Summary
Nous présentons dans l'étude d'un nouveau test basé sur la fluorescence en utilisant des lymphocytes dérivés d'une souris transgénique. Ce dosage est adapté pour le criblage à haut débit (HTS) de petites molécules dotées de la capacité de l'une ou l'inhibition de la promotion de l'activation des lymphocytes.
Abstract
Le criblage à haut-débit (HTS) est actuellement le pilier pour l'identification des entités chimiques capables de moduler les réactions biochimiques ou processus cellulaires. Avec l'avancement des biotechnologies et le potentiel translationnelle élevé de petites molécules, un certain nombre d'approches novatrices dans la découverte de médicaments ont évolué, ce qui explique le regain d'intérêt dans l'utilisation des HTS. Le domaine de l'oncologie est actuellement la zone la plus active de recherche pour le dépistage des drogues, sans percée majeure faite pour l'identification de nouveaux composés immunomodulateurs ciblant les complications liées à la transplantation ou d'affections auto-immunes,. Ici, nous présentons un roman dans le test murin in vitro des lymphocytes fluorescents à base facilement adapté pour l'identification de nouveaux composés immunomodulateurs. Cet essai utilise des cellules T ou B dérivées d'une souris transgénique dans laquelle le promoteur conduit l'expression Nur77 GFP sur T- ou la stimulation du récepteur des lymphocytes B. Comme l'intensité de la GFP reflète laactivation / activité transcriptionnelle de la cellule cible, notre test définit un nouvel outil pour étudier l'effet du composé (s) donnée sur les réponses cellulaires / biologiques. Par exemple, un criblage primaire a été réalisée en utilisant 4,398 composés en l'absence d'une "hypothèse cible", qui a conduit à l'identification de 160 résultats potentiels présentant des activités immunomodulatrices. Ainsi, l'utilisation de ce test est approprié pour les programmes de découverte de médicaments explorant de grandes bibliothèques chimiques avant de poursuivre des études in vitro / in vivo de validation.
Introduction
criblage à haut débit (HTS) est une stratégie éprouvée largement adoptée pour l'identification de nouvelles molécules thérapeutiques ou pour le repositionnement de médicaments approuvés par la FDA dans de nouvelles indications médicales. 1 Jusqu'à présent, le succès HTS obtenu peut être mesurée par la pléthore de médicaments précédemment découverts. Par exemple, l'inhibiteur de tyrosine-kinase lapatinib utilisé pour le traitement du cancer du sein, la sitagliptine; une dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4), l'inhibiteur utilisé comme un médicament anti-hyperglycémique, et la Bcr-Abl inhibiteur de tyrosine kinase dasatinib oral pour le traitement de la leucémie myéloïde chronique représentent quelques exemples d'une liste de médicaments approuvés initialement découverts par HTS. 2 Bien que la productivité de l'industrie pharmaceutique a récemment souffert d'un manque dans la découverte de nouvelles entités chimiques, la probabilité de découverte de médicaments réussie peut être améliorée grâce à une augmentation du nombre de candida pré-cliniquetes présentant des propriétés biologiques / biochimiques modulateurs. En conséquence, le développement de nouveaux tests HTS adaptés pour le criblage phénotypique pourrait offrir le potentiel de fournir des outils pharmacologiques importants pour la découverte de nouveaux hits de drogue. 3, 4, 5, 6 En outre, HTS peuvent maintenant être effectuées à un rythme plus rapide en raison de transformations technologiques importantes au cours des dernières années , y compris les installations sur mesure flexibles robotiques, de nouvelles technologies de lecture et une miniaturisation poussée. 2, 7 Parmi les facteurs qui contribuent à l'intérêt croissant pour l'utilisation du dépistage phénotypique (aka l' avant de la pharmacologie) est la perception qu'en se concentrant sur les effets fonctionnels plutôt que des hypothèses réductionnistes simplificatrices concernant les cibles moléculaires (dépistage / réactions biochimiques par objectifs) est plus probable sho efficacité clinique w. Ainsi, le dépistage phénotypique tient la promesse de découvrir de nouveaux composés potentiellement thérapeutiques et les voies moléculaires des maladies actuellement incurables. 2
Pour bien identifier des inhibiteurs ou activateurs pour une cible moléculaire donnée ou la fonction cellulaire, un dosage très sensible et fiable est nécessaire pour faire la différence entre succès de bonne foi et de faux positifs. Donc, ce qui fait un bon dosage? La qualité d'un dosage donné doit être jugé par le premier rapport signal-sur-bruit (par un facteur réfléchi Z). 8 Deuxièmement, l'effet ciblé ou le but de l'écran doivent être clairement établies. Par exemple, les approches basées sur les cellules fonctionnelles peuvent offrir des avantages significatifs pour le dépistage du récepteur par rapport à un essai spécialement conçu pour évaluer la liaison du ligand-récepteur. La raison pour cela est que cette dernière approche ne peut pas différencier entre les ligands agonistes et antagonistes.ss = "référence externe"> 9 En revanche, une approche basée sur des cellules est susceptible d'être plus efficace que la fonction du récepteur peut être évalué directement en un phénotype biologique (prolifération, arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et / ou la différenciation). Cependant, il faut noter que les tests biochimiques peuvent fournir des avantages significatifs par rapport aux essais phénotypiques car ils empiètent sur une cible intracellulaire spécifique. Un dosage biochimique bien optimisé aura généralement moins de dispersion de données qu'un dépistage phénotypique tout en simplifiant la suite des enquêtes relatives au mécanisme moléculaire de la drogue de l'action. Cependant, l'inconvénient majeur de tests d'objectifs ou biochimiques est le risque d'amplifier le taux de résultats faussement positifs qui peuvent influer sur les cibles non spécifiques lorsqu'il est testé dans un système biologique (perte de la spécificité étudiée à l'origine dans le dosage biochimique). 10 Bien que d' un point de coupure bien établie entre résultats négatifs et positifs peut réduire le nombre de faux positifs in le criblage primaire, l'utilisation d'un système physiologiquement pertinent mimant l'environnement cellulaire natif telles que des cellules intactes, des tissus entiers ou animal entier reste le noyau du pendule de la conception de l'essai. Par conséquent, le dépistage phénotypique permet la découverte de plomb avec des effets phénotypiques biologiques / souhaitables pour les maladies sans cibles de médicaments identifiés sans avoir une connaissance préalable de l'activité du composé ou le mode d'action. 11
L'étude de ce document concerne le développement et le test d'un dépistage phénotypique optimisé et reproductible sur la base de deux éléments importants: un modèle de souris disponible dans le commerce et une sous-famille cluster de composés chimiques. En ce qui concerne le modèle animal, le test repose sur l'utilisation de lymphocytes provenant d'une souche de souris (Nur77 GFP) hébergeant un chromosome artificiel bactérien contenant une cassette dans laquelle l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP) est entraîné par epromoteur e Nur77. 12 La caractéristique de cette stimulation est basée sur le fait que Nur77 est un gène précoce immédiat régulée à la hausse suivant récepteur des lymphocytes T (TCR) ou un récepteur de lymphocyte B (BCR) de stimulation. 12 En ce qui concerne la méthode de dépistage lui - même, une approche a été utilisée pour aider à éviter la projection d'analogues triviales tout en minimisant le temps nécessaire pour évaluer une grande bibliothèque chimique (> 10 5 composés). Pour ce faire, une base de données de composés chimiques sélectionnés par les chimistes médicinaux en utilisant des outils de criblage virtuel a été exploitée pour identifier des composés topologiquement similaires en utilisant des structures de semences actives connues comme des références. Cette approche nous a permis de cribler 4,398 composés représentant une bibliothèque globale de plus de 136.000 entités chimiques.
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Protocol
Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité de l'Université de Montréal le soin des animaux. Les souris ont été euthanasiées par inhalation de CO 2 graduelle jusqu'à ce qu'aucun des signes vitaux n'a été observé suivi par dislocation cervicale. La procédure a été effectuée par une personne certifiée pour garantir que les animaux ont été euthanasiés d'une façon humaine et conformément aux recommandations du Conseil canadien de protection des animaux.
1. Préparation des splénocytes Medium and Flow-cytométrie Buffer
- Effectuez toutes les étapes sous une hotte biologique 70% d'éthanol nettoyés.
- Retirer 70 ml de Roswell Park Memorial Institute préchauffée (RPMI) 1640 moyen 1x (disponible dans le commerce et fourni dans filtrés 500 ml de volume des flacons stériles) et placer dans un tube stérile. Le milieu enlevé sera utilisé plus tard dans le protocole.
- Compléter les 430 ml restants de RPMI 1640 1x avec 50 ml inactivé de sérum bovin fœtal (FBS), 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5HEPES ml, 5 ml d'acides aminés non essentiels, pyruvate de sodium, 5 ml et 0,05 ml filtrées (1M) 2-mercaptoéthanol.
NOTE: moyenne de splénocytes Pré-chaud à l'aide d'un bain-marie réglé à 37 ° C pour éviter les cellules de chaleur choquant. Ceci est important pour éviter l'induction de l'apoptose cellulaire. - Pour préparer le tampon par cytométrie de flux, ajouter 2 ml de FBS à 98 ml du tampon phosphate salin (PBS) et conserver au réfrigérateur jusqu'à utilisation (de préférence dans les trois jours).
2. Génération de splénocytes suspension cellulaire de Nur77 GFP Spleens souris
- Un isolat septique ou la rate d'une vieille femme de 6-8 semaines souris Nur77 GFP.
- Pour ce faire, travailler sous hotte stérile. Faire tremper les sacrifiés souris fourrure, des ciseaux et des pinces à 70% d'éthanol.
- Poser la souris sur son côté droit, couper la peau et les muscles dans le quadrant supérieur gauche abdominale. Inspecter la zone d'incision pour localiser visiblement la rate puis le découper. Gardez la rateen milieu de splénocytes sur la glace jusqu'à ce que prêt à effectuer l'étape suivante.
- Placez la rate (s) dans une boîte de 10 cm culture Pétri 2 cellules contenant 5 ml de milieu de splénocytes préchauffé.
- Piler la rate à l'aide d'un piston de seringue stérile jusqu'à ce que la solution soit trouble. Une matrice de collagène de la rate doit rester à la fin de la procédure.
- Après une vaste brassage en milieu de splénocytes, de recueillir la suspension cellulaire et le passer à travers un tamis cellulaire de 70 um placé sur un tube de 50 ml pour filtrer-tout débris ou des caillots.
- Centrifuger à 500 xg pendant 5 min. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension le culot cellulaire dans 2-3 ml de tampon de lyse interne produit commercial ou de globules rouges. Après pipetage (2-3 fois) laisser le reste de suspension pour 20-30 s.
- Ajouter 5 ml de PBS ou un tampon approprié de choix puis centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 500 x g.
- Retirer le surnageant (devrait être de couleur rouge car il contient lysée rouge bles cellules Lood) et remettre en suspension le culot cellulaire dans 2 ml de milieu de splénocytes.
- L'utilisation d'un hémocytomètre, compter le nombre de cellules colorées avec du bleu trypan faire la différence entre (nécrotiques) cellules vivantes et mortes.
3. T-cellule d'isolement de la suspension cellulaire splénocytes
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 500 x g. Remettre en suspension les cellules dans un milieu RPMI exempt de sérum (50 ml) provenant de l' étape 1.3 pour obtenir une concentration cellulaire de 10 x 10 6 cellules / ml.
- Transférer les cellules à un tube 5 ml de polystyrène et mettre de côté une partie aliquote de 100 pi de splénocytes de pureté évaluation / comparaison à la fin de l'étape de purification.
- Ajouter du sérum de rat normal à la suspension cellulaire à 50 ul / ml, suivi par un anticorps T d'isolement des cellules cocktail (50 ul / mL).
- Mélanger la suspension cellulaire et laisser reposer pendant 10 minutes. Cette étape permet au cocktail d'anticorps pour lier toutes les cellules non désirées.
- Ajouter les sphères rapides streptavidine (aimantperles IC) pendant 2,5 minutes, puis amener le volume à 2,5 ml en utilisant le milieu sans sérum.
- Placer le tube dans un aimant d'isolement des cellules pendant 3 min.
- Transférer la suspension de cellules T dans un nouveau tube de polystyrène en maintenant l'aimant et en versant la solution en un seul mouvement.
NOTE: La suspension isolée contient les cellules T purifiées. Toutes les cellules non désirées sont maintenus sur le côté du tube lié aux billes magnétiques de streptavidine. - Compter les cellules T isolées en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre.
NOTE: A cette étape , la pureté des cellules T isolées peuvent être vérifiées (facultatif) en analysant le pourcentage d'événements CD3 + avant et après l' isolement des cellules T par cytométrie de flux. 13- En bref, centrifugeuse 1 ml de splénocytes suspension cellulaire à 500 x g. Jeter le surnageant et les cellules en suspension dans un tampon de cytométrie de flux à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml.
- Ajouter fluorescent marqué anti-nymee CD3 anticorps à une concentration de 1: 100. Incuber à 4 ° C pendant 30 min. Laver une fois, de centrifugation et remettre en suspension dans un tampon cytométrie de flux (400 pi) pour une analyse par cytométrie de flux.
4. B-cellule d'isolement de la suspension cellulaire splénocytes
- Suivre le même protocole que celui décrit pour les cellules T (étapes 3,1 à 3,8) mais en utilisant un kit d'isolement de cellules B. Pour l' évaluation de la pureté, utiliser l'anticorps CD19 au lieu de l'anticorps CD3. 13
- L'évaluation de la pureté (facultatif), en utilisant l'anticorps CD19 à la place de l'anticorps CD3. 1 mL de centrifugeuse splénocytes suspension cellulaire à 500 x g. Jeter le surnageant et les cellules en suspension dans un tampon de cytométrie de flux à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml.
- Ajouter fluorescence étiquetée anticorps anti-souris CD19 à une concentration de 1: 100 et incuber à 4 ° C pendant 30 min. Laver une fois, centrifugeuse et remettre en suspension dans un tampon par cytométrie de flux (400 pi) foanalyse de r par cytométrie de flux.
5. L'activation des lymphocytes T et l'induction de l'expression de GFP
- Ensemencer les cellules T, en suspension, dans une plaque de 96 puits à fond rond à une concentration de 2,5 x 10 5 cellules / puits.
- Ajouter interleukine recombinante (IL) -7 à 2 ng / ml et perles CD3 / CD28 magnétiques (25 pi / 10 6 cellules). Gardez une partie des cellules T non traités avec des perles pour servir de témoin négatif pour les mesures ultérieures qui représentent les cellules T non activées.
- Douze heures plus tard, récolter les cellules de la plaque de 96 puits T par pipetage doucement la suspension de cellules dans chaque puits et vers le bas pour briser les complexes billes-cellules / agrégats. Recueillir la suspension de tous les puits dans un tube de polystyrène 5 mL.
- Placer le tube contenant la suspension à l'intérieur du même aimant d'isolement des cellules utilisées précédemment pour la purification des cellules T ou B et laisser reposer pendant 5 min.
- Transférer le int T de suspension cellulaireoa nouveau tube de polystyrène en maintenant l'aimant et en versant la solution en un seul mouvement.
- Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de splénocytes frais pour obtenir une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml.
- Évaluer GFP intensité d'expression par cytométrie de flux (en option pour le contrôle de la qualité) à 12 à 24 h post-stimulation en comparaison avec des cellules non-T activées. 12
REMARQUE: La fluorescence de la GFP est intrinsèque aux cellules T Nur77 GFP et se manifeste lors de l' activation réussie du RCT. 12 - Pour l'évaluation de la viabilité et de l'activation (en option), par microscopie, colorer les cellules activées avec Hoechst 30 minutes avant l'analyse à une concentration de 0,2 ug / ml. Ajouter un volume adéquat de la suspension cellulaire sur une lame de couverture ou à un puits d'une plaque à 384 puits noire face à fond plat et examiner au microscope à fluorescence pour évaluer les cellules vivantes. Les cellules mortes ne conserveront pas nucléairecoloration. 14
6. L'activation des cellules B et l'induction de l'expression de GFP
- En utilisant un ballon de culture T-25, remettre en suspension les cellules isolées B à 1 x 10 6 cellules / ml.
- Ajouter des anti-souris IgG / IgM (H + L) à 10 ul / ml et CD40L recombinant à une concentration de 200 ng / ml. Gardez une partie des cellules B non traitées pour servir de témoin négatif pour les mesures ultérieures (représentant les cellules B non activées).
- Évaluer GFP intensité d'expression par cytométrie de flux à 12 ou 24 h post-stimulation en comparaison avec des cellules non activées B.
REMARQUE: La fluorescence de la GFP est intrinsèque aux cellules GFP Nur77 B et se manifeste lors de l' activation réussie du BCR. 12 - Pour l'évaluation de la viabilité et de l'activation (en option), par microscopie, colorer les cellules activées avec Hoechst 30 minutes avant l'analyse à une concentration de 0,2 ug / ml. Ajouter un volume adéquat de la suspension cellulaire àune lame de couverture ou à un puits d'une plaque à 384 puits noire face à fond plat et d'examiner sous un microscope à fluorescence pour évaluer les cellules vivantes. Les cellules mortes ne conserveront pas une coloration nucléaire. 14
7. criblage à haut débit des petites molécules
- Préparer une suspension cellulaire à 2 x 10 6 cellules / ml des cellules T ou B activées (billes magnétiques ou des anticorps / CD40L) ou des groupes non activés.
- Plate 75.000 cellules / puits dans une plaque à 384 puits (volume de 40 pi). Utiliser une plaque à 384 puits noire face à fond plat ou d'une lamelle de microscope pour la viabilité et l'activation d'évaluation par microscopie à fluorescence (en option étape de contrôle de la qualité avant HTS) en utilisant Hoechst tache (voir les étapes 5.8 et 6.4 pour plus de détails). 14
- Manuellement ou en utilisant un système automatisé, ajoutez les médicaments de choix (dissous dans 0,5% de DMSO) à chaque puits.
- Ajouter le véhicule (DMSO) à positif (activé) et négatif (non-activée) Les puits de contrôle. Ajuster la concentration du DMSO jusqu'à un maximum de 0,5%.
- Laisser incuber les plaques pendant 24 h (ou la durée d' incubation de choix) à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Le jour de l'examen, on dilue la solution de colorant 33342 de Hoechst (1:. 3333, par exemple , ajouter 10 ul des cellules dans les plaques à 384 puits pour générer un volume total de 50 ul). Tacher 30 min avant l'analyse de la GFP, par addition d'une solution de Hoechst pour obtenir une concentration de 0,2 ug / ml.
- pipette doucement les cellules de haut en bas pour obtenir une distribution homogène dans chaque puits.
Remarque: Cette étape est importante dans le cas de la distribution des médicaments (étape 7.3), en utilisant un système automatisé, les cellules ont tendance à s'accumuler sur un côté du puits, opposée à la direction de l'écoulement. - Faites tourner les plaques à 45 xg pendant 3 min à température ambiante.
- Laissez les plaques pour se reposer pendant 15 min à température ambiante.
- Effectuer plaque (s) de lecture-out, en utilisant les scre à contenu élevé confocale automatiséssystème renfor- (HCS). 15 Charger la plaque sur la machine. Définir l'objectif à 40X ou plus grossissement. Utilisez la caméra n ° 4 pour Hoechst (lampe UV) et la caméra n ° 1 pour la GFP (laser 488). Mettre en place la machine à lire 6-10 champs par puits. Réglez la machine à faire deux lectures séquentielles par champ à 488 nm (pour lire GFP) et la lumière UV (à lire Hoechst). Définir l'objectif à 40X ou plus grossissement.
NOTE: Le système est un microscope informatisé qui ne nécessite aucun réglage. La distance focale, l'intensité de la lumière incidente et le temps d'exposition sont tous les réglages automatiquement par la machine.
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Representative Results
Conception de l'essai HTS
Deux facteurs importants ont été pris en considération lors de la conception de l'essai ici fluorescent. Tout d' abord, nous avions besoin de reproduire un état physiologique dans lequel l' activation des lymphocytes T ou B représenterait une maladie (par exemple de la maladie du greffon contre l'hôte). En second lieu, l'évaluation de l'activation cellulaire doit être réalisée en utilisant une méthode sensible et quantitative. Fluorescence est aujourd'hui l'un des premier choix pour HTS lecture-outs car il correspond à ces besoins. 10, 16 En tant que GFP robuste de lecture peut être obtenu après Nur77 GFP -derived T ou cellules B stimulation in vitro ou in vivo, 12 notre test exploité cette stratégie pour différencier les cellules non activées et activées comme un modèle de travail pour le identification des composés immunomodulateurs.
A l'origine, la conception de notre analyse a été fondée sur une évaluation de la GFP par cytométrie de flux en utilisant des splénocytes stimulés non fractionnées. Dans ce cas, les cellules non activées / T activées et B sont colorées avec des anticorps anti-CD3 ou anti-CD19, respectivement avant l'évaluation de la GFP. Comme cela est représenté sur la figure 1A, les lymphocytes T (cellules CD3 +) représentent environ 30% de la rate de la souris donnée. À l'état d'équilibre, le niveau de la GFP était de l'ordre de 10% (le plus probable en raison de la sélection post-thymique par le TCR au cours du développement ou de la stimulation homéostatique dans la périphérie). Après la stimulation du TCR en utilisant les billes / CD28 CD3, une augmentation de cinq à six fois le pourcentage d'expression de la GFP (57% au lieu de 10%) a été détectée dans des cellules T CD3 + (figure 1A - B). De même, les lymphocytes B (cellules CD19 +) représentent 50 à 55% des splénocytes totaux et de leur base GFP expression est comparable à celle des cellules non-T activées (par exemple , ~ 10%, la figure 1C). Il est intéressant, cependant, la stimulation BCR utilisant des anticorps anti-souris IgG / IgM et CD40L recombinant a provoqué une augmentation triviale dans l' expression de la GFP (33% au lieu de 12%, la figure 1C - D). Comme expression de la GFP est un élément clé pour l'évaluation de l'effet pharmacologique de petites molécules criblées sur les lymphocytes T ou B activées, l'optimisation de son intensité est au cœur de la sensibilité et de la réussite de l'examen.
L'évaluation de l'expression de la GFP en utilisant des cellules T ou B purifiées
Bien que la stimulation des lymphocytes T et B peut être effectuée directement en utilisant des splénocytes non fractionnés, l'intensité de l'expression de GFP n'a pas été suffisamment sensible pour le criblage en particulier si postaux lus doivent être effectuées par microscopie. Afin d'améliorer la réponse cellulaire, les lymphocytes T ont d'abord été purifiés par magnétiquedes perles en utilisant un kit disponible dans le commerce (figure 2A). Comme montré précédemment en utilisant des splénocytes non fractionnés, 10% des cellules T CD3 + ont été isolées GFP positive (expression basale). Dans ce contexte, la stimulation des cellules T en utilisant des billes CD3 / CD28 a amélioré de manière significative leur réponse à la GFP (Figure 2A - 2B, 86% contre 57% lorsque les splénocytes non fractionnés ont été utilisés). Des améliorations similaires ont été obtenus avec les cellules B (Figure 2C - 2D, 80% au lieu de 33%). Ces résultats démontrent clairement que l'utilisation des cellules T et B purifiés maximise l'expression de GFP, qui est appropriée pour le criblage phénotypique proposé.
Schéma de l'essai HTS conçu
Dans l' ensemble, le dosage peut être subdivisé en quatre sections principales (figure 3). Dans le cas des cellules T, par exemple, un splénocytesla suspension cellulaire est préparée afin de purifier les cellules T (étapes 1-3) suivie d'une étape de stimulation 12 h in vitro en utilisant des billes CD3 / CD28 (étapes 4-5). Les cellules T activées sont ensuite étalées et cultivées pendant 24 h avec les petites molécules de choix dans des plaques à 384 puits (étapes 07/06) avant l'évaluation de la GFP et Hoechst intensités en utilisant le système automatisé HCS. Le même dosage peut être utilisé pour les cellules B avec les modifications effectuées aux étapes 4-5. En bref, les cellules B peuvent être stimulées avec un anti-souris IgG / IgM et CD40L recombinant au lieu de billes. Comme ces composants sont utilisés dans leur forme soluble (par exemple , ne sont pas liées à des billes), les cellules B peuvent être incubées pendant 12 h puis tout simplement lavées avant le placage dans des plaques de 384 puits pour le processus de sélection.
la survie des cellules T efficace est primordiale pour le succès de l'étude HTS. En conséquence, deux facteurs limitants peuvent entraver la qualité de l'analyse et devraient être pris en considération. Premier, Les lymphocytes T murins sont très sensibles à l' apoptose après stimulation in vitro. 17 Deuxièmement, tous les composés testés sont dilués dans une solution de DMSO, ce qui pourrait ajouter un deuxième facteur de stress. Pour réduire au minimum la perte de cellules, l'IL-7 recombinante (2 ng / ml) a été additionné à des lymphocytes T lors de la stimulation du TCR aux étapes 4-5. Cette cytokine prolifération homéostatique soutient et renforce la survie des lymphocytes T par l'expression de molécules anti-apoptotiques tels que Bcl-2, Bcl-xL et Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22
criblage à haut débit primaire de 4,398 composés révèle plusieurs activateurs et des inhibiteurs de l'activation des lymphocytes T
Un criblage à haut débit a été réalisée par placage 75.000 (co non activé négativentrol) ou des cellules T activées (contrôle positif) tel qu'il est affiché dans la figure 4. Afin d' assurer une bonne reproductibilité, l'essai a été effectué plusieurs fois avec un facteur Z obtenu de 0,87 (figure 5A). En utilisant le système HCS, l'expression de la GFP observée des cellules T stimulées était de 20 fois supérieure à celle des cellules T non stimulées permettant la génération d'un «« fenêtre d'action "" zone où les composés inhibiteurs de la GFP ont pu être facilement détectés (figure 5A). Ceci est représenté sur la figure en ce qui concerne le nombre de cellules fluorescentes, divisé par le nombre total de cellules dans les champs analysés. Dans l'exemple illustré sur la figure 5A, la projection de 320 composés a dévoilé trois composés (souligné-out par des flèches rouges) capables d'inhiber l' expression de la GFP par 1,5-2,5 plis. Dans cet exemple, la valeur de contrôle positif a été de 0,44 ± 0,02 et le contrôle négatif a été de 0,02 ± 0,00.
the projection d'un total de 4398 composés (facteur Z de 0,85) a ensuite été réalisée. Les composés ont été sélectionnés par les chimistes médicinaux en tant que composés représentatifs de semences / en fonction de leur structure chimique représentant une bibliothèque chimique globale contenant des entités 136,000 (figure 5B). A la fin de l'essai, l'analyse de l'inhibition de la GFP a identifié des composés capables d'inhiber une ou l'autre des déviateurs (positif) ou l'amélioration de l'expression de GFP (les déviateurs négatives).
Figure 1: Analyse des lymphocytes T et des lymphocytes B GFP expression suivante TCR ou de l' activation de BCR réalisée sur des splénocytes non fractionnés. (A) représentant l' analyse par cytométrie de flux de cellules T colorées avec un anticorps anti-CD3 en utilisant des splénocytes en l'absence (panneau supérieur gauche) ou en présence de billes CD3 / CD28 (panneau en haut à droite). expression de la GFP pour les deux groupes de cellules T sont affichésau fond. (B) Pourcentage d'expression de la GFP obtenue par analyse par cytométrie de flux de cellules T. Les barres d'erreur représentent SD ± moyenne. (C) similaire à (A) , sauf que splénocytes ont été activés avec anti-souris IgG / IgM recombinante et CD40L ensuite colorées pour CD19. (D) Pourcentage d'expression de la GFP obtenue par analyse par cytométrie de flux des cellules B. Les barres d'erreur représentent SD ± moyenne. Toutes les expériences présentées ont été répétées au moins trois fois (n = 5 / groupe; * p <0,05 et *** P <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Analyse de l' expression de GFP en utilisant T purifiées ou des cellules B suivant TCR ou de l' activation de BCR , respectivement. (A) Represrepré- analyse par cytométrie de flux de cellules T purifiées colorées avec un anticorps anti-CD3. Pour GFP induction, les cellules T purifiées ont été stimulées en utilisant des billes CD3 / CD28 (panneau en haut à droite). cellules T non activées contrôle sont indiquées sur le panneau supérieur gauche. expression de la GFP des deux cellules non activées et T activées est affiché en bas. (B) Pourcentage d'expression de la GFP obtenue par analyse par cytométrie de flux de cellules T. Les barres d'erreur représentent SD ± moyenne. (C) similaire à (A) , sauf que la pureté des cellules B a été évaluée par coloration au CD19 et activée à l' aide anti-souris IgG / IgM recombinante et CD40L. (D) Pourcentage d'expression de la GFP obtenue par analyse par cytométrie de flux des cellules B. Les barres d'erreur représentent SD ± moyenne. Toutes les expériences présentées ont été répétées au moins trois fois (n = 5 / groupe et *** P <0,001). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.
Figure 3: diagramme schématique représentant l' ensemble des étapes du criblage phénotypique. Il y a 7 grandes étapes nécessaires pour préparer le test HTS. Une souris Nur77 GFP femelle est sacrifié pour isoler sa rate (étape 1). À la suite de la génération d'une suspension de cellules de splénocytes (étape 2), les lymphocytes T sont isolés négativement (par épuisement des cellules non souhaitées) en utilisant un kit disponible dans le commerce (étape 3). les lymphocytes T isolés sont ensuite incubés avec IL-7 recombinante en l'absence ou la présence de CD3 perles / CD28 en plaque de 96 puits à fond rond à 37 ºC (étape 4). Douze heures plus tard (étape 5), les lymphocytes T sont introduits à la pipette plusieurs fois pour déloger les granulats avant le retrait des billes en utilisant le même aimant d'isolement des cellules initialement utilisée pour la purification de lymphocytes T. Les cellules T isolées sont ensuite ensemencées dans des plaques 384 puits (75 000 cells / puits, étape 6) avec les composés pendant 24 heures (étape 7). Le jour suivant, les cellules incubées sont colorées avec Hoechst 30 minutes avant l'analyse par le système de HCS (étape 8). Le même set-up pourrait être suivi pour la préparation d'un essai à base de cellules B, sauf que l'étape 4 et 5 doivent être remplacés par un simple lavage comme les stimulateurs sont ajoutés sous des formes solubles. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Mise en page pour le dépôt des cellules T dans une des plaques 384 puits. Chaque plaque utilisée dans l'essai contenait trois groupes. Dans le premier groupe, les puits ont été chargées avec des cellules non activées T (témoin négatif pour GFP sur chaque côté de la plaque, les puits A1-A24 et P1-P24), tandis que le deuxième groupe contenu des lymphocytes T activés sans drugs (contrôle positif pour GFP; puits A2-P2 et A23-P23). Tous les puits restants contenant les cellules T activées complétées par les entités chimiques utilisées dans le dépistage. Tous les puits contenaient 0,5% de DMSO. Des exemples pour les signaux GFP et Hoechst sont présentés pour les cellules non activées et T activés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: le dépistage phénotypique primaire. (A) Exemple représentatif d'un dépistage primaire réalisée sur 320 composés. Les cellules non-T activées sont pratiquement nulles GFP contrairement aux cellules T stimulées par le TCR, qui présentent 20 fois supérieure à l'expression de GFP. (B) Les données cumulées de tous les composés criblés en utilisant le test. L'expression de la GFP montre des composés diaction inhibitrice évasement alors que d'autres composés se comportaient comme des stimulateurs de lymphocytes T. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Plusieurs méthodes de lecture ont été exploitée pour le développement des sensibles et fiables HTS. Ceux-ci comprennent colorimétriques, luminescents ou fluorescents méthodes. Bien que les méthodes colorimétriques sont simples à mettre en place, ils nécessitent plusieurs ajouts de produits chimiques qui peuvent interférer ou perturber les cellules testées. 23 En outre, ils ne permettent pas une évaluation dynamique d'une réponse biologique comme l'effet pharmacologique est évaluée à un effet spécifique. En outre, cette méthode peut exiger des bras robotiques coûteux si HTS automatisés est utilisé. Ces facteurs rendent lecture-outs colorimétriques moins compatible avec l'objectif de HTS en raison de leurs exigences lourdes et une faible sensibilité. 23 Bien que la luminescence a été proposée comme une alternative aux essais colorimétriques, l'application de ces tests luminescents en HTS est généralement limitée en raison de l'exigence de la lyse cellulaire. Même si d'autres protocoles non-lyse ont été Dèdéve-, l'intensité du signal de bioluminescence peut être gênée par de nombreux facteurs tels que l'absorption de la luciférine, la disponibilité des co-facteurs, le pH et la transparence des milieux de culture ou un tampon, ce qui provoque des écarts entre les signaux de bioluminescence détectés et les changements réels dans l'activité cellulaire. 24 Par conséquent, la plupart des tests reposent sur des méthodes de fluorescence. En fait, les essais de fluorescence à base ont d'abord été développées en utilisant des petites molécules organiques, hautement fluorescentes capables de contrôler une variété de processus cellulaires lors de l'activation cellulaire. En somme, les dosages fluorescents ont une sensibilité plus élevée et peuvent être facilement adaptés pour les mesures phénotypiques pendant HTS. 23
Le HTS fluorescents à base de test développé présenté ici présente trois avantages majeurs. Tout d'abord, il est hautement fiable, reproductible et a été adoptée pour le criblage de composés capables de moduler deux cellules primaires différentes (lymphocytes T et B) en utilisant la même stimulation / lecture concept. Par exemple, le criblage primaire de 4,398 composés, qui a été achevée sur cinq pistes différentes affiche un signal cohérent induite par activation GFP avec intra minime et variabilités inter-dosage (<5% et <15%, respectivement pour le dosage des lymphocytes T). En second lieu, le dosage utilise un modèle de souris transgénique disponible dans le commerce. En règle générale, la conception d'un essai basé sur la fluorescence nécessite l'ingénierie génétique de cellules primaires ou d'une lignée cellulaire d'intérêt afin d'afficher un signal fluorescent lors d'une stimulation. Bien que cette approche génère un outil de laboratoire précieux, il est généralement pas facilement accessibles à la communauté scientifique. Pour contourner cette limitation, les lymphocytes T et B ont été isolés à partir des souris transgéniques GFP Nur77. L'avantage de ces lymphocytes est leur capacité à exprimer la GFP dans les 24 h sur TCR ou BCR stimulation. Par conséquent, les médicaments de criblage capable de moduler la machinerie transcriptionnelle conduisant l'expression de la GFP ou l'ensemble cellulaireréponse représente une approche attrayante. Troisièmement, complétant les cellules T avec des billes CD3 / CD28 dans leur phase d'activation initiale exige le retrait de ces perles avant l'évaluation de la GFP. Ceci est important si la microscopie est utilisée pour l'analyse des cellules T d'activation / inhibition en laissant les billes seront par ailleurs de masquer le signal de la GFP. Si par cytométrie de flux est utilisé à la place pour l'analyse, les perles peuvent être laissées dans les puits (à moins qu'il ne crée spécifiquement limitation supplémentaire de confusion (s) à l'essai) que la population d'intérêt spécifique peut être fermée à l'aide à la fois avant et éparpillements latérales.
L'objectif initial était de concevoir un test de dépistage à la manipulation cellulaire minimale. En vertu de ce contexte, l'activation des lymphocytes T ou B en utilisant des splénocytes non fractionnées stimulées avec des perles ou des anticorps solubles / recombinant CD40L respectivement été limitées comme une grande proportion de lymphocytes est resté GFP négative (Figure 1). Comme cette étape est essentielle pour le succèsde l'essai, le protocole a été modifié pour purifier des cellules T ou B en utilisant des kits disponibles dans le commerce pour augmenter les cellules exprimant la GFP pourcentage. Cette approche a considérablement amélioré les résultats d'activation des deux populations cellulaires. Bien qu'une autre méthode de choix peut être utilisé pour l'isolement des lymphocytes T et B, si cela est jugé nécessaire, l'approche proposée est la suivante: i) hautement reproductible, ii) facilement adaptée pour évaluer la pureté de la population isolée par cytométrie de flux avant HTS, iii) et plus efficace que l'étape de purification du temps est relativement courte (~ 30 min) et peut être réalisée avec un minimum de préparation. Cependant, il faut noter que l'analyse présentée dans cette étude est basée sur l'utilisation de cellules primaires de souris. Secondaire (à des fins de confirmation) et tertiaire (validation finale sur la cible d'intérêt) des essais doit être menée à la suite de l'écran principal pour valider les résultats identifiés. Bien qu'il puisse être facilement adapté à une variété de différentes lignées cellulaires, l'effet pharmacologique de l'irésultats indéterminés a besoin une validation supplémentaire sur d' autres espèces (par exemple des cellules humaines - exemple de dosage tertiaire) car il n'y a pas de moyens possibles pour prédire les effets durables entre les espèces. En bref, ce dosage est utile pour l'identification de nouveaux hits potentiels et / ou des cibles moléculaires avec une éventuelle extrapolation des résultats à partir de tests sur des animaux / in vitro pour l' homme.
Même si le test conçu peut être exploité aussi bien pour les lymphocytes T et B, un avantage est conféré à l'utilisation spécifique des lymphocytes T dans ce cas. L' activation du TCR nécessite généralement une stimulation double conférée par un primaire (par exemple anti-CD3 ou anti-TCR) et un signal de co-activation secondaire (par exemple anti-CD28). 25, 26 Il est intéressant, à la fois anti-CD3 et anti-CD28 peut être acheté directement lié à la surface de billes magnétiques, et peut être retiré de la suspension cellulaire en utilisant un aimant standard avant d' ajouter til des composés chimiques à tester dans le dépistage. Une bibliothèque avec des entités chimiques inconnues est utilisé, en conservant les cellules T activées libres de molécules liées à leur complexe TCR peut minimiser toute interférence possible entre les composés testés et ceux qui sont liés aux sillons de liaison de TCR. 27 En outre, l' élimination de l'agent de stimulation suivant mimétiques d'activation des lymphocytes T situations physiologiques plutôt que de travailler avec des cellules T soumises à une activation prolongée supraphysiologique TCR. Cette dernière situation peut être problématique, car il pourrait remplacer l'effet pharmacologique d'un composé donné en particulier si elle a été utilisée à de faibles concentrations dans le dépistage. Étant donné qu'il n'y a pas de billes disponibles dans le commerce exerçant le même effet sur les cellules B, il serait intéressant d'effectuer une HTS dans l'analyse ultérieure si la présence continue du stimulus sur les cellules B limite les performances du dosage.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les fonds Merck Frosst Start-up fournis par l'Université de Montréal. Nous tenons à remercier les Drs Jean Duchaine et Dominic Salois de la plate-forme à haut débit à l'Institut de recherche en immunologie et en cancérologie pour leurs discussions, commentaires et évaluations. Moutih Rafei est titulaire d'un Fonds de la Recherche en Santé du Québec 1 Prix junior.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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