Summary
우리는 현재의 연구에서 형질 전환 마우스에서 파생 된 림프구를 사용하여 새로운 형광 기반의 분석을 제시한다. 이 분석은 억제 또는 림프구의 활성을 촉진하거나 용량을 부여 소분자의 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 적합하다.
Abstract
높은 처리량 스크리닝 (HTS)는 현재 생화학 반응 또는 세포 과정을 조절할 수있는 화학 엔티티의 식별을위한 대들보이다. 바이오 기술의 진보 및 작은 분자의 병진 높은 전위, 신약 혁신적인 접근 방법은 HTS의 사용에 관심을 부활 설명하는 진화 해왔다. 종양학 필드는 현재 이식 관련 합병증 또는자가 면역 질환을 대상으로 새로운 면역 조절 화합물의 식별을 위해 만든 더 큰 혁신과 약물 검사에 대한 가장 활발한 연구 분야이다. 여기서는 관내 뮤린 형광 계 분석에서 림프구 신규 쉽게 새로운 면역 조절 화합물을 동정하도록 제안한다. 상기 분석은 Nur77 프로모터 T- 또는 B 세포 수용체 자극에 GFP 발현을 구동하는 트랜스 제닉 마우스로부터 유도 된 T 세포 또는 B를 사용한다. GFP의 강도가 반영하는 바와 같이,표적 세포의 활성화 / 전사 활성은, 우리의 분석은 셀룰러 / 생물학적 반응에 대한 특정 화합물 (들)의 효과를 연구하기위한 신규 도구를 정의한다. 예를 들어, 차 스크리닝은 면역 활동 전위를 디스플레이 (160)의 히트 식별되었다 「타겟 가설 "의 부재 하에서 4,398 화합물을 사용하여 수행 하였다. 따라서, 이러한 분석의 사용은 시험 관내 / 생체 내 유효성 연구를 촉진하기 전에 큰 화학 라이브러리를 탐색 신약 프로그램에 적합하다.
Introduction
높은 처리량 스크리닝 (HTS)을 널리 새로운 치료 분자의 식별을 위해 또는 새로운 의료 적응증에 FDA 승인 약물의 재배치 채택 입증 된 전략이다. 하나는 지금까지 달성 HTS 성공은 이전에 발견 된 약물의 과다에 의해 측정 될 수있다. 예를 들어, 티로신 키나제 억제제 라파티닙 유방암, 시타 글 립틴의 치료에 사용; 디펩 티딜 펩 티다 제 -4 (DPP-4) 억제제 항 혈당 약물로 사용하고, 만성 골수성 백혈병의 치료에 사용되는 경구 체 Bcr-Abl의 티로신 키나제 억제제 프라이 셀은 원래 발견 승인 된 약물의 긴리스트의 몇 가지 예를 나타내는 HTS. 제약 업계의 생산성 최근 새로운 화학 실체의 발견의 부족으로 고생하고 있지만 2 성공적인 약물 발견 가능성은 전임상 칸디다 수의 증가를 통해 향상시킬 수있다조절 성 생물 / 생화학 적 특성을 표시 TES. 따라서, 표현형 선별하도록 새로운 HTS 분석법의 개발은 신약 히트 발견 중요한 약리학 적 도구를 제공 할 수있는 가능성을 제공 할 수있다. 3, 4, 5, 6 더욱이, HTS 해주기 때문에 주문 설계된가요 로봇 설비, 신규 한 판독 기술 광범위한 소형화 포함한 최근의 상당한 기술적 변형으로 빠른 속도로 수행 될 수있다. 표현형 검사 (일명 앞으로 약리학)의 사용에 대한 관심이 증가에 기여하는 요인 중 2, 7은 기능적인 효과보다는 분자 표적 (목표 기반 검사 / 생화학 반응)에 대해 과도하게 단순화 환원 가정에 집중하는 것이 더 가능성이 있다는 인식이다 SHO하기 w 임상 효능. 따라서, 표현형 검사는 새로운 잠재적 치료 화합물 및 현재 치료가 질병의 분자 경로를 발견 할 수있는 약속을 보유하고있다. 이
제대로 주어진 분자 대상 또는 세포 기능에 대한 억제제 또는 활성제를 확인하려면, 매우 민감하고 신뢰할 수있는 분석은 선의의 히트와 오탐 (false positive)을 구별하기 위해 필요합니다. 그럼, 좋은 분석한다? 주어진 분석의 질은 제 (a 인자 Z를 통해 반사 된) 신호 대 잡음비에 의해 판단되어야한다. 여덟 번째로, 타겟 효과 나 화면의 목적은 명확 확립되어야한다. 특이 적으로 결합하는 리간드 - 수용체를 평가하도록 설계된 분석 반대로 예를 들면, 기능성 세포 기반 접근법 수용체 스크리닝 상당한 이점을 제공 할 수있다. 그 이유는 후자의 방법은 작용제 및 길항제 리간드를 구별 할 수 없다는 것이다.SS = "외부 참조"대조적> 9 세포 - 기반 접근법은 수용체 기능 직접 생물학적 표현형에서 평가 될 수있는 더욱 효과적인 것으로 보인다 (증식, 세포주기 억류, 아폽토시스 및 / 또는 분화). 그러나, 그들 특정 대상 세포 침해 생화학 분석법 표현형 분석에 비해 상당한 이점을 제공 할 수 있음에 유의해야한다. 이후 행동의 약물 분자 메커니즘에 관한 조사를 단순화 잘 최적화 된 생화학 적 분석은 일반적으로 표현형 검사보다 적은 데이터 분산을해야합니다. 그러나, 타겟 기반 또는 생화학 적 분석의 주요 단점은 생물학적 시스템 (원래 생화학 적 분석에서 연구 된 특이성을 손실)에서 시험 할 때 비특이적 목표에 영향을 미칠 수있는 거짓 양성 히트의 속도를 증폭의 가능성이다. (10) 음성 및 양성 사이에 히트 노포 컷오프 포인트 위양성의 수를 최소화 할 수 있지만 난N 차 스크리닝은 이러한 손상 세포, 조직 전체의 전부 또는 동물로 네이티브 셀룰러 환경을 흉내 낸 생리 관련 시스템의 사용은 분석의 디자인 진자의 코어 남아있다. 따라서, 표현형 검사는 화합물의 활동이나 행동의 모드에 대한 사전 지식없이 어떤 확인 된 약물 표적과 질병에 대한 바람직한 / 생물학적 표현형 효과를 리드 발견 할 수 있습니다. (11)
시판되는 마우스 모델, 화학적 화합물의 클러스터 서브 가족 : 본원의 연구는 두 가지 중요한 구성 요소를 기반으로 최적의 재현성 표현형 선별 개발 및 테스트에 관한 것이다. 동물 모델에 대하여, 상기 분석은 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 번째로 구동되는 마우스 스트레인 (Nur77 GFP) 카세트를 함유하는 세균 인공 염색체를 보유하는 유래의 림프구의 사용에 의존전자 Nur77 프로모터. (12)이 자극의 특징은 Nur77는 T 세포 수용체 (TCR) 또는 B 세포 수용체 (BCR) 자극 다음 상향 조절 즉각적인 초기 유전자라는 사실에 기초한다. 스크리닝 방법 자체로서 12 접근법은 큰 화학 라이브러리 (> 105 화합물)를 평가하는 데 필요한 시간을 최소화하면서 사소한 동족체의 선별을 방지하는 데 도움이되었다. 이를 위해 가상 스크리닝 도구를 사용하여 의약 화학자에 의해 선택된 화학적 화합물의 데이터베이스를 참조로 알려진 활성 종 구조를 사용하여 토폴로지와 유사한 화합물을 식별하는 데 이용 하였다. 이러한 접근 방식은 우리가 136,000 이상의 화학 실체의 전체 라이브러리를 나타내는 4398 화합물을 스크리닝 할 수있었습니다.
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Protocol
모든 동물 프로토콜은 몬트리올 대학교의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다. 마우스가 더 활력 징후는 자궁 경부 전위 다음에하지 관찰 될 때까지 CO 2의 점진적 흡입에 의해 안락사시켰다. 절차는 동물이 인도적인 방법으로 안락사와 동물 관리에 캐나다위원회의 권고에 따라되었는지 확인하기 위해 인증 된 사람에 의해 수행되었다.
비장 매체와 흐름 - 세포 계측법 버퍼 1. 준비
- 70 % 에탄올 세정 생물 후드 아래의 모든 단계를 수행합니다.
- 미리 예열 로스웰 파크 메모리얼 연구소의 70 ㎖ (RPMI) 멸균 튜브 (시판 여과 500ml의 볼륨 살균 병 제공) 및 장소 1640 1X 매체를 제거합니다. 제거 된 매체는 프로토콜의 뒷부분에 사용됩니다.
- 50ml의 비활성화 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 5 RPMI 나머지 430 mL의 1640 1X 보충용액 HEPES, 5 ㎖의 비 필수 아미노산, 5 ㎖ 피루브산 나트륨, 여과 0.05 ㎖ (1M) 2- 머 캅토 에탄올.
주 : 열 충격을 피하기 위해 세포를 37 ºC로 설정 한 수욕을 사용 전 따뜻한 비장 매체. 이 세포 사멸 유도를 방지하는 것이 중요하다. - , 유동 세포 계측법 버퍼를 준비하는 98 ml의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 FBS의 2 mL를 넣어 사용까지 (바람직하게는 내 삼일) 냉장 보관합니다.
Nur77 GFP 마우스 비장의 비장 세포 현탁액의 2 세대
- A는 septically 6 ~ 8 주 된 여성 Nur77 GFP 마우스에서 비장을 격리 할 것.
- 이를 달성하기 위해, 무균 후드하에 작동한다. 70 % 에탄올에 희생 마우스 모피, 가위와 집게를 만끽 해보세요.
- 그 오른쪽에 마우스를 놓고 왼쪽 상단 복부 사분면의 피부와 근육을 잘라. 눈에 띄게 후 비장을 찾아 그것을 잘라하는 절개 영역을 검사합니다. 비장 유지전까지 얼음 비장 세포 배지에서 다음 단계를 수행한다.
- 예열 된 비장 세포 배지 5ml를 함유하는 10cm이 세포 배양 용 배양 접시에 비장 (들)을 놓는다.
- 용액이 혼탁해질 때까지 멸균 주사기의 플런저를 사용하여 비장을 매쉬. 비장 콜라겐 매트릭스 절차의 종료에 의해 유지한다.
- 비장 매체의 광범위한 숙성 후, 세포 현탁액을 수집하고 필터링 아웃하는 이물질이나 혈전을 50 mL의 관에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다.
- 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기. 상청액을 폐기 한 후 자체 제작 또는 상업적 적혈구 용해 완충액 2-3 ㎖의 세포 펠렛을 다시 일시. 다음 피펫 (2-3 시간) 20 ~ 30 초 동안 정지 휴식을 할 수 있습니다.
- g 다음 X 500에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기 5 PBS의 용액 또는 선택의 적절한 버퍼를 추가합니다.
- 붉은 색이어야한다 (상층 액을 제거 빨간색 B를 용해 포함로들 (100d) 세포) 및 재 정지 비장 세포 배지 2 ㎖의 세포 펠릿.
- 혈구를 사용하여 라이브와 죽은 (괴사) 세포를 구분하는 트리 판 블루로 염색 된 세포의 수를 계산합니다.
비장 세포 현탁액 3. T 세포 분리
- g X 500에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. 10 × 106 세포 / ㎖의 세포 농도를 얻기 위해, 무 혈청 RPMI 배지에서 세포 (단계 1.3 내지 50 ml)에 다시 대기.
- 5 mL의 폴리스티렌 튜브에 세포 이동 및 정제 공정의 마지막에 별도로 순도 평가 / 비교 비장의 100 μL 분취를 설정한다.
- T 세포 격리 항체 칵테일 (50 μL / mL)에 이어 50 μL / mL로의 세포 현탁액에 정상 쥐의 혈청을 추가합니다.
- 세포 현탁액을 혼합하고 10 분 동안 휴식을 할 수 있습니다. 이 단계는 항체 칵테일 모든 원치 않는 세포를 결합 할 수 있습니다.
- 스트렙 타비 딘 빠른 분야 추가 (자석2.5 분 동안 IC 비드) 다음 무 혈청 배지를 사용하여 2.5 mL의 부피를 가져온다.
- 3 분에 대한 세포 분리 자석에 튜브를 놓습니다.
- 자석을 잡고 하나의 움직임에 용액을 주입하여 새로운 폴리스티렌 튜브에 T 세포 현탁액을 전송합니다.
참고 : 격리 된 서스펜션은 정제 된 T 세포가 포함되어 있습니다. 모든 원하지 않는 세포는 자기 스트렙 타비 딘 비드에 결합 튜브 측에 유지된다. - 트립 판 블루 및 혈구를 사용하여 격리 된 T 세포를 카운트.
주 :이 단계에서 분리 된 T 세포의 순도 전에 유동 세포 계측법에 의한 T 세포의 분리 후 CD3 + 사건의 비율을 분석함으로써 (선택 사항) 검증 될 수있다. (13)- 간단히, 원심 분리기 500 X g에서 비장 세포 현탁액 1 ㎖. 상층 액을 제거하고 1 × 106 세포 / ㎖의 농도로 유동 세포 계측법 버퍼 셀을 정지.
- 형광 표지 된 항 MOUS 추가100 : 1의 농도로 전자 CD3 항체. 30 분 동안 4 ° C에서 품어. 한 번 세척, 원심 분리기 및 유동 세포 계측법에 의한 분석에 대한 흐름 세포 계측법 버퍼 (400 μL)에 다시 일시 중지합니다.
비장 세포 현탁액 4. B 세포 분리
- T 세포 (3.1-3.8 단계) 그러나 B 세포 분리 키트를 사용하여 설명한 것과 동일한 프로토콜을 따른다. 순도 평가를 들어, 대신 CD3 항체의 CD19 항체를 사용합니다. (13)
- (선택 사항) 순도 평가를 들어, CD3 항체 대신 CD19 항체를 사용합니다. 500 X g에서 비장 세포 현탁액의 원심 분리기 1 mL를. 상층 액을 제거하고 1 × 106 세포 / ml의 농도로 유동 세포 계측법 버퍼 셀을 정지.
- 추가 형광등 (1)의 농도로 항 - 마우스 CD19 항체에 태그 : 100, 30 분 동안 4 ℃에서 배양한다. 한 번 세척, 원심 분리기 및 유동 세포 계측법 버퍼 (400 μL) FO에서 다시 일시 중지유동 세포 계측법에 의해 연구 분석.
5. T 세포 활성화 및 GFP 발현의 유도
- / 웰 2.5 × 105 세포의 농도로, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에, 서스펜션에서, T 세포를 시드.
- 2 NG / mL의 CD3 / CD28 자석 구슬 (25 μL / 10 6 세포)에서 재조합 인터루킨 (IL)를 -7 추가합니다. 비 - 활성화 T 세포를 나타내는 이상 측정을위한 대조군으로 사용할 구슬 미처리 T 세포의 일부를 유지한다.
- 12 시간 후, 부드럽게 각 세포 현탁액을 피펫 아니라 상하 어느 비드 세포 복합체 / 집계 침입하여 96- 웰 플레이트에서 T 세포를 수확. 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 모든 우물에서 정지를 수집합니다.
- T 또는 B 세포의 정제를 위해 이전에 사용 된 동일한 세포 격리 자석 내부의 현탁액을 함유하는 튜브를 배치하고 5 분 동안 휴식을 허용한다.
- T 세포 현탁액 INT 전송자석을 잡고 하나의 움직임에 용액을 주입하여 OA 새로운 폴리스티렌 튜브.
- 5 분 동안 500 XG에 세포를 원심 분리기. 다시 중단 2 × 106 세포 / ml의 농도를 얻기 위해 새로운 비장 세포 배지에서 세포.
- 비 - 활성화 T 세포와 비교하여 12 내지 24 시간 이후에 자극 (품질 관리 옵션) 유동 세포 계측법에 의한 GFP 발현 강도를 평가한다. (12)
주 : GFP 형광이 Nur77 GFP T 세포에 내재하고 TCR의 성공적인 활성화시에 발현된다. (12) - 현미경으로 생존 및 활성화 (선택 사항)의 평가를 들어, 0.2 μg의 / ㎖의 농도로 훽스트 30 분 전에 분석과 활성화 된 세포를 얼룩. 커버 슬라이드 또는 평저 블랙 양면 384- 웰 플레이트의 웰에 세포 현탁액의 적절한 양을 첨가하고 살아있는 세포를 평가하기 위해 형광 현미경으로 조사한다. 죽은 세포는 핵을 보유하지 않습니다더럽히는 것. (14)
6. B 세포 활성화 및 GFP 발현의 유도
- 은 T-25 배양 플라스크를 사용하여, 1 × 106 세포 / ㎖에서 단리 된 B 세포를 다시 일시.
- 200 NG / ml의 농도에서 10 μL / mL의에서 항 - 마우스 IgG / IgM의 (H + 1) 및 재조합 CD40L를 추가합니다. (비 - 활성화 된 B 세포를 나타냄) 후에 측정 대조군 역할을 미처리 상기 B 세포의 일부를 유지한다.
- 비 - 활성화 된 B 세포와 비교하여 12 또는 24 시간 후 자극의 유동 세포 계측법에 의한 GFP 발현 강도를 평가한다.
참고 : GFP의 형광이 Nur77 GFP B 세포에 내재하고 BCR의 성공적인 활성화에 명시되어있다. (12) - 현미경으로 생존 및 활성화 (선택 사항)의 평가를 들어, 0.2 μg의 / ㎖의 농도로 훽스트 30 분 전에 분석과 활성화 된 세포를 얼룩. 세포 현탁액의에 적절한 볼륨을 추가형광 현미경 커버 슬라이드 또는 평면 바닥 검은 색면 384 웰 플레이트의 우물에와 검사는 살아있는 세포를 평가합니다. 죽은 세포는 핵 염색을 유지하지 않습니다. (14)
작은 분자 7. 높은 처리량 검열
- 2 × 10 6 세포 / 활성화 된 T 또는 B 세포의 ㎖ (자석 구슬 또는 항체 / CD40L) 또는 비 활성화 그룹에서 세포 현탁액을 준비합니다.
- 플레이트 75,000 세포 / 웰의 384 웰 플레이트 (40 μL 볼륨). 평평한 바닥 검은 색면 384 웰 플레이트 또는 훽스트 얼룩을 사용하여 형광 현미경 (이전 HTS에 대한 선택적 품질 관리 단계)에 의해 생존 및 활성화 평가를위한 현미경 커버 슬라이드를 사용하여 (단계 5.8 및 자세한 내용은 6.4 참조). (14)
- 수동 또는 자동화 된 시스템을 사용하여, 잘 각각 (0.5 % DMSO에 용해) 선택의 약물을 추가 할 수 있습니다.
- (활성화) 양성 및 음성 (비 ACTI에 차량 (DMSO)를 추가비활) 제어 우물. 0.5 %의 최대 DMSO 농도를 조정한다.
- 24 시간 (또는 배양 선택의 시간) 37 ºC에서 5 % CO 2의 접시를 품어.
- (. 1 : 3333; 예를 들어, 50 μL에 총 부피를 생성하기 위해 384- 웰 플레이트에서 세포에 10 μL를 추가) 스크리닝의 날, 훽스트 33342 염색 액을 희석한다. 0.2 μg의 / ml의 농도를 달성하기 훽스트 용액을 첨가하여 GFP 분석 전에 30 분 얼룩.
- 부드럽게 웰 각각에서 균일 한 분포를 얻기 위해 상하 세포를 피펫.
주 :이 단계는 세포의 반대 흐름 방향으로 상기 웰의 일측에 축적되는 경향으로 자동화 된 시스템을 사용하여 약물 (단계 7.3)를 송출하는 경우에 중요하다. - 실온에서 3 분 동안 45 XG에 플레이트 스핀.
- 실온에서 15 분 동안 나머지 판을 떠난다.
- 자동화 된 공 초점 높은 콘텐츠 scre를 사용하여, 플레이트 (들) 읽기 아웃을 수행, 체결 (HCS) 시스템. (15) 기계에 플레이트를 넣습니다. 40X 이상 배율로 목표를 설정합니다. 훽스트 (UV 램프) 및 GFP를위한 카메라 # 1 (레이저 488)에 대한 카메라 # 4를 사용합니다. 물론 당 6-10 필드를 읽을 수있는 기계를 설정합니다. 488 nm의 (GFP를 읽을) 및 자외선 (훽스트을 읽을)에서 필드 당이 순차적으로 판독을 수행하는 기계를 조정합니다. 40X 이상 배율로 목표를 설정합니다.
주 : 시스템이 조정을 필요로하지 않는 컴퓨터 현미경입니다. 초점 거리, 입사광의 강도와 노출 시간은 시스템에 의해 자동으로 모두 설치된다.
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Representative Results
고온 초전도 분석의 디자인
본원 형광 분석법을 설계 할 때 중요한 두 가지 요인을 고려 하였다. 먼저, T- 또는 B 세포 활성화는 질병 (예를 들어, 이식편 대 숙주 병)을 나타내는 것이되는 생리 학적 상태를 재현 할 필요가 있었다. 둘째, 세포 활성에 대한 평가가 민감하고 정량적 인 방법을 이용하여 수행되어야한다. 그것은 이러한 요구에 대응으로 형광 요즘 HTS 읽기 아웃에 대한 기본 선택 중 하나입니다. 10, 16 강력한 GFP 판독이 Nur77 GFP에 따라 얻을 수있는 바와 같이, 시험 관내 또는 생체 내에서 모두 T 또는 B 세포 자극 - 유래, (12) 우리의 분석은 내가위한 작업 모델로 비 활성화하고 활성화 된 세포를 구별하기 위해이 전략을 악용면역 조절 화합물의 dentification.
원래, 우리의 분석의 디자인은 미분 획 자극 비장 세포를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 GFP 평가에 근거했다. 이 경우, 모두 비 활성화 / 활성화 T 및 B 세포는 항 CD3 또는 각각 이전 GFP 평가에 안티 CD19, 염색된다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, T 세포 (CD3 + 세포)의 소정의 마우스 비장의 약 30 %를 나타낸다. 정상 상태에서, GFP 레벨은 (인해 주변의 개발 또는 항상성 자극 동안 TCR을 통해 포스트 흉선 선택에 대부분)의 10 %의 범위에 있었다. CD3 / CD28 비드 사용 TCR 자극 후, GFP 발현 비율의 5-6 배 증가 (대신에 10 %의 57 %)의 (- B도 1a) CD3 + T 세포를 검출 하였다. 마찬가지로, B 세포 (CD19 + 세포) 총 비장 세포의 50~55%을 대표하고 그들의 기초 GFP의 전Pression의 비 - 활성화 T 세포에 필적 (예, ~ 10 %,도 1C). 그러나 흥미롭게도, 항 - 마우스 IgG / IgM의 재조합 CD40L를 사용 BCR 자극은 GFP 발현 사소한 증가 (- D 33 % 대신 12 %,도 1C)을 트리거. GFP 발현 활성화 T 또는 B 세포에서 스크리닝 소분자의 약물 효과를 평가하기위한 중요한 요소이기 때문에, 그 강도를 최적화 심사의 감도와 성공의 핵심이다.
정제 된 T 또는 B 세포를 사용하여 GFP 발현의 평가
T 및 B 세포 자극이 분획의 비장 세포를 사용하여 직접 실현 될 수 있지만, 판독 아웃이 현미경에 의해 수행 될 경우 특히 상기 GFP 발현 강도 스크리닝 충분히 민감하지 않았다. 세포 반응을 개선하기 위해, T 세포는 제 1 자성층에 의해 정제 하였다시판되는 키트 (도 2a)를 이용하여 비드. 이전 분획의 비장 세포를 사용하여 도시 된 바와 같이, 격리 된 CD3 + T 세포의 10 %는 GFP 양성 (기저 식)이었다. 이러한 맥락에서, CD3 / CD28 비드를 사용하여 T 세포 자극은 현저히 GFP 응답 (- 2B, 분획의 비장 세포를 사용했을 때 57 % 반대로 86 %도 2a)을 향상시켰다. 유사한 향상은 B 세포 (- 2D 80 % 대신 33 %도 2C)로 수득 하였다. 이러한 결과는 명확 정제 T 및 B 세포의 사용이 제안 된 표현형 선별 적합 GFP 발현을 최대화하는 것을 보여준다.
디자인 된 HTS 분석의 개략도
전반적으로, 분석은 서브 분할 된 네 개의 주요 섹션 (그림 3)로 할 수있다. 예를 들어, T 세포의 경우, 비장세포 현탁액 (4-5 단계) CD3 / CD28 비드를 사용하여 시험 관내에서 12 시간 자극 공정이어서 T 세포를 정제하기 위해 (단계 1-3)에서 제조된다. 활성화 된 T 세포는 도금 및 HCS 자동화 시스템을 이용하여 GFP 및 훽스트 강도의 평가 이전에 384 웰 플레이트에 원하는 작은 분자 (6-7 단계)와 함께 24 시간 동안 배양한다. 동일한 분석은 단계 4-5에서 수행 수정하여 B 세포를 위해 사용될 수있다. 간략하게, B 세포는 항 - 마우스 IgG / IgM의 재조합 CD40L 비드 대신 자극 할 수있다. 이러한 구성 요소 (예를 비드에 결합되지 않은) 자신의 가용성 형태에서 사용되는 바와 같이, B 세포는 단순히 스크리닝 공정에 384 웰 플레이트에 도금하기 전에 세척하고 12 시간 동안 배양 할 수있다.
효율적인 T 세포의 생존은 HTS 연구의 성공을위한 원시입니다. 따라서, 두 개의 한계 요인 분석의 품질을 저해 할 수 있으며 고려되어야한다. 먼저뮤린 T 세포는 시험 관내 자극 다음 아폽토시스에 매우 민감하다. 17 번째, 모든 시험 화합물은 제 스트레스 인자를 추가 수도 DMSO 용액에 희석된다. 셀 손실, 재조합 IL-7 (2 NG / ㎖)을 최소화하기 위해 단계 4-5에서 TCR 자극에 T 세포에 첨가 하였다. 이 항상성 사이토킨 증식을 지원하며 BCL-2, BCL-XL과의 Mcl-1 항 - 아폽토시스 분자의 발현을 통해 T 세포의 생존율을 향상시킨다. 18, 19, 20, 21, 22
4398 화합물의 차 높은 처리량 검사는 T 세포 활성화의 여러 활성제 및 억제제를 보여준다
고 스루풋 스크리닝 비활성 (네거티브 공동 75,000 도금함으로써 행했다ntrol) 또는도 4에 표시되는 바와 같이 활성화 된 T 세포 (양성 대조군). 높은 재현성을 보장하기 위해, 분석은 0.87 (도 5a)의 Z 얻어진 계수 수회 행 하였다. HCS 시스템을 사용하여 자극 된 T 세포의 관찰 GFP 발현은 GFP 억제 화합물은 용이하게 검출 될 수있는 영역 'A' '액션 창'(도 5a)의 생성을 허용 비자극 T 세포보다 20 배 높았다. 이것은 스캔 필드 셀의 총 개수로 나누어 형광 세포의 수의 관점에서 도시된다. 도 5a에 도시 된 예에서, (320) 화합물의 스크리닝 1.5-2.5 폴드 의해 GFP 발현을 억제 할 수있는 세 가지 화합물 (적색 화살표가 가리키는 아웃)를 공개했다. 이 예에서, 양의 제어 값은 0.44 ± 0.02이고, 음성 대조군은 0.02 ± 0.00이었다.
일4398 화합물 (0.85 Z 계수)의 총 전자 심사는 실시 하였다. 화합물은 136,000 엔티티 (도 5b)를 포함하는 전체 화학 라이브러리를 나타내는 그들의 화학 구조에 기초한 시드 / 대표 화합물 의약 화학자에 의해 선택되었다. 분석의 끝에서 GFP 억제 분석 (포지티브 deviators) 억제 또는 GFP 발현 (네거티브 deviators)을 향상 할 수있는 하나의 화합물을 확인 하였다.
그림 1 : TCR 또는 미분 획 비장 세포에서 수행 BCR 활성화 다음 T- 분석 및 B 세포 GFP 식입니다. (A) 항 CD3의 부재하에 비장 세포를 이용하여 항체 (좌측 상단 패널) 또는 CD3 / CD28 비드의 존재 (오른쪽 패널)로 염색 한 T 세포의 주제 유동 세포 계측법 분석. 두 T 세포 집단 GFP 발현은 표시된맨 아래에. T 세포의 유동 세포 계측법 분석에 의해 얻어진 GFP 발현 (B) 백분율. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 비장 세포를 항 - 마우스 IgG / IgM의 사용을 활성화 재조합 CD40L 후 CD19 스테인드 것 외에는 (A)와 유사하게 (C). B 세포의 유동 세포 계측법 분석에 의해 얻어진 GFP 발현 (D) 백분율. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 모든 도시 실험 (* P <0.05 *** P <0.001, N = 5 / 군) 적어도 3 회 반복 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 각각 TCR 또는 BCR 활성화 다음 정제 된 T 또는 B 세포를 사용하여 GFP 발현 분석. (A) Repres항 CD3 항체로 염색 정제 T 세포 entative 유동 세포 계측법 분석. GFP 유도를 들어, 정제 된 T 세포는 CD3 / CD28 비즈 (오른쪽 패널)를 사용하여 자극 하였다. 비 - 활성화 T 조절 세포는 왼쪽 상단 패널에 표시된다. 모두 비 활성화하고 활성화 된 T 세포의 GFP 발현은 하단에 표시된다. T 세포의 유동 세포 계측법 분석에 의해 얻어진 GFP 발현 (B) 백분율. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. B 세포의 순도 CD19 염색으로 평가하고, 항 - 마우스 IgG / IgM의 재조합 CD40L을 사용하여 활성화되는 것을 제외하고는, (A)와 유사하게 (C). B 세포의 유동 세포 계측법 분석에 의해 얻어진 GFP 발현 (D) 백분율. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냅니다. 모든 도시 실험 (N = 5 / 군 *** P <0.001)을 3 회 이상 반복 하였다. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.
그림 3 : 표현형 검사의 단계를 나타내는 전체 개략도. 고온 초전도 시험을 준비하는 데 필요한 7 가지 주요 단계가 있습니다. 여성 Nur77 GFP의 마우스의 비장 (1 단계)을 분리하기 위해 희생된다. 비장 세포 현탁액 (단계 2)의 생성에 따라, T 세포에 부정적인 시판 키트 (단계 3)를 사용하여 (원하지 않는 세포의 고갈에 의해) 분리된다. 격리 된 T 세포는 다음 재조합 IL-7 37 ºC (단계 4)에서 둥근 바닥 96 웰 플레이트 부재 또는 CD3 / CD28 비드의 존재하에 배양된다. 12 시간 후 (단계 5), T 세포는 T 세포의 정제를 위해, 원래 사용 된 동일한 세포 격리 자석을 이용하여 비드 전에 제거 어떠한 응집물을 제거하기 위해 수회 피펫 팅한다. 격리 된 T 세포를 384 웰 플레이트 (75 CEL 000에 시딩LS / 웰, 또 다른 24 시간 (7 단계)의 화합물과 6 단계). 다음 날, 배양 된 세포는 전에 HCS 시스템 (8 단계)에 의한 분석에 훽스트 30 분으로 염색된다. 동일한 셋업은 단계 4를 제외하고 B 세포 기반 분석의 제조 추시 수 있으며 5는 자극이 수용성 형태로 추가되는 간단한 세척에 의해 대체되어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4 : 384 웰 플레이트에서 T 세포의 도금 레이아웃. 분석에 사용 된 각 판은 세 그룹이 포함되어 있습니다. 제 1 그룹, 웰 비 - 활성화 T 세포를 로딩 하였다 (판의 각 측면에 GFP에 대한 대조군; 웰 A1-P1 및 A24-P24), 제 그룹 DRU없이 T 세포를 활성화 함유 반면GS (긍정적 인 GFP에 대한 제어, 우물 A2-P2와 A23-P23). 모든 나머지 웰 스크리닝에 사용되는 화학 물질 실체 보충 된 T 세포를 활성화 함유. 모든 우물은 DMSO 0.5 %가 포함되어 있습니다. GFP의 훽스트 및 신호의 예로는 비 활성화하고 활성화 된 T 세포에 대해 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 1 차 표현형 검사. (A) (320)의 화합물에서 수행 차 검사의 대표적인 예. 비 - 활성화 된 T 세포는 높은 GFP 발현을 20 배 표시 TCR 자극 된 T 세포와는 달리 거의 GFP 널이다. (B) 모든 화합물 누적 데이터 분석을 이용하여 스크리닝. GFP의 발현은 화합물 디 보여다른 화합물 반면 플레잉 억제 작용은 T 세포 자극으로 행동했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여러 판독 방법은 민감하고 안정적인 HTS 분석의 개발에 이용되고있다. 이러한 색채, 발광 또는 형광 방법을 포함한다. 비색 방법은 설정이 간단하지만, 그들은 방해하거나 세포가 테스트되고 중단시킬 수있는 화학 물질의 다수의 추가가 필요합니다. 약리 효과는 특정 포인트에서 평가 된 바와 같이 (23) 또한, 이들은 생물학적 반응의 동적 평가를 허용하지 않는다. 자동화 된 HTS 사용하는 경우 또한,이 방법은 고가의 로봇 아암을 필요로 할 수있다. 이러한 요인으로 인해 자신의 성가신 요구 사항과 낮은 감도 HTS의 목적에 비색 읽기 아웃을 덜 호환. 발광은 비색 분석의 대안으로서 제안되어 있지만 (23)은 HTS 이러한 발광 테스트의 적용은 일반적으로 인한 세포 용해의 요구에 한정된다. 비록 다른 비 용해 프로토콜 드 것처럼이미 개발은 생물 발광 신호의 세기가 검출 생물 발광 신호 및 세포 활성의 실제의 변화 사이의 불일치를 일으키는 등 루시페린 흡수, 공동 인자, 산도의 가용성, 배지 또는 완충액의 투명성 등의 여러 가지 요인에 의해 방해 될 수있다. 24 따라서, 대부분의 분석은 형광 방법에 의존하고있다. 실제로, 형광 계 분석 초기에 세포가 활성화되면 세포 과정의 다양한 모니터링 할 작고, 높은 형광 유기 분자를 사용하여 개발되었다. 요컨대, 형광 분석은 높은 감도를 쉽게 HTS 동안 표현형 측정하도록 구성 될 수있다. (23)
여기에 제시된 개발 된 형광 기반 HTS 분석은 세 가지 주요 이점이있다. 첫째, 재현성, 신뢰성이 높고 같은 stimula를 이용하여 두 개의 서로 다른 기본 셀을 조절할 수있는 화합물 (T 및 B 림프구)의 선별을 위해 채용되고기 / 판독 개념. 예를 들어, 다섯 가지의 실행을 통해 완성되었다 4,398 화합물의 일차 스크리닝 (T 세포 분석을위한 각각 <5 % <15 %) 일관된 활성화 유도 GFP의 최소 내 간 분석 가변성와 신호를 표시. 둘째, 분석은 시판의 트랜스 제닉 마우스 모델을 사용한다. 일반적으로, 형광 계 분석의 디자인은 일차 세포의 유전 공학 또는 자극시 형광 신호를 표시하기 위해 관심있는 세포주를 필요로한다. 이 방법은 귀중한 실험 도구를 생성하지만, 일반적으로 과학적인 지역 사회에 쉽게 사용할 수 없습니다. 이 제한을 우회하기 위해 T 및 B 세포는 Nur77 GFP 형질 전환 마우스에서 분리 하였다. 이러한 림프구의 장점은 TCR 또는 BCR 자극에 따라 24 시간 이내에 GFP를 표현하는 능력이다. 따라서, 가능한 GFP 발현 또는 세포 전체를 구동하는 전사 기계를 변조 심사 약물응답은 매력적인 접근 방식을 나타냅니다. 셋째, 초기 기동 단계에서 CD3 / CD28 비드 T 세포를 보충하는 GFP 평가에 앞서 이러한 비드의 제거를 필요로한다. 현미경 그렇지 않으면 GFP 신호를 마스크 할 비드 이탈로 T 세포 활성화 / 금지를 분석에 사용되는 경우에 중요하다. 유동 세포 계측법은 분석을 위해 사용되고있는 경우는 모두 전방 및 측면 산란하여 게이팅 될 수있는 특정 관심 집단 등 (이 구체적 분석 추가적인 교란 제한 (들)을 생성하지 않은 경우), 비드 웰에 남아있을 수있다.
초기 목표는 최소한의 세포 처리와 심사 분석을 설계하는 것이 었습니다. 이러한 맥락에서, T 또는 분획의 비장 세포를 사용하여 B 세포의 활성화는 GFP의 음극 (도 1)를 유지 비드 또는 각각 림프구의 큰 비율로 한정 하였다 가용성 항체 / 재조합 CD40L 자극. 이 단계의 성공에 중요 같이분석의 프로토콜은 백분율 GFP 발현 세포를 증가시키기 위해 시판되는 키트를 사용하여 T 또는 B 세포를 정제하기 위해 수정되었다. 이러한 접근 방식은 크게 두 세포 집단의 활성 결과를 향상시켰다. 필요하다고 판단되는 경우에 선택하는 다른 방법은 T 및 B 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만, 제안 된 방법은 : ⅰ) 높은 재현성, ⅱ) 쉽게 종래 HTS로 유동 세포 계측법에 의해 분리 된 집단의 순도를 평가하기 위해 적응 된, ⅲ) 상기 정제 단계 효율적인 시간은 비교적 짧다 (~ 30 분) 및 최소 제제로 수행 될 수있다. 그러나, 본 연구에 제시된 분석은 마우스의 일차 전지의 사용에 기초한 것을 주목해야한다. 분석 보조 (확인을 위해) 및 차 (관심의 대상에 대한 최종 검증)을 식별 안타를 검증하는 기본 화면에서 다음을 수행해야합니다. 그것은 쉽게 다른 세포주 다양한 I의 약리 효과를 적용 할 수 있지만종 사이의 지속 효과를 예측 할 수있는 방법이 없기 때문에 - dentified 안타는 다른 종 (차 분석의 예 예를 들어 인간의 세포)에 대한 추가 검증이 필요합니다. 요컨대,이 분석은 인간에게 시험관 / 동물 시험에서 결과의 가능한 외삽 새로운 가능성 안타 및 / 또는 분자 표적의 식별을 위해 유용합니다.
설계된 분석 모두 T 및 B 세포가 이용 될 수 있더라도, 하나의 장점은,이 경우에 T 세포의 용도에 부여된다. TCR의 활성화는 보통 차 (예를 들면 항 CD3 또는 안티 TCR)를 통해 수여 이중 자극과 보조 협력 활성화 (예를 들면 항 CD28) 신호를 필요로한다. 25, 26은 흥미롭게도, 항 CD3, 항 CD28 항체는 모두 직접 자성 비드 표면에 결합하여 구입 될 수 있으며, t를 추가하기 전에 표준 자석을 이용하여 세포 현탁액으로부터 제거 될 수있다그는 화학 화합물은 심사에서 시험한다. 알 화학적 실체와 라이브러리가 사용되는 바와 같이, 시험 화합물 및 TCR 결합 홈에 결합 된 이들 사이의 가능한 간섭을 최소화 할 수 이들 TCR 복합체에 결합 된 분자의 자유 T 세포를 활성화 보유하기. 지속 생리적 TCR 활성화 대상 T 세포 작업 반대로 27은 또한 T 세포 활성화를 모방 다음 생리 상황 자극 제거제. 이 심사에서 작은 농도에서 사용 특히이 주어진 화합물의 약리 효과를 무시할 수로 후자의 상황은 문제가 될 수 있습니다. B 세포에서 동일한 효과를 발휘에는 시판 비드가 없을 때, 이는 B 세포에 대한 자극의 지속적인 존재는 분석의 성능을 제한할지 여부를 나중에 검사에 HTS 수행 흥미로울 것이다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 몬트리올 대학교에서 제공하는 머크 Frosst 시동 기금에 의해 지원되었다. 우리는 그들의 토론, 의견과 피드백을위한 면역학 및 암 연구를위한 연구소의 높은 처리량 플랫폼에서 박사 진 Duchaine와 도미닉 Salois에게 감사의 말씀을 전합니다. Moutih Rafei는 퐁 드 라 공들인 엉 상테 뒤 퀘벡 주니어 1 상을 보유하고있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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