 г внутривенного катетера. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Последовательность событий в интубации пятен. ( A ) Поросята помещают в боковое лежачее положение для интубации. Стандартные мониторы размещены. ( B ) Помощник вытеснил язык из ротовой полости, в то время как ларингоскопист выполняет ларингоскопию. ( C ) Надгортанник морфологически подобен эпиглоттиту человека. На этом графике кончикЛезвие находится в долине. ( D ) анатомия гортани свиней отчетливо отличается от анатомии человека; Голосовые связки имеют глубину в несколько миллиметров от входа в гортань. На этом графике кончик лезвия вытеснил надгортанник, обнажая гортань. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подход к артериям. ( A ) Температуру животных поддерживают с помощью устройства для подогрева принудительного воздуха. Мониторинг используется на протяжении всей процедуры. Широкое стерильное поле готовится с тонированным хлоргексидином, а животное покрывается стерильной драпированной драпировкой. ( B ) Пальпация при паховой складке выявляет бедренный пульс. ( C ) A crАококаудальный разрез кожи, примерно перпендикулярный паховой складке и приблизительно 1,5 см в длину, выполняется над бедренным пульсом. ( D ) Для тупого бедренного нейрососудистого пучка достигается тупое рассечение. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Каунтуляция бедренной артерии. ( A ) От латерального до медиального, нейрососудистый пучок содержит бедренный нерв, артерию и вену. ( B ) Бедренную артерию изолируют, используя петли сосудов и / или шов. Устойчивое напряжение на проксимальном галстуке предотвращает чрезмерную кровопотери во время прокола артерии (см. Отбеливание сосуда). ( C ) Игла используется для прокола бедренной кости aИзбегая перфорации задней стенки артерии. Когда кровь возвращается, проводник направляется в артерию через иглу. ( D ) Игла удаляется, и катетер продвигается по направляющей в бедренная артерия. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сравнение среднего веса и возраста контроля и покрытых Isoflurane Piglets. Полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение ±/- 1, со стандартным значением отклонения, отмеченным выше каждой строки ошибок.
Таблица 1: Сводка нормальных признаков жизнеспособности пятачка, ArteriAl Blood Gas и значения электролитов в сыворотке с помощью предложенных методов коррекции. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой таблицы.
Таблица 2: Сводка среднего веса и возраста контроля против покрытых Isoflurane Piglets. Проведен непарный двухсторонний Т-тест, не демонстрирующий существенной разницы между двумя группами. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой таблицы.
Таблица 3: Средние вещественные признаки и лабораторные значения животных, обработанных изофлураном. В ходеE операции, отклонения жизненных признаков и лабораторных значений от нормальных диапазонов быстро исправляются. Нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой таблицы.
Discussion
Критические шаги протокола / устранение неполадок
По мере начала эксперимента мониторинг неинвазивных жизненно важных признаков должен начинаться с индукции. Кровяное давление, сердечный ритм, насыщение кислородом и ректальная температура могут быть легко получены и контролироваться. Поросенок должен находиться под устройством для подогрева воздуха для поддержания адекватной температуры тела, так как эти животные могут быстро стать гипотермически под общей анестезией. Быстрое размещение периферического внутривенного катетера позволяет лечить чрезвычайные ситуации, если они возникают во время индукции. Важно постоянно следить за поросенком, неинвазивно или инвазивно, как по изофлурановой процедуре, так и по процедуре жертвоприношения. Порошок может испытывать десатурацию артериального кислорода очень быстро в течение нескольких этапов в течение всего протокола, особенно во время управления дыханием и интубации. Мы используем 8% -ный севофлуран для индукции анестезии, чтобы воспроизвести педиатрическую практику человека и описатьD индукция. Однако 5% изофлуран был успешно использован и подходит. Учитывая различия в анатомии и предрасположенность к ларингоспазму, поросенок может быть трудно интубировать. Если порошок начинает десазорить во время индукции и / или управления дыхательными путями, 100% кислорода и севофлурана следует немедленно вводить через конус лица, чтобы восстановить безопасный уровень насыщения кислородом и адекватную глубину анестезии. Имейте в виду, что, хотя плоскость анестезии должна быть достаточно глубокой, чтобы позволить интубацию, чрезмерная анестезия может привести к апноэ. Требуется непрерывная бдительность в отношении вентиляции и оксигенации животного, соответственно, титрование ингаляционной анестезии. Затем интубацию можно повторно активировать после восстановления оксигенации и достижения адекватной анестезии. Можно попытаться обеспечить вентиляцию положительного давления через конус лица, но, как правило, не удается. Если возникает ларингоспазм, применение раствора лидокаина непосредственно в голосДля подтверждения трахеальной интубации.
Экстренные лекарства всегда должны быть доступны и должны применяться по мере необходимости во время критических частей протокола для исправления физиологических нарушений. В то время как тщательное обсуждение наркотического и экстренного употребления наркотиков у поросят выходит за рамки этой рукописи, «Swine in the Laboratory: Хирургия, анестезия, визуализация и экспериментальные методы» Swindle - отличный ресурс. 27
Аналогично, поросенок может начать быстро обессохляться во время жертвоприношения, после открытия грудной полости во время средней линии стернотомии. Оператор должен работать быстро, но безопасно, чтобы открыть сердце и вставить ангиокатетер, чтобы запустить холодный PBS. Для предотвращения ишемического повреждения головного мозга необходима тщательная холодная перфузия PBS (и быстрая фиксация с помощью PFA, если указано).
После того, как поросенок был интубирован, респиратор( Табл. 1 ). Стабилизируйте приливную оксигенацию и вентиляцию поросенка путем титрования поддержки вентилятора при сохранении адекватной анестезии. Мы используем механическую вентиляцию, чтобы имитировать то, что используется у людей как можно ближе. Следует избегать гиперэксии, чтобы минимизировать вероятность окислительного стресса.
Порошки изофлурана подвергаются канюлю бедренной артерии по двум причинам: постоянно контролировать артериальное давление; И образец артериальной крови для оценки состояния кислотной основы, газов крови и электролитов на протяжении всей процедуры. Канюляция бедренной артерии может быть сложной задачей. Подробнее см. Видео. Для экспериментов по выживанию эта процедура должна проводиться в стерильной операционной среде в стерильных условиях. После канюлирования бедренной артерии начните ежечасный мониторинг артериального кровяного газа и сывороточных электролитов, исправив при необходимостиПоддерживать гомеостаз ( табл. 1 ). Порошок должен получать непрерывную содержащую декстрозу изотоническую жидкость для поддержания адекватного уровня глюкозы в крови. На протяжении всего эксперимента животное должно постоянно контролироваться для нормотермии, и при необходимости необходимо обеспечить принудительное воздушное потепление. Не менее важно избегать гипотермии и гипертермии.
Хотя этот протокол обеспечивает одно полушарие «свежего» мозга и одного полушария фиксированной нервной ткани, это можно легко адаптировать для альтернативных схем исследования. Дополнительные образцы также могут быть собраны у поросенка. CSF можно получить после обезболивания поросенка с помощью или без проведения рентгеноскопии. Кровь может также собираться у поросенка на разных стадиях протокола, включая катетер бедренной артерии, а также непосредственно из левого желудочка через ангиокатетер непосредственно перед перфузией. Период выздоровления также может быть увеличен или sh Ortened, для изучения хронического или острого ответа, соответственно.
Ограничения техники
Этот протокол и модель технически сложны. Требуется квалифицированный исследователь и полностью поставляемый операционный набор, особенно для экспериментов по выживанию. Исследователь (и помощник, для определенных частей протокола) должен быть удобным как с хирургическим, так и с анестетическим компонентом этого протокола, что может потребовать обучения и опыта для овладения. Другие ограничения включают в себя расходы на поросят по сравнению с моделями грызунов, хотя модель поросенков намного дешевле, чем приматов, не относящихся к человеку. В то время как стоимость поросят будет варьироваться в зависимости от региона и фермы, из которых получены животные, можно ожидать, что стоимость на животное будет меньше 500 долларов США, тогда как приматы нечеловека могут составлять тысячи долларов на животное. По нашему опыту, средняя стоимость животного обычно составляет около 200 долларов.
Jove_content "> Наконец, поскольку цель модели поросенок имитировать развивающийся человеческий мозг, следует использовать только неонатальных поросят. Центральная нервная система наиболее уязвима в период быстрого роста, а у поросят этот период простирается от За шесть недель до рождения до пяти недель после рождения 8. Использование старших поросят, более отдаленных от даты их опороса, несут риск ослабления клинической значимости модели поросенка. Несмотря на наличие значительных противоречий в отношении «эквивалентности» развития мозга поросят до Что у новорожденного человека наблюдаются поразительные сходства, когда сравнивается раннее развитие постнатального мозга между людьми и свиньями. По рождению мозг человека и свиней составляет соответственно 27% и 25% взрослого веса. 14 Основываясь на работе Джонсона И коллег, мы можем заключить, что одна неделя поросенка примерно эквивалентна одному человеческому месяцу. 9 Эти результаты, основанные на wh Оле-мозгового объема, были подтверждены работой Работника и его коллег. 28 Мы выбрали поросят 7-14 дней, чтобы приблизиться к человеку в возрасте 1-2 месяцев. Тем не менее, может быть разумным использовать более молодых животных (1-5 дней), если экспериментальная цель состоит в том, чтобы имитировать зенит пороха развития роста поросят. Это возможно, поскольку поросят можно отнимать от груди при рождении. Наше использование модели поросенок будет адаптировано по мере поступления новых данных в отношении параллелей между развитием постнатального мозга человека и свиньи.Значение техники в отношении альтернативных / существующих методов
Поросенок обладает поразительным сходством с новорожденными человека, включая критические параллели в развитии мозга и патофизиологических реакциях. Таким образом, клинически значимая модель млекопитающих и исследование доказательной концепции показывают, что поросенок является подходящей моделью для исследования анестезирующей нейротоксичностиRef "> 29 , 30. Он также может быть легко адаптирован к другим типам исследований нейронауки развития. Модель предназначена для исследования с научной точки зрения степени и механизма AIDN, сводящих к минимуму опасения, что смутные факторы, такие как гипоксия или гиперкарбия, являются Вызывая неврологический ущерб, который может быть неверно истолкован как вызванный анестезией. Для этого поросят обрабатывают те же периоперационные хирургические и анестезирующие условия и мониторинг, которым подвергаются педиатрические пациенты.
Будущие направления и приложения после освоения техники
Двигаясь вперед, поросят также очень чувствительны к нейрокогнитивным испытаниям 17 . Этот атрибут позволит провести комплексную, всестороннюю оценку нейрокогнитивного результата после анестезирующего воздействия в будущих экспериментах. Следует также подчеркнуть, что в клинических условиях дети чаще всего подвергаются анестезииФизиологически стрессовая процедура (операция). Взаимодействие между анестезией и постхирургическим воспалением, а также результирующее повреждение нейронов и / или токсичность (как видно у грызунов и приматов) заслуживают дальнейшего изучения и значительного рассмотрения. Порошок новорожденного представляет собой уникальную, клинически значимую базовую модель для воздействия анестетиков на развивающийся мозг без смешения влияния операции (имитация общих клинических сценариев у детей). Воздействие различных видов хирургии или других факторов (ишемия, черепно-мозговая травма, генетическая предрасположенность и т. Д.) Теперь может быть надежно проверено с использованием этой модели.
В лаборатории мы планируем использовать несколько электрофизиологических и электрохимических методов для дальнейшего изучения механизмов анестезии и AIDN в интактных нейронных цепях. Эти методы включают in vivo измерение активности нейротрансмиттера, записи цельноклеточных патч-зажима, нейровизуализации иНейрофизиологические исследования в срезах мозга. Что касается нейронауки в незрелом мозге, поросята более важны для человека, чем мышиные модели с очень немногими недостатками, присутствующими у нечеловеческих приматов. С дальнейшим развитием поросят могут быть идеальной моделью для исследований нейронауки человека.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить вклад Университета штата Огайо, центр лабораторных ресурсов животных (ULAR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liqui-Wean | Milk Specialities | 454836 | |
| Piglet Anesthesia Face-Cone Mask | VetEquip | 921428 | |
| Masterflex L/S Peristaltic Pump | Cole-Parmer | EW-77916-20 | Alternative peristaltic pumps can be used, as long as a constant and sufficient perfusion rate can be achieved |
| Masterflex L/S Pump Tubing, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-24 | |
| 14 G angiocatheter | Becton-Dickson | 381164 | |
| 10x PBS | Thermo-Fisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148-5KG | Our lab makes this reagent from the powder as it is much more cost-effective. Prepared paraformaldehyde can also be purchased. |
| 2-methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Needle holder | Teleflex | 152720 | |
| Right angle clamp | Teleflex | 496217 | |
| Rongeurs | Teleflex | 028120 | |
| Tenotomy scissors | Teleflex | 423480 | |
| Stitch scissors | Teleflex | 423440 | |
| McPherson Tying Forceps | Teleflex | 425200 | |
| Adson Tissue Forceps | Teleflex | 181223 | |
| 3-0 nylon suture | Medline | ETH627H | |
| Integra SL Anesthesia Workstation | DRE Veterinary | 2350 | This anesthesia workstation is chosen to best mimic the clinical monitoring experienced by pediatric patients in the operating room. Any anesthesia machine can be used as long as it allows for sufficient physiologic monitoring and intervention. |
| Laryngoscope handle | Teleflex | 8710000 | |
| Miller 1 Laryngoscope blade | Teleflex | 2216100 | |
| Bair Hugger | 3M | 750 | |
| Bair Hugger Torso Blanket | 3M | 540 | |
| iStat Handheld | Abbott Point of Care | 300 | Alternative point of care arterial blood gas analysis devices may be used |
| iStat Cartridges | Abbott Point of Care | CG8+ | |
| Dermabond Advanced Topic Skin Adhesive | Ethicon | DNX6 | |
| LMA Laryngotracheal Atomization Device | Teleflex | MAD720 | A cotton-tipped applicator soaked in local anesthetic can also be used |
| Sheridan CF 3.0 Cuffed Endotracheal Tube | Teleflex | 5-10106 | This model ETT was selected because it has a Murphy's eye, which is important to prevent ETT occlusion during the experiment |
| Pediatric Intubation Stylet | Smiths Medical | 100/120/100 | |
| 24 G angiocatheter | Becton-Dickson | 381112 | |
| #10 Disposable Scalpel | Ted Pella, Inc | 549-9-10 | |
| Arterial Pressure Monitoring Kit (3 French, 8 cm catheter) |
Cook Medical | C-PMSY-300-FA | Simple polyethylene tubing with a luer-lock adapter can also be used |
| Intramedic PE90 Polyethylene tubing | Fisher Scientific | 14-170-12D | |
| Monoject Blunt Cannula | VWR International | 15141-144 |
References
- Buie, V. C., Owings, M. F., DeFrances, C. J., Golosinskiy, A. National hospital discharge survey: 2006 annual summary. Vital Health Stat 13. (168), 1-79 (2010).
- Hays, S. R., Deshpande, J. K. Newly postulated neurodevelopmental risks of pediatric anesthesia. Curr Neurol Neurosci Rep. 11, 205-210 (2011).
- Disma, N., Mondardini, M. C., Terrando, N., Absalom, A. R., Bilotta, F. A systematic review of methodology applied during preclinical anesthetic neurotoxicity studies: important issues and lessons relevant to the design of future clinical research. Paediatr Anaesth. 26, 6-36 (2016).
- Loepke, A. W., Vutskits, L. What lessons for clinical practice can be learned from systematic reviews of animal studies? The case of anesthetic neurotoxicity. Paediatr Anaesth. 26, 4-5 (2016).
- Cherubini, E., Rovira, C., Gaiarsa, J. L., Corradetti, R., Ben Ari, Y. GABA mediated excitation in immature rat CA3 hippocampal neurons. International journal of developmental neuroscience. 8, 481-490 (1990).
- Kaindl, A. M., et al. Brief alteration of NMDA or GABAA receptor-mediated neurotransmission has long term effects on the developing cerebral cortex. Mol Cell Proteomics. 7, 2293-2310 (2008).
- Glauser, E. M. Advantages of piglets as experimental animals in pediatric research. Exp Med Surg. 24, 181-190 (1966).
- Dickerson, J., Dobbing, J. Prenatal and postnatal growth and development of the central nervous system of the pig. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 166 (1005), 384-395 (1967).
- Conrad, M. S., Johnson, R. W. The domestic piglet: an important model for investigating the neurodevelopmental consequences of early life insults. Annu Rev Anim Biosci. 3, 245-264 (2015).
- Nielsen, K. B., et al. Reelin expression during embryonic development of the pig brain. BMC Neuroscience. 11, 75 (2010).
- Niblock, M. M., et al. Comparative anatomical assessment of the piglet as a model for the devleoping human medullary serotonergic system. Brain Res Brain Res Rev. 50 (1), Netherlands. 169-183 (2005).
- van Straaten, H. W., Peeters, M. C., Hekking, J. W., van der Lende, T. Neurulation in the pig embryo. Anat Embryol (Berl). 202 (2), 75-84 (2000).
- Goureau, A., et al. Conserved synteny and gene order difference between human chromosome 12 and pig chromosome 5. Cytogenetics and cell genetics. 94 (1-2), 49-54 (2001).
- Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
- Istaphanous, G. K., et al. Characterization and quantification of isoflurane-induced developmental apoptotic cell death in mouse cerebral cortex. Anesth Analg. 116 (4), 845-854 (2013).
- Loepke, A. W., et al. The effects of neonatal isoflurane exposure in mice on brain cell viability, adult behavior, learning, and memory. Anesth Analg. 108 (1), 90-104 (2009).
- Sullivan, S., et al. Improved behavior, motor, and cognition assessment in neonatal piglets. J Neurotrauma. 30 (20), 1770-1779 (2013).
- Gieling, E. T., Nordquist, R. E., van der Staay, F. J. Assessing learning and memory in pigs. Anim Cogn. 14 (12), 151-173 (2011).
- Broom, D. M., Sena, H., Moynihan, K. L. Pigs learn what a mirror image represents and use it to obtain information. Animal Behaviour. 78 (5), 1037-1041 (2009).
- Martin, L. J., Spicer, D. M., Lewis, M. H., Gluck, J. P., Cork, L. C. Social deprivation of infant rhesus monkeys alters the chemoarchitecture of the brain: I. Subcortical regions. The Journal of neuroscience. 11 (11), 3344-3358 (1991).
- Rizzi, S., Ori, C., Jevtovic-Todorovic, V. Timing versus duration: determinants of anesthesia-induced developmental apoptosis in the young mammalian brain. Annals of the New York Academy of Sciences. 1199, 43-51 (2010).
- Brambrink, A. M., et al. Isoflurane-induced neuroapoptosis in the neonatal rhesus macaque brain. Anesthesiology. 112 (4), 834-841 (2010).
- Elmore, M. R., et al. Respiratory viral infection in neonatal piglets causes marked microglia activation in the hippocampus and deficits in spatial learning. J Neurosci. 34 (6), 2120-2129 (2014).
- Alonso-Alconada, D., et al. Brain cell death is reduced with cooling by 3.5 degrees C to 5 degrees C but increased with cooling by 8.5 degrees C in a piglet asphyxia model. Stroke. 46 (1), 275-278 (2015).
- Costine, B. A., et al. The subventricular zone in the immature piglet brain: anatomy and exodus of neuroblasts into white matter after traumatic brain injury. Developmental neuroscience. 37 (2), Switzerland. 115-130 (2015).
- Holtzman, D., et al. In vivo phosphocreatine and ATP in piglet cerebral gray and white matter during seizures. Brain research. 783 (1), 19-27 (1998).
- Swindle, M. M. Swine in the Laboratory. , 2nd ed, CRC Press. (2007).
- Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
- Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. International journal of biological sciences. 3 (3), 179-184 (2007).
- Nemzek, J. A., Hugunin, K. M., Opp, M. R. Modeling sepsis in the laboratory: merging sound science with animal well-being. Comparative medicine. 58 (2), 120-128 (2008).
