Summary
Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.
Abstract
rastreio de alto rendimento (HTS) está actualmente a base para a identificação de entidades químicas capazes de modular as reacções bioquímicas ou processos celulares. Com o avanço das biotecnologias e o elevado potencial translacional de moléculas pequenas, uma série de abordagens inovadoras na descoberta de medicamentos têm evoluído, o que explica o interesse ressurgente no uso de HTS. O campo de oncologia é atualmente a área de pesquisa mais ativa para a triagem de drogas, sem grande avanço feito para a identificação de novos compostos imunomoduladores segmentação complicações relacionadas ao transplante ou doenças auto-imunes. Aqui, nós apresentamos um romance no ensaio linfócito fluorescente à base de murino in vitro facilmente adaptado para a identificação de novos compostos imunomoduladores. Este ensaio utiliza células T ou B derivados de um ratinho transgénico, em que o promotor conduz a expressão da GFP Nur77 mediante T ou a estimulação do receptor de células-B. À medida que a intensidade de GFP reflecte oactivação / actividade de transcrição da célula-alvo, o nosso ensaio define uma nova ferramenta para estudar o efeito de um dado composto (s) em respostas celulares / biológicas. Por exemplo, um rastreio primário foi realizado usando 4.398 compostos, na ausência de uma "hipótese de alvo", o que conduziu à identificação de potenciais sucessos 160 que exibem actividades imunomoduladoras. Assim, a utilização deste ensaio é adequado para programas de descoberta de drogas que exploram grandes bibliotecas químicas antes de serem in vitro / in vivo, os estudos de validação.
Introduction
High Throughput Screening (HTS) é uma estratégia comprovada amplamente adoptada para a identificação de novas moléculas terapêuticas ou para o reposicionamento de drogas aprovadas pela FDA em novas indicações médicas. 1 Até agora, o sucesso conseguido HTS pode ser medido pela pletora de drogas anteriormente descobertos. Por exemplo, a lapatinib inibidor de tirosina cinase utilizado para o tratamento de cancro da mama, sitagliptina; uma dipeptidil-peptidase-4 (DPP-4) inibidor utilizado como uma droga anti-hiperglicémicos, e o dasatinib inibidor de tirosina quinase Bcr-Abl oral utilizado para o tratamento de leucemia mielóide crónica representam alguns exemplos de uma longa lista de drogas aprovadas originalmente descobertas pela HTS. 2 Embora a produtividade da indústria farmacêutica ultimamente tem sofrido com a falta na descoberta de novas entidades químicas, a probabilidade de sucesso da descoberta de drogas podem ser melhorados através de um aumento no número de Candida pré-clínicates que apresentam propriedades biológicas / bioquímicas moduladores. Por conseguinte, o desenvolvimento de novos ensaios HTS adaptados para o rastreio fenotípica pode oferecer o potencial para proporcionar ferramentas farmacológicas importantes para a descoberta de novas drogas visitas. 3, 4, 5, 6 Além disso, HTS agora podem ser realizadas em um ritmo mais rápido devido às transformações tecnológicas significativas nos últimos anos, incluindo instalações de design personalizado flexíveis de robótica, novas tecnologias de leitura e do extenso miniaturização. 2, 7 Entre os fatores que contribuem para o crescente interesse no uso de triagem fenotípica (aka frente farmacologia) é a percepção de que o foco em efeitos funcionais, em vez de pressupostos reducionistas simplistas sobre alvos moleculares (/ reações bioquímicas de triagem por objectivo) é mais provável ao sho W eficácia clínica. Assim, a seleção fenotípica mantém a promessa de descobrir novos compostos potencialmente terapêuticos e vias moleculares de doenças atualmente incuráveis. 2
Para identificar correctamente inibidores ou activadores para um determinado alvo molecular ou função celular, um ensaio altamente sensível e fiável é necessária, a fim de diferenciar entre visitas de bona fide e falsos positivos. Então, o que faz um bom ensaio? A qualidade de um dado ensaio deve ser primeiro julgado por a relação sinal-ruído (reflectida por meio de um factor de Z). 8 Em segundo lugar, o efeito alvejado ou a meta da tela deve ser claramente estabelecida. Por exemplo, as abordagens baseadas em células funcionais podem oferecer vantagens significativas para o rastreio do receptor, em oposição a um ensaio especificamente concebido para avaliar o ligando-receptor de ligação. A razão para isto é que a última abordagem não é possível diferenciar entre ligandos agonistas e antagonistas.SS = "refex"> 9 Em contraste, uma abordagem baseada na célula é provável que seja mais eficaz como função do receptor pode ser avaliada directamente num fenótipo biológico (proliferação, a paragem do ciclo celular, apoptose, e / ou diferenciação). No entanto, deve notar-se que os ensaios bioquímicos pode proporcionar vantagens significativas sobre ensaios fenotípicos como eles infringir um alvo intracelular específico. Um ensaio bioquímico bem otimizado geralmente têm menos dispersão de dados do que uma triagem fenotípica, simplificando posteriormente investigações relacionadas com o mecanismo molecular de drogas de ação. No entanto, o grande inconveniente de ensaios baseados em alvo ou bioquímicos, é a possibilidade de amplificar a taxa de visitas de falsos positivos que possam afectar alvos não-específicas, quando testado num sistema biológico (perda da especificidade originalmente estudada no ensaio bioquímico). 10 Apesar de um ponto de corte bem estabelecida entre hits negativos e positivos podem minimizar o número de falsos positivos in a despistagem primária, a utilização de um sistema fisiologicamente relevante imitando o ambiente celular nativo, tais como células intactas, tecido ou animal inteiro todo permanece o núcleo do pêndulo desenhos de ensaios. Portanto, a seleção fenotípica permite a descoberta liderança com efeitos fenotípicos biológicas / desejáveis para doenças sem drogas metas identificados sem ter conhecimento prévio da actividade do composto ou modo de ação. 11
O presente estudo refere-se ao desenvolvimento e teste de uma seleção fenotípica optimizada e reprodutível com base em dois componentes importantes: um modelo de rato disponível no mercado e uma sub-família agrupado de compostos químicos. No que diz respeito ao modelo animal, o ensaio baseia-se na utilização de linfócitos derivados de uma estirpe de ratinho (Nur77 GFP) que alberga um cromossoma artificial bacteriano que contém uma cassete em que a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) é accionado por Thpromotor e Nur77. 12 A principal característica de esta estimulação é baseado no facto de que Nur77 é um gene precoce imediato sobre-regulada na sequência do receptor de células T (TCR) ou a estimulação do receptor de células B (BCR). 12 Como para o próprio método de rastreio, uma abordagem foi utilizada para ajudar a evitar o rastreio de análogos de triviais, minimizando o tempo necessário para avaliar uma biblioteca de química (> 10 5 compostos). Para isso, um banco de dados de compostos químicos selecionados por medicamentos químicos usando ferramentas Virtual foi explorada para identificar compostos topologicamente semelhantes usando estruturas de sementes ativos conhecidos como referências. Esta abordagem permitiu-nos para a tela 4.398 compostos representam uma biblioteca global de mais de 136.000 entidades químicas.
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Protocol
Todos os protocolos animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade de Montreal. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por inalação de CO 2 gradual até que não há sinais vitais foram observadas seguido por deslocamento cervical. O procedimento foi realizado por uma pessoa certificada para garantir que os animais foram sacrificados de forma humana e de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care.
1. Preparação de esplenócitos de médio e citometria de fluxo Tampão
- Executar todas as etapas sob um capuz biológica de 70% de etanol limpos.
- Remover 70 mL de pré-aquecido do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (comercialmente disponível e fornecido em filtradas frascos estéreis de 500 ml de volume) e colocar num tubo estéril. O meio removido será utilizado mais tarde no protocolo.
- Suplemento os restantes 430 mL de RPMI 1640 com soro 1x 50 ml inactivado fetal de bovino (FBS), 5 mL de penicilina / estreptomicina, 5ml de HEPES, 5 ml de aminoácidos não essenciais, piruvato de sódio a 5 mL, e 0,05 mL de filtrado (1M) de 2-mercaptoetanol.
NOTA: medium esplen�ito Pré-quente usando um banho de água regulado a 37 ºC para evitar células de calor chocante. Isto é importante para evitar a indução da apoptose celular. - Para preparar o tampão de citometria de fluxo, adicionar 2 ml de FBS a 98 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e manter refrigerado até à sua utilização (de um modo preferido dentro de três dias).
2. Geração de células em suspensão de esplenócitos de rato Nur77 GFP baços
- A septically isolar o baço de um rato fêmea 6-8 semanas de idade Nur77 GFP.
- Para conseguir isso, trabalhar sob o capô estéril. Mergulhe as sacrificaram rato pele, tesouras e pinças em 70% de etanol.
- Coloque o mouse sobre o lado direito, cortou a pele e os músculos no quadrante abdominal superior esquerdo. Inspecione a área da incisão para localizar visivelmente o baço, em seguida, cortá-lo. Mantenha o baçoem meio de esplenócitos em gelo até estar pronto para executar o próximo passo.
- Colocar o baço (s) numa célula de 10 cm2 placa de cultura de petri contendo 5 ml de meio de esplenócitos pré-aquecido.
- Amasse o baço usando um êmbolo da seringa estéril até que a solução é turva. Uma matriz de colagénio do baço devem permanecer até ao final do processo.
- Depois da extensa esmagou em meio esplen�ito, recolher a suspensão de células e passá-lo através de um filtro de células 70 mm colocado em um tubo de 50 mL para filtrar-out quaisquer detritos ou coágulos.
- Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, re-suspender o sedimento de células em 2-3 mL de tampão de lise in-house ou produzido comercial de células vermelhas do sangue. Na sequência de pipetagem (2-3 vezes) deixar o resto suspensão por 20-30 s.
- Adicionar 5 ml de PBS ou um tampão adequado de escolha depois centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 500 x g.
- Remover o sobrenadante (deve ser de cor vermelha, pois contém lisadas vermelho bcélulas Lood) e re-suspender o sedimento celular em 2 ml de meio de esplenócitos.
- Usando um hemocitômetro, contar o número de células coradas com azul de tripano para diferenciar entre células vivas e mortas (necróticas).
3. Isolamento de células T a partir de células em suspensão de esplenócitos
- Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 500 x g. Re-suspender as células em meio RPMI isento de soro (50 ml a partir do passo 1.3) para se obter uma concentração celular de 10 x 10 6 células / ml.
- Transferir as células para um tubo de poliestireno de 5 ml e reservar uma alíquota de 100 uL de esplenócitos para avaliação da pureza / comparação no final da etapa de purificação.
- Adicionar soro de rato normal a suspensão de células a 50 uL / mL seguido de cocktail de anticorpos de isolamento de células T (50 ul / ml).
- Misture a suspensão de células e deixe descansar por 10 min. Este passo permite que a mistura de anticorpos que ligam todas as células não desejadas.
- Adicione as esferas rápidas estreptavidina (ímangrânulos Ic) de 2,5 min, em seguida, levar o volume a 2,5 ml, utilizando o meio isento de soro.
- Colocar o tubo em um ímã de isolamento de células por 3 min.
- Transferir a suspensão de células T em um novo tubo de poliestireno, segurando o imã e derrama para fora a solução em um movimento.
NOTA: A suspensão isolado contém as células T purificadas. Todas as células indesejadas são realizadas no lado do tubo ligada às pérolas magnéticas de estreptavidina. - Contar as células isoladas T utilizando azul de tripano e um hemocitómetro.
NOTA: Nesta etapa a pureza das células T isoladas podem ser verificados (opcional) através da análise da percentagem de eventos CD3 +, antes e após o isolamento das células T por citometria de fluxo. 13- Resumidamente, centrifugação de 1 ml de suspensão de células de esplenócitos a 500 x g. Descartar o sobrenadante e suspender as células em tampão de citometria de fluxo a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml.
- Adicionar fluorescente marcada com anti-mouse CD3 anticorpo numa concentração de 1: 100. Incubar a 4 ° C durante 30 min. Lavar uma vez, de centrifugação e re-suspensão em tampão de citometria de fluxo (400 ul) para análise por citometria de fluxo.
4. Isolamento de células B a partir de células em suspensão de esplenócitos
- Seguir o mesmo protocolo que o descrito para as células T (passos 3,1-3,8), mas utilizando um estojo de isolamento de células-B. Para a avaliação da pureza, utilizar o anticorpo de CD19, em vez de o anticorpo CD3. 13
- Para a avaliação da pureza (opcional), utilizar o anticorpo de CD19, em vez de o anticorpo CD3. Centrifugar 1 ml de suspensão de células de esplenócitos a 500 x g. Descartar o sobrenadante e suspender as células em tampão de citometria de fluxo a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml.
- Adicionar fluorescente etiquetado anticorpo CD19 anti-ratinho a uma concentração de 1: 100 e incubar a 4 ° C durante 30 min. Lavar uma vez, de centrifugação e re-suspensão em tampão de citometria de fluxo (400 mL) foR análise por citometria de fluxo.
5. A activação de células T e a indução da expressão de GFP
- Semear as células T, em suspensão, em uma placa de 96 poços de fundo redondo numa concentração de 2,5 x 10 5 células / poço.
- Adicionar interleucina recombinante (IL) -7 em 2 ng / mL e CD3 / CD28 esferas magnéticas (25? L / 10 6 células). Manter uma porção das células T não tratados com os grânulos para servir como um controlo negativo para as medições posteriores, que representam as células T não activadas.
- Doze horas mais tarde, a colheita das células T a partir da placa de 96 cavidades por pipetagem suave da suspensão celular em cada cavidade para cima e para baixo para quebrar quaisquer complexos de células do grânulo / agregados. Recolha a suspensão de todos os poços para um tubo de poliestireno de 5 ml.
- Colocar o tubo contendo a suspensão no interior do mesmo íman isolamento de células utilizado anteriormente para a purificação de células T ou B e permitir que ele descansar durante 5 min.
- Transferir a suspensão de células T intoa novo tubo de poliestireno, segurando o imã e derrama para fora a solução em um movimento.
- Centrifugar as células a 500 xg durante 5 min. Re-suspender as células em meio fresco de esplenócitos para obter uma concentração de 2 X 10 6 células / ml.
- Avaliar GFP intensidade de expressão por citometria de fluxo (opcional para o controlo de qualidade), às 12 a 24 horas pós-estimulação em comparação com células não-T activadas. 12
NOTA: A fluorescência da GFP é intrínseco às células T Nur77 GFP e manifesta-se após a activação bem sucedida do TCR. 12 - Para avaliação da viabilidade e activação (opcional) por microscopia, corar as células activadas com Hoechst 30 min antes da análise a uma concentração de 0,2 ug / ml. Adicionar um volume adequado da suspensão de células para uma lâmina de cobertura ou a um poço de uma placa de 384 poços preta faces de fundo plano e examinar ao microscópio de fluorescência para avaliar as células vivas. As células mortas não reterá nuclearcoloração. 14
6. Activação de células B e a indução da expressão de GFP
- Utilizando um balão de cultura T-25, re-suspender as células B isoladas a 1 x 10 6 células / ml.
- Adicionar anti-rato IgG / IgM (H + L) a 10 uL / mL e CD40L recombinante a uma concentração de 200 ng / mL. Manter uma parte das células B não tratadas para servir como um controlo negativo para as medições posteriores (representando as células B não activados).
- Avaliar GFP intensidade de expressão por citometria de fluxo às 12 ou 24 h após a estimulação, em comparação com células não-B activadas.
NOTA: A fluorescência da GFP é intrínseco às células B Nur77 GFP e manifesta-se após a activação bem sucedida do BCR. 12 - Para avaliação da viabilidade e activação (opcional) por microscopia, corar as células activadas com Hoechst 30 min antes da análise a uma concentração de 0,2 ug / mL. Adicionar um volume adequado da suspensão de células auma cobertura deslizante ou a um poço de uma placa de 384 poços preta faces de fundo plano e examinar ao microscópio de fluorescência para avaliar as células vivas. As células mortas não irá reter a coloração nuclear. 14
Screening 7. High Throughput de pequenas moléculas
- Prepara-se uma suspensão de células a 2 x 10 6 células / ml de células T ou B activadas (grânulos magnéticos ou anticorpos / CD40L) ou grupos não-activado.
- Placa de 75.000 células / poço numa placa de 384 poços (volume de 40 uL). Use uma placa de 384 poços black-sided de fundo chato ou uma tampa de lâmina de microscópio para a viabilidade e ativação de avaliação por microscopia de fluorescência (passo de controle de qualidade opcionais antes da HTS) através da coloração Hoechst (consulte os passos 5.8 e 6.4 para mais detalhes). 14
- Manualmente ou utilizando um sistema automatizado, adicionar as drogas de escolha (dissolvido em DMSO a 0,5%) a cada poço.
- Adicionar o veículo (DMSO) para positiva (activado) e negativo (não-ACTIvado) poços de controlo. Ajustar a concentração de DMSO para um máximo de 0,5%.
- Incubar as placas durante 24 h (ou tempo de incubação de escolha) a 37 ºC e 5% de CO 2.
- No dia da análise, dilui-se a solução de corante Hoechst 33342 (1:. 3333; por exemplo, adicionar 10 ul às células em placas de 384 pos para gerar um volume total de 50 uL). Manchar 30 minutos antes da análise por adição de solução de GFP Hoechst para alcançar uma concentração de 0,2 ug / mL.
- Pipeta suavemente as células para cima e para baixo para obter uma distribuição homogênea em cada poço.
NOTA: Este passo é importante no caso de distribuição dos medicamentos (passo 7.3), utilizando um sistema automatizado como as células tendem a acumular-se num lado do poço, oposto ao sentido do fluxo. - Rodar as placas a 45 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Deixar as placas em repouso durante 15 min à temperatura ambiente.
- Execute placa (s) read-outs, utilizando as scre alto teor confocal automatizadosening sistema (HCS). 15 Carregue a placa para a máquina. Estabeleceu o objectivo de 40X ou superior ampliação. Usar a câmera # 4 por Hoechst (lâmpada UV) e câmera # 1 para GFP (laser 488). Configure o aparelho para ler 6-10 campos por poço. Ajustar a máquina para fazer duas leituras sequenciais por campo a 488 nm (para ler GFP) e luz UV (para ler Hoechst). Estabeleceu o objectivo de 40X ou superior ampliação.
NOTA: O sistema é um microscópio computadorizado que não necessita de quaisquer ajustes. A distância focal, a intensidade da luz incidente e o tempo de exposição são todos de configuração automaticamente pela máquina.
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Representative Results
Projeto do ensaio HTS
Dois fatores importantes foram tomadas em consideração na concepção do ensaio aqui fluorescente. Em primeiro lugar, o que for necessário para replicar uma condição fisiológica em que a activação das células T ou B representaria uma doença (por exemplo, doença enxerto-versus-hospedeiro). Em segundo lugar, a avaliação da activação celular deve ser efectuada utilizando um método sensível e quantitativo. Fluorescência é hoje um dos a escolha principal para HTS read-outs, uma vez que corresponde a essas necessidades. 10, 16 Como robusta GFP read-out podem ser obtidos seguindo Nur77 GFP -derived estimulação de células B ou T, tanto in vitro ou in vivo, 12 nosso ensaio exploraram esta estratégia para diferenciar entre células não activadas e activadas como um modelo útil para o iDENTIFICAÇÃO de compostos imunomoduladores.
Originalmente, o design do nosso ensaio foi baseada na avaliação de GFP por citometria de fluxo utilizando esplenócitos estimulados não fraccionadas. Neste caso, ambas as células não-activados / activados T e B foram coradas com anti-CD3 ou anti-CD19, respectivamente, antes da avaliação da GFP. Como mostrado na Figura 1A, as células T (células T CD3 +) representam aproximadamente 30% de um dado de baço de ratinho. No estado de equilíbrio, o nível de GFP foi na gama de 10% (mais provavelmente devido à selecção de pós-tímica através do TCR durante o desenvolvimento ou a estimulação homeostático na periferia). Após a estimulação de TCR utilizando as esferas / CD28 CD3, de cinco a seis vezes aumento na percentagem de expressão da GFP (57% em vez de 10%) foi detectada em células T CD3 + (Figura 1A - B). Do mesmo modo, as células B (células CD19 +) representam 50-55% dos esplenócitos totais e sua basal GFP expression é comparável com as células não-T activadas (por exemplo, ~ 10%, a Figura 1C). É interessante notar, no entanto, a estimulação de BCR utilizando anti-IgG de ratinho / IgM e CD40L recombinante provocou um aumento insignificante na expressão da GFP (33% em vez de 12%, a Figura 1C - D). Como expressão da GFP é um elemento chave para avaliar o efeito farmacológico de pequenas moléculas selecionados em células T ou B ativadas, optimizando a sua intensidade é central para a sensibilidade e sucesso da triagem.
Avaliação da expressão de GFP utilizando células T ou B purificadas
Embora a estimulação de células T e B pode ser conseguida directamente usando esplenócitos não fraccionados, a intensidade da expressão da GFP não foi suficientemente sensível para o rastreio especialmente se leituras de devem ser executadas por microscopia. A fim de melhorar a resposta celular, as células T foram primeiro purificados por magnéticagrânulos usando um kit disponível comercialmente (Figura 2A). Como mostrado anteriormente utilizando esplenócitos não fraccionados, 10% de células T CD3 + foram isoladas de GFP positivo (expressão basal). Neste contexto, a estimulação de células T utilizando as esferas CD3 / CD28 melhorou significativamente a sua resposta a GFP (Figura 2A - 2B, 86% contra 57% quando foram utilizados os esplenócitos não fraccionados). Melhorias semelhantes foram obtidos com células B (Figura 2C - 2D, 80% em vez de 33%). Estes resultados demonstram claramente que a utilização de células T e B purificadas maximiza a expressão de GFP, que é adequado para o rastreio fenotípica proposto.
Diagrama esquemático do ensaio HTS concebido
Em geral, o ensaio pode ser sub-dividido em quatro secções principais (Figura 3). No caso de células T, por exemplo, um esplenócitossuspensão de células é preparada de forma a purificar as células T (passos 1-3), seguido por um passo de estimulação de 12 h in vitro, utilizando esferas de CD3 / CD28 (passos 4-5). As células T activadas são então plaqueadas e cultivadas durante 24 h com as pequenas moléculas de escolha em placas de 384 poços (passos 6-7), antes da avaliação das intensidades de GFP e Hoechst utilizando o sistema automatizado de HCS. O mesmo ensaio pode ser utilizado para as células B com as modificações realizadas nos passos 4-5. Resumidamente, as células B podem ser estimuladas com anti-ratinho IgG / IgM e CD40L recombinante em vez de pérolas. Como estes componentes são utilizados na sua forma solúvel (isto é, não ligados a esferas), células B podem ser incubadas durante 12 h, em seguida, simplesmente lavadas antes do plaqueamento em placas de 384 poços para o processo de triagem.
sobrevivência de células T eficaz é primordial para o sucesso do estudo HTS. Por conseguinte, dois factores limitantes podem impedir a qualidade do ensaio e deve ser tomado em consideração. Primeiro, As células T de murideo são altamente susceptíveis à apoptose após estimulação in vitro. 17 Em segundo lugar, todos os compostos testados são diluídos numa solução de DMSO, que pode adicionar um segundo factor de stress. Para minimizar a perda de células, IL-7 recombinante (2 ng / ml) foi suplementado para as células T por estimulação de TCR nos passos 4-5. Esta citocina homeostático suporta a proliferação e aumenta a sobrevivência de células T através da expressão de moléculas de anti-apoptóticos tais como Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22
throughput screening alta primária de 4.398 compostos revela vários ativadores e inibidores da activação de células T
Um rastreio de elevado rendimento foi realizada por plaqueamento de 75000 não activado (co negativontrol) ou células T activadas (controlo positivo) como indicadas na Figura 4. Para garantir uma elevada reprodutibilidade, o ensaio foi realizado várias vezes com um factor de Z obtida de 0,87 (Figura 5A). Usando o sistema de HCS, a expressão da GFP observada de células T estimuladas foi 20 vezes mais elevada do que as células T não estimuladas, permitindo a geração de um '' janela de acção ' "zona em que os compostos inibitórios GFP podia ser facilmente detectadas (Figura 5A). Isto é mostrado na figura, em termos do número de células fluorescentes, dividido pelo número total de células nos campos digitalizados. No exemplo mostrado na Figura 5A, o rastreio de 320 compostos revelados três compostos (apontado-out por setas vermelhas), capazes de inibir a expressão de GFP por 1,5-2,5 dobras. Neste exemplo, o valor de controlo positivo foi de 0,44 ± 0,02 e o controlo negativo foi de 0,02 ± 0,00.
ºe o rastreio de um total de 4398 (factor de compostos Z de 0,85) foi então realizada. Os compostos foram seleccionados pelos químicos medicinais como sementes / compostos representativos com base na sua estrutura química que representam uma biblioteca química global contendo 136.000 entidades (Figura 5B). No final do ensaio, a análise de inibição de GFP compostos capazes de inibir quer desviadores (positivo) ou aumentar a expressão de GFP (desviadores negativos) identificado.
Figura 1: Análise de T e a expressão da GFP de células B seguinte TCR ou activação BCR conduzida em esplenócitos não fraccionados. (A) Análise de citometria de fluxo representativas de células T coradas com um anticorpo anti-CD3 utilizando esplenócitos na ausência (painel superior esquerdo) ou na presença de grânulos de CD3 / CD28 (painel superior direito). a expressão da GFP em ambos os grupos de células T são apresentadosno fundo. (B) Percentagem de expressão de GFP obtido por análise de citometria de fluxo de células T. As barras de erro representam SD ± média. (C) Semelhante a (A), excepto que os esplenócitos foram activadas utilizando anti-IgG de ratinho / IgM e CD40L recombinante, em seguida, coradas para CD19. (D) Percentagem de expressão de GFP obtido por análise de citometria de fluxo de células B. As barras de erro representam SD ± média. Todas as experiências mostradas foram repetidas pelo menos três vezes (n = 5 / grupo; * P <0,05 e *** P <0,001). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Análise da expressão de GFP utilizando células T purificadas ou B seguinte TCR ou activação BCR respectivamente. Repres (A)análise de citometria de fluxo tante de células T purificadas coradas com um anticorpo anti-CD3. Para a indução GFP, as células T purificadas foram estimuladas utilizando esferas CD3 / CD28 (painel superior direito). As células T não activadas de controle são mostradas no painel superior esquerdo. expressão GFP de ambas as células não ativadas e ativadas T é exibida na parte inferior. (B) Percentagem de expressão de GFP obtido por análise de citometria de fluxo de células T. As barras de erro representam SD ± média. (C) Semelhante a (A), excepto que a pureza das células B foi avaliada por coloração com CD19 e activado utilizando anti-IgG de ratinho / IgM e CD40L recombinante. (D) Percentagem de expressão de GFP obtido por análise de citometria de fluxo de células B. As barras de erro representam SD ± média. Todas as experiências mostradas foram repetidas pelo menos três vezes (n = 5 / grupo e *** P <0,001). Por favor clique aqui para ver uma maiorversão desta figura.
Figura 3: diagrama esquemático geral que representa as etapas de a triagem fenotípica. Existem 7 grandes passos necessários para preparar o ensaio de HTS. Um rato Nur77 GFP fêmea é sacrificada para isolar o seu baço (Passo 1). Após a geração de uma suspensão de células de esplenócitos (Passo 2), as células T são isoladas de forma negativa (por depleção das células não desejadas) utilizando um estojo comercialmente disponível (passo 3). As células T isoladas são então incubadas com IL-7 recombinante na ausência ou na presença de grânulos de CD3 / CD28 na placa de 96 poços de fundo redondo a 37 ° C (passo 4). Doze horas mais tarde (passo 5), as células T são pipetados várias vezes para remover quaisquer agregados antes da remoção grânulos utilizando o mesmo íman isolamento de células originalmente utilizado para a purificação de células T. As células T isoladas são então semeadas em placas de 384 poços (75 000 celLS / poço, passo 6) com os compostos durante mais 24 horas (passo 7). No dia seguinte, as células incubadas são corados com Hoechst, 30 minutos antes da análise por o sistema de HCS (passo 8). O mesmo esquema pode ser seguido-se para a preparação de um ensaio à base de células B, excepto que o passo 4 e 5 são para ser substituída por uma lavagem simples como os estimuladores são adicionados em formas solúveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Esquema para o plaqueamento de células T num placas de 384 poços. Cada uma das placas usadas no ensaio continha três grupos. No primeiro grupo, os poços foram carregadas com células não-T activados (controlo negativo para GFP em cada um dos lados da placa; poços A1-A24-P1 e P24), enquanto que o segundo grupo continha células T activadas sem Drugs (controle positivo para GFP; poços A2-P2 e A23-P23). Todos os restantes poços contendo células T activadas suplementadas com as entidades químicas utilizadas no rastreio. Todos os poços continham 0,5% de DMSO. Exemplos para os sinais de GFP e Hoechst são apresentados para as células não-activados e T activadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: triagem fenotípica primária. (A) Exemplo representativo de um rastreio primário realizado em 320 compostos. As células não-T activadas são quase nula GFP em contraste com as células T TCR-estimuladas, o monitor 20 vezes maior expressão da GFP. (B) dados cumulativo de todos os compostos rastreados utilizando o ensaio. A expressão de GFP demonstra compostos diacção inibidora espalhamento enquanto outros compostos se comportavam como estimuladores de células T. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Vários métodos read-out foram explorada para o desenvolvimento de ensaios de HTS sensíveis e fiáveis. Estes incluem colorimétrico, luminescentes ou fluorescentes métodos. Embora os métodos colorimétricos são simples de set-up, eles exigem várias adições de produtos químicos, que podem interferir ou perturbar as células que está sendo testado. 23 Além disso, eles não permitem a avaliação dinâmica de uma resposta biológica como o efeito farmacológico é considerada como sendo um parâmetro específico. Além disso, este método pode necessitar de braços robóticos caro se HTS automatizado é utilizado. Esses fatores tornam colorimétricos read-outs menos compatível com o objectivo de HTS devido aos seus requisitos complicados e baixa sensibilidade. 23 Embora luminescência tem sido proposto como uma alternativa ao meio de ensaios colorimétricos, a aplicação destes ensaios luminescentes em HTS é geralmente limitado devido à necessidade de lise celular. Embora outros protocolos não foram de liseveloped, a intensidade do sinal de bioluminescência pode ser impedida por muitos factores, tais como a absorção de luciferina, a disponibilidade de co-factores, o pH, e a transparência de meios de cultura ou de tampão, fazendo com que as discrepâncias entre os sinais detectados de bioluminescência e as variações reais da actividade celular. 24 Por conseguinte, a maioria dos ensaios contam com métodos de fluorescência. De facto, ensaios fluorescentes à base foram inicialmente desenvolvido utilizando moléculas orgânicas pequenas, altamente fluorescentes capazes de monitorizar uma variedade de processos celulares, por activação de célula. Em suma, ensaios fluorescentes têm uma sensibilidade mais elevada e pode ser facilmente adaptado para medições fenotípicas durante HTS. 23
O ensaio de HTS-fluorescentes com base desenvolvido aqui apresentada tem três vantagens principais. Em primeiro lugar, é altamente fiável, reprodutível e foi aprovada para o rastreio de compostos capazes de modular a duas células primárias diferentes (linfócitos T e B) utilizando o mesmo estimulaçãoção / leitura de conceito. Por exemplo, o rastreio primário de 4.398 compostos, que foi completada ao longo de cinco ensaios diferentes exibido um sinal consistente induzida por activação com GFP intra mínima e variabilidades inter-ensaio (<5% e <15%, respectivamente, para o ensaio de células T). Em segundo lugar, o ensaio utiliza um modelo de ratinho transgénico disponíveis comercialmente. Geralmente, o desenho de um ensaio baseado em fluorescência requer a engenharia genética de células primárias ou de uma linha de células de interesse, a fim de exibir um sinal fluorescente após estimulação. Embora esta abordagem gera uma ferramenta de laboratório precioso, geralmente não está prontamente disponível para a comunidade científica. Para ultrapassar esta limitação, células T e B foram isolados a partir dos ratinhos transgénicos Nur77 GFP. A vantagem destes linfócitos é a sua capacidade para expressar GFP dentro de 24 h após estimulação TCR ou BCR. Portanto, o rastreio de drogas capazes de modular a maquinaria transcricional condução expressão GFP ou o total celularresposta representa uma abordagem atraente. Em terceiro lugar, completando as células T com contas CD3 / CD28 em sua fase de ativação inicial requer a remoção de estas contas antes da avaliação GFP. Isto é importante se a microscopia foi utilizado para a análise de activação de células T / inibição como deixando os grânulos, caso contrário, mascarar o sinal de GFP. Se citometria de fluxo é usado em vez disso para a análise, os grânulos podem ser deixados nos poços (a menos que especificamente gera limitação adicional de confusão (s) para o ensaio) como a população específica de interesse pode ser fechado usando tanto para a frente e dispersa laterais.
O objetivo inicial era criar um ensaio de rastreio com a manipulação celular mínima. De acordo com este contexto, a activação de células B, utilizando esplenócitos não fraccionados ou T estimuladas com esferas ou anticorpos solúveis / CD40L recombinante, respectivamente, foi limitada a uma grande proporção de linfócitos permaneceram negativos GFP (Figura 1). Uma vez que este passo é crítico para o sucessodo ensaio, o protocolo foi modificado para purificar as células T ou B, utilizando kits disponíveis comercialmente para aumentar as células que expressam GFP percentuais. Esta abordagem melhora significativamente o resultado de activação de ambas as populações de células. Embora um outro método de escolha pode ser usada para o isolamento de células T e B, se for considerado necessário, o método proposto é: i) altamente reprodutível, ii) facilmente adaptado para avaliar a pureza da população isolada por citometria de fluxo antes de HTS, iii) e tempo eficiente como o passo de purificação é relativamente curto (~ 30 min) e pode ser realizada com o mínimo de preparação. No entanto, deve notar-se que o ensaio apresentado neste estudo baseia-se na utilização de células primárias de rato. Secundário (para confirmação) e terciária (validação final sobre o alvo de interesse) ensaios devem ser realizados seguindo a tela principal para validar os sucessos identificados. Embora possa ser facilmente adaptado para uma variedade de diferentes linhas de células, o efeito farmacológico da isucessos dentified precisa de maior validação em outras espécies (por exemplo, células humanas - Exemplo de ensaio terciária) como não há nenhuma maneira possível prever efeitos sustentados entre as espécies. Em resumo, este ensaio é útil para a identificação de novos potenciais sucessos e / ou em alvos moleculares com a possibilidade de extrapolação de resultados de ensaios in vitro para os seres humanos / animais.
Embora o ensaio concebido pode ser explorada para ambas as células T e B, uma vantagem é conferido para a utilização específica de células T neste caso. Activação TCR geralmente requer estimulação dupla conferida por meio de um primário (por exemplo, anti-CD3 ou anti-TCR) e um sinal secundário de co-activação (por exemplo, anti-CD28). 25, 26 Curiosamente, ambos os anticorpos anti-CD28 e anti-CD3 podem ser adquiridos directamente ligada sobre a superfície de esferas magnéticas, e pode ser removida a partir da suspensão de células utilizando um magnete padrão antes de adicionar tele compostos químicos a ser testado na triagem. Como uma biblioteca com entidades químicas desconhecidas está sendo usado, mantendo células T ativadas livres de moléculas ligadas ao seu complexo de TCR podem minimizar qualquer possível interferência entre os compostos testados e aqueles vinculados às ranhuras de ligação de TCR. 27 Além disso, a remoção do agente estimulador da seguinte imita activação de células T situações fisiológicas em vez de trabalhar com células T submetidas a uma activação TCR suprafisiológica sustentada. A última situação pode ser problemática, uma vez que pode substituir o efeito farmacológico de um dado composto, especialmente se ele foi usado em pequenas concentrações no rastreio. Como não existem grânulos disponíveis comercialmente que exercem o mesmo efeito em células B, que seria interessante para realizar um HTS na testes futuros se a presença contínua do estímulo de células B limita o desempenho do ensaio.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos fundos Merck Frosst arranque proporcionado pela Université de Montréal. Nós gostaríamos de agradecer Drs Jean Duchaine e Dominic Salois a partir da plataforma de alta capacidade no Instituto de Investigação em Imunologia e Cancro para sua discussão, comentários e feedbacks. Moutih Rafei detém uma Fonds Recherche en Santé du Québec Award de la júnior 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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