Summary
We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.
Abstract
High-throughput screening (HTS) is momenteel de steunpilaar voor de identificatie van chemische entiteiten kan moduleren biochemische reacties of cellulaire processen. Met de vooruitgang van biotechnologie en de hoge translationele potentieel van kleine moleculen, een aantal innovatieve benaderingen geneesmiddelen hebben ontwikkeld, waarbij de oplevende belangstelling voor het gebruik van HTS verklaart. De oncologie veld is op dit moment de meest actieve onderzoeksgebied voor drug discovery, zonder belangrijke doorbraak voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen targeting-transplantatie gerelateerde complicaties of auto-immune aandoeningen. Hier presenteren we een nieuwe in vitro muizen-fluorescentie gebaseerde assay lymfocyt gemakkelijk worden aangepast voor de identificatie van nieuwe immunomodulerende verbindingen. Deze test maakt gebruik van T- of B-cellen afkomstig van een transgene muis waarin het Nur77 promotor drijft GFP expressie na T- of B-celreceptor stimulatie. Aangezien de GFP intensiteit weerspiegelt deactivatie / transcriptionele activiteit van de doelcel, onze assay bepaalt een nieuw hulpmiddel om het effect van bepaalde verbinding (en) aan cellulaire / biologische reacties bestuderen. Zo werd een primaire screening uitgevoerd onder gebruikmaking 4398 verbindingen in afwezigheid van een "target hypothese", die leidde tot de identificatie van mogelijke treffers 160 tonen immunomodulerende activiteiten. Zo is het gebruik van deze test is geschikt voor drug discovery programma verkennen grote chemische libraries voorafgaand aan in vitro / in vivo studies verder valideren.
Introduction
High throughput screening (HTS) is een bewezen strategie voor de identificatie van nieuwe therapeutische moleculen of herpositionering van FDA-goedgekeurde geneesmiddelen in nieuwe medische indicaties ingeburgerd. 1 nu toe, kan de bereikte HTS succes worden gemeten door de overvloed van eerder ontdekte drugs. Bijvoorbeeld de tyrosine kinase inhibitor lapatinib gebruikt voor de behandeling van borstkanker, sitagliptine; een dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) -remmer gebruikt als een anti-hyperglycemische drugs, en de orale Bcr-Abl tyrosine kinase inhibitor dasatinib gebruikt voor de behandeling van chronische myelogene leukemie geven enkele voorbeelden van een lange lijst van goedgekeurde geneesmiddelen oorspronkelijk ontdekt door HTS. 2 Hoewel de productiviteit van de farmaceutische industrie onlangs heeft last van een gebrek in de ontdekking van nieuwe chemische entiteiten, de kans op een succesvolle geneesmiddelen kan worden verbeterd door een toename van het aantal pre-klinische candidates weergeven van modulerende biologische / biochemische eigenschappen. Bijgevolg kan de ontwikkeling van nieuwe assays HTS aangepast voor fenotypische screening potentieel belangrijke farmacologische instrumenten verschaffen voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen treffers bieden. 3, 4, 5, 6 Verder kunnen HTS nu worden uitgevoerd in een sneller tempo door belangrijke technologische veranderingen in de afgelopen jaren ook op maat gemaakte flexibele robot installaties nieuwe uitlezing technologieën of omvangrijke miniaturisatie. 2, 7 Onder de factoren die bijdragen aan de groeiende belangstelling voor het gebruik van fenotypische screening (aka forward farmacologie) is de perceptie dat het focussen op de functionele gevolgen in plaats van ongenuanceerd reductionistische aannames ten aanzien van moleculaire doelwitten (target-based screening / biochemische reacties) is de kans groter naar sho w klinische werkzaamheid. Zo fenotypische screening houdt de belofte om nieuwe potentiële therapeutische verbindingen en moleculaire wegen van nog onbehandelbare ziekten bloot te leggen. 2
Goed remmers of activatoren voor een gegeven doelwit of celfunctie te identificeren, is een zeer gevoelige en betrouwbare test nodig om onderscheid te maken tussen bonafide klappen en valse positieven. Dus, wat maakt een goede test? De kwaliteit van een gegeven test moet eerst worden beoordeeld door de signaal-ruisverhouding (weerspiegeld door een Z-factor). 8 Ten tweede moet het gerichte effect of het doel van het scherm duidelijk worden vastgesteld. Zo kunnen functionele celtechnieken belangrijke voordelen voor screening receptor in tegenstelling tot een assay specifiek ontworpen om ligand-receptorbinding te bepalen. De reden hiervoor is dat de laatste benadering niet kan maken tussen agonist en antagonist liganden.ss = "xref"> 9 daarentegen een celgebaseerde aanpak waarschijnlijk effectiever receptorfunctie direct kan worden beoordeeld in een biologisch fenotype te zijn (proliferatie, stoppen van de celcyclus, apoptose en / of differentiatie). Wel moet worden opgemerkt dat biochemische assays belangrijke voordelen kan bieden via fenotypische testen zoals inbreuk maken op een specifieke intracellulaire doelwit. Een goed geoptimaliseerde biochemische assay zullen over het algemeen minder gegevens scatter dan een fenotypische screening en vereenvoudigt nadien onderzoeken die op de drug moleculaire werkingsmechanisme. De belangrijkste nadeel van doelgerichte of biochemische assays is de kans op het amplificeren van het aantal valse positieve hits die aspecifieke doelen kunnen beïnvloeden wanneer getest in een biologisch systeem (verlies van de specificiteit oorspronkelijk onderzocht in de biochemische assay). 10 Hoewel een gevestigde cut-off point tussen negatieve en positieve treffers het aantal valse positieven te minimaliseren in de primaire screening, het gebruik van een fysiologisch relevante systeem nabootsen van de natuurlijke cellulaire omgeving zoals intacte cellen, weefsels of hele hele dier blijft de kern van het testontwerp slinger. Daarom fenotypische screening maakt lead discovery met gewenste biologische / fenotypische effecten op ziekten zonder geïdentificeerde drug targets zonder voorafgaande kennis van activiteiten of wijze van optreden van de verbinding. 11
De hierin studie heeft betrekking op de ontwikkeling en het testen van een geoptimaliseerd en reproduceerbare fenotypische screening op basis van twee belangrijke componenten: een in de handel verkrijgbaar muismodel en een geclusterde sub-familie van chemische verbindingen. Wat het diermodel, de assay berust op het gebruik van lymfocyten afgeleid van een muizenstam (Nur77 GFP) herbergt een bacterieel kunstmatig chromosoom bevat een cassette waarin de expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) wordt aangedreven door The Nur77 promotor. 12 Het kenmerk van deze stimulering is gebaseerd op het feit dat Nur77 een directe vroege gen opgereguleerd na T-celreceptor (TCR) of B-cel receptor (BCR) stimulatie. 12 Wat betreft de werkwijze het screenen zelf, is een aanpak om het vermijden van de screening van triviale analogen tegelijk de tijd die nodig is om een grote chemische library (> 10 5 verbindingen) te beoordelen. Om dit te doen, een database van chemische verbindingen geselecteerd door geneesmiddelen chemici gebruik van virtuele screening instrumenten werd benut om topologisch soortgelijke verbindingen met behulp van bekende actieve zaad structuren als verwijzingen te identificeren. Deze aanpak liet ons toe om te screenen 4398 verbindingen waarmee een totaalbedrag bibliotheek van meer dan 136.000 chemische entiteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Montreal. De muizen werden gedood door een geleidelijke inademing van CO 2 tot er geen vitale functies waargenomen gevolgd werden door cervicale dislocatie. De procedure werd uitgevoerd door een gecertificeerd persoon uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de dieren werden gedood op een humane manier en op basis van de aanbevelingen van de Canadese Raad over Animal Care.
1. Bereiding van splenocyten Medium en Flow-cytometrie Buffer
- Voer alle stappen in het kader van een 70% ethanol-gereinigd biologische capuchon.
- Verwijder 70 ml voorverwarmde Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium (in de handel verkrijgbaar en in gefilterd 500 ml volume steriele flessen meegeleverd) en plaats in een steriele buis. Het verwijderde medium zal later worden gebruikt in het protocol.
- Supplement de resterende 430 ml RPMI 1640 met 1 x 50 ml geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 5 ml penicilline / streptomycine, 5mL HEPES, 5 ml niet-essentiële aminozuren, 5 ml natriumpyruvaat en 0,05 ml gefiltreerd (1M) 2-mercaptoethanol.
OPMERKING: Pre-warm splenocyten medium met behulp van een waterbad ingesteld op 37 ºC tot warmte schokkend cellen te voorkomen. Dit is belangrijk voor inductie van cellulaire apoptose voorkomen. - Om de stroom-cytometrie buffer te bereiden, voeg 2 ml FBS tot 98 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en koel bewaren tot gebruik (bij voorkeur binnen drie dagen).
2. Genereren van splenocyten Cell Suspension uit Nur77 GFP muizenmilten
- Een septically de milt uit een 6-8 weken oude vrouwelijke Nur77 GFP muis isoleren.
- Hiervoor werken onder steriele kap. Week de opgeofferd muis vacht, schaar en pincet in 70% ethanol.
- Leg de muis op zijn rechterzijde, snijd de huid en de spieren in de linkerbovenhoek buik kwadrant. Inspecteer de incisie gebied om zichtbaar te lokaliseren de milt en snijd het uit. Houd de miltin splenocyten medium op ijs pas klaar om de volgende stap uit te voeren.
- Plaats de milt (en) in een 10 cm 2 celkweek petrischaaltje met 5 ml voorverwarmd medium splenocyten.
- Wrijf de milt met behulp van een steriele injectiespuit zuiger totdat de oplossing troebel. Een milt collageenmatrix moet tegen het einde van de procedure blijven.
- Na een uitgebreide pureren in splenocyten medium, het verzamelen van de celsuspensie en geef het door een 70 um cel zeef geplaatst op een 50 ml buis te filteren-out vuil of stolsels.
- Centrifugeer bij 500 xg gedurende 5 minuten. Na het weggooien van het supernatant, resuspendeer de cel pellet in 2-3 ml in-house geproduceerde of commercieel van rode bloedcellen lysisbuffer. Na pipetteren (2-3 keer) laat de schorsing rust voor 20-30 s.
- Voeg 5 ml PBS buffer of een geschikte keuze centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof (moet rood van kleur zijn, want het bevat gelyseerde rode blood-cellen) en resuspendeer de cel pellet in 2 ml splenocyten medium.
- Met behulp van een hemocytometer, tel het aantal cellen gekleurd met trypan blauw te maken tussen levende en dode (necrotische) cellen.
3. T-cel Isolatie van de splenocyten Cell Suspension
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 500 x g. Resuspendeer de cellen in serumvrij RPMI-medium (50 ml van stap 1,3) tot een cellulaire concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml te verkrijgen.
- Overdracht van de cellen naar een 5 ml polystyreen buis en de vernietiging van een 100 ul aliquot van splenocyten zuiverheid beoordeling / vergelijking aan het einde van de zuiveringsstap.
- Voeg normaal rattenserum aan de celsuspensie bij 50 ul / ml gevolgd door T celisolatie antilichaam cocktail (50 ul / ml).
- Meng de celsuspensie en laat het rusten voor 10 min. Deze stap maakt het antilichaam cocktail om alle ongewenste cellen te binden.
- Voeg de streptavidine snelle sferen (magneetic korrels) gedurende 2,5 min, breng dan het volume op 2,5 ml met de serumvrije medium.
- Plaats de buis in een celisolatie magneet voor 3 minuten.
- Breng de T-cel suspensie in een nieuwe polystyreen buis door het houden van de magneet en uitgieten van de oplossing in één beweging.
OPMERKING: De geïsoleerde suspensie bevat het gezuiverde T-cellen. Alle ongewenste cellen worden gehouden op de zijkant van de buis gebonden aan de magnetische streptavidine beads. - Tel de geïsoleerde T-cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer.
OPMERKING: Bij deze stap de zuiverheid van de geïsoleerde T-cellen (optioneel) kan worden gecontroleerd door analyse van het percentage van CD3 + gebeurtenissen voor en na T cel isolatie door flow-cytometrie. 13- Kort Centrifugeer 1 ml splenocyten celsuspensie bij 500 x g. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen in stromingscytometrie buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
- Voeg fluorescent-gelabelde anti-mouse CD3 antilichaam bij een concentratie van 1: 100. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was eenmaal, centrifuge en resuspendeer in flow-cytometrie buffer (400 ul) voor analyse door middel van flow-cytometrie.
4. B-cel Isolatie van de splenocyten Cell Suspension
- Volgen hetzelfde protocol als beschreven voor T-cellen (stappen 3.1-3.8) maar met gebruik van een B-cel isolatiekit. Voor de beoordeling zuiverheid, gebruik maken van de CD19 antilichaam in plaats van de CD3 antilichaam. 13
- Voor de beoordeling zuiverheid (optioneel), gebruik maken van de CD19 antilichaam in plaats van de CD3 antilichaam. Centrifuge 1 ml splenocyten celsuspensie bij 500 x g. Verwijder het supernatant en suspendeer de cellen in stromingscytometrie buffer bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
- add fluorescent gelabeld anti-muis CD19 antilichaam bij een concentratie van 1: 100 en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Was eenmaal, centrifuge en resuspendeer in flow-cytometrie buffer (400 ul) for analyse door middel van flow-cytometrie.
5. T-cel activatie en de inductie van GFP expressie
- Zaad de T-cellen, in suspensie, in een ronde bodem 96-well plaat bij een concentratie van 2,5 x 10 5 cellen / putje.
- Voeg recombinant interleukine (IL) -7 bij 2 ng / ml en CD3 / CD28 magnetische parels (25 ui / 10 6 cellen). Houd een gedeelte van de T-cellen behandeld met kralen te dienen als een negatieve controle voor latere metingen die niet-geactiveerde T-cellen vertegenwoordigen.
- Twaalf uur later, oogsten de T-cellen van de 96-well plaat door voorzichtig pipetteren de celsuspensie in elk putje en neer elke hiel-cel complex / aggregaten breken. Verzamel de opschorting van alle putjes in een 5 ml polystyreen buis.
- De buis wordt met de suspensie in de eerder voor zuivering van T- of B-cellen hetzelfde celisolatie magneet en laat het rusten gedurende 5 min.
- Breng de celsuspensie T into een nieuwe polystyreen buis door het houden van de magneet en uitgieten van de oplossing in één beweging.
- Centrifugeer de cellen bij 500 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de cellen in splenocyten vers medium tot een concentratie van 2 x 10 6 cellen / ml te krijgen.
- Beoordelen van GFP expressie intensiteit door flow-cytometrie (optioneel voor kwaliteitscontrole) op 12 tot 24 uur na de stimulatie in vergelijking met niet-geactiveerde T-cellen. 12
NB: De GFP-fluorescentie is inherent aan de Nur77 GFP T-cellen en manifesteert zich na succesvolle activering van de TCR. 12 - Voor de beoordeling van de levensvatbaarheid en activering (optioneel) van microscopie, vlekken op de geactiveerde cellen met Hoechst 30 minuten vóór de analyse bij een concentratie van 0,2 ug / ml. Voeg voldoende volume van de celsuspensie om een cover dia of een putje van een vlakke bodem zwart-zijdige 384-wells plaat en onderzoek onder de fluorescentie microscoop om levende cellen te beoordelen. Dode cellen zal niet nucleaire behoudenkleuring. 14
6. B-cel activatie en de inductie van GFP expressie
- Gebruik een kolf T-25, resuspendeer de geïsoleerde B-cellen in 1 x 10 6 cellen / ml.
- Add anti-muis IgG / IgM (H + L) bij 10 ul / ml en recombinant CD40L bij een concentratie van 200 ng / mL. Houd een deel van de B-cellen onbehandeld om te dienen als een negatieve controle voor latere metingen (die niet-geactiveerde B-cellen).
- Beoordelen intensiteit GFP expressie door flow-cytometrie op 12 of 24 uur na stimulatie in vergelijking met niet-geactiveerde B-cellen.
LET OP: De GFP-fluorescentie is inherent aan de Nur77 GFP B-cellen en manifesteert zich na succesvolle activering van de BCR. 12 - Voor de beoordeling van de levensvatbaarheid en activering (optioneel) van microscopie, vlekken op de geactiveerde cellen met Hoechst 30 minuten vóór de analyse bij een concentratie van 0,2 ug / ml. Voeg voldoende volume van de celsuspensieeen cover dia of een putje van een vlakke bodem zwart-zijdige 384-wells plaat en onderzoeken in het kader van een fluorescentie microscoop om levende cellen te beoordelen. Dode cellen nucleaire kleuring handhaven. 14
7. high throughput screening van kleine moleculen
- Bereid een celsuspensie van 2 x 10 6 cellen / ml van de geactiveerde T- of B-cellen (magnetische korrels of antilichamen / CD40L) of niet-geactiveerde groepen.
- Plaat 75.000 cellen / putje in een 384-well plaat (volume van 40 ui). Gebruik een platte bodem zwart-zijdige 384-well plaat of een microscoop dekking glijbaan voor de levensvatbaarheid en activering beoordeling door fluorescentie microscopie (optioneel kwaliteitscontrole stap voorafgaand aan de HTS) met behulp van Hoechst vlek (zie stap 5.8 en 6.4 voor details). 14
- Handmatig of met een geautomatiseerd systeem, om de geneesmiddelen van keuze (opgelost in 0,5% DMSO) aan elke well.
- Voeg de drager (DMSO) positieve (geactiveerd) en negatieve (non-actiactiveerd) controleputjes. Passen DMSO concentratie tot maximaal 0,5%.
- Incubeer de platen gedurende 24 uur (of incubatietijd keuze) bij 37 ° C en 5% CO2.
- Op de dag van de screening verdunnen Hoechst 33342 vlek oplossing (1:. 3333, voor bijvoorbeeld voeg 10 ul aan de cellen in 384 putjes met een totaal volume 50 uL genereren). Vlek 30 min voor GFP analyse door toevoeging Hoechst oplossing tot een concentratie van 0,2 ug / ml te bereiken.
- Voorzichtig pipet de cellen op en neer om een homogene verdeling in elke krijgen ook.
Opmerking: Deze stap is belangrijk bij het afgeven van geneesmiddelen (stap 7,3) onder toepassing van een geautomatiseerd systeem zoals de cellen hopen zich aan één zijde van de put, tegengesteld aan de richting van de stroming. - Spin de platen bij 45 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Laat de platen rusten gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Voer plaat (s) read-outs, met behulp van de geautomatiseerde confocale hoge gehalte scresterking (HCS) -systeem. 15 Laad de plaat aan de machine. Stel de doelstelling op 40X of hogere vergroting. Gebruik camera # 4 voor Hoechst (UV-lamp) en camera # 1 voor GFP (laser 488). Stel de machine 6-10 velden per goed te lezen. Stel de machine tot twee opeenvolgende metingen per gebied te doen bij 488 nm (te lezen GFP) en UV-licht (te lezen Hoechst). Stel de doelstelling op 40X of hogere vergroting.
NB: Het systeem is een geautomatiseerde microscoop die aanpassingen niet vereist. De brandpuntsafstand, de intensiteit van het invallende licht en de blootstellingsduur worden allemaal automatisch door de machine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het ontwerp van de HTS assay
Twee belangrijke factoren rekening gehouden bij het ontwerpen van de hierin fluorescentie. Eerst moesten we een fysiologische aandoening waarbij T- of B-celactivering een aandoening (bijvoorbeeld graft-versus-host ziekte) zou betekenen repliceren. Ten tweede moet de beoordeling van cellulaire activering worden uitgevoerd met een gevoelige en kwantitatieve methode. Fluorescentie is tegenwoordig een van de belangrijkste keuze voor HTS uitlezingen als deze overeenkomt met deze behoeften. 10, 16 Als robuuste GFP uitlezing kan worden verkregen volgend Nur77 GFP -afgeleide T- of B-cel stimulatie, zowel in vitro of in vivo, 12 onze assay benut deze strategie te maken tussen niet- geactiveerde en geactiveerde cellen als werkmodel voor de identification van immunomodulerende verbindingen.
Oorspronkelijk was de vormgeving van onze assay was gebaseerd op GFP beoordeling door flow cytometrie middels gefractioneerde gestimuleerde splenocyten. In dit geval worden zowel niet-geactiveerde / geactiveerde T- en B-cellen gekleurd met anti-CD3 of anti-CD19, respectievelijk vóór GFP evaluatie. Zoals getoond in figuur 1A, T-cellen (CD3 + cellen) vertegenwoordigen ongeveer 30% van elke muis milt. Bij steady state, het GFP niveau lag in het gebied van 10% (waarschijnlijk door post-thymus selectie via TCR tijdens ontwikkeling of homeostatische stimulatie in de periferie). Na TCR stimulatie met de CD3 / CD28 beads, een 5-6-voudige toename in het percentage GFP-expressie (57% in plaats van 10%) werd gedetecteerd in CD3 + T-cellen (Figuur 1A - B). Evenzo B-cellen (CD19 + cellen) vertegenwoordigen 50-55% van splenocyten en hun basale GFP expression is vergelijkbaar met niet-geactiveerde T-cellen (bijvoorbeeld ~ 10%, figuur 1C). Interessant genoeg, BCR stimulatie met behulp van anti-muis IgG / IgM en recombinant CD40L veroorzaakt triviale toename van GFP expressie (33% in plaats van 12%, Figuur 1C - D). Zoals GFP expressie is een belangrijk element voor de beoordeling van het farmacologisch effect van gescreend kleine moleculen op geactiveerde T-of B-cellen, het optimaliseren van de intensiteit is centraal voor de gevoeligheid en het succes van de screening.
Beoordeling van de GFP expressie met behulp van gezuiverde T of B-cellen
Hoewel T- en B-cel stimulatie direct met ongefractioneerde splenocyten kunnen worden bereikt, de intensiteit van GFP-expressie was niet gevoelig genoeg voor het screenen vooral als uitlezingen worden uitgevoerd door microscopie. Om de cellulaire respons te verbeteren, werden T-cellen eerst gezuiverd door magnetischekralen met een commercieel verkrijgbare kit (Figuur 2A). Zoals eerder gegeven met ongefractioneerde splenocyten, 10% geïsoleerde CD3 + T-cellen werden GFP-positieve (basale expressie). In dit verband, T-cel stimulatie met de CD3 / CD28 beads aanzienlijk verbeterd hun GFP respons (Figuur 2A - 2B, 86% tegenover 57% bij gefractioneerde splenocyten werden gebruikt). Soortgelijke verbeteringen werden verkregen met B-cellen (Figuur 2C - 2D, 80% in plaats van 33%). Deze resultaten tonen duidelijk aan dat het gebruik van gezuiverde T- en B-cellen maximaliseert GFP expressie, die geschikt is voor de voorgenomen fenotypische screening.
Schematische weergave van de ontworpen HTS-test
Kortom, de assay onderverdeeld in vier secties (figuur 3) zijn. Bij T-cellen bijvoorbeeld een splenocytencelsuspensie bereid om T-cellen te zuiveren (stappen 1-3), gevolgd door een 12 uur stimulatie stap in vitro gebruik CD3 / CD28 beads (stappen 4-5). Geactiveerde T-cellen worden daarna uitgeplaat en gedurende 24 uur met de kleine moleculen van keuze in 384 putjes (stappen 6-7) voor de beoordeling van GFP en Hoechst intensiteiten van de geautomatiseerde HCS systeem. Dezelfde assay kan worden gebruikt voor B-cellen met modificaties uitgevoerd bij stappen 4-5. In het kort kunnen B-cellen worden gestimuleerd met anti-muis IgG / IgM en recombinant CD40L plaats van kralen. Deze onderdelen in hun oplosbare vorm (bijvoorbeeld niet gekoppeld aan parels), B-cellen worden gedurende 12 uur dan gewoon vóór uitplaten in 384-well platen voor de screening gewassen.
Efficiënte overleving T-cel fundamenteel voor het welslagen van de HTS studie. Dienovereenkomstig kunnen twee beperkende factoren die de kwaliteit van de test belemmeren en in aanmerking moeten worden genomen. EersteMurine T-cellen zijn zeer gevoelig voor apoptose volgend op in vitro stimulatie. 17 In de tweede plaats zijn alle geteste verbindingen verdund in een DMSO oplossing, die een tweede stressfactor zou kunnen toevoegen. Om celverlies, recombinant IL-7 (2 ng / ml) werd aangevuld minimaliseren om T cellen na TCR stimulatie stappen 4-5. Deze homeostatische cytokine ondersteunt proliferatie en verhoogt T-cel overleving door de expressie van anti-apoptotische moleculen zoals Bcl-2, Bcl-xL en Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22
Primaire high throughput screening van 4398 verbindingen onthult meerdere activatoren en remmers van T-cel activatie
Een high throughput screening werd uitgevoerd door het uitplaten 75.000 niet-geactiveerde (negatieve co verrichtntrol) of geactiveerde T-cellen (positieve controle) zoals weergegeven in figuur 4. Om een hoge reproduceerbaarheid te waarborgen, werd de test herhaaldelijk uitgevoerd met een Z verkregen factor van 0,87 (figuur 5A). Met het HCS systeem, de waargenomen GFP expressie van gestimuleerde T-cellen was 20 maal hoger dan niet-gestimuleerde T-cellen waardoor de vorming van een 'venster actie' zone waar GFP remmende verbindingen gemakkelijk kan worden gedetecteerd (Figuur 5A). Dit wordt afgebeeld in termen van het aantal fluorescente cellen gedeeld door het totale aantal cellen in het gescande gebied. In het in figuur 5A bijvoorbeeld het screenen van 320 verbindingen onthulde drie verbindingen (richten-door rode pijlen) kunnen remmen GFP expressie door 1.5-2.5 vouwen. In dit voorbeeld is de positieve controlewaarde was 0,44 ± 0,02 en de negatieve controle was 0,02 ± 0,00.
the screening van een totaal van 4398 verbindingen (Z factor 0,85) werd vervolgens uitgevoerd. De verbindingen werden geselecteerd als medicinale chemici seed / representatieve verbindingen op basis van hun chemische structuur waarmee een totaalbedrag chemische bibliotheek met 136.000 eenheden (figuur 5B). Aan het einde van de test, analyse van GFP remming geïdentificeerde verbindingen die ofwel remmen (positieve coördinerende) of verbetering GFP expressie (negatieve devianten).
Figuur 1: Analyse van T- en B-cel GFP expressie na TCR of BCR activering uitgevoerd met gefractioneerde splenocyten. (A) Representatieve stroomcytometrie analyse van T-cellen gekleurd met een anti-CD3 antilichaam behulp splenocyten in afwezigheid (linker paneel) of aanwezigheid van CD3 / CD28 beads (rechter paneel). GFP-expressie van zowel T-cel blokken worden weergegevenaan de onderkant. (B) Percentage van GFP-expressie verkregen door flow-cytometrie analyse van T-cellen. Error bars vertegenwoordigt gemiddelde ± SD. (C) vergelijkbaar met (A) behalve dat splenocyten geactiveerd met anti-muis IgG / IgM en recombinant CD40L vervolgens gekleurd voor CD19. (D) Het percentage GFP-expressie verkregen door flow-cytometrie analyse van B-cellen. Error bars vertegenwoordigt gemiddelde ± SD. Alle weergegeven experimenten werden minstens driemaal herhaald (n = 5 / groep; * P <0,05 en *** p <0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van GFP expressie met behulp van gezuiverde T- of B-cellen na respectievelijk TCR of BCR activatie. (A) Represdiger stroomcytometrie analyse van gezuiverde T-cellen gekleurd met een anti-CD3 antilichaam. Voor GFP inductie, werden gezuiverde T-cellen gestimuleerd met behulp van CD3 / CD28 beads (bovenste rechter paneel). Niet-geactiveerde controle T-cellen worden getoond in de linkerbovenhoek paneel. GFP expressie van zowel niet-geactiveerde en geactiveerde T-cellen wordt weergegeven op de bodem. (B) Percentage van GFP-expressie verkregen door flow-cytometrie analyse van T-cellen. Error bars vertegenwoordigt gemiddelde ± SD. (C) vergelijkbaar met (A) behalve dat de zuiverheid van B-cellen werd vastgesteld door CD19 kleuring en geactiveerd met anti-muis IgG / IgM en recombinant CD40L. (D) Het percentage GFP-expressie verkregen door flow-cytometrie analyse van B-cellen. Error bars vertegenwoordigt gemiddelde ± SD. Alle weergegeven experimenten werden minstens driemaal herhaald (n = 5 / groep en *** p <0,001). Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.
Figuur 3: Gemiddelde schematisch diagram dat de stappen van de fenotypische screening. Er zijn 7 belangrijke stappen die nodig zijn om de HTS-test voor te bereiden. Een vrouwelijke Nur77 GFP muis opgeofferd om haar milt (Stap 1) te isoleren. Na het genereren van een splenocyten celsuspensie (stap 2), worden T-cellen geïsoleerd negatief (door depletie van ongewenste cellen) met een commercieel verkrijgbare kit (stap 3). Geïsoleerde T-cellen worden vervolgens geïncubeerd met recombinant IL-7 in de afwezigheid of aanwezigheid van CD3 / CD28 beads in ronde-bodem 96-putjes plaat bij 37 ° C (stap 4). Twaalf uur later (stap 5), worden T-cellen herhaaldelijk gepipetteerd één aggregaten vóór parels verwijderd met dezelfde celisolatie magneet oorspronkelijk voor T-cel zuivering verjagen. Geïsoleerde T-cellen worden vervolgens gezaaid in 384 putjes (75 000 CELls / putje, stap 6) met de verbindingen nog eens 24 uur (stap 7). De volgende dag worden geïncubeerd cellen gekleurd met Hoechst 30 min voorafgaand aan analyse door het HCS systeem (stap 8). Dezelfde opzet kan opgevolgd voor de bereiding van een B-cel-gebaseerde assay, behalve dat stap 4 en 5 worden vervangen door een eenvoudige wassing als de stimulatoren worden toegevoegd in oplosbare vormen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Schema voor de beplating van T-cellen in een 384-well platen. Elke plaat die in de test bevatte drie groepen. In de eerste groep werden de putjes beladen met niet-geactiveerde T-cellen (negatieve controle voor GFP aan elke zijde van de plaat, putjes A1-A24 en P1-P24), terwijl de tweede groep bevatte geactiveerde T-cellen zonder drugs (positieve controle voor GFP, putten A2-P2 en A23-P23). Alle overblijvende putjes die geactiveerde T-cellen aangevuld met de chemische entiteiten die in de screening. Alle wells bevatten 0,5% DMSO. Voorbeelden van de GFP en Hoechst signalen weergegeven voor niet-geactiveerde en geactiveerde T-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Primaire fenotypische screening. (A) Representatief voorbeeld van een primaire screening uitgevoerd op 320 verbindingen. Niet-geactiveerde T-cellen GFP bijna nul in tegenstelling tot TCR-gestimuleerde T-cellen, welk scherm 20 maal hoger GFP expressie. (B) De gecumuleerde gegevens van alle verbindingen gescreend met de test. De GFP expressie toont verbindingen displaying remmende werking terwijl andere verbindingen werden gedragen als T-cel stimulatoren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verscheidene uitlezing werkwijzen zijn gebruikt voor de ontwikkeling van gevoelige en betrouwbare HTS assays. Deze omvatten colorimetrische, lichtgevende of fluorescerende methoden. Hoewel colorimetrische methoden zijn eenvoudig te installeren, ze vereisen meerdere toevoegingen van chemicaliën die kunnen interfereren of verstoren van de cellen getest. 23 Verder zij geen dynamische beoordeling van een biologische respons mogelijk de farmacologische werking wordt gesteld op een specifiek eindpunt. Voorts kan deze werkwijze kostbaar robotarmen zijn indien automatische HTS gebruikt. Deze factoren maken colorimetrische uitlezen minder met de doelstelling van HTS vanwege de omslachtige eisen en lage gevoeligheid. 23 Hoewel luminescentie is als alternatief voor colorimetrische assays voorgesteld, de toepassing van deze luminescerende tests HTS is gewoonlijk beperkt door de eis van cellysis. Hoewel andere niet-lysis protocollen DEkeld, de intensiteit van de bioluminescentie signaal kan worden belemmerd door vele factoren, zoals luciferine absorptie, beschikbaarheid van co-factoren, pH en transparantie van kweekmedia of buffer, waardoor verschillen tussen de gedetecteerde signalen bioluminescentie en werkelijke veranderingen in celactiviteit. 24 Vandaar dat de meeste assays afhankelijk fluorescentiewerkwijzen. In feite werden fluorescerende gebaseerde testen oorspronkelijk ontwikkeld met behulp van kleine, zeer fluorescente organische moleculen voor de controle van diverse cellulaire processen bij celactivering. Kortom, fluorescente assays hogere gevoeligheid en kan eenvoudig worden aangepast voor fenotypische metingen tijdens HTS. 23
De ontwikkelde fluorescerende gebaseerd HTS-test hier gepresenteerde heeft drie grote voordelen. Ten eerste is zeer betrouwbaar, reproduceerbaar en voor het screenen van verbindingen die moduleren twee verschillende primaire cellen (T- en B-lymfocyten) vastgesteld volgens dezelfde stimutie / uitlezing concept. Bijvoorbeeld, de primaire screening van verbindingen 4398, die vijf verschillende runs voltooid vertoonde een consistente activatie geïnduceerd GFP signaal met minimale intra- en inter-assay variabiliteit (<5% en <15% voor respectievelijk T cel assay). Ten tweede, de test maakt gebruik van een in de handel verkrijgbaar transgeen muismodel. Meestal is het ontwerp van een fluorescentie-gebaseerde test vereist de genetische manipulatie van primaire cellen of een cellijn van belang teneinde een fluorescerend signaal na stimulatie geven. Hoewel deze aanpak genereert een kostbaar laboratorium tool, het is over het algemeen niet gemakkelijk beschikbaar zijn voor de wetenschappelijke gemeenschap. Om deze beperking te omzeilen, werden T en B-cellen geïsoleerd uit de Nur77 GFP transgene muizen. Het voordeel van deze lymfocyten is hun vermogen om GFP binnen 24 uur na TCR of BCR stimulatie uit te drukken. Daarom screenen drugs kunnen moduleren het transcriptieapparaat drijvende GFP expressie of de totale cellulairerespons vertegenwoordigt een aantrekkelijke aanpak. Ten derde, ter aanvulling van T-cellen met CD3 / CD28 beads in hun eerste activering fase vereist de verwijdering van deze kralen voorafgaand aan GFP evaluatie. Dit is belangrijk als microscopie gebruikt voor het analyseren van T-cel activatie / inhibitie als het verlaten van de kralen anders het GFP-signaal maskeren. Als stroomcytometrie plaats wordt gebruikt bij de analyse, kunnen korrels worden achtergelaten in de putjes (tenzij uitdrukkelijk tot extra verstorende beperking (en) aan de assay) als specifieke populatie van belang kan worden afgesloten met behulp van zowel voorwaartse en zijwaartse verstrooit.
Het oorspronkelijke doel was om een screeningstest met minimale cellulaire handling ontwerpen. Onder dit verband is de activering van T- of B-cellen middels gefractioneerde splenocyten gestimuleerd met kralen of oplosbare antilichamen / recombinant CD40L respectievelijk beperkt, aangezien een groot deel van lymfocyten bleven negatief GFP (Figuur 1). Aangezien deze stap is essentieel voor het succesvan de test, het protocol werd aangepast voor T- of B-cellen met behulp van commercieel verkrijgbare kits voor het percentage GFP tot expressie brengende cellen te verhogen zuiveren. Deze benadering aanzienlijk verbeterd activatie uitkomst van beide celpopulaties. Hoewel andere voorkeursmethode kan worden gebruikt voor T en B celisolatie zo nodig, de voorgestelde aanpak: i) zeer reproduceerbare, ii) gemakkelijk worden aangepast aan de zuiverheid van de geïsoleerde populatie beoordelen door flow-cytometrie vóór HTS, iii) en tijdbesparend de zuiveringsstap betrekkelijk kort (~ 30 min) en kan worden uitgevoerd met minimale voorbereiding. Wel moet worden opgemerkt dat de test die in deze studie is gebaseerd op het gebruik van de muis primaire cellen. Secundaire (ter bevestiging) en tertiaire (uiteindelijke validatie van het doelwit van belang) tests moeten worden uitgevoerd na de primaire scherm om de geïdentificeerde klappen te valideren. Hoewel het gemakkelijk kan worden aangepast om een verscheidenheid van verschillende cellijnen, het farmacologische effect van identified klappen moet verder gevalideerd op andere soorten (bijvoorbeeld menselijke cellen - bijvoorbeeld van de tertiaire test) omdat er geen mogelijkheden om langdurige effecten tussen soorten te voorspellen. Kortom, deze test is waardevol voor de identificatie van nieuwe potentiële hits en / of moleculaire doelwitten met mogelijke extrapolatie van de resultaten van in vitro / dierproeven mens.
Hoewel de test gemaakt kan worden benut voor zowel T- als B-cellen, is één voordeel van het gebruik van specifieke T-cellen in casu verleend. TCR activatie vereist gewoonlijk dual stimulatie via een primaire (bijvoorbeeld anti-CD3 of anti-TCR) verleend en een tweede co-activeren (bv anti-CD28) signaal. 25, 26 Interessant zowel anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen kunnen worden aangeschaft direct gekoppeld op het oppervlak van de magnetische korrels, en kan uit de celsuspensie verwijderd worden met een standaard magneet voor het toevoegen thij chemische verbindingen te testen in de screening. Als een bibliotheek met onbekende chemische entiteiten wordt gebruikt, vasthouden van geactiveerde T-cellen zonder gebonden moleculen hun TCR complex kan eventuele interferentie tussen de onderzochte verbindingen en die gebonden aan de TCR binden groeven minimaliseren. 27 Bovendien verwijderen de stimulerende middel na T-celactivering bootst fysiologische omstandigheden in tegenstelling tot het werken met T-cellen onderworpen aan een langdurige suprafysiologische TCR activatie. Deze laatste situatie kan problematisch zijn omdat het farmacologische effect van een bepaalde verbinding kan overschrijven vooral als het werd gebruikt bij kleine concentraties in de screening. Aangezien er geen commercieel verkrijgbaar kralen uitoefenen hetzelfde effect op B-cellen, zou het interessant zijn om een HTS presteren in de toekomst te onderzoeken of het continue aanwezigheid van de stimulus op B-cellen beperkt de werking van de test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Merck Frosst Start-up middelen die door Universiteit van Montreal. We danken Drs Jean Duchaine en Dominic Salois van de High-throughput platform aan het Instituut voor Onderzoek in de Immunologie en Kanker voor hun discussie, commentaar en feedback. Moutih Rafei houdt een Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
