Summary
Vi præsenterer i den aktuelle undersøgelse en hidtil ukendt fluorescens-baseret assay under anvendelse af lymfocytter afledt fra en transgen mus. Dette assay er egnet til high-throughput screening (HTS) af små molekyler forsynet med kapacitet på enten inhibere eller fremme lymfocytaktivering.
Abstract
High-throughput screening (HTS) er for tiden grundpillen for identifikation af kemiske enheder stand til at modulere biokemiske reaktioner eller cellulære processer. Med fremme af bioteknologi og den høje translationelle potentiale af små molekyler, har en række innovative tilgange i lægemiddelforskning udviklet sig, hvilket forklarer den genopståede interesse i brugen af HTS. Den onkologi felt er i øjeblikket den mest aktive forskningsområde til screening af narkotika, uden større gennembrud for identificering af nye immunmodulerende forbindelser målrettet mod transplantation-relaterede komplikationer eller autoimmune lidelser. Her præsenteres en roman in vitro murine fluorescerende-baserede lymfocyt assay let tilpasses til identifikation af nye immunmodulerende forbindelser. Dette assay anvender T eller B-celler afledt fra en transgen mus, hvori Nur77 promotoren driver GFP-ekspression ved T- eller B-celle-receptor-stimulering. Som GFP intensitet afspejleraktivering / transkriptionsaktivitet af målcellen, vores assay definerer et hidtil ukendt redskab til at studere virkningen af given forbindelse (r) på cellulære / biologiske reaktioner. For eksempel blev en primær screening udføres ved hjælp 4,398 forbindelser i mangel af en "target hypotese", som førte til identifikationen af 160 potentielle hits viser immunmodulerende aktiviteter. Anvendelsen af dette assay er egnet til forskningsprogrammer udforske store kemiske biblioteker inden yderligere in vitro / in vivo valideringsundersøgelser.
Introduction
Høj throughput screening (HTS) er en bevist strategi udbredt til identifikation af nye terapeutiske molekyler eller til repositionering af FDA-godkendte lægemidler i nye medicinske indikationer. 1 Indtil videre kan det opnås HTS succes måles ved overfloden af tidligere opdagede lægemidler. For eksempel tyrosinkinaseinhibitoren lapatinib anvendes til behandling af brystkræft, sitagliptin; en dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) -hæmmer anvendes som et anti-hyperglykæmiske lægemiddel og den orale Bcr-Abl tyrosinkinaseinhibitoren dasatinib anvendes til behandling af kronisk myeloid leukæmi repræsenterer få eksempler på en lang liste over godkendte lægemidler oprindeligt opdaget af HTS. 2 Selv om produktiviteten af medicinalindustrien sidst har lidt under manglende i opdagelsen af nye kemiske enheder, kan sandsynligheden for en vellykket lægemiddelforskning forbedres gennem en stigning i antallet af prækliniske candidaTES viser modulerende biologiske / biokemiske egenskaber. Følgelig kunne udviklingen af nye HTS analyser tilpasset til fænotypisk screening giver mulighed for at give vigtige farmakologiske værktøjer til opdagelsen af nye lægemiddelkandidater hits. 3, 4, 5, 6 Endvidere kan HTS nu udføres i et hurtigere tempo på grund af betydelige teknologiske forandringer i de senere år, herunder specialdesignede fleksible robot installationer, nye read-out teknologier og omfattende miniaturisering. 2, 7 Blandt de faktorer, der bidrager til den stigende interesse for brugen af fænotypisk screening (aka fremad farmakologi) er opfattelsen, at fokusere på funktionelle virkninger snarere end forsimplede reduktionistiske antagelser om molekylære mål (mål-baserede screening / biokemiske reaktioner) er mere sandsynligt at sho w klinisk effektivitet. Således fænotypisk screening giver løfte at afdække nye potentielle terapeutiske forbindelser og molekylære veje for øjeblikket uhelbredelige sygdomme. 2
For at kunne identificere inhibitorer eller aktivatorer for en given molekylær mål eller cellulære funktion, er en meget følsom og pålidelig analyse nødvendig for at skelne mellem bona fide hits og falske positiver. Så hvad gør en god analyse? Kvaliteten af en given assay skal først bedømt af signal-til-støj-forhold (reflekteret gennem en Z faktor). 8 andet bør målrettet virkning eller målet af skærmen være klart fastlagt. For eksempel kan funktionelle cellebaserede indebære betydelige fordele for receptor screening i modsætning til et assay specifikt designet til at vurdere ligand-receptorbinding. Grunden til dette er, at sidstnævnte tilgang ikke kan skelne mellem agonist- og antagonist-ligander.ss = "xref"> 9 I modsætning hertil en celle tilgang vil sandsynligvis være mere effektive som receptor funktion kan direkte vurderes i et biologisk fænotype (proliferation, cellecyklusstop, apoptose, og / eller differentiering). Dog skal det bemærkes, at biokemiske analyser kan give betydelige fordele i forhold fænotypiske analyser, som de krænke en bestemt intracellulær mål. Et godt optimeret biokemisk assay vil generelt have mindre data scatter end et fænotypisk screening mens bagefter forenkle opklaring af den molekylære mekanisme lægemiddel virkningsmekanisme. Men den største ulempe ved målrettede eller biokemiske assays er chancen for at amplificere antallet af falske positive tilfælde, der kan påvirke ikke-specifikke mål, når det afprøves i et biologisk system (tab af specificiteten oprindelig gennemført den biokemiske assay). 10 Selv om en veletableret afskæringspunkt mellem negative og positive hits kan minimere antallet af falske positive in den primære screening, anvendelsen af et fysiologisk relevant system, efterligne den native cellulære miljø såsom intakte celler, hele væv eller hele dyret fortsat kernen i assaydesignet pendul. Derfor fænotypisk screening giver bly opdagelse med ønskelige biologiske / fænotypiske virkninger for sygdomme uden identificerede lægemiddelkandidater uden at have forudgående kendskab til forbindelsens aktivitet eller virkemåde. 11
Den heri Undersøgelsen vedrører udvikling og afprøvning af en optimeret og reproducerbar fænotypisk screening baseret på to vigtige komponenter: en kommercielt tilgængelig musemodel og et grupperet sub-familie af kemiske forbindelser. Med hensyn til dyremodel, assayet bygger på anvendelsen af lymfocytter afledt fra en musestamme (Nur77 GFP) huser et bakterielt kunstigt kromosom, som indeholder en kassette, i hvilken ekspression af det grønt fluorescerende protein (GFP) drives af the Nur77 promotoren. 12 Kendetegnet for denne stimulering er baseret på det faktum, at Nur77 er et umiddelbart tidligt gen opreguleres efter T-celle-receptor (TCR) eller B-celle-receptor (BCR) stimulation. 12 Med hensyn til den screeningsmetode selv, blev en fremgangsmåde, der anvendes til at bidrage til at undgå screening af trivielle analoger samtidig minimere den nødvendige tid til at vurdere et stort kemisk bibliotek (> 10 5 forbindelser). For at gøre dette, blev en database over kemiske forbindelser udvalgt af medicinske kemikere anvender virtuelle screening-værktøjer udnyttes til at identificere topologisk lignende forbindelser ved hjælp af kendte aktive frø strukturer som henvisninger. Denne fremgangsmåde tillod os at screene 4,398 forbindelser, der repræsenterer en samlet bibliotek med over 136.000 kemiske enheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller blev godkendt af Animal Care udvalg Université de Montréal. Mus blev aflivet ved gradvis inhalation af CO2, indtil der ikke vitale tegn blev observeret efterfulgt af cervikal dislokation. Proceduren blev udført af en certificeret person til at sikre, at dyrene blev aflivet på en human måde og i overensstemmelse med anbefalingerne fra det canadiske Rådet om Animal Care.
1. Udarbejdelse af splenocyt Medium og Flow-cytometri Buffer
- Udfør alle trin under en 70% ethanol-renset biologisk hætte.
- Fjern 70 ml forvarmet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium (kommercielt tilgængelige og leveres i filtreret 500 ml volumen sterile flasker) og anbringes i et sterilt rør. Den fjernede medium vil blive brugt senere i protokollen.
- Supplere resterende 430 ml RPMI 1640 1x med 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 5 ml penicillin / streptomycin, 5ml HEPES, 5 ml ikke-essentielle aminosyrer, 5 ml natriumpyruvat, og 0,05 ml filtreret (1m) 2-mercaptoethanol.
BEMÆRK: Pre-varm splenocytpopulation medium ved hjælp af et vandbad indstillet på 37 ºC for at undgå varme chokere celler. Dette er vigtigt for at undgå induktion af cellulær apoptose. - Til fremstilling af flow-cytometri-puffer, tilsættes 2 ml FBS til 98 ml phosphatbufret saltvand (PBS) og opbevares i køleskab indtil anvendelse (fortrinsvis inden for tre dage).
2. Frembringelse af splenocytpopulation cellesuspension fra Nur77 GFP musemilte
- En septically isolere milten fra en 6-8 uger gammel kvindelig Nur77 GFP mus.
- For at opnå dette, arbejde under sterile hætte. Soak de ofrede mus pels, saks og pincet i 70% ethanol.
- Læg musen på sin højre side, skære huden og musklerne i øverste venstre abdominale kvadrant. Undersøg snittet område synligt lokalisere milten derefter skære det ud. Hold milteni splenocytpopulation medium på is indtil klar til at udføre det næste skridt.
- Placer milten (r) i en 10 cm2 cellekultur petriskål indeholdende 5 ml forvarmet splenocyt medium.
- Mash milten ved hjælp af en steril sprøjte stempel indtil opløsningen er uklar. En milt collagenmatrix bør forblive i slutningen af proceduren.
- Efter omfattende mashing i splenocytpopulation medium, indsamle cellesuspensionen og ledes gennem en 70 um celle si placeret på en 50 ml rør til at filtrere ud eventuelle rester eller blodpropper.
- Centrifuger ved 500 x g i 5 min. Efter bortkastning af supernatanten, re-suspendere cellepelleten i 2-3 ml in-house produceret eller kommerciel røde blodlegemer lysisbuffer. Efter pipettering (2-3 gange) lade suspensionen hvile i 20-30 s.
- Der tilsættes 5 ml PBS eller en passende puffer af valg centrifugeres cellesuspensionen i 5 minutter ved 500 x g.
- Fjern supernatanten (skal være rød i farven, da det indeholder lyserede røde bLood celler) og re-suspendere cellepelleten i 2 ml splenocyt medium.
- Anvendelse af et hæmocytometer, tælle antallet af celler farvet med trypanblåt til at skelne mellem levende og døde (nekrotiske celler).
3. T-celle Isolation fra splenocytpopulation Cell Suspension
- Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 500 x g. Resuspender cellerne i serumfrit RPMI-medium (50 ml fra trin 1.3) til opnåelse af en cellulær koncentration på 10 x 10 6 celler / ml.
- Overfør cellerne til en 5 ml polystyrenrør og der er afsat en 100 pi portion af splenocytter renhedskrav vurdering / sammenligning ved afslutningen af oprensningstrin.
- Tilføj normal rotteserum til cellesuspensionen ved 50 uL / mL efterfulgt af T-celle-isolation antistofcocktail (50 pl / ml).
- Bland cellesuspensionen og lad den hvile i 10 min. Dette trin tillader antistoffet cocktail til at binde alle uønskede celler.
- Tilsæt streptavidin hurtige kugler (magnetic perler) i 2,5 min, derefter bringe volumenet til 2,5 ml under anvendelse af serum-frit medium.
- Glasset anbringes i en celle isolation magnet for 3 min.
- Overfør T-celle suspensionen i en ny polystyrenrør ved at holde magneten og hælde ud opløsningen i et træk.
BEMÆRK: Det isolerede suspension indeholder de oprensede T-celler. Alle uønskede celler befinder sig, på siden af røret bundet til de magnetiske streptavidinkugler. - Tæl isolerede T-celler under anvendelse af trypanblåt og et hæmocytometer.
BEMÆRK: I dette trin kan verificeres (valgfrit) renheden af de isolerede T-celler ved at analysere procentdelen af CD3 + begivenheder før og efter T-celle-isolation ved flow-cytometri. 13- Kort fortalt centrifugeres 1 ml splenocyt cellesuspension ved 500 x g. Supernatanten kasseres, og suspenderer cellerne i flow-cytometri puffer ved en koncentration på 1 x 10 6 celler / ml.
- Tilføj fluorescerende-mærket anti-muse CD3-antistof i en koncentration på 1: 100. Der inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter. Vask en gang, centrifuge og re-suspendere flow-cytometri buffer (400 uL) til analyse ved flow-cytometri.
4. B-celle Isolation fra splenocytpopulation Cell Suspension
- Følg den samme protokol som beskrevet for T-celler (trin 3,1-3,8), men under anvendelse af en B-celle isolation kit. Til vurdering renhed, bruge CD19 antistof i stedet for CD3 antistof. 13
- Til vurdering renhed (valgfrit), skal du bruge CD19 antistof i stedet for CD3 antistof. Centrifuge 1 ml splenocyt cellesuspension ved 500 x g. Supernatanten kasseres, og suspenderer cellerne i flow-cytometri puffer ved en koncentration på 1 x 10 6 celler / ml.
- Tilføj fluorescerende mærkede anti-muse CD19-antistof i en koncentration på 1: 100 og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter. Vask en gang, centrifuge og re-suspendere flow-cytometri buffer (400 uL) for analyse ved flow-cytometri.
5. T-celle aktivering og induktion af GFP Expression
- Seed T-cellerne i suspension, i en rundbundet plade med 96 brønde i en koncentration på 2,5 x 10 5 celler / brønd.
- Tilføj rekombinant interleukin (IL) -7 på 2 ng / ml og CD3 / CD28 magnetiske perler (25 pl / 10 6 celler). Hold en del af T-cellerne ubehandlede med perler for at tjene som en negativ kontrol for senere målinger, der repræsenterer ikke-aktiverede T-celler.
- Tolv timer senere, høste T-celler fra 96-brønds plade ved forsigtigt at pipettere cellesuspensionen i hver brønd op og ned for at bryde eventuelle perle-celle kompleks / aggregater. Opsaml suspensionen fra alle brønde i en 5 ml polystyrenrør.
- Anbring rør indeholdende suspensionen inden i samme celle isolation magnet tidligere anvendt til oprensning af T eller B-celler og lad det hvile i 5 min.
- Overfør T-celle suspensionen intoa ny polystyrenrør ved at holde magneten og hælde ud løsningen i et træk.
- Centrifugeres cellerne ved 500 x g i 5 min. Re-suspendere cellerne i frisk splenocytpopulation medium til at få en koncentration på 2 x 10 6 celler / ml.
- Vurdere GFP udtryk intensitet ved flow-cytometri (ekstraudstyr til kvalitetskontrol) ved 12 til 24 timer efter stimulering i sammenligning med ikke-aktiverede T-celler. 12
BEMÆRK: GFP-fluorescens er uløseligt forbundet med de Nur77 GFP T-celler og manifesterer sig efter en vellykket aktivering af TCR. 12 - Til vurdering af levedygtighed og aktivering (valgfrit) ved mikroskopi, plette de aktiverede celler med Hoechst 30 min inden analyse ved en koncentration på 0,2 ug / ml. Tilføj passende volumen af cellesuspensionen til en dækglas eller til en brønd i en fladbundet sort-sidet 384-brønds plade og undersøges i fluorescensmikroskop at vurdere levende celler. Døde celler vil ikke beholde den nuklearefarvning. 14
6. B-celle aktivering og induktion af GFP Expression
- Ved hjælp af en T-25 dyrkningskolbe, genopslæmmes de isolerede B-celler ved 1 x 10 6 celler / ml.
- Tilføj anti-muse-IgG / IgM (H + L) ved 10 pl / ml og rekombinant CD40L ved en koncentration på 200 ng / mL. Hold en del af B-cellerne ubehandlede for at tjene som en negativ kontrol for senere målinger (som repræsenterer ikke-aktiverede B-celler).
- Vurdere GFP-ekspression intensitet ved flow-cytometri ved 12 eller 24 timer efter stimulering i sammenligning med ikke-aktiverede B-celler.
BEMÆRK: GFP-fluorescens er uløseligt forbundet med de Nur77 GFP B-celler og manifesterer sig efter en vellykket aktivering af BCR. 12 - Til vurdering af levedygtighed og aktivering (valgfrit) ved mikroskopi, plette de aktiverede celler med Hoechst 30 min inden analyse ved en koncentration på 0,2 ug / mL. Tilføj passende volumen af cellesuspensionen tilet dækglas eller til en brønd i en fladbundet sort-sidet 384-brønds plade og undersøges i et fluorescensmikroskop for at vurdere levende celler. Døde celler bevarer ikke kernefarvning. 14
7. high throughput screening af små molekyler
- Der fremstilles en cellesuspension på 2 x 10 6 celler / ml af de aktiverede T eller B-celler (magnetiske perler eller antistoffer / CD40L) eller ikke-aktiverede grupper.
- Plate 75.000 celler / brønd i en plade med 384 brønde (volumen på 40 pi). Brug en fladbundet 384 brønde sort-sidet eller et mikroskop dække slide for levedygtighed og aktivering vurdering fra fluorescerende mikroskopi (valgfrit kvalitetskontrol skridt forud for HTS) ved hjælp af Hoechst farvning (se trin 5.8 og 6.4 for detaljer). 14
- Manuelt eller ved hjælp af et automatiseret system, tilsæt narkotika valg (opløst i 0,5% DMSO) til hver brønd.
- Tilsæt vehikel (DMSO) til positiv (aktiveret) og negative (ikke-Activeret) kontrol brønde. Juster DMSO-koncentration på højst 0,5%.
- Pladerne inkuberes i 24 timer (eller inkubationstid på valg) ved 37 * C og 5% CO2.
- På dagen for screeningen, fortyndes Hoechst 33342 farveopløsning (1:. 3.333, for eksempel tilsættes 10 pi til cellerne i de 384 brønde for at generere en samlet volumen på 50 pi). Farv 30 min før GFP analyse ved tilsætning Hoechst løsning til at opnå en koncentration på 0,2 ug / mL.
- Pipettér forsigtigt cellerne op og ned for at opnå en homogen fordeling i hver brønd.
BEMÆRK: Dette trin er vigtigt i tilfælde af afgivelse af lægemidler (trin 7.3) ved anvendelse af et automatiseret system som cellerne har tendens til at akkumulere i den ene side af brønden, modsat retningen af strømningen. - Spin pladerne ved 45 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
- Efterlad pladerne til hvile i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Udfør skilt (e) udlæsninger, ved hjælp af automatiserede konfokale høje indhold skruekelse (HCS) system. 15 Indlæse pladen til maskinen. Indstil mål på 40X eller højere forstørrelse. Brug kamera # 4 for Hoechst (UV lampe) og kamera # 1 for GFP (laser 488). Indstil maskinen til at læse 6-10 felter pr godt. Indstille maskinen til at gøre to sekventielle aflæsninger pr felt ved 488 nm (for at læse GFP) og UV-lys (for at læse Hoechst). Indstil mål på 40X eller højere forstørrelse.
BEMÆRK: Systemet er et edb mikroskop, der kræver ingen justeringer. Brændvidden er intensiteten af det indfaldende lys og eksponeringstiden er alle setup automatisk af maskinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design af HTS assay
To vigtige faktorer blev taget i betragtning ved udformningen af heri fluorescenstest. Først, vi har brug for at replikere en fysiologisk tilstand, hvor T- eller B-celle-aktivering ville repræsentere en lidelse (f.eks graft-versus-host sygdom). For det andet bør udføres vurderingen af cellulær aktivering ved hjælp af en følsom og kvantitativ metode. Fluorescens er i dag en af de primære valg for HTS udlæsninger, da det svarer til disse behov. 10, 16 Som kan opnås en robust GFP udlæsning efter Nur77 GFP-afledt T- eller B-celle-stimulering både in vitro eller in vivo, 12 vores assay udnytte denne strategi til at skelne mellem ikke-aktiverede og aktiverede celler som en arbejdsmodel for iDENTIFICERING af immunomodulatoriske forbindelser.
Oprindeligt var udformningen af vores assay baseret på GFP vurdering ved flow-cytometri ved hjælp ufraktionerede stimulerede splenocyter. I dette tilfælde er både ikke-aktiverede / aktiverede T- og B-celler farvet med anti-CD3 eller anti-CD19, henholdsvis før GFP vurdering. Som vist i figur 1A, T-celler (CD3 + celler) udgør ca. 30% af en given musemilt. Ved steady state GFP-niveau var i området fra 10% (mest sandsynligt på grund af post-thymisk udvælgelse gennem TCR under udvikling eller homeostatiske stimulation i periferien). Efter TCR-stimulering ved hjælp af de CD3 / CD28 beads, blev en fem til seks gange stigning i procentdelen af GFP-ekspression (57% i stedet for 10%) påvist i CD3 + T-celler (figur 1A - B). Ligeledes B-celler (CD19 + celler) repræsenterer 50-55% af de samlede splenocytter og deres basale GFP expression er sammenlignelig med ikke-aktiverede T-celler (f.eks ~ 10%, figur 1C). Men interessant nok, BCR-stimulering under anvendelse af anti-muse-IgG / IgM og rekombinant CD40L udløste en triviel stigning i GFP-ekspression (33% i stedet for 12%, figur 1C - D). Da GFP udtryk er et nøgleelement for at vurdere den farmakologiske effekt af screenede små molekyler på aktiverede T eller B-celler, optimere dens intensitet er central for følsomhed og succes af screeningen.
Vurdering af GFP-ekspression ved anvendelse af rensede T-eller B-celler
Selvom T og B-celle-stimulering kan opnås direkte ved hjælp af ufraktionerede splenocytter GFP-ekspression intensitet var ikke følsom nok til screening, især hvis udlæsninger skal udføres ved mikroskopi. For at forbedre den cellulære reaktion blev T-celler først oprenset ved magnetiskperler ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit (figur 2A). Som tidligere vist ved anvendelse af ikke-fraktionerede splenocytter, 10% af isolerede CD3 + T-celler var GFP positive (basal ekspression). I denne sammenhæng T-celle-stimulering under anvendelse af de CD3 / CD28 beads væsentligt forbedret deres GFP respons (figur 2A - 2B, 86% mod 57%, når ufraktionerede splenocytter blev anvendt). Blev opnået lignende forbedringer med B-celler (figur 2C - 2D, 80% i stedet for 33%). Disse resultater viser klart, at anvendelsen af oprensede T- og B-celler maksimerer GFP-ekspression, som er egnet til den påtænkte fænotypiske screening.
Skematisk diagram over designet HTS assay
Samlet set kan assayet være underinddelt i fire store sektioner (figur 3). I tilfælde af T-celler for eksempel en splenocyttercellesuspension fremstilles for at rense T-celler (trin 1-3), efterfulgt af en 12 timers stimulering trin in vitro under anvendelse CD3 / CD28 beads (trin 4-5). Aktiverede T-celler udplades derefter og dyrkes i 24 timer med de små molekyler af valg i 384-brønds plader (trin 6-7) før vurderingen af GFP og Hoechst intensiteter ved den automatiserede HCS-systemet. Det samme assay kan anvendes til B-celler med modifikationer udføres på trin 4-5. Kort beskrevet kan B-celler stimuleres med anti-muse-IgG / IgM og rekombinant CD40L i stedet for perler. Da disse komponenter anvendes i deres opløselig form (f.eks ikke knyttet til perler), kan B-celler inkuberes i 12 timer og derefter simpelthen vaskes før plating i 384-brønds plader til screeningsprocessen.
Effektiv T-celle overlevelse er ur for succes HTS undersøgelsen. Følgelig kan to begrænsende faktorer hindre kvaliteten af assayet og bør tages i betragtning. Først, Murine T-celler er meget modtagelige for apoptose efter in vitro-stimulering. 17 For det andet er alle testede forbindelser fortyndet i en DMSO-opløsning, som kan tilføje en anden stressfaktor. For at minimere celletab, rekombinant IL-7 (2 ng / ml) blev suppleret til T-celler ved TCR-stimulering ved trin 4-5. Denne homeostatiske cytokin understøtter proliferation og forøger T-celle overlevelse gennem ekspression af anti-apoptotiske molekyler, såsom Bcl-2, Bcl-xL og Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22
Primær screening med højt gennemløb af 4,398 forbindelser afslører flere aktivatorer og inhibitorer af T-celleaktivering
High throughput screening blev udført ved udpladning 75.000 af ikke-aktiveret (negativ control) eller aktiverede T-celler (positiv kontrol) som vist i figur 4. For at sikre høj reproducerbarhed blev assayet udført flere gange med en opnået Z faktor på 0,87 (figur 5A). Brug af HCS-systemet, den observerede GFP-ekspression af stimulerede T-celler var 20 gange højere end ikke-stimulerede T-celler muliggør genereringen af et '' vindue ordning « 'zone, hvor GFP inhibitoriske forbindelser kan let påvises (figur 5A). Dette er vist i figuren med hensyn til antallet af fluorescerende celler divideret med det samlede antal celler i de scannede områder. I eksemplet vist i figur 5A eksempel screening af 320 forbindelser afslørede tre forbindelser (understreget-out med røde pile) kan inhibere GFP-ekspression ved 1,5-2,5 folder. I dette eksempel er den positive kontrol-værdien var 0,44 ± 0,02 og den negative kontrol var 0,02 ± 0,00.
the screening af i alt 4398 forbindelser (Z faktor på 0,85) blev derefter udført. Forbindelserne blev udvalgt af medicinske kemikere som frø / repræsentative forbindelser baseret på deres kemiske struktur, der repræsenterer en samlet kemisk bibliotek indeholdende 136.000 enheder (figur 5B). Ved afslutningen af assayet, analysen af GFP inhibering identificerede forbindelser, der kan enten inhibere (positive deviators) eller forøgelse GFP-ekspression (negative deviators).
Figur 1: Analyse af T- og B-celle-GFP-ekspression efter TCR eller BCR-aktivering udført på ikke-fraktionerede splenocytter. (A) repræsentant flow-cytometri-analyse af T-celler farvet med et anti-CD3-antistof ved anvendelse splenocytter i fravær (øverste venstre felt) eller nærvær af CD3 / CD28 beads (øverste højre panel). GFP-ekspression for både T-celle-grupper visespå bunden. (B) Procentdel af GFP-ekspression opnået ved flow-cytometri-analyse af T-celler. Fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SD. (C) Svarende til (A), undtaget at splenocytter blev aktiveret under anvendelse af anti-muse-IgG / IgM og rekombinant CD40L derefter farvet for CD19. (D) Procentdel af GFP-ekspression opnået ved flow-cytometri-analyse af B-celler. Fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SD. Alle viste forsøg blev gentaget mindst tre gange (n = 5 / gruppe; * P <0,05 og *** P <0,001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Analyse af GFP-ekspression ved anvendelse af oprenset T- eller B-celler efter TCR eller BCR-aktivering henholdsvis. (A) repræsentant flow-cytometri-analyse af oprensede T-celler farvet med et anti-CD3-antistof. For GFP induktion blev rensede T-celler stimuleres ved hjælp af CD3 / CD28-perler (øverst til højre panel). Ikke-aktiverede kontrol T-celler er vist øverst til venstre panel. GFP-ekspression af både ikke-aktiverede og aktiverede T-celler er vist i bunden. (B) Procentdel af GFP-ekspression opnået ved flow-cytometri-analyse af T-celler. Fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SD. (C) Svarende til (A), undtaget at renheden af B-celler blev vurderet ved CD19-farvning og aktiveres under anvendelse af anti-muse-IgG / IgM og rekombinant CD40L. (D) Procentdel af GFP-ekspression opnået ved flow-cytometri-analyse af B-celler. Fejlsøjler repræsenterer middelværdi ± SD. Alle viste forsøg blev gentaget mindst tre gange (n = 5 / gruppe og *** P <0,001). Klik her for at se et størreversion af denne figur.
Figur 3: Samlet skematisk diagram, der repræsenterer trinene den fænotypiske screening. Der er 7 store trin, der kræves for at forberede HTS analysen. En kvindelig Nur77 GFP musen er ofret for at isolere sin milt (trin 1). Efter genereringen af en splenocytter cellesuspension (trin 2), er T-celler negativt isoleret (ved udtømning af uønskede celler) ved anvendelse af et kommercielt tilgængeligt kit (trin 3). Isolerede T-celler inkuberes derefter med rekombinant IL-7 i fravær eller nærvær af CD3 / CD28 beads i rundbundet 96-brønds plade ved 37 ° C (trin 4). Tolv timer senere (trin 5), er T-celler pipetteres flere gange for at løsne eventuelle aggregater forud for perler fjernelse ved hjælp af den samme celle isolation magnet anvendt oprindeligt for T-celle oprensning. Isolerede T-celler podes derefter i 384-brønds plader (75 000 cells / brønd, trin 6) med forbindelserne i yderligere 24 timer (trin 7). Den følgende dag, inkuberes celler farvet med Hoechst 30 min før analyse ved HCS-systemet (trin 8). Den samme opsætning kunne være fulgt i fremstillingen af en B-celle-baseret assay, bortset fra at trin 4 og 5 skal erstattes af en simpel vask som stimulatorerne tilsættes i opløselige former. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Layout for udpladning af T-celler i en 384-brønds plader. Hver plade anvendt i assayet indeholdt tre grupper. I den første gruppe blev brønde fyldt med ikke-aktiverede T-celler (negativ kontrol for GFP på hver side af pladen; brønde A1-P1 og A24-P24), hvorimod den anden gruppe indeholdt aktiverede T-celler uden drugs (positiv kontrol for GFP, brønde A2-P2 og A23-P23). Alle resterende brønde indeholdende aktiverede T-celler suppleret med kemiske enheder, der anvendes i screeningen. Alle brønde indeholdt 0,5% DMSO. Eksempler på GFP og Hoechst signaler er vist for ikke-aktiverede og aktiverede T-celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Primære fænotypisk screening. (A) Et repræsentativt eksempel på en primær screening udført på 320 forbindelser. Ikke-aktiverede T-celler er næsten GFP null i modsætning til TCR-stimulerede T-celler, som udviser 20 gange højere GFP-ekspression. (B) Kumulative data for alle forbindelser screenet ved anvendelse af assayet. GFP-ekspression viser forbindelserne displaying inhiberende virkning hvorimod andre forbindelser opfører sig som T celle stimulatorer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adskillige udlæste metoder er blevet udnyttet til udvikling af følsomme og pålidelige HTS assays. Disse omfatter kolorimetriske, luminescerende eller fluorescerende metoder. Selvom kolorimetriske metoder er enkle at sætte op, de kræver flere tilføjelser af kemikalier, som kan forstyrre eller forstyrre cellerne bliver testet. 23 Hertil kommer, at de ikke tillader dynamisk vurdering af en biologisk reaktion som den farmakologiske virkning vurderes ved en given virkning. Endvidere kan denne fremgangsmåde kræver dyre robotarme, hvis der anvendes automatiserede HTS. Disse faktorer gør kolorimetriske udlæsninger mindre foreneligt med målsætningen om HTS grund af deres besværlige krav og lav følsomhed. 23 Selv luminescens er blevet foreslået som et alternativ til kolorimetriske assays, er anvendelsen af disse luminescerende prøver i HTS normalt begrænset på grund af kravet om cellelysis. Selvom andre ikke-lysis protokoller blev deviklet, intensiteten af bioluminescens signal kan hæmmes af mange faktorer såsom luciferin absorption, tilgængelighed af co-faktorer, pH, og gennemsigtigheden af dyrkningsmedier eller buffer, der forårsager uoverensstemmelser mellem påviste bioluminescens signaler og faktiske ændringer i cellulær aktivitet. 24 Derfor fleste assays afhængige fluorescensmetoder. Faktisk blev fluorescerende assays oprindeligt udviklet under anvendelse af små, meget fluorescerende organiske molekyler, der kan overvåge en række cellulære processer upon celleaktivering. I summen, fluorescerende assays har højere følsomhed og kan let tilpasses til fænotypiske målinger under HTS. 23
Den udviklede fluorescerende-baserede HTS assay præsenteres her har tre store fordele. For det første er yderst pålidelig, reproducerbar og er blevet vedtaget til screening af forbindelser i stand til at modulere to forskellige primære celler (T og B-lymfocytter) under anvendelse af samme stimulation / udlæsning koncept. For eksempel vil den primære screening af 4,398 forbindelser, som blev afsluttet i løbet af fem forskellige kørsler vises en konsistent aktiverings-induceret GFP signal med minimal intra- og inter-assay variabilitet (<5% og <15%, henholdsvis for T-celle-assay). For det andet assayet anvender et kommercielt tilgængeligt transgen musemodel. Normalt er udformningen af en fluorescens-baseret assay kræver gensplejsning af primære celler eller en cellelinie af interesse for at kunne vise et fluorescerende signal ved stimulering. Selv om denne metode genererer en dyrebar laboratorium værktøj, er det generelt ikke let tilgængelige for det videnskabelige samfund. For at omgå denne begrænsning, blev T og B-celler isoleret fra Nur77 GFP transgene mus. Fordelen ved disse lymfocytter er deres evne til at udtrykke GFP inden for 24 timer upon TCR eller BCR-stimulering. Derfor screening af lægemidler stand til at modulere det transkriptionelle maskineri kørsel GFP-ekspression eller den overordnede cellulærerespons repræsenterer en tiltalende tilgang. For det tredje, at supplere T-celler med CD3 / CD28 perler i deres første aktivering fase kræver fjernelse af disse perler før GFP vurdering. Dette er vigtigt, hvis der anvendes mikroskopi til analyse T-celle-aktivering / hæmning som forlader perlerne ellers vil maskere GFP signal. Hvis flow-cytometri i stedet anvendes til analysen, kan perler efterlades i brøndene (medmindre det udtrykkeligt skaber yderligere confounding begrænsning (er) til assay) som den specifikke population af interesse kan gated anvendelse af både fremadrettet og sideværts scatters.
Det oprindelige mål var at designe en screeningsanalyse med minimal cellulære håndtering. Under denne sammenhæng aktiveringen af T- eller B-celler ved anvendelse af ufraktionerede splenocytter stimuleret med perler eller opløselige antistoffer / rekombinant CD40L henholdsvis var begrænset som en stor andel af lymfocytter forblev GFP negativ (figur 1). Da dette trin er afgørende for succesenaf assayet blev protokollen modificeret til at oprense T eller B-celler under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits at øge andelen GFP-udtrykkende celler. Denne tilgang forbedres betydeligt aktiveringen resultatet af begge cellepopulationer. Selv om der kan anvendes en anden metode til T- og B-celle isolation hvis det skønnes nødvendigt, den foreslåede fremgangsmåde er: i) meget reproducerbar, ii) let tilpasses til at vurdere renheden af det isolerede population ved flow-cytometri før HTS, iii) og tid effektiv som oprensningstrinnet er relativt kort (~ 30 min) og kan udføres med minimal forberedelse. Dog skal det bemærkes, at analysen præsenteres i denne undersøgelse er baseret på anvendelse af muse primære celler. bør gennemføres Sekundær (til bekræftelse formål) og tertiære (endelige validering på målet af interesse) analyser efter den primære skærm til at validere de identificerede hits. Selv om det kunne let tilpasses til en række forskellige cellelinjer, den farmakologiske virkning af Identified hits behov for yderligere validering på andre arter (f.eks humane celler - eksempel på videregående assay), som der er ingen muligheder for at forudsige længerevarende effekt blandt arter. I summen, denne analyse er værdifuldt for identifikation af nye potentielle hits og / eller molekylære mål med mulig ekstrapolation af resultater fra in vitro / dyreforsøg til mennesker.
Selv om designet assay kan udnyttes til både T- og B-celler, er en fordel for den specifikke anvendelse af T-celler i dette tilfælde. TCR-aktivering kræver sædvanligvis dobbelt stimulering tillagt gennem en primær (f.eks anti-CD3 eller anti-TCR) og en sekundær co-aktivering (f.eks anti-CD28) signal. 25, 26 Interessant både anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer kan købes direkte forbundet på overfladen af magnetiske perler, og kan fjernes fra cellesuspensionen ved anvendelse af en standard magnet før tilsætning the kemiske forbindelser, der skal testes i screeningen. Som anvendes et bibliotek med ukendte kemiske enheder, støttemure aktiverede T-celler fri af molekyler bundet til deres TCR-komplekset kan minimere enhver mulig interferens mellem de testede forbindelser og dem bundet til TCR bindende riller. 27 Hertil kommer, at fjerne den stimulerende middel efter aktivering T-celle efterligner fysiologiske situationer i modsætning til at arbejde sammen med T-celler udsat for en vedvarende suprafysiologisk TCR aktivering. Den sidstnævnte situation kan være problematisk, da det kan tilsidesætte den farmakologiske virkning af en given forbindelse, især hvis det blev brugt ved små koncentrationer i screeningen. Som der er ingen kommercielt tilgængelige perler udøver samme virkning på B-celler, ville det være interessant at foretage en HTS i fremtiden at teste, om den kontinuerlige tilstedeværelse af stimulus på B-celler begrænser udførelsen af assayet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Merck Frosst Start-up midler fra Université de Montréal. Vi vil gerne takke Drs Jean Duchaine og Dominic Salois fra High-throughput platform på Institut for Forskning i Immunologi og kræft for deres diskussion, kommentarer og feedbacks. Moutih Rafei har en Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
