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Immunology and Infection

एक प्रतिदीप्ति आधारित लिम्फोसाइट परख छोटे अणुओं के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त

Published: March 10, 2017 doi: 10.3791/55199
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1,2,3
1Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 2Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal, 3Molecular Biology Program, Université de Montréal

Summary

हम वर्तमान अध्ययन में मौजूद एक उपन्यास प्रतिदीप्ति आधारित एक ट्रांसजेनिक माउस से निकाली गई लिम्फोसाइट का उपयोग परख। इस परख सकते हैं या तो बाधा या लिम्फोसाइट सक्रियण को बढ़ावा देने की क्षमता के साथ संपन्न छोटे अणुओं के उच्च throughput स्क्रीनिंग (एचटीएस) के लिए उपयुक्त है।

Abstract

उच्च throughput स्क्रीनिंग (एचटीएस) वर्तमान में रासायनिक जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं या सेलुलर प्रक्रियाओं नियमन करने में सक्षम संस्थाओं की पहचान के लिए मुख्य आधार है। जैव प्रौद्योगिकी की उन्नति और छोटे अणुओं के उच्च translational क्षमता के साथ, दवाओं की खोज में नवीन दृष्टिकोण की एक संख्या विकसित किया है, जो एचटीएस के उपयोग में उभरते ब्याज बताते हैं। ऑन्कोलॉजी क्षेत्र वर्तमान में दवा स्क्रीनिंग के लिए सबसे अधिक सक्रिय अनुसंधान के क्षेत्र, प्रत्यारोपण से संबंधित जटिलताओं या स्व-प्रतिरक्षित बीमारियों को लक्षित नई इम्यूनोमॉड्यूलेटरी यौगिकों की पहचान के लिए किया जाता है कोई बड़ी सफलता के साथ है। यहाँ, हम इन विट्रो murine फ्लोरोसेंट आधारित लिम्फोसाइट परख में एक उपन्यास आसानी से नए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी यौगिकों की पहचान के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करते हैं। इस परख टी या बी कोशिकाओं एक ट्रांसजेनिक माउस, जिसमें Nur77 प्रमोटर टी या बी सेल रिसेप्टर उत्तेजना पर ड्राइव GFP अभिव्यक्ति से निकाली गई उपयोग करता है। GFP तीव्रता को दर्शाता है के रूप मेंलक्ष्य सेल के सक्रियण / ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि, हमारे परख सेलुलर / जैविक प्रतिक्रियाओं पर दिए गए परिसर (एस) के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास उपकरण को परिभाषित करता है। उदाहरण के लिए, एक प्राथमिक स्क्रीनिंग एक 'लक्ष्य परिकल्पना ", जो 160 संभावित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधियों को प्रदर्शित हिट की पहचान करने के लिए नेतृत्व के अभाव में 4398 यौगिकों का उपयोग किया गया था। इस प्रकार, इस परख के उपयोग में इन विट्रो / विवो सत्यापन पढ़ाई को आगे करने से पहले बड़ी रासायनिक पुस्तकालयों की खोज दवाओं की खोज के कार्यक्रमों के लिए उपयुक्त है।

Introduction

उच्च throughput प्रदर्शन (एचटीएस) एक सिद्ध रणनीति में व्यापक रूप से नए चिकित्सीय अणु की पहचान के लिए या नए संकेत चिकित्सा में एफडीए को मंजूरी दी दवाओं के repositioning के लिए अपनाया है। 1 अब तक हासिल एचटीएस सफलता में पहले की खोज की दवाओं की अधिकता से मापा जा सकता है। उदाहरण के लिए, tyrosine kinase अवरोध lapatinib स्तन कैंसर, sitagliptin के इलाज के लिए इस्तेमाल किया; एक dipeptidyl पेप्टिडेज़ -4 (डीपीपी -4) अवरोध करनेवाला एक विरोधी hyperglycemic दवा के रूप में प्रयोग किया जाता है, और मौखिक BCR-Abl tyrosine kinase अवरोध पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया के इलाज के लिए इस्तेमाल किया dasatinib दवाओं को मंजूरी दी मूलतः द्वारा की खोज की एक लंबी सूची के कुछ उदाहरण का प्रतिनिधित्व एचटीएस। 2 हालांकि दवा उद्योग की उत्पादकता में हाल ही में नए रासायनिक संस्थाओं की खोज में कमी से पीड़ित है, सफल दवाओं की खोज की संभावना पूर्व नैदानिक कैंडिडा की संख्या में वृद्धि के माध्यम से सुधार किया जा सकताटीईएस modulatory जैविक / जैव रासायनिक गुण प्रदर्शित। तदनुसार, प्ररूपी स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित नई एचटीएस assays के विकास की क्षमता नई दवा हिट की खोज के लिए महत्वपूर्ण औषधीय उपकरण प्रदान करने की पेशकश कर सकता। 3, 4, 5, 6 इसके अलावा, एचटीएस अब कस्टम डिजाइन लचीला रोबोट प्रतिष्ठानों, उपन्यास पढ़ने के लिए बाहर प्रौद्योगिकियों और व्यापक miniaturization सहित हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण तकनीकी परिवर्तनों के कारण एक तेज गति से किया जा सकता है। 2, 7 कारकों प्ररूपी स्क्रीनिंग (उर्फ आगे औषध विज्ञान) के उपयोग में बढ़ती रुचि के लिए योगदान के अलावा धारणा है कि आणविक लक्ष्य (लक्ष्य आधारित स्क्रीनिंग / जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं) के बारे में oversimplified न्यूनीकारक मान्यताओं के बजाय कार्यात्मक प्रभाव पर ध्यान केंद्रित कर अधिक होने की संभावना है दर्शाना डब्ल्यू नैदानिक ​​प्रभावकारिता। इस प्रकार, प्ररूपी स्क्रीनिंग नए संभावित चिकित्सीय यौगिकों और वर्तमान में असाध्य रोगों की आणविक रास्ते उजागर करने के लिए वादा है। 2

ठीक से एक दिया आणविक लक्ष्य या सेलुलर समारोह के लिए अवरोधकों या activators की पहचान करने के लिए, एक बेहद संवेदनशील और विश्वसनीय परख आदेश सदाशयी हिट और झूठी सकारात्मक के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। तो, क्या एक अच्छा परख बनाता है? एक दिया परख की गुणवत्ता पहले संकेत करने वाली शोर अनुपात (एक जेड कारक के माध्यम से परिलक्षित) द्वारा न्याय किया जाना चाहिए। 8 दूसरा, लक्षित प्रभाव या स्क्रीन के लक्ष्य को स्पष्ट रूप से स्थापित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक सेल आधारित दृष्टिकोण के रूप में एक परख विशेष रूप से बाध्यकारी ligand रिसेप्टर का आकलन करने के लिए तैयार करने के लिए विरोध रिसेप्टर स्क्रीनिंग के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकते हैं। इस का कारण यह है कि बाद के दृष्टिकोण एगोनिस्ट और प्रतिपक्षी ligands के बीच अंतर नहीं कर सकता है।एस एस = "xref"> 9 इसके विपरीत, एक सेल आधारित दृष्टिकोण (भेदभाव प्रसार, सेल चक्र गिरफ्तारी, apoptosis, और / या) को और अधिक प्रभावी रूप रिसेप्टर समारोह सीधे एक जैविक phenotype में मूल्यांकन किया जा सकता होने की संभावना है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जैव रासायनिक assays प्ररूपी assays से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान कर सकते हैं के रूप में वे एक विशिष्ट intracellular लक्ष्य पर उल्लंघन। एक अच्छी तरह से अनुकूलित जैव रासायनिक परख आम तौर पर एक प्ररूपी स्क्रीनिंग की तुलना में कम डेटा बिखराव होगा, जबकि बाद में कार्रवाई की दवा आणविक तंत्र से संबंधित जांच को सरल बनाने। हालांकि, लक्ष्य के आधार पर या जैव रासायनिक assays की बड़ी खामी झूठी सकारात्मक हिट जब एक जैविक प्रणाली (विशिष्टता मूल रूप से जैव रासायनिक परख में अध्ययन के नुकसान) में परीक्षण गैर विशिष्ट लक्ष्यों को प्रभावित कर सकता है कि की दर amplifying की संभावना है। 10 हालांकि नकारात्मक और सकारात्मक हिट के बीच एक अच्छी तरह से स्थापित कट ऑफ बिंदु झूठी सकारात्मक की संख्या को कम कर सकते हैं मैंn प्राथमिक स्क्रीनिंग, एक physiologically प्रासंगिक ऐसे बरकरार कोशिकाओं, पूरे ऊतक या पूरे जानवर के रूप में देशी सेलुलर पर्यावरण नकल उतार प्रणाली के उपयोग परख डिजाइन पेंडुलम की कोर बनी हुई है। इसलिए, प्ररूपी स्क्रीनिंग यौगिक की गतिविधि या कार्रवाई की विधा के पूर्व ज्ञान के बिना कोई पहचान दवा लक्ष्य के साथ रोगों के लिए वांछनीय जैविक / प्ररूपी प्रभाव के साथ नेतृत्व की खोज के लिए सक्षम बनाता है। 1 1

एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस मॉडल और रासायनिक यौगिकों के एक संकुल उप-family: इस के साथ साथ अध्ययन के विकास और एक अनुकूलित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने प्ररूपी दो महत्वपूर्ण घटकों पर आधारित स्क्रीनिंग के परीक्षण का सवाल है। पशु मॉडल के लिए सम्मान के साथ, परख, जिसमें हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) की अभिव्यक्ति वें से प्रेरित है एक माउस तनाव (Nur77 GFP) के एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र एक कैसेट युक्त शरण देने से निकाली गई लिम्फोसाइटों के उपयोग पर निर्भर करता हैई Nur77 प्रमोटर। 12 इस उत्तेजना की बानगी तथ्य यह है कि Nur77 एक तत्काल जल्दी जीन टी सेल रिसेप्टर (TCR) या बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) उत्तेजना के बाद विनियमित है पर आधारित है। 12 स्क्रीनिंग विधि खुद के लिए के रूप में, एक दृष्टिकोण तुच्छ analogues की स्क्रीनिंग से परहेज करते हुए समय एक बड़ी रासायनिक पुस्तकालय (> 10 5 यौगिकों) का आकलन करने की जरूरत को कम करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ऐसा करने के लिए, आभासी स्क्रीनिंग उपकरण का उपयोग औषधीय दवा की दुकानों द्वारा चयनित रासायनिक यौगिकों का एक डाटाबेस संदर्भ के रूप में जाना जाता सक्रिय बीज संरचनाओं का उपयोग topologically इसी तरह के यौगिकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह दृष्टिकोण हमें 136.000 से अधिक रासायनिक संस्थाओं की एक समग्र पुस्तकालय का प्रतिनिधित्व 4398 यौगिकों स्क्रीन करने के लिए अनुमति दी।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल Université de मॉन्ट्रियल के पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। चूहे तक कोई महत्वपूर्ण संकेत ग्रीवा अव्यवस्था के बाद मनाया गया सीओ 2 के क्रमिक साँस लेना द्वारा euthanized थे। प्रक्रिया एक प्रमाणित व्यक्ति द्वारा किया गया यह सुनिश्चित करें कि जानवरों को एक मानवीय ढंग से euthanized और पशु की देखभाल पर कनाडा परिषद की सिफारिशों के अनुसार किया गया।

1. Splenocyte मध्यम और प्रवाह cytometry बफर की तैयारी

  1. एक 70% इथेनॉल-साफ जैविक हुड के तहत सभी चरणों का प्रदर्शन।
  2. पूर्व गर्म रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान के 70 एमएल (RPMI) 1640 1x मध्यम (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और छान 500 मिलीलीटर मात्रा बाँझ बोतलों में आपूर्ति) और एक बाँझ ट्यूब में जगह निकालें। हटा मध्यम बाद में प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाएगा।
  3. RPMI के शेष 430 एमएल 1640 1x अनुपूरक 50 मिलीलीटर निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 के साथएमएल HEPES, 5 मिलीलीटर गैर आवश्यक अमीनो एसिड होता है, 5 एमएल सोडियम पाइरूवेट, और 0.05 एमएल फ़िल्टर (1 मी) 2-मर्केप्टोइथेनाल।
    नोट: पूर्व गर्म splenocyte मध्यम एक पानी के स्नान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट गर्मी चौंकाने वाला कोशिकाओं से बचने के लिए इस्तेमाल करते हैं। इस सेलुलर apoptosis के शामिल से बचने के लिए महत्वपूर्ण है।
  4. प्रवाह cytometry बफर तैयार करने के लिए, 98 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के लिए FBS के 2 एमएल जोड़ने और प्रशीतित उपयोग करें जब तक (अधिमानतः के भीतर तीन दिन) रहते हैं।

2. Nur77 GFP माउस Spleens से Splenocyte सेल निलंबन की जनरेशन

  1. एक septically एक 6-8 सप्ताह पुराने महिला Nur77 GFP माउस से तिल्ली अलग।
    1. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, बाँझ हुड के तहत काम करते हैं। 70% इथेनॉल में बलिदान माउस फर, कैंची और संदंश लेना।
    2. अपनी सही पक्ष पर माउस निर्धारित करना, त्वचा और ऊपरी बाएँ पेट की मांसपेशियों चक्र में कटौती। चीरा क्षेत्र दिख तिल्ली का पता लगाने के लिए तो यह बाहर कटौती का निरीक्षण किया। तिल्ली रखेंतैयार है जब तक बर्फ पर splenocyte माध्यम में अगले कदम के प्रदर्शन करने के लिए।
  2. तिल्ली (एस) एक 10 सेमी 2 सेल संस्कृति पेट्री पूर्व गर्म splenocyte माध्यम के 5 मिलीलीटर युक्त डिश में रखें।
  3. तिल्ली एक बाँझ सिरिंज सवार का उपयोग कर जब तक समाधान परेशान है मैश। एक तिल्ली कोलेजन मैट्रिक्स प्रक्रिया के अंत तक रहना चाहिए।
  4. splenocyte माध्यम में व्यापक mashing के बाद, सेल निलंबन इकट्ठा करने और एक 70 माइक्रोन सेल एक 50 एमएल ट्यूब पर रखा फिल्टर बाहर करने के लिए किसी भी मलबे या थक्के झरनी के माध्यम से इसे पारित।
  5. 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला discarding के बाद, घर में उत्पादित या वाणिज्यिक लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 2-3 एमएल में सेल गोली फिर से निलंबित। बाद pipetting (2-3 बार) 20-30 एस के लिए निलंबन आराम करते हैं।
  6. पीबीएस के 5 मिलीलीटर या पसंद का एक उपयुक्त बफर जोड़ें तो 500 पर एक्स 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र जी।
  7. सतह पर तैरनेवाला निकालें (लाल रंग में होना चाहिए, यह lysed होता है के रूप में लाल खlood कोशिकाओं) और फिर से निलंबित splenocyte मध्यम 2 मिलीलीटर में सेल गोली।
  8. एक hemocytometer का उपयोग, रहते हैं और मृत (परिगलित) कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए trypan नीले रंग के साथ दाग कोशिकाओं की संख्या गिनती।

3. Splenocyte सेल निलंबन से टी-सेल अलगाव

  1. 500 से कम 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र x जी। 10 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक सेलुलर एकाग्रता प्राप्त करने के लिए सीरम मुक्त RPMI माध्यम में कोशिकाओं (1.3 कदम से 50 मिलीलीटर) फिर से निलंबित।
  2. एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और एक तरफ शुद्धि कदम के अंत में पवित्रता आकलन / तुलना के लिए splenocytes की एक 100 μL विभाज्य निर्धारित किया है।
  3. टी सेल अलगाव एंटीबॉडी कॉकटेल (50 μL / एमएल) के बाद 50 μL / एमएल सेल निलंबन के लिए सामान्य चूहे सीरम जोड़ें।
  4. सेल निलंबन मिलाकर 10 मिनट के लिए आराम करते हैं। यह कदम एंटीबॉडी कॉकटेल सभी अवांछित कोशिकाओं बाध्य करने की अनुमति देता है।
  5. streptavidin तेजी क्षेत्रों जोड़ें (चुंबकआईसी मोती) 2.5 मिनट के लिए, तो सीरम मुक्त माध्यम का उपयोग कर 2.5 एमएल मात्रा लाने के लिए।
  6. 3 मिनट के लिए एक सेल अलगाव चुंबक में ट्यूब रखें।
  7. चुंबक पकड़े और एक चाल में समाधान बाहर गिरने से एक नया polystyrene ट्यूब में टी सेल निलंबन स्थानांतरण।
    नोट: पृथक निलंबन शुद्ध टी सेल शामिल हैं। सभी अवांछित कोशिकाओं ट्यूब चुंबकीय streptavidin मोती के लिए बाध्य के पक्ष में आयोजित की जाती हैं।
  8. Trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग पृथक टी कोशिकाओं की गणना।
    नोट: इस चरण में पृथक टी कोशिकाओं की पवित्रता से पहले और प्रवाह cytometry द्वारा टी सेल अलगाव के बाद CD3 + घटनाओं का प्रतिशत का विश्लेषण करके सत्यापित किया जा सकता (वैकल्पिक)। 13
    1. संक्षेप में, सेंट्रीफ्यूज से कम 500 x जी splenocyte सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में प्रवाह cytometry बफर में कोशिकाओं को निलंबित।
    2. फ्लोरोसेंट टैग विरोधी समझौता ज्ञापनों जोड़े100: 1 की एकाग्रता में ई CD3 एंटीबॉडी। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक बार धोएं, सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए प्रवाह cytometry बफर (400 μL) में फिर से निलंबित।

4. Splenocyte सेल निलंबन से बी-सेल अलगाव

  1. के रूप में टी कोशिकाओं (कदम 3.1-3.8), लेकिन एक बी सेल अलगाव किट का उपयोग कर के लिए वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का पालन करें। पवित्रता मूल्यांकन के लिए, CD3 एंटीबॉडी के बजाय CD19 एंटीबॉडी का उपयोग करें। 13
    1. पवित्रता मूल्यांकन (वैकल्पिक) के लिए, CD3 एंटीबॉडी के बजाय CD19 एंटीबॉडी का उपयोग करें। अपकेंद्रित्र 1 से कम 500 x जी splenocyte सेल निलंबन के एमएल। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में प्रवाह cytometry बफर में कोशिकाओं को निलंबित।
    2. फ्लोरोसेंट जोड़े के 1 एकाग्रता में टैग किए विरोधी माउस CD19 एंटीबॉडी: 100 और 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। एक बार धोएं, सेंट्रीफ्यूज और प्रवाह cytometry बफर (400 μL) के लिए में फिर से निलंबितप्रवाह cytometry द्वारा आर विश्लेषण।

5. टी सेल सक्रियण और GFP अभिव्यक्ति की प्रेरण

  1. अच्छी तरह / 2.5 x 10 5 कोशिकाओं की एकाग्रता में टी कोशिकाओं के बीज, निलंबन, एक दौर तली 96 अच्छी तरह से थाली में।
  2. 2 एनजी / एमएल और CD3 / CD28 चुंबकीय मोती (25 μL / 10 6 कोशिकाओं) पर पुनः संयोजक इंटरल्यूकिन (IL) -7 जोड़ें। टी कोशिकाओं बाद में माप है कि गैर-सक्रिय टी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के मोतियों के साथ इलाज के एक हिस्से को रखें।
  3. बारह घंटे बाद, धीरे प्रत्येक में सेल निलंबन pipetting अच्छी तरह से ऊपर और नीचे किसी भी मनका-सेल जटिल / समुच्चय को तोड़ने के द्वारा फसल 96 अच्छी तरह से थाली से टी कोशिकाओं। एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब में सभी कुओं से निलंबन लीजिए।
  4. एक ही सेल अलगाव टी या बी कोशिकाओं की शुद्धि के लिए पहले से इस्तेमाल किया चुंबक अंदर निलंबन युक्त ट्यूब प्लेस और इसे 5 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. टी सेल निलंबन int स्थानांतरणचुंबक पकड़े और एक चाल में समाधान बाहर गिरने से OA नई polystyrene ट्यूब।
  6. 5 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। पुनः निलंबित ताजा splenocyte माध्यम से कोशिकाओं को 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पाने के लिए।
  7. गैर सक्रिय टी कोशिकाओं की तुलना में 12 से 24 घंटे के बाद उत्तेजना में प्रवाह cytometry (गुणवत्ता नियंत्रण के लिए वैकल्पिक) द्वारा GFP अभिव्यक्ति तीव्रता का आकलन करें। 12
    ध्यान दें: GFP प्रतिदीप्ति Nur77 GFP टी कोशिकाओं के लिए स्वाभाविक है और TCR के सफल सक्रियण पर प्रकट होता है। 12
  8. माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यवहार्यता और सक्रियण (वैकल्पिक) के आकलन के लिए, 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में Hoechst 30 मिनट विश्लेषण करने से पहले साथ सक्रिय कोशिकाओं दाग। सेल निलंबन की पर्याप्त मात्रा एक कवर स्लाइड करने के लिए या एक फ्लैट तली काले तरफा 384 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ें और प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे की जांच जीवित कोशिकाओं का आकलन करें। मृत कोशिकाओं परमाणु बरकरार नहीं होगाधुंधला हो जाना। 14

6. बी सेल सक्रियण और GFP अभिव्यक्ति की प्रेरण

  1. एक टी -25 संस्कृति कुप्पी का प्रयोग, 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल पर पृथक बी कोशिकाओं फिर से निलंबित।
  2. विरोधी माउस आईजीजी / 10 μL / एमएल आईजीएम (एच + एल) और पुनः संयोजक CD40L 200 एनजी / एमएल की एकाग्रता में जोड़ें। बाद में मापन के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए इलाज बी कोशिकाओं के एक हिस्से रखें (गैर सक्रिय बी कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व)।
  3. गैर सक्रिय बी कोशिकाओं की तुलना में 12 या 24 घंटे के बाद उत्तेजना में प्रवाह cytometry द्वारा GFP अभिव्यक्ति तीव्रता का आकलन करें।
    नोट: GFP प्रतिदीप्ति Nur77 GFP बी कोशिकाओं के लिए स्वाभाविक है और बीसीआर के सफल सक्रियण पर प्रकट होता है। 12
  4. माइक्रोस्कोपी द्वारा व्यवहार्यता और सक्रियण (वैकल्पिक) के आकलन के लिए, 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता में Hoechst 30 मिनट विश्लेषण करने से पहले साथ सक्रिय कोशिकाओं दाग। सेल निलंबन की पर्याप्त मात्रा में जोड़ेंएक कवर स्लाइड या एक फ्लैट तली काले तरफा 384 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से करने के लिए और जांच एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे जीवित कोशिकाओं का आकलन करने के लिए। मृत कोशिकाओं परमाणु धुंधला बनाए रखने के लिए नहीं होगा। 14

छोटे अणुओं का 7. उच्च throughput स्क्रीनिंग

  1. 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं को सक्रिय टी या बी कोशिकाओं की / एमएल (चुंबकीय मोती या एंटीबॉडी / CD40L) या गैर सक्रिय समूहों में एक सेल निलंबन तैयार करें।
  2. प्लेट 75,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से में एक 384 अच्छी तरह से थाली (40 μL की मात्रा)। (कदम 5.8 और जानकारी के लिए 6.4 देखें) एक फ्लैट तली काले तरफा 384 अच्छी तरह से थाली या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (एचटीएस करने से पहले वैकल्पिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम) Hoechst दाग का उपयोग करके व्यवहार्यता और सक्रियण के आकलन के लिए एक खुर्दबीन के कवर स्लाइड का प्रयोग करें। 14
  3. मैन्युअल या एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग कर, प्रत्येक के लिए चुनाव (0.5% DMSO में भंग) की दवाओं को अच्छी तरह से जोड़ें।
  4. वाहन (DMSO) सकारात्मक (सक्रिय) और नकारात्मक (गैर acti में जोड़ेबढ़ा) नियंत्रण कुओं। 0.5% की एक अधिकतम करने के लिए DMSO एकाग्रता को समायोजित करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे (या ऊष्मायन चुनाव के समय) और 5% सीओ 2 के लिए प्लेटें सेते हैं।
  6. स्क्रीनिंग के दिन, Hoechst 33342 दाग समाधान पतला (1:। 3333; उदाहरण के लिए 384 अच्छी तरह प्लेटें में कोशिकाओं के लिए 10 μL जोड़ने के 50 μL के लिए कुल मात्रा उत्पन्न करने के लिए)। 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए Hoechst समाधान जोड़कर GFP विश्लेषण से पहले 30 मिनट के दाग।
  7. धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक में एक समरूप वितरण प्राप्त करने के लिए ऊपर और नीचे कोशिकाओं पिपेट।
    नोट: यह कदम दवाओं (कदम 7.3) के वितरण के रूप में कोशिकाओं विपरीत प्रवाह की दिशा के लिए अच्छी तरह से एक के पक्ष में जमा करते हैं, एक स्वचालित प्रणाली का उपयोग करने के मामले में महत्वपूर्ण है।
  8. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 45 XG पर प्लेटों स्पिन।
  9. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए आराम करने के लिए प्लेटों छोड़ दें।
  10. स्वचालित confocal उच्च सामग्री scre का उपयोग कर प्लेट (ओं) को पढ़ने के बहिष्कार प्रदर्शन करना,ening (एचसीएस) प्रणाली। 15 मशीन के लिए प्लेट लोड। 40X या उच्च बढ़ाई उद्देश्य निर्धारित करें। Hoechst (यूवी दीपक) और GFP के लिए कैमरा # 1 (लेजर 488) के लिए कैमरा # 4 का प्रयोग करें। अच्छी तरह से प्रति 6-10 क्षेत्रों को पढ़ने के लिए मशीन की स्थापना की। 488 एनएम (GFP पढ़ने के लिए) और यूवी प्रकाश (Hoechst पढ़ने के लिए) पर क्षेत्र के प्रति दो अनुक्रमिक रीडिंग करने के लिए मशीन को समायोजित करें। 40X या उच्च बढ़ाई उद्देश्य निर्धारित करें।
    नोट: सिस्टम एक कम्प्यूटरीकृत माइक्रोस्कोप है कि किसी भी समायोजन की आवश्यकता नहीं है। फोकल दूरी, घटना के प्रकाश की तीव्रता और जोखिम के समय मशीन द्वारा स्वचालित रूप से सभी सेटअप कर रहे हैं।

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Representative Results

एचटीएस परख का डिजाइन

जब इस के साथ साथ फ्लोरोसेंट परख डिजाइनिंग दो महत्वपूर्ण कारकों को ध्यान में रखा गया था। सबसे पहले, हम एक शारीरिक स्थिति है जिसमें टी या बी सेल सक्रियण एक बीमारी (जैसे भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग) का प्रतिनिधित्व करेगा दोहराने की जरूरत है। दूसरा, सेलुलर सक्रियण के आकलन के एक संवेदनशील और मात्रात्मक विधि का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रतिदीप्ति आजकल एचटीएस पढ़ बहिष्कार के लिए प्राथमिक चुनाव में से एक के रूप में यह इन जरूरतों से मेल खाती है। 10, 16 के रूप में एक मजबूत GFP पढ़ने के लिए बाहर Nur77 GFP निम्नलिखित प्राप्त किया जा सकता टी या बी सेल उत्तेजना व्युत्पन्न दोनों इन विट्रो में या विवो में, 12 हमारे परख इस रणनीति के लिए मैं काम कर रहे एक मॉडल के रूप में गैर सक्रिय और सक्रिय कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए शोषणइम्यूनोमॉड्यूलेटरी यौगिकों के dentification।

मूल रूप से, हमारे परख के डिजाइन unfractionated प्रेरित splenocytes का उपयोग कर प्रवाह cytometry द्वारा GFP आकलन के आधार पर किया गया था। इस मामले में, दोनों गैर सक्रिय / सक्रिय टी और बी कोशिकाओं विरोधी CD3 या विरोधी CD19, GFP आकलन करने के लिए क्रमश: प्रायर के साथ दाग रहे हैं। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 ए, टी कोशिकाओं (CD3 + कोशिकाओं) एक दिया माउस तिल्ली का लगभग 30% का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्थिर अवस्था में, GFP स्तर (विकास या परिधि में होमियोस्टैटिक उत्तेजना के दौरान TCR के माध्यम से पोस्ट-थाइमिक चयन के कारण सबसे अधिक संभावना) 10% की सीमा में था। CD3 / CD28 मोतियों का उपयोग TCR उत्तेजना के बाद, GFP अभिव्यक्ति के प्रतिशत में वृद्धि के पांच से छह गुना करने के लिए (10% के बजाय 57%) CD3 + टी कोशिकाओं में पाया गया था (चित्रा 1 ए - बी)। इसी तरह, बी कोशिकाओं (CD19 + कोशिकाओं) कुल splenocytes की 50-55% का प्रतिनिधित्व करते हैं और उनके बेसल GFP पूर्वअभिव्यक्ति गैर सक्रिय टी कोशिकाओं के बराबर है (उदाहरण के लिए ~ 10%, चित्रा 1 सी)। दिलचस्प है, हालांकि, विरोधी माउस आईजीजी / आईजीएम और पुनः संयोजक CD40L का उपयोग कर बीसीआर उत्तेजना GFP अभिव्यक्ति में एक तुच्छ वृद्धि (- डी के बजाय 33% से 12%, चित्रा 1 सी) शुरू हो गया। GFP अभिव्यक्ति सक्रिय टी या बी कोशिकाओं पर जांच छोटे अणुओं के औषधीय प्रभाव का आकलन करने के लिए एक प्रमुख तत्व है, इसकी तीव्रता अनुकूलन संवेदनशीलता और स्क्रीनिंग की सफलता के लिए केंद्रीय है।

GFP अभिव्यक्ति का आकलन शुद्ध टी या बी कोशिकाओं का उपयोग

हालांकि टी और बी सेल उत्तेजना सीधे unfractionated splenocytes का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता, GFP अभिव्यक्ति तीव्रता खासकर अगर पढ़-बहिष्कार माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदर्शन किया जा रहा हैं जांच के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं था। सेलुलर प्रतिक्रिया में सुधार करने के लिए, टी कोशिकाओं पहली चुंबकीय द्वारा शुद्ध कर रहे थेएक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (2A चित्रा) का उपयोग करते हुए मोती। पहले से unfractionated splenocytes का उपयोग करते हुए दिखाया गया है, अलग-थलग CD3 + टी कोशिकाओं का 10% GFP सकारात्मक (बेसल अभिव्यक्ति) थे। इस संदर्भ में, टी सेल CD3 / CD28 मोतियों का उपयोग उत्तेजना काफी उनके GFP प्रतिक्रिया (- 2 बी, 86% जब unfractionated splenocytes इस्तेमाल किया गया के रूप में 57% करने का विरोध किया 2A चित्रा) में सुधार हुआ। इसी तरह के सुधार बी कोशिकाओं (- 2 डी, के बजाय 80% से 33% चित्रा 2 सी) के साथ प्राप्त किया गया। ये परिणाम स्पष्ट रूप से प्रदर्शित कि शुद्ध टी और बी कोशिकाओं के उपयोग GFP अभिव्यक्ति है, जो प्रस्तावित प्ररूपी स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है अधिकतम हो।

डिज़ाइन किया गया एचटीएस परख के योजनाबद्ध आरेख

कुल मिलाकर, परख उप-विभाजित चार प्रमुख वर्गों (चित्रा 3) में हो सकता है। उदाहरण के लिए टी कोशिकाओं के मामले में, एक splenocytesसेल निलंबन (कदम 4-5) आदेश टी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए (कदम 1-3) इन विट्रो में एक 12 घंटे उत्तेजना कदम CD3 / CD28 मोतियों का उपयोग करके बाद में तैयार किया जाता है। सक्रिय टी कोशिकाओं को फिर चढ़ाया और (कदम 6-7) 384 अच्छी तरह से प्लेट में छोटे पसंद के अणुओं स्वचालित एचसीएस प्रणाली का उपयोग GFP और Hoechst तीव्रता का आकलन पहले से 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं। एक ही परख कदम 4-5 पर प्रदर्शन संशोधनों के साथ बी कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संक्षेप में, बी कोशिकाओं विरोधी माउस आईजीजी / आईजीएम और पुनः संयोजक CD40L बजाय मोतियों के साथ प्रेरित किया जा सकता है। इन घटकों (जैसे मोतियों से जुड़ा हुआ नहीं है) उनके घुलनशील रूप में उपयोग किया जाता है के रूप में, बी कोशिकाओं 12 h तो बस स्क्रीनिंग प्रक्रिया के लिए 384 अच्छी तरह से प्लेटों में चढ़ाना करने से पहले धोया लिए incubated जा सकता है।

कुशल टी-सेल अस्तित्व एचटीएस अध्ययन की सफलता के लिए मौलिक है। तदनुसार, दो सीमित कारकों परख की गुणवत्ता में बाधा हो सकती है और ध्यान में रखा जाना चाहिए। प्रथम, Murine टी कोशिकाओं को अत्यधिक इन विट्रो उत्तेजना के बाद apoptosis के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। 17 दूसरा, सभी परीक्षण यौगिकों एक DMSO के समाधान के लिए एक दूसरे तनाव कारक जोड़ सकता है, जिसमें पतला कर रहे हैं। सेल नुकसान, पुनः संयोजक आईएल 7 (2 एनजी / एमएल) को कम से कम करने के लिए कदम 4-5 पर TCR उत्तेजना पर टी कोशिकाओं को सहारा लिया जाता था। इस होमियोस्टैटिक साइटोकाइन प्रसार का समर्थन करता है और इस तरह के बीसीएल -2, बीसीएल एक्सएल और एमसीएल -1 के रूप में विरोधी apoptotic अणुओं की अभिव्यक्ति के माध्यम से टी-सेल अस्तित्व को बढ़ाता है। 18, 19, 20, 21, 22

4398 यौगिकों के प्राथमिक उच्च throughput प्रदर्शन के कई activators और टी सेल सक्रियण के अवरोधकों का पता चलता है

एक उच्च throughput स्क्रीनिंग चढ़ाना गैर सक्रिय (नकारात्मक सह के 75,000 से बाहर किया गया थाntrol) या सक्रिय टी कोशिकाओं (सकारात्मक नियंत्रण) 4 चित्र में दिखाया गया है। उच्च reproducibility सुनिश्चित करने के लिए परख 0.87 (चित्रा 5 ए) के एक प्राप्त जेड कारक के साथ कई बार आयोजित किया गया। एचसीएस प्रणाली का प्रयोग, उत्तेजित टी कोशिकाओं की मनाया GFP अभिव्यक्ति एक 'जहां GFP निरोधात्मक यौगिकों आसानी से पता लगाया जा सकता जोन' 'कार्रवाई की खिड़की' (चित्रा 5 ए) की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है unstimulated टी कोशिकाओं की तुलना में 20 गुना अधिक था। इस स्कैन के खेतों में कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या के मामले में यह आंकड़ा में दिखाया गया है। उदाहरण चित्रा 5 ए में दिखाया गया में, 320 यौगिकों की स्क्रीनिंग तीन यौगिकों (लाल तीर द्वारा उठाई-बाहर) 1.5-2.5 परतों द्वारा GFP अभिव्यक्ति में बाधा के लिए सक्षम अनावरण किया। इस उदाहरण में, सकारात्मक नियंत्रण मूल्य 0.44 ± 0.02 था और नकारात्मक नियंत्रण 0.02 ± 0.00 था।

गु4398 यौगिकों (0.85 के Z कारक) के एक कुल की ई स्क्रीनिंग तब आयोजित किया गया। यौगिकों बीज / प्रतिनिधि 136.000 संस्थाओं (चित्रा 5 ब) युक्त एक समग्र रासायनिक पुस्तकालय का प्रतिनिधित्व उनकी रासायनिक संरचना के आधार पर यौगिकों के रूप में औषधीय केमिस्टों द्वारा चयन किया गया था। परख के अंत में, GFP निषेध के विश्लेषण पहचान या तो (सकारात्मक deviators) बाधा या GFP अभिव्यक्ति (नकारात्मक deviators) को बढ़ाने में सक्षम यौगिकों।

आकृति 1
चित्रा 1: टी का विश्लेषण और बी सेल GFP अभिव्यक्ति TCR या unfractionated splenocytes पर आयोजित बीसीआर सक्रियण के बाद। (ए) एक विरोधी CD3 एंटीबॉडी अभाव में splenocytes का उपयोग कर (ऊपर बाएं पैनल) या CD3 / CD28 मोतियों की उपस्थिति (शीर्ष सही पैनल) के साथ दाग टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह cytometry विश्लेषण। दोनों टी सेल समूहों के लिए GFP अभिव्यक्ति प्रदर्शित कर रहे हैंतल पर। (बी) टी कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा प्राप्त GFP अभिव्यक्ति का प्रतिशत। त्रुटि सलाखों मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करता है। (सी) (ए) इसी तरह, सिवाय इसके कि splenocytes विरोधी माउस आईजीजी / आईजीएम का उपयोग कर सक्रिय थे और पुनः संयोजक CD40L तो CD19 के लिए दाग। (डी) बी कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा प्राप्त GFP अभिव्यक्ति का प्रतिशत। त्रुटि सलाखों मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करता है। सभी दिखाए गए प्रयोगों से कम से कम तीन बार (; * पी <0.05 और *** पी <0.001 एन = 5 / समूह) दोहराया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: शुद्ध टी या TCR या बीसीआर सक्रियण क्रमशः निम्नलिखित बी कोशिकाओं का उपयोग कर GFP अभिव्यक्ति का विश्लेषण। (ए) represएक विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ दाग शुद्ध टी कोशिकाओं की entative प्रवाह cytometry विश्लेषण। GFP शामिल करने के लिए, शुद्ध टी कोशिकाओं CD3 / CD28 मोती (शीर्ष सही पैनल) का उपयोग प्रेरित किया गया। गैर सक्रिय नियंत्रण टी कोशिकाओं ऊपरी बाएं फलक पर दिखाए जाते हैं। दोनों गैर सक्रिय और सक्रिय टी कोशिकाओं की GFP अभिव्यक्ति तल पर प्रदर्शित किया जाता है। (बी) टी कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा प्राप्त GFP अभिव्यक्ति का प्रतिशत। त्रुटि सलाखों मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करता है। (सी) (ए) इसी तरह, सिवाय इसके कि बी कोशिकाओं की पवित्रता CD19 धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया है और विरोधी माउस आईजीजी / आईजीएम और पुनः संयोजक CD40L का उपयोग कर सक्रिय हो गया था। (डी) बी कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा प्राप्त GFP अभिव्यक्ति का प्रतिशत। त्रुटि सलाखों मतलब ± एसडी प्रतिनिधित्व करता है। सभी दिखाए गए प्रयोगों से कम से कम तीन बार दोहराया गया (एन = 5 / समूह और *** पी <0.001)। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा का संस्करण।

चित्र तीन
चित्रा 3: कुल मिलाकर योजनाबद्ध आरेख प्ररूपी स्क्रीनिंग के कदम का प्रतिनिधित्व। वहाँ 7 प्रमुख कदम एचटीएस परख तैयार करने के लिए आवश्यक हैं। एक महिला Nur77 GFP माउस अपने तिल्ली (चरण 1) को अलग-थलग करने के लिए बलिदान किया है। एक splenocytes सेल निलंबन (चरण 2) की पीढ़ी के बाद, टी कोशिकाओं नकारात्मक (अवांछित कोशिकाओं की कमी) के द्वारा अलग कर रहे हैं एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (चरण 3) का उपयोग कर। पृथक टी कोशिकाओं तो पुनः संयोजक आईएल 7 से 37 डिग्री सेल्सियस (चरण 4) में अभाव या दौर तली 96 अच्छी तरह से थाली में CD3 / CD28 मोतियों की उपस्थिति में साथ incubated हैं। बारह घंटे बाद (चरण 5), टी कोशिकाओं को एक ही सेल अलगाव टी सेल शुद्धि के लिए मूल रूप से इस्तेमाल चुंबक का उपयोग मोती हटाने से पहले किसी भी समुच्चय को बेदखल करने के लिए कई बार pipetted हैं। पृथक टी कोशिकाओं तो 384 अच्छी तरह से प्लेट (75 000 सेल में वरीयता प्राप्त कर रहे हैंLS / अच्छी तरह से, एक और 24 एच (चरण 7) के लिए यौगिकों के साथ कदम 6)। अगले दिन, incubated कोशिकाओं एचसीएस प्रणाली (चरण 8) द्वारा विश्लेषण करने से पहले Hoechst 30 मिनट के साथ दाग रहे हैं। एक ही सेट-अप चरण 4 को छोड़कर एक बी सेल आधारित परख की तैयारी के लिए पीछा किया हुआ हो सकता है और 5 एक सरल धोने से प्रतिस्थापित किया जा के रूप में stimulators घुलनशील रूपों में जोड़ा जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: 384 अच्छी तरह से प्लेटों में टी कोशिकाओं के चढ़ाना के लिए लेआउट। परख में इस्तेमाल प्रत्येक प्लेट तीन समूहों निहित। है, जबकि दूसरे समूह DRU बिना टी कोशिकाओं को सक्रिय निहित, पहले समूह में, कुओं गैर सक्रिय टी कोशिकाओं के साथ भरी हुई थी (कुओं A1-P1 और A24-P24 थाली के प्रत्येक पक्ष पर GFP के लिए नकारात्मक नियंत्रण)जीएस (GFP के लिए सकारात्मक नियंत्रण, कुओं A2-P2 और A23-p23)। सभी शेष कुओं टी कोशिकाओं स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया रासायनिक संस्थाओं के साथ पूरक सक्रिय हैं। सभी कुओं 0.5% DMSO निहित। GFP और Hoechst संकेतों के लिए उदाहरण गैर सक्रिय और सक्रिय टी कोशिकाओं के लिए दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: प्राथमिक प्ररूपी स्क्रीनिंग। (ए) 320 यौगिकों पर प्रदर्शन एक प्राथमिक जांच के प्रतिनिधि उदाहरण है। गैर सक्रिय टी कोशिकाओं लगभग GFP TCR उत्तेजित टी कोशिकाओं है, जो प्रदर्शन 20 गुना अधिक है GFP अभिव्यक्ति के विपरीत अशक्त हैं। (ख) सभी यौगिकों का संचयी डेटा परख का उपयोग कर जांच की। GFP अभिव्यक्ति को दर्शाता है यौगिकों diअन्य यौगिकों जबकि splaying निरोधात्मक कार्रवाई के टी सेल stimulators के रूप में व्यवहार कर रहे थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कई पढ़ने के लिए बाहर तरीकों संवेदनशील और विश्वसनीय एचटीएस assays के विकास के लिए शोषण किया गया है। ये वर्णमिति, luminescent या फ्लोरोसेंट तरीके शामिल हैं। हालांकि वर्णमिति तरीकों सेट अप करने के लिए सरल कर रहे हैं, वे रसायनों के कई परिवर्धन, जो हस्तक्षेप या बाधित कोशिकाओं परीक्षण किया जा रहा सकता है की आवश्यकता होती है। 23 इसके अलावा, वे एक जैविक प्रतिक्रिया के गतिशील मूल्यांकन की अनुमति नहीं के रूप में औषधीय प्रभाव एक विशिष्ट समापन बिंदु पर मूल्यांकन किया है है। इसके अलावा, इस विधि महंगा रोबोट हथियार की आवश्यकता हो सकती है, तो स्वचालित एचटीएस प्रयोग किया जाता है। इन कारकों में उनकी बोझिल आवश्यकताओं और कम संवेदनशीलता के कारण वर्णमिति पढ़ें बहिष्कार कम एचटीएस के उद्देश्य के साथ संगत बनाने। 23 यद्यपि luminescence वर्णमिति assays के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है, एचटीएस में इन luminescent परीक्षण के आवेदन आमतौर पर सेल की आवश्यकता के कारण सीमित है। हालांकि अन्य गैर-सेल प्रोटोकॉल डे के थेveloped, bioluminescence संकेत की तीव्रता ऐसे luciferin अवशोषण, सह कारकों, पीएच की उपलब्धता, और संस्कृति मीडिया या बफर की पारदर्शिता के रूप में कई कारकों द्वारा बाधा जा सकता है, पता लगाया bioluminescence संकेतों और सेलुलर गतिविधि में वास्तविक परिवर्तन के बीच फ़र्क हो सकता है। 24 इसलिए, सबसे assays प्रतिदीप्ति तरीकों पर भरोसा करते हैं। वास्तव में, फ्लोरोसेंट आधारित assays शुरू में छोटे, उच्च फ्लोरोसेंट कार्बनिक सेल सक्रियण पर सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म की निगरानी करने में सक्षम अणुओं का उपयोग कर विकसित किया गया। संक्षेप में, फ्लोरोसेंट assays उच्च संवेदनशीलता है और आसानी से एचटीएस दौरान प्ररूपी मापन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। 23

यहाँ प्रस्तुत विकसित फ्लोरोसेंट आधारित एचटीएस परख तीन प्रमुख फायदे हैं। सबसे पहले, यह अत्यंत विश्वसनीय, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और दो अलग अलग प्राथमिक कोशिकाओं नियमन करने में सक्षम यौगिकों (टी और बी लिम्फोसाइट) की स्क्रीनिंग के लिए अपनाया गया है एक ही stimula का उपयोग करtion / पढ़ने के लिए बाहर अवधारणा। उदाहरण के लिए, 4398 यौगिकों की प्राथमिक स्क्रीनिंग, जो पाँच अलग अलग रन पूरा किया गया (टी सेल परख के लिए <5% और <15%, क्रमशः) के साथ कम से कम अंतर और अंतर-परख variabilities एक सुसंगत सक्रियण प्रेरित GFP संकेत दिखाया गया है। दूसरा, परख एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग करता है। आमतौर पर, एक प्रतिदीप्ति आधारित परख के डिजाइन प्राथमिक कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग या आदेश उत्तेजना पर एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रदर्शित करने के लिए ब्याज की एक सेल लाइन की आवश्यकता है। हालांकि इस दृष्टिकोण एक कीमती प्रयोगशाला उपकरण उत्पन्न करता है, यह आम तौर पर वैज्ञानिक समुदाय के लिए आसानी से उपलब्ध नहीं है। इस सीमा को बायपास करने के लिए, टी और बी कोशिकाओं Nur77 GFP ट्रांसजेनिक चूहों से अलग थे। इन लिम्फोसाइट का लाभ उनकी TCR या बीसीआर उत्तेजना पर 24 घंटे के भीतर GFP व्यक्त करने की क्षमता है। इसलिए, स्क्रीनिंग दवाओं GFP अभिव्यक्ति या समग्र सेलुलर ड्राइविंग ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी नियमन करने के लिए सक्षमप्रतिक्रिया एक आकर्षक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। तीसरा, अपने शुरुआती चरण में सक्रियण CD3 / CD28 मोतियों के साथ टी कोशिकाओं का सप्लीमेंट इन मोतियों GFP आकलन करने के लिए पहले से हटाने की आवश्यकता है। यह महत्वपूर्ण है अगर माइक्रोस्कोपी मोती छोड़ने अन्यथा GFP संकेत होगा मुखौटा के रूप में टी सेल सक्रियण / निषेध विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए के बजाय प्रयोग किया जाता है, मोती कुओं में छोड़ा जा सकता है हित के विशिष्ट जनसंख्या दोनों आगे और पक्ष scatters का उपयोग कर gated जा सकता है (जब तक यह विशेष रूप से परख करने के लिए अतिरिक्त confounding सीमा (ओं) बनाता है)।

प्रारंभिक उद्देश्य कम से कम सेलुलर हैंडलिंग के साथ एक स्क्रीनिंग परख डिजाइन करने के लिए किया गया था। इस संदर्भ के तहत, टी या बी कोशिकाओं unfractionated splenocytes का उपयोग कर के सक्रियण मोती या घुलनशील एंटीबॉडी / पुनः संयोजक CD40L क्रमश लिम्फोसाइट का एक बड़ा अनुपात के रूप में ही सीमित था के साथ प्रेरित GFP नकारात्मक (चित्रा 1) बने रहे। इस कदम की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है के रूप मेंपरख की, प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग प्रतिशत GFP व्यक्त कोशिकाओं में वृद्धि करने के लिए टी या बी कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए संशोधित किया गया था। यह दृष्टिकोण काफी दोनों सेल आबादी की सक्रियता के परिणाम में सुधार हुआ। पसंद का एक और तरीका टी और बी सेल अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यदि आवश्यक समझा, प्रस्तावित दृष्टिकोण है: i) अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, द्वितीय) आसानी से प्रवाह cytometry एचटीएस के लिए पहले से पृथक आबादी की शुद्धता का आकलन करने के लिए अनुकूलित, iii) और समय शुद्धि कदम के रूप में कुशल अपेक्षाकृत कम है (~ 30 मिनट) और कम से कम तैयारी के साथ किया जा सकता है। हालांकि, यह है कि इस अध्ययन में प्रस्तुत परख माउस प्राथमिक कोशिकाओं के उपयोग पर आधारित है ध्यान दिया जाना चाहिए। माध्यमिक (पुष्टि प्रयोजनों के लिए) और तृतीयक assays (ब्याज के लक्ष्य पर अंतिम मान्यता) प्राथमिक स्क्रीन पहचान हिट मान्य करने के लिए निम्नलिखित आयोजित किया जाना चाहिए। यह आसानी से अलग सेल लाइनों की एक किस्म है, मैं के औषधीय प्रभाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकिवहाँ के रूप में प्रजातियों के बीच निरंतर प्रभाव की भविष्यवाणी करने के लिए कोई संभव तरीके हैं - dentified हिट अन्य प्रजातियों (तृतीयक परख का उदाहरण जैसे मानव कोशिकाओं) पर आगे की मान्यता की जरूरत है। संक्षेप में, इस परख मनुष्य के लिए इन विट्रो / पशु परीक्षणों में से परिणाम के संभावित एक्सट्रपलेशन के साथ नए संभावित हिट और / या आणविक लक्ष्यों की पहचान के लिए मूल्यवान है।

हालांकि डिज़ाइन किया गया परख दोनों टी और बी कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, एक लाभ यह है कि इस मामले में टी कोशिकाओं की विशिष्ट उपयोग करने के लिए प्रदान किया जाता है। TCR सक्रियण आम तौर पर एक प्राथमिक (जैसे विरोधी CD3 या विरोधी TCR) के माध्यम से प्रदत्त दोहरी उत्तेजना और एक माध्यमिक सह सक्रिय (जैसे विरोधी CD28) संकेत की आवश्यकता है। 25, 26 दिलचस्प है, दोनों विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी सीधे चुंबकीय मोतियों की सतह पर जुड़े हुए खरीदा जा सकता है, और टी जोड़ने से पहले एक मानक चुंबक का उपयोग सेल निलंबन से हटाया जा सकता हैवह रासायनिक यौगिकों स्क्रीनिंग में परीक्षण किया जाना है। के रूप में अज्ञात रासायनिक संस्थाओं के साथ एक पुस्तकालय का इस्तेमाल किया जा रहा है, टी कोशिकाओं को अपनी TCR जटिल के लिए बाध्य कर परीक्षण किया यौगिकों और TCR बाध्यकारी खांचे के लिए बाध्य कर उन लोगों के बीच किसी भी संभव हस्तक्षेप को कम कर सकते हैं अणुओं की मुक्त सक्रिय बनाए रखना है। 27 इसके अलावा, शारीरिक स्थितियों टी सेल सक्रियण mimics निम्नलिखित उत्तेजक एजेंट को हटाने के रूप में एक निरंतर supraphysiological TCR सक्रियण के अधीन टी कोशिकाओं के साथ काम करने का विरोध किया। के रूप में यह एक दिया परिसर के औषधीय प्रभाव को ओवरराइड हो सकता है, खासकर अगर यह स्क्रीनिंग में छोटे सांद्रता में इस्तेमाल किया गया था बाद की स्थिति समस्याग्रस्त किया जा सकता है। बी कोशिकाओं पर ही प्रभाव exerting कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मोती देखते हैं के रूप में, यह भविष्य के परीक्षण में एक एचटीएस प्रदर्शन करने के लिए बी कोशिकाओं पर प्रोत्साहन की निरंतर उपस्थिति परख के प्रदर्शन को सीमित करता है कि क्या दिलचस्प होगा।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम Université de मॉन्ट्रियल द्वारा प्रदान की मर्क Frosst शुरू हुआ धन द्वारा समर्थित किया गया। हम उनकी चर्चा, टिप्पणियों और फीडबैक के लिए इम्यूनोलॉजी और कैंसर अनुसंधान संस्थान में उच्च throughput मंच से डीआरएस जीन Duchaine और डोमिनिक Salois को धन्यवाद देना चाहूंगा। Moutih Rafei एक Fonds डी ला Recherche एन Santé डु क्यूबेक जूनियर 1 पुरस्कार रखती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 121 उच्च throughput स्क्रीनिंग प्ररूपी स्क्रीनिंग लक्ष्य आधारित स्क्रीनिंग दवाओं की खोज लिम्फोसाइटों टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं प्रतिदीप्ति हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन Nur77 प्रतिरक्षादमन सक्रियण
एक प्रतिदीप्ति आधारित लिम्फोसाइट परख छोटे अणुओं के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त
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Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, … More

Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

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