Summary
Wir präsentieren in der aktuellen Studie eine neuartige fluoreszenzbasierten Assays von einer transgenen Maus abgeleiteten Lymphozyten. Dieser Assay ist für Hochdurchsatz-Screening (HTS) von kleinen Molekülen dotiert mit einer Kapazität von entweder Hemmung oder Förderung der Lymphozytenaktivierung geeignet.
Abstract
High-Throughput-Screening (HTS) ist derzeit die Hauptstütze für die Identifizierung chemischer Einheiten fähig biochemischer Reaktionen oder zellulärer Prozesse zu modulieren. Mit der Weiterentwicklung der Biotechnologien und der hohen translationale Potenzial von kleinen Molekülen, eine Reihe von innovativen Ansätzen in der Wirkstoffforschung entwickelt haben, die den wieder auflebenden Interesse an der Verwendung von HTS erklärt. Die Onkologie Bereich ist derzeit der aktivste Forschungsgebiet für Wirkstoff-Screening, ohne großen Durchbruch für die Identifizierung neuer immunmodulatorischer Verbindungen Targeting Transplantation Komplikationen im Zusammenhang mit oder Autoimmunerkrankungen gemacht. Hier stellen wir ein neues in vitro murine fluoreszenzbasierten Lymphozyten - Assay zur Identifizierung neuer immunmodulatorischen Verbindungen leicht angepasst. Dieser Assay verwendet T- oder B-Zellen von einer transgenen Maus abgeleitet ist, in dem der Promotor Nur77 GFP-Expression auf T- oder B-Zellen-Rezeptor-Stimulation steuert. Da die GFP Intensität spiegelt dieAktivierung / transkriptionale Aktivität der Zielzelle, unser Test definiert einen neuen Werkzeug, um die Wirkung der gegebenen Verbindung (en) auf die zelluläre / biologische Reaktionen zu untersuchen. Verwendung von 4.398 Verbindungen in Abwesenheit eines "Zielhypothese" wurde zum Beispiel ein primäres Screening durchgeführt, die auf die Identifizierung von 160 potentiellen Treffer anzeigt immunmodulatorischen Aktivitäten führte. Somit ist die Verwendung dieses Assays für die Wirkstoffforschung Programme Erforschung großer chemischer Bibliotheken vor geeignet , um in vitro / in - vivo - Validierungsstudien fördern.
Introduction
Hochdurchsatz-Screening (HTS) ist eine bewährte Strategie weithin für die Identifizierung neuer therapeutischer Moleküle oder für die Neupositionierung von FDA-zugelassenen Medikamente in neuen medizinischen Indikationen angenommen. 1 Bisher kann die erzielte HTS Erfolg durch die Fülle der bisher entdeckten Drogen gemessen werden. Zum Beispiel verwendet der Tyrosinkinaseinhibitor lapatinib für die Behandlung von Brustkrebs, sitagliptin; ein Dipeptidyl-Peptidase-4 (DPP-4) Inhibitors als antihyperglykämischen Medikament, und die orale Bcr-Abl-Tyrosinkinase-Inhibitor dasatinib für die Behandlung von chronischer myeloischer Leukämie stellen einige Beispiele für eine lange Liste von zugelassenen Medikamente ursprünglich entdeckt, verwendet durch HTS. 2 Obwohl die Produktivität der pharmazeutischen Industrie in letzter Zeit von einem Mangel in der Entdeckung neuer chemischer Einheiten erlitten hat, kann die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Wirkstoffforschung durch eine Erhöhung der Anzahl der vorklinischen Candida verbessert werdentes Anzeige modulierende biologische / biochemische Eigenschaften. Dementsprechend könnte die Entwicklung von neuen HTS-Assays zur phänotypischen Screening angepasst bieten das Potential wichtige pharmakologische Werkzeuge zur Entdeckung neuer Medikamente Treffern zu liefern. 3, 4, 5, 6 Darüber hinaus HTS kann nun in einem schnelleren Tempo durchgeführt werden aufgrund erheblichen technologischen Veränderungen in den letzten Jahren mit speziell entwickelten flexiblen Roboterinstallationen, neue Auslesetechnologien und umfassende Miniaturisierung. 2, 7 Unter den Faktoren , die zu dem wachsenden Interesse an der Verwendung von phänotypischen Screening (auch bekannt als Vorwärts-Pharmakologie) ist die Wahrnehmung beitragen , dass eher als vereinfachend reduktionistischen Annahmen über funktionale Effekte konzentriert in Bezug auf molekulare Targets (Zielbasierte Screening / biochemische Reaktionen) wahrscheinlicher ist , zu sho w klinische Wirksamkeit. Somit hält phänotypischen Screening versprechen neue potentiell therapeutischen Verbindungen und molekularen Mechanismen von derzeit unheilbar Krankheiten aufzudecken. 2
Um richtig Inhibitoren oder Aktivatoren für eine gegebene molekulare Ziel oder die Zellfunktion zu identifizieren, ein hoch empfindlicher und zuverlässiger Assay erforderlich ist, um zwischen bona fide - Hits und Fehlalarme zu unterscheiden. Also, was macht einen guten Test? Die Qualität eines gegebenen Assay müssen zunächst durch das Signal-zu-Rausch-Verhältnis beurteilt werden (durch einen Z-Faktor reflektiert). 8 Zweitens ist die gezielte Wirkung oder das Ziel des Bildschirms sollte eindeutig festgelegt. Zum Beispiel, funktionale zellbasierte Ansätze können erhebliche Vorteile für die Rezeptor-Screening bieten als die Bindung an einen Assay spezifisch zu beurteilen Ligand-Rezeptor entworfen gegenüber. Der Grund dafür ist, dass der letztgenannte Ansatz nicht zwischen Agonisten- und Antagonisten-Liganden unterscheiden.ss = "xref"> 9 Im Gegensatz dazu ist eine zellbasierte Ansatz ist wahrscheinlich (, Zellzyklusarrest, Apoptose und / oder Differenzierung Proliferation) zu sein , kann effektiver als Rezeptor - Funktion direkt in einem biologischen Phänotyp beurteilt werden. Es muss jedoch beachtet werden, daß biochemische Assays wesentliche Vorteile gegenüber phänotypischen Assays stellen können, da sie auf einem spezifischen intrazellulären Ziel verletzen. Eine gut optimierte biochemische Assays haben in der Regel weniger Datenstreuung als eine phänotypische Screening während danach Untersuchungen zum Drogen molekularen Wirkmechanismus der im Zusammenhang zu vereinfachen. Jedoch ist der Hauptnachteil der zielbasierten oder biochemischen Assays die Wahrscheinlichkeit, die Rate falsch positiver Treffer Amplifizieren die unspezifischen Targets beeinflussen können, wenn sie in einem biologischen System (Verlust der Spezifität ursprünglich untersucht in der biochemischen Assay) getestet. 10 Obwohl ein gut etabliertes Grenzpunkt zwischen negativen und positiven Treffer können die Anzahl der Fehlalarme zu minimieren in die primäre Screening, die Verwendung eines physiologisch relevanten System die nativen zellulären Umgebung wie intakte Zellen, Gewebe oder ganzen ganze Tier nachahmt bleibt der Kern des Assaydesigns Pendels. Daher ermöglicht phänotypischen Screening Leitstruktursuche mit wünschenswerten biologischen / phänotypischen Wirkungen für Krankheiten, bei denen keine Angriffspunkte für Medikamente ohne vorherige Kenntnis der Verbindung der Aktivität oder Wirkungsweise aufweist. 11
Die hierin Studie bezieht sich auf die Entwicklung und Erprobung eines optimierten und reproduzierbaren Screening phänotypische basiert auf zwei wichtigen Komponenten: eine handelsübliche Maus-Modell und einem gruppierten Unterfamilie von chemischen Verbindungen. In Bezug auf das Tiermodell beruht der Test auf der Verwendung von Lymphozyten aus einer Maus - Stamm abgeleitet (Nur77 GFP) ein bakterielles künstliches Chromosom beherbergt eine Kassette enthält , in dem die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) von th angetrieben wirde Nur77-Promotor. 12 Das Kennzeichen dieser Stimulation basiert auf der Tatsache , dass Nur77 ein immediate early Gens hochreguliert folgenden T-Zell - Rezeptor (TCR) oder B-Zell - Rezeptor (BCR) Stimulation. 12 Wie für das Screening - Verfahren selbst wurde ein Ansatz verwendet , um das Screening von trivialen Analoga zu helfen , zu vermeiden , während die Zeit eine große chemische Bibliothek zu beurteilen , zu minimieren benötigt (> 10 5 Verbindungen). Dazu wählte eine Datenbank von chemischen Verbindungen, die durch medizinischen Chemikern virtuelles Screening-Tools wurde ausgebeutet zu identifizieren topologisch ähnliche Verbindungen bekannten aktiven Samenstrukturen als Referenzen. Dieser Ansatz erlaubt uns 4398 Verbindungen Einheiten vertreten, eine Gesamt Bibliothek von über 136.000 chemischen Bildschirm.
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Protocol
Alle Tier Protokolle wurden von der Animal Care Committee der Université de Montréal genehmigt. Die Mäuse wurden durch allmähliche Einatmen von CO 2 , bis keine Vital eingeschläfert wurden durch Genickbruch folgte beobachtet. Das Verfahren wurde von einem zertifizierten Person durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Tiere auf humane Weise eingeschläfert wurden und entsprechend den Empfehlungen des Canadian Council on Animal Care.
1. Herstellung von Splenozyten-Medium und Durchflusszytometrie-Puffer
- Führen Sie alle Schritte unter einem 70% igem Ethanol gereinigt biologische Kapuze.
- Entfernen Sie 70 ml vorgewärmtes Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x Medium (im Handel erhältlich und in gefiltertem Volumen von 500 ml sterile Flaschen geliefert) und in einem sterilen Röhrchen. Das entfernte Medium wird später in dem Protokoll verwendet werden.
- Ergänzen die restlichen 430 ml RPMI 1640 1x mit 50 ml inaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5ml HEPES, 5 ml nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml Natriumpyruvat und 0,05 mL filtriert (1M) 2-Mercaptoethanol.
HINWEIS: vorwärmen Splenozyten- Medium ein Wasserbad gesetzt bei 37 ° C unter Verwendung von Hitze schockierend Zellen zu vermeiden. Dies ist wichtig, die Induktion von zellulärer Apoptose zu vermeiden. - Um die Durchflusszytometrie-Puffer vorzubereiten, fügen Sie 2 ml FBS bis 98 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und im Kühlschrank aufbewahren bis zur Verwendung (vorzugsweise innerhalb von drei Tagen).
2. Erzeugung von Splenozyten- Zellsuspension von Nur77 GFP - Maus Milzen
- Ein isolieren septisch die Milz einer 6-8 Wochen alten weiblichen Nur77 GFP - Maus.
- Um dies zu erreichen, arbeiten unter sterilen Haube. Weichen Sie die Maus geopfert Fell, Schere und Pinzette in 70% Ethanol.
- Legen Sie die Maus auf der rechten Seite, schneiden Sie die Haut und Muskeln im oberen linken Bauch. Untersuchen Sie den Schnittbereich zu sichtbar die Milz suchen Sie dann schneiden Sie es aus. Halten Sie die Milzin Splenozyten- Medium auf Eis, bis sie bereit, den nächsten Schritt auszuführen.
- Legen Sie die Milz (n) in einem 10 cm 2 Zellkulturpetrischale mit 5 ml vorgewärmten Splenozyten- Medium.
- Mash die Milz eine sterile Spritzenkolben mit, bis die Lösung trüb ist. Eine Milz Kollagenmatrix sollte Ende des Verfahrens verbleiben.
- Nach umfangreichen Maischen in Splenozyten- Medium, sammeln Sie die Zellsuspension und führt es durch eine 70 um Zelle Sieb auf einem Rohr 50 ml platziert filter aus jeglichen Schmutz oder Klumpen.
- Zentrifuge bei 500 × g für 5 min. das Zellpellet in 2-3 ml in-house produziert oder kommerziellen roten Blutkörperchen Lysepuffer Nach Verwerfen des Überstandes, wieder aussetzen. Nach Pipettieren (2-3 mal) die Aussetzung Rest für 20-30 s lassen.
- 5 ml PBS oder einem geeigneten Puffer der Wahl dann die Zellsuspension bei 500 für 5 min zentrifugieren x g.
- Entfernen Sie den Überstand (sollte in der Farbe rot sein, wie es rot b lysiert enthältlood Zellen) und resuspendieren das Zellpellet in 2 ml Splenozyten-Medium.
- Mit Hilfe einer Zählkammer, zählen die Anzahl der mit Trypanblau gefärbten Zellen zwischen lebenden und toten (nekrotischen) Zellen zu unterscheiden.
3. T-Zell-Isolation von der Splenozyten- Zellsuspension
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 500 x g. Resuspendieren der Zellen in serumfreiem RPMI - Medium (50 ml aus Schritt 1.3) eine zelluläre Konzentration von 10 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten.
- Übertragen Sie die Zellen in ein 5 ml Polystyrolröhrchen und beiseite stellen eine 100-ul-Aliquot von Splenozyten für Reinheit Beurteilung / Vergleich am Ende des Reinigungsschrittes.
- Hinzufügen normale Rattenserum zu der Zellsuspension bei 50 & mgr; l / ml, gefolgt von T-Zell-Isolierung Antikörper-Cocktail (50 ul / ml).
- Mischen Sie die Zellsuspension und lassen Sie es für 10 Minuten ruhen. Dieser Schritt erlaubt es dem Antikörper-Cocktail alle unerwünschten Zellen zu binden.
- Fügen Sie die Streptavidin schnelle Kugeln (Magnetic Perlen) für 2,5 min, bringen dann das Volumen auf 2,5 ml Serum-freien Medium.
- Das Röhrchen wird in einer Zellisolierung Magnet für 3 min.
- Übertragen Sie die T-Zellsuspension in ein neues Polystyrolröhrchen durch den Magneten halten und die Lösung in einem Zug Ausgießen.
HINWEIS: Die isolierte Suspension enthält die gereinigten T-Zellen. Alle unerwünschten Zellen werden auf der Seite des an die magnetischen Streptavidin-Kügelchen gebunden Rohr gehalten. - Zählen Sie die isolierten T - Zellen unter Verwendung von Trypanblau und einer Zählkammer.
HINWEIS: Bei diesem Schritt kann die Reinheit der isolierten T - Zellen überprüft (optional) werden , indem der Prozentsatz von CD3 + Ereignisse Analyse vor und nach der T - Zell - Isolierung durch Durchflusszytometrie. 13- Kurz gesagt, Zentrifuge 1 ml Splenozyten Zellsuspension bei 500 x g. Überstand verwerfen und die Zellen in Durchflusszytometrie - Puffer bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
- In fluoreszierend-markierte anti-mouse CD3-Antikörper in einer Konzentration von 1: 100. für 30 min bei 4 ° C inkubieren. Waschen Sie einmal, Zentrifuge und resuspendieren in Durchflusszytometrie-Puffer (400 ul) für die Analyse durch Durchflusszytometrie.
4. B-Zell-Isolation von der Splenozyten- Zellsuspension
- Folgen Sie dem gleichen Protokoll wie für T - Zellen beschrieben (Schritte 3,1-3,8) , aber eine B-Zell - Isolation - Kit. Für Reinheit Beurteilung, verwenden Sie den CD19 - Antikörper anstelle des CD3 - Antikörper. 13
- Für Reinheit Beurteilung (optional), verwenden Sie den CD19-Antikörper anstelle des CD3-Antikörper. Zentrifuge 1 ml Splenozyten-Zellsuspension bei 500 x g. Überstand verwerfen und die Zellen in Durchflusszytometrie - Puffer bei einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Hinzufügen fluoreszierend markierte anti-Maus-CD19-Antikörper in einer Konzentration von 1: 100 und Inkubieren bei 4 ° C für 30 min. Waschen Sie einmal, Zentrifuge und resuspendieren in Durchflusszytometrie-Puffer (400 ul) for Analyse durch Durchflusszytometrie.
5. T-Zell-Aktivierung und die Induktion der GFP-Expression
- Samen der T - Zellen, in Suspension, in einen Rundboden 96-Well - Platte in einer Konzentration von 2,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung.
- Hinzufügen rekombinantem Interleukin (IL) -7 bei 2 ng / mL und CD3 / CD28 Magnetkügelchen (25 & mgr; l / 10 6 Zellen). Halten eines Teils der T-Zellen unbehandelt mit Kügelchen als negative Kontrolle für die spätere Messungen zu dienen, die nicht-aktivierte T-Zellen darstellt.
- Zwölf Stunden später ernten die T-Zellen aus der 96-Well-Platte durch vorsichtiges Pipettieren der Zellsuspension in jede Vertiefung nach oben und unten keine Wulst-Zell-Komplex / Aggregate zu brechen. Sammeln Sie die Suspension aus allen Vertiefungen in eine 5 ml Polystyrolröhrchen.
- Das Röhrchen wird die Suspension innerhalb der gleichen Zellisolierung Magnet enthält, die zuvor für die Reinigung von T- oder B-Zellen verwendet, und lassen Sie es für 5 Minuten ruhen.
- Übertragen Sie die T-Zell-Suspension intoa neuen Polystyrolröhrchen durch den Magneten halten und die Lösung in einem Zug Ausgießen.
- Zentrifugieren der Zellen bei 500 xg für 5 min. Wieder die Zellen in frischem Splenozyten- Medium mit einer Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten.
- Beurteilen Sie die GFP-Expression Intensität durch Durchflusszytometrie (optional für die Qualitätskontrolle) bei 12 bis 24 h nach der Stimulation im Vergleich zu nicht-aktivierten T-Zellen. 12
HINWEIS: Die GFP - Fluoreszenz auf die Nur77 GFP - T - Zellen zu eigen ist und wird bei erfolgreicher Aktivierung des TCR manifestiert. 12 - Für die Beurteilung der Lebensfähigkeit und Aktivierung (optional) durch Mikroskopie, färben die aktivierten Zellen mit 30 Hoechst min vor der Analyse bei einer Konzentration von 0,2 ug / ml. In adäquates Volumen der Zellsuspension auf eine Abdeckschlitten oder zu einer Vertiefung einer mit flachem Boden schwarz seitige 384-Well-Platte und untersuchen unter dem Fluoreszenzmikroskop lebenden Zellen zu beurteilen. Tote Zellen werden nicht behalten KernFärbung. 14
6. B-Zell-Aktivierung und die Induktion der GFP-Expression
- Mit einem T-25 Kulturflasche, erneut zu suspendieren die isolierten B - Zellen bei 1 × 10 6 Zellen / ml.
- Hinzufügen anti-Maus-IgG / IgM (H + L) bei 10 & mgr; l / ml und rekombinante CD40L bei einer Konzentration von 200 ng / mL. Halten eines Teils der B-Zellen unbehandelt als Negativkontrolle zu dienen für die spätere Messungen (die nicht-aktivierte B-Zellen).
- Beurteilen GFP-Expressionsintensität durch Durchflusszytometrie bei 12 oder 24 h nach der Stimulation im Vergleich zu nicht-aktivierten B-Zellen.
HINWEIS: Die GFP - Fluoreszenz ist untrennbar mit dem Nur77 GFP B - Zellen und wird nach erfolgreicher Aktivierung des BCR manifestiert. 12 - Für die Beurteilung der Lebensfähigkeit und Aktivierung (optional) durch Mikroskopie, färben die aktivierten Zellen mit 30 Hoechst min vor der Analyse bei einer Konzentration von 0,2 & mgr; g / mL. Hinzufügen ausreichenden Volumen der Zellsuspensionein Deckglas oder eine Vertiefung einer flachen Boden schwarz seitige 384-Well-Platte und untersuchen unter einem Fluoreszenzmikroskop lebenden Zellen zu beurteilen. Tote Zellen werden nicht Kernfärbung behalten. 14
7. High Throughput Screening kleiner Moleküle
- Vorbereitung einer Zellsuspension mit 2 x 10 6 Zellen / ml der aktivierten T oder B - Zellen (Magnetkügelchen oder Antikörper / CD40L) oder nicht-aktivierten Gruppen.
- Platte 75.000 Zellen / Vertiefung in einer 384-Well-Platte (Volumen von 40 & mgr; l). Verwenden Sie einen flachen Boden schwarz seitige 384-Well-Platte oder ein Mikroskop Abdeckschlitten für die Lebensfähigkeit und die Aktivierung Beurteilung durch Fluoreszenzmikroskopie (optional Schritt der Qualitätskontrolle vor der HTS) unter Verwendung von Hoechst-Färbung (siehe Schritte 5.8 und 6.4 für Details). 14
- Manuell oder ein automatisiertes System verwenden, fügen Sie die Medikamente der Wahl (in 0,5% DMSO gelöst) in jede Vertiefung.
- Fügen Sie das Fahrzeug (DMSO) zu positiv (aktiviert) und negativen (nicht aktiviert) Kontrollvertiefungen. Einstellen DMSO-Konzentration bis zu einem Maximum von 0,5%.
- Inkubieren der Platten für 24 h (oder Inkubationszeit von choice) bei 37 ºC und 5% CO 2.
- Am Tag des Screenings, verdünnen die Hoechst 33342 Färbelösung (1:. 3333; für zB 10 & mgr; l - Platten zu den Zellen in den 384-Well -Unternehmen ein Gesamtvolumen von 50 & mgr; l zu erzeugen). Fleck 30 min vor der Analyse durch Zugabe von GFP Hoechst-Lösung mit einer Konzentration von 0,2 ug / ml zu erreichen.
- Pipette die Zellen vorsichtig nach oben und unten eine homogene Verteilung in jeder Vertiefung zu erhalten.
HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig im Falle der Medikamente Abgabe (Schritt 7.3), ein automatisiertes System verwendet, wenn die Zellen an einer Seite des Schachts zu akkumulieren neigen, entgegengesetzt zur Richtung der Strömung. - Drehen die Platten bei 45 × g für 3 min bei Raumtemperatur.
- Lassen Sie die Platten ruhen für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
- Führen Platte (n) Auslesen, die automatisierten konfokalen hohen Gehalt scre mitkung (HCS) System. 15 Legen Sie die Platte an der Maschine. Stellen Sie das Ziel bei 40-facher oder höherer Vergrößerung. Verwenden Sie die Kamera # 4 für Hoechst (UV-Lampe) und Kamera # 1 für GFP (Laser 488). Stellen Sie das Gerät auf 6-10 Felder pro Vertiefung lesen. Stellen Sie die Maschine bei 488 nm zwei aufeinanderfolgenden Messungen pro Feld zu tun (zu lesen GFP) und UV-Licht (zu lesen Hoechst). Stellen Sie das Ziel bei 40-facher oder höherer Vergrößerung.
HINWEIS: Das System ein computerisiertes Mikroskop ist, der keine Anpassungen erfordert. Die Brennweite, die Intensität des einfallenden Lichts und die Belichtungszeit sind alle Setup automatisch von der Maschine.
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Representative Results
Entwurf des HTS-Assay
Zwei wichtige Faktoren wurden berücksichtigt, wenn die hierin Fluoreszenztest zu entwerfen. Zuerst mussten wir einen physiologischen Zustand zu replizieren , in der T- oder B - Zell - Aktivierung eine Krankheit (zB graft-versus-host disease) darstellen würde. Zweitens sollte die Beurteilung der zellulären Aktivierung durchgeführt werden, um eine empfindliche und quantitative Methode. Die Fluoreszenz ist heutzutage eine der ersten Wahl für HTS-Lese-outs, da es auf diese Bedürfnisse entspricht. 10, 16 Als robuste GFP ausgelesene Nur77 GFP erhalten werden können folgende abgeleitetes Stimulation T oder B - Zelle in vitro oder in vivo, ausgebeutet 12 unseren Assays dieser Strategie zwischen nichtaktivierten und aktivierten Zellen als ein Arbeitsmodell für die i zu differenzierendentification von immunmodulatorischen Verbindungen.
Ursprünglich wurde das Design unserer Test auf GFP Beurteilung durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von unfraktioniertem stimulierte Splenozyten basiert. In diesem Fall sind beide nicht aktivierten / aktivierte T-und B-Zellen mit anti-CD3 oder anti-CD19 bzw. vor GFP Beurteilung gefärbt. Wie in 1A, T - Zellen gezeigt (CD3 + Zellen) stellen etwa 30% einer gegebenen Mäusemilz. Im stationären Zustand wurde das GFP-Niveau im Bereich von 10% (höchstwahrscheinlich auf post-Thymus-Selektion durch den TCR während der Entwicklung oder homeostatic Stimulation in der Peripherie). Folgende TCR - Stimulation die CD3 / CD28 Perlen verwenden, einen fünf- bis sechsfache Erhöhung im Prozentsatz der GFP - Expression (57% statt 10%) wurde in CD3 + T - Zellen (- B 1A) erkannt. Ebenso B - Zellen (CD19 + Zellen) stellen 50-55% der gesamten Splenozyten und deren basale GFP expression ist vergleichbar mit nicht-aktivierten T - Zellen (zB ~ 10%, 1C). Interessanterweise jedoch ausgelöst anti-Maus - IgG / IgM und rekombinante CD40L Verwendung BCR Stimulation eine triviale Erhöhung eine GFP - Expression (33% statt 12%, 1C - D). Da die GFP-Expression für die Beurteilung der pharmakologischen Wirkung von geschirmten kleine Moleküle auf aktivierten T-oder B-Zellen ein Schlüsselelement ist, ist von zentraler Bedeutung seine Intensität Optimierung für die Empfindlichkeit und den Erfolg des Screenings.
Beurteilung der GFP-Expression gereinigten T oder B-Zellen unter Verwendung von
Obwohl T und B-Zell-Stimulation direkt über unfraktioniertem Splenozyten erreicht werden, war die GFP-Expression Intensität nicht empfindlich genug für das Screening besonders wenn Auslesungen sind durch Mikroskopie durchgeführt werden. Um wurden die zelluläre Antwort, T-Zellen zuerst durch magnetische gereinigt zu verbessernKügelchen eines kommerziell erhältlichen Kits (2A) verwendet wird . Wie bereits unfraktioniertem Splenozyten gezeigt unter Verwendung von 10% der isolierten CD3 + T - Zellen wurden GFP positiv (basale Expression). In diesem Zusammenhang verbessert die CD3 / CD28 - Perlen unter Verwendung von T - Zell - Stimulierung signifikant ihre GFP Reaktion (2A - 2B, 86% zu 57% gegenüber, wenn unfraktioniertem Splenozyten verwendet wurden). Ähnliche Verbesserungen wurden mit B - Zellen (- 2D, 80% anstelle von 33% 2C) erhalten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Verwendung von gereinigten T-Zellen und B maximiert GFP-Expression, die für die vorgeschlagene phänotypischen Screening geeignet ist.
Schematische Darstellung des entworfenen HTS-Assay
Insgesamt kann der Assay unterteilt werden in vier Hauptabschnitten (Abbildung 3). Im Falle von T-Zellen, beispielsweise ein SplenozytenZellsuspension wird hergestellt , um T - Zellen zu reinigen (Schritte 1-3) durch einen Schritt 12 h - Stimulation in vitro unter Verwendung von CD3 / CD28 - Kügelchen (Schritte 4-5). Aktivierte T-Zellen werden dann plattiert und für 24 h mit den kleinen Moleküle der Wahl in 384-Well-Platten (Schritte 6-7) vor der Bewertung der GFP und Hoechst Intensitäten des automatisierten HCS-Systems. Der gleiche Assay kann für B-Zellen mit Modifikationen in den Schritten 4-5 durchgeführt werden. Kurz gesagt, können B-Zellen mit anti-Maus-IgG / IgM und rekombinante CD40L statt Kügelchen stimuliert werden. Da diese Komponenten in ihrer löslichen Form verwendet werden (beispielsweise nicht an Kügelchen verbunden sind ), können B - Zellen für 12 h dann einfach vor gewaschen inkubiert werden , in 384-Well - Platten für das Screening - Verfahren zum Plattieren.
Effiziente T-Zell-Überleben ist für den Erfolg des HTS Studie primordialen. Dementsprechend können zwei limitierenden Faktoren die Qualität des Assays beeinträchtigen und sollten berücksichtigt werden. ZuerstSind murine T - Zellen Apoptose nach in vitro Stimulation sehr anfällig. 17 Zweitens alle getesteten Verbindungen werden in einer DMSO - Lösung verdünnt, die eine zweite Stressfaktor hinzufügen könnte. In den Zellverlust, rekombinantes IL-7 (2 ng / ml) wurde 4-5 bei den Schritten zu T-Zellen nach Stimulation TCR ergänzt minimieren. Dieses Zytokin homöostatischen unterstützt die Proliferation und verbessert T-Zell-Überleben durch die Expression von anti-apoptotischen Molekülen wie Bcl-2, Bcl-xL sowie Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22
Primary Screening mit hohem Durchsatz von 4.398 Verbindungen offenbart mehrere Aktivatoren und Inhibitoren der T-Zell-Aktivierung
Ein Hochdurchsatz-Screening wurde durch Ausplattieren von 75.000 nicht-aktivierten (negative co durchgeführtntrol) oder aktivierte T - Zellen (positive Kontrolle) , wie in Figur 4 dargestellt. Um eine hohe Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, wurde der Test mehrmals mit einem erhaltenen Z - Faktor von 0,87 (5A) durchgeführt. Verwendung des HCS - System, das beobachtete GFP Expression von stimulierten T - Zellen war 20 - mal höher als unstimulierten T - Zellen , so dass die Erzeugung eines '' Fenster Wirkungs '' Zone , wo GFP inhibitorischen Verbindungen leicht nachgewiesen werden (5A). Dies ist in der Abbildung in Bezug auf die Anzahl von fluoreszierenden Zellen durch die Gesamtzahl der Zellen in den abgetasteten Feldern unterteilt gezeigt. In dem Beispiel in 5A gezeigt, stellte das Screening von 320 Verbindungen mit drei Verbindungen (spitz-out durch rote Pfeile) in der Lage GFP - Expression von 1,5-2,5 Falten zu hemmen. In diesem Beispiel war die positive Kontrollwert 0,44 ± 0,02 und die negative Kontrolle war 0,02 ± 0,00.
the Screening von insgesamt 4398 Verbindungen (Z-Faktor von 0,85) wurde dann durchgeführt. Die Verbindungen wurden durch medizinischen Chemikern als Saatgut / Vertreter Verbindungen , die eine gesamte chemische Bibliothek mit 136.000 Einheiten (5B) , die aufgrund ihrer chemischen Struktur ausgewählt. Am Ende des Tests, die Analyse der GFP Hemmung Verbindungen identifiziert der Lage, entweder die Hemmung (positive deviators) oder Verstärkung GFP-Expression (negative deviators).
Abbildung 1: Analyse von T- und B-Zell - GFP - Expression nach TCR oder BCR - Aktivierung auf unfraktioniertem Splenozyten durchgeführt. (A) Repräsentative Durchflusszytometrie Analyse von T gefärbten Zellen mit einem anti-CD3 - Antikörper Splenozyten in Abwesenheit (oben links) oder in Gegenwart von CD3 / CD28 - Perlen (oben rechts) verwenden. GFP-Expression für beide T-Zell-Gruppen werden angezeigtganz unten. (B) Prozentsatz der GFP - Expression durch Durchflusszytometrie - Analyse von T - Zellen erhalten. Die Fehlerbalken stellt Mittelwert ± SD. (C) Wie (A) mit der Ausnahme , daß Splenozyten aktiviert wurden unter Verwendung von anti-Maus - IgG / IgM und rekombinante CD40L für CD19 dann gefärbt. (D) Anteil der GFP - Expression durch Durchflusszytometrie - Analyse von B - Zellen erhalten. Die Fehlerbalken stellt Mittelwert ± SD. Alle gezeigten Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt (n = 5 / Gruppe; * p <0,05 und *** P <0,001). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Analyse der GFP - Expression gereinigten T- oder B - Zellen nach der TCR oder BCR Aktivierung mit jeweils. (A) Representative Durchflusszytometrie-Analyse von gereinigten T-Zellen, gefärbt mit einem anti-CD3-Antikörper ist. Für GFP Induktion wurden gereinigte T-Zellen unter Verwendung von CD3 / CD28-Perlen (oben rechts) stimuliert. Nicht aktivierte Steuer T-Zellen werden in der oberen linken Bereich angezeigt. GFP Expression beider nichtaktivierten und aktivierten T-Zellen wird unten angezeigt. (B) Prozentsatz der GFP - Expression durch Durchflusszytometrie - Analyse von T - Zellen erhalten. Die Fehlerbalken stellt Mittelwert ± SD. (C) Wie (A) mit der Ausnahme , dass die Reinheit der B - Zellen durch CD19 - Färbung beurteilt wurde und aktiviert mit Anti-Maus - IgG / IgM und rekombinante CD40L. (D) Anteil der GFP - Expression durch Durchflusszytometrie - Analyse von B - Zellen erhalten. Die Fehlerbalken stellt Mittelwert ± SD. Alle gezeigten Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt (n = 5 / Gruppe und *** P <0,001). Bitte klicken Sie hier ein , um zu vergrößernVersion dieser Figur.
Figur 3: schematische Gesamtdiagramm , das die Schritte des phänotypischen Screening darstellt. Es gibt 7 wichtige Schritte erforderlich, um die HTS-Test vorzubereiten. Eine weibliche Nur77 GFP - Maus geopfert ihre Milz (Schritt 1) zu isolieren. Nach der Erzeugung eines Splenozyten Zellsuspension (Schritt 2), sind T-Zellen negativ isoliert (durch Abreicherung von unerwünschten Zellen) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Schritt 3). Isolierte T-Zellen werden dann mit rekombinantem IL-7 in Abwesenheit oder Gegenwart von CD3 / CD28-Perlen in Rundboden-96-Well-Platte bei 37 ºC (Schritt 4) inkubiert. Zwölf Stunden später (Schritt 5) werden T-Zellen mehrmals pipettiert alle Aggregate zu entfernen, bevor Perlen Entfernung die gleiche Zellisolierung Magneten verwendet, um die ursprünglich für T-Zell-Reinigung. Isolierte T-Zellen werden dann in 384-Well-Platten (75 000 cells / gut, Schritt 6) mit den Verbindungen für weitere 24 h (Schritt 7). Am folgenden Tag werden die Zellen mit Hoechst inkubiert 30 min vor der Analyse durch die HCS-System (Schritt 8) gefärbt. Der gleiche Aufbau könnte gefolgt-up für die Herstellung eines B-Zell-basierten Assay sein, außer dass Schritt 4 und 5 sind durch einen einfachen Wasch ersetzt werden, da die Stimulatoren in lösliche Formen hinzugefügt werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Layout für die Beschichtung von T - Zellen in einer 384-Well - Platten. Jede Platte in dem Assay verwendet wurden, enthielten drei Gruppen. (; Vertiefungen A1-P1 und A24-P24 negative Kontrolle für die GFP auf jeder Seite der Platte), während die zweite Gruppe ohne T-Zellen aktiviert dru Enthalten in der ersten Gruppe wurden die Vertiefungen mit nicht-aktivierten T-Zellen geladengs (positive Kontrolle für die GFP; Brunnen A2-P2 und A23-P23). Alle verbleibenden Vertiefungen, die T-Zellen mit den chemischen Einheiten, die in dem Screening ergänzt aktiviert. Alle Vertiefungen enthielten 0,5% DMSO. Beispiele für die GFP und Hoechst-Signale werden für nicht-aktivierten und aktivierten T-Zellen dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Primäre phänotypischen Screening. (A) Ein repräsentatives Beispiel eines primären Screening auf 320 Verbindungen durchgeführt. Nicht-aktivierte T-Zellen sind fast GFP null im Gegensatz zu TCR-stimulierten T-Zellen, die Anzeige höher GFP-Expression 20-fach. (B) Kumulative Daten aller Verbindungen gescreent , um die Assay. Die GFP-Expression zeigt Verbindungen diSpreizen hemmende Wirkung, während andere Verbindungen, die als T-Zell-Stimulatoren verhielten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Mehrere Ausleseverfahren wurden für die Entwicklung von empfindlichen und zuverlässigen HTS-Assays genutzt werden. Dazu gehören kolorimetrischen, lumineszente oder Fluoreszenzmethoden. Obwohl farbmetrischen Methoden einfach einzurichten sind, benötigen sie mehrere Zugaben von Chemikalien, die getestet stören oder unterbrechen können wobei die Zellen. 23 Darüber hinaus sind sie erlauben keine dynamische Bewertung einer biologischen Reaktion , wie die pharmakologische Wirkung zu einem bestimmten Endpunkt bewertet. Darüber hinaus kann dieses Verfahren teuer Roboterarme erfordern, wenn automatisierte HTS verwendet wird. Diese Faktoren machen kolorimetrischen Ablesungen weniger kompatibel mit dem Ziel der HTS wegen ihrer umständlichen Bedarf und niedrige Empfindlichkeit. 23 Obwohl Lumineszenz hat als Alternative zur kolorimetrischen Assays, die Anwendung dieser lumineszente Tests in HTS ist üblicherweise begrenzt durch das Erfordernis der Zellyse vorgeschlagen. Auch wenn andere nicht-Lyse-Protokolle wurden dewickelt, die Intensität der Biolumineszenz-Signal kann durch viele Faktoren, wie beispielsweise Luciferin Absorption, die Verfügbarkeit von Cofaktoren, pH, und die Transparenz der Kulturmedien oder Puffer behindert werden, Abweichungen zwischen erfaßten Signalen und Biolumineszenz tatsächlichen Veränderungen der zellulären Aktivität führt. 24 Daher sind die meisten Assays basieren auf Fluoreszenzmethoden. Verwendung von kleinen, hoch-fluoreszierendes organischen Moleküle in der Tat wurden fluoreszenzbasierten Assays ursprünglich entwickelt Lage ist, eine Vielzahl von zellulären Prozessen auf Zellaktivierung zu überwachen. In der Summe haben Fluoreszenzassays eine höhere Empfindlichkeit und kann leicht für phänotypische Messungen während der HTS angepasst werden. 23
Das entwickelte fluoreszenzbasierte HTS-Assay hier präsentiert hat drei wesentliche Vorteile. Erstens, es ist sehr zuverlässig, reproduzierbar und wurde für das Screening von Verbindungen, die zur Modulation zwei verschiedene Primärzellen (T und B-Lymphozyten) unter Verwendung des gleichen stimula angenommention / Auslesekonzept. Zum Beispiel kann die primäre Screening von 4.398 Verbindungen, die mehr als fünf verschiedenen Durchläufen abgeschlossen wurde zeigte eine konsistente aktivierungsinduzierten GFP-Signal mit minimaler intra und inter-assay Variabilitäten (<5% und <15%, bzw. für T-Zell-Assay). Zweitens verwendet der Test einen im Handel erhältlichen transgenen Mausmodell. Üblicherweise wird die Konstruktion eines auf Fluoreszenz basierenden Assay erfordert die gentechnische Veränderung von primären Zellen oder einer Zelllinie von Interesse, um ein Fluoreszenzsignal bei Anregung anzuzeigen. Obwohl dieser Ansatz ein kostbares Labor-Tool generiert, ist es in der Regel nicht ohne weiteres auf der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung. Um diese Einschränkung zu umgehen, T- und B - Zellen wurden aus den Nur77 GFP - transgenen Mäusen isoliert. Der Vorteil dieser Lymphozyten ist ihre Fähigkeit GFP innerhalb von 24 h auf TCR oder BCR-Stimulation zu exprimieren. Daher Screening Drogen in der Lage, die Transkriptionsmaschinerie treibende GFP-Expression zu modulieren oder die GesamtzellAntwort repräsentiert ein ansprechendes Konzept. Drittens erfordert die Entfernung dieser Perlen Beurteilung vor GFP in ihrer anfänglichen Aktivierungsphase Zellen mit CD3 / CD28 Perlen T Ergänzung. Dies ist wichtig, wenn die Mikroskopie für die Analyse von T-Zell-Aktivierung / Hemmung als Verlassen der Kügelchen verwendet wird, da sonst die GFP-Signal maskieren. Wenn Durchflusszytometrie stattdessen für die Analyse verwendet wird, könnte Perlen in den Vertiefungen gelassen werden (es sei denn, es speziell zusätzliche verwirrende Begrenzung schafft (n) dem Test) als die spezifische Population von Interesse gated sowohl vorwärts als auch Seite streut mit werden kann.
Das ursprüngliche Ziel war es, ein Screening-Test mit minimalen zellulären Handhabung zu entwerfen. Unter diesem Zusammenhang stimuliert die Aktivierung von T- oder B - Zellen unter Verwendung von unfraktioniertem Splenozyten mit Perlen oder lösliche Antikörper / bzw. rekombinanten CD40L als ein großer Anteil von Lymphozyten GFP negativ blieb (Abbildung 1) beschränkt war. Da dieser Schritt ist entscheidend für den Erfolgdes Assays wurde das Protokoll modifiziert kommerziell erhältlichen Kits T oder B-Zellen zu reinigen, die prozentualen GFP-exprimierenden Zellen zu erhöhen. Dieser Ansatz verbessert signifikant die Aktivierung Ergebnisse der beiden Zellpopulationen. Obwohl eine andere Methode der Wahl für T- und B-Zell-Isolierung verwendet werden, wenn dies notwendig erscheint, mit dem vorgeschlagenen Konzept: i) in hohem Maße reproduzierbar, ii) leicht die Reinheit der isolierten Population von Durchflusszytometrie vor HTS zu bewerten angepasst, iii) und Zeit effizient wie der Reinigungsstufe ist relativ kurz (~ 30 min) und kann mit minimaler Vorbereitung durchgeführt werden. Es muss jedoch angemerkt werden, dass der Test in dieser Studie präsentierten auf der Verwendung von Maus-Primärzellen basiert. Sekundär (zur Bestätigung) und tertiäre (endgültige Validierung auf dem Ziel von Interesse) Assays sollten nach dem primären Bildschirm durchgeführt werden, um die identifizierten Hits zu validieren. Obwohl es leicht zu einer Vielzahl von verschiedenen Zelllinien, die pharmakologische Wirkung von i angepasst werden könntendentified Treffer muss eine weitere Validierung auf andere Arten (zB menschliche Zellen - Beispiel für tertiäre Assay) , da es keine Möglichkeiten gibt nachhaltige Wirkung zwischen den Arten vorherzusagen. Insgesamt ist dieser Assay wertvoll für die Identifizierung von neuen potentiellen Treffer und / oder molekularen Targets mit möglichen Extrapolation der Ergebnisse aus in vitro / Tierversuche für den Menschen.
Obwohl die entworfene Assay kann für beide T und B-Zellen ausgenutzt werden, ein Vorteil ist auf die spezifische Verwendung von T-Zellen in diesem Fall übertragen. TCR - Aktivierung erfordert in der Regel dual durch eine Primärtragenen Stimulation (zB anti-CD3 oder anti-TCR) und ein sekundäres co-aktivierende (zB anti-CD28) -Signals. 25, 26 Interessanterweise sowohl anti-CD3 und anti-CD28 - Antikörper können direkt auf die Oberfläche von magnetischen Perlen gebunden gekauft werden, und kann vor der Zugabe von t aus der Zellsuspension unter Verwendung eines Standard Magneten entfernt werdener chemische Verbindungen im Screening getestet werden. Als eine Bibliothek mit unbekannten chemischen Einheiten verwendet wird, Bindung T-Zellen an ihre TCR-Komplex gebunden frei von Molekülen aktiviert werden, um mögliche Interferenzen zwischen den getesteten Verbindungen und diejenigen, auf die TCR-Bindungs Rillen gebunden zu minimieren. 27 Darüber hinaus Entfernen der stimulierende Mittel folgende T - Zell - Aktivierung ahmt physiologischen Situationen im Gegensatz zu der Arbeit mit T zu einer nachhaltigen supraphysiologischen TCR - Aktivierung unterworfen Zellen. Die letztere Situation kann problematisch sein, da es die pharmakologische Wirkung einer bestimmten Verbindung überschreiben können, besonders wenn sie in geringen Konzentrationen in dem Screening verwendet wurde. Da es keine im Handel erhältlichen Perlen die gleiche Wirkung auf B-Zellen ausüben, wäre es interessant sein, eine HTS in Zukunft Tests durchzuführen, ob die kontinuierliche Anwesenheit des Reizes auf B-Zellen, die Leistung des Assays begrenzt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Merck Frosst Startkapital zur Verfügung gestellt von der Université de Montréal unterstützt. Wir möchten Drs Jean Duchaine und Dominic Salois aus der Hochdurchsatzplattform am Institut für Forschung in der Immunologie und Krebs für ihre Diskussion, Kommentare und Feedbacks zu danken. Moutih Rafei hält einen Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Auszeichnung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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