Summary
Vi presenterer i denne studien en ny fluorescens-baserte analysen ved hjelp av lymfocytter avledet fra en transgen mus. Denne analysen er egnet for high-throughput screening (HTS) av små molekyler utrustet med evnen til enten å inhibere eller fremme lymfocyttaktivering.
Abstract
Høy throughput screening (HTS) er i dag den mest for identifisering av kjemiske enheter som er i stand til å modulere biokjemiske reaksjoner eller cellulære prosesser. Med fremme av bioteknologi og den høye translasjonell potensialet av små molekyler, har en rekke innovative tilnærminger i medisiner utviklet seg, noe som forklarer den gjenoppblomstrende interesse for bruk av HTS. Den onkologi feltet er for tiden den mest aktive forskningsområde for narkotika screening, med ingen store gjennombrudd gjort for identifisering av nye immunmodulerende forbindelser rettet mot transplantasjonsrelaterte komplikasjoner eller autoimmune sykdommer. Her presenterer vi en ny in vitro murin fluorescerende basert lymfocytt analyse lett tilpasses for identifisering av nye immunmodulerende forbindelser. Denne analysen anvender T- eller B-celler avledet fra en transgen mus, i hvilken det Nur77 promoteren driver GFP uttrykk på T- eller B-celle-reseptor-stimulering. Som GFP intensitet reflektereraktivering / transkripsjonen aktivitet av målcellen, definerer vår analyse et nytt verktøy for å studere effekten av gitt forbindelse (r) på cellulære / biologiske responser. For eksempel ble en primær screening utført ved å bruke 4,398 forbindelser i fravær av en "target hypotesen", noe som førte til identifisering av 160 mulige treff som viser immunmodulerende aktiviteter. Således er bruken av denne analyse er egnet for drug discovery programmer som utforsker store kjemiske biblioteker før videre in vitro / in vivo valideringsstudier.
Introduction
Høy throughput screening (HTS) er en bevist strategi allment vedtatt for identifisering av nye terapeutiske molekyler eller for reposisjonering av FDA-godkjente legemidler i nye medisinske indikasjoner. 1. Så langt, kan det oppnås HTS suksess måles ved den mengde av tidligere oppdaget legemidler. For eksempel, tyrosinkinaseinhibitoren lapatinib brukes til behandling av brystkreft, sitagliptin; en dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) inhibitor brukt som et anti-hyperglykemisk legemiddel, og den orale Bcr-Abl tyrosin kinase inhibitor dasatinib anvendes for behandling av kronisk myelogen leukemi representere noen eksempler på en lang liste over godkjente medikamenter som opprinnelig oppdaget av HTS. 2 Selv om produktiviteten i den farmasøytiske industrien har i det siste hatt en mangel i oppdagelsen av nye kjemiske enheter, kan sannsynligheten for vellykket drug discovery forbedres gjennom en økning i antall preklinisk candidates viser modulatory biologiske / biokjemiske egenskaper. Følgelig kan utviklingen av nye HTS-analyser som er tilpasset for fenotypisk screening har potensial til å gi viktige farmakologiske verktøy for oppdagelsen av nye legemiddel treff. 3, 4, 5, 6 Videre kan HTS nå utføres i et raskere tempo på grunn av betydelige teknologiske forandringer de siste årene, inkludert spesialdesignede fleksible robotinstallasjoner, nye avlesningsteknologi og omfattende miniatyrisering. 2, 7 Blant de faktorer som bidrar til den økende interesse for bruk av fenotypisk screening (aka frem farmakologi) er oppfatningen at fokus på funksjonelle effekter fremfor forenklede reduksjonistisk forutsetninger om molekylære mål (mål-basert screening / biokjemiske reaksjoner) er mer sannsynlig å sho w klinisk effekt. Dermed holder fenotypisk screening løfte om å avdekke nye potensielt terapeutiske forbindelser og molekylære stier av tiden botemiddel sykdommer. 2
Slik skal identifisere hemmere eller aktivatorer for en gitt molekylære mål eller cellular funksjon, er en svært følsom og pålitelig analyse er nødvendig for å kunne skille mellom bona fide treff og falske positiver. Så, hva gjør en god analyse? Kvaliteten på en gitt analyse, må først bedømt av signal-til-støy-forhold (reflektert gjennom en Z-faktor). 8 andre bør målrettet effekt eller målet på skjermen bli klarlagt. For eksempel kan funksjonelle cellebaserte tilnærminger gi betydelige fordeler for reseptoren screening i motsetning til en assay er spesielt utformet for å vurdere ligand-reseptor-binding. Grunnen til dette er at den sistnevnte metode ikke kan skille mellom agonist og antagonist-ligander.ss = "xref"> 9 I motsetning til dette, er en cellebasert tilnærming sannsynligvis være mer effektive som reseptor-funksjon kan være direkte vurdert i en biologisk fenotype (proliferasjon, cellesyklus-stans, apoptose og / eller differensiering). Det må imidlertid bemerkes at biokjemiske analyser kan gi betydelige fordeler i forhold til fenotypiske assays som de krenker en spesifikk intracellulær mål. Et godt optimalisert biokjemiske analysen vil generelt ha mindre data scatter enn en fenotypisk screening samtidig forenkle etterpå etterforskning knyttet til stoffet molekylære virkningsmekanismen. Imidlertid er den største ulempen av target-baserte eller biokjemiske analyser mulighet til å forsterke graden av falske positive treff som kan påvirke ikke-spesifikke mål når de testes i et biologisk system (tap av spesifisiteten opprinnelig ble studert i biokjemisk analyse). 10 Selv om en veletablert cut-off punkt mellom negative og positive treff kan redusere antall falske positiver in den primære screening, anvendelse av et fysiologisk relevant system etterligne det naturlige cellulære miljø som intakte celler, vev eller hele helhet dyr forblir i kjernen av analysen utforming pendel. Derfor gjør fenotypiske screening bly funn med ønskelige biologiske / fenotypiske effekter for sykdommer uten identifiserte narkotika mål uten å ha forkunnskaper om forbindelsens aktivitet eller virkningsmekanisme. 11
Den her undersøkelsen gjelder utvikling og testing av en optimalisert og reproduserbar fenotypiske screening basert på to viktige komponenter: en kommersielt tilgjengelig mus modell og en gruppert sub-familie av kjemiske forbindelser. Med hensyn til dyremodell, avhengig av analysen på anvendelsen av lymfocytter som stammer fra et musestamme (Nur77 GFP) huse et bakterielt kunstig kromosom inneholdende en kassett i hvilken ekspresjonen av grønt fluorescerende protein (GFP) drives av the Nur77 promoter. 12 Kjennetegn på denne stimuleringen er basert på det faktum at Nur77 er en umiddelbar tidlig gen oppregulert etter T-celle-reseptor (TCR) eller B-celle-reseptoren (BCR) stimulering. 12 Som for screening metoden selv, ble en tilnærming brukes til å unngå screening av trivielle analoger mens den tiden som trengs for å vurdere en stor kjemisk bibliotek (> 10 5 forbindelser) minimeres. For å gjøre dette, ble en database over kjemiske forbindelser som er valgt av medisinske kjemikere bruker virtuelle screening verktøy utnyttes for å identifisere topologisk lignende forbindelser ved hjelp av kjente aktive frø strukturer som referanser. Denne tilnærmingen tillot oss å screene 4,398 forbindelser som representerer en samlet bibliotek med over 136 000 kjemiske enheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr protokoller ble godkjent av Animal Care komité Université de Montréal. Musene ble avlivet ved gradvis innånding av CO 2 til ingen vitale ble observert fulgt ved halshugging. Prosedyren ble utført av en sertifisert person for å sikre at dyr ble avlivet på en human måte og i henhold til anbefalingene fra den kanadiske Council on Animal Care.
1. Utarbeidelse av splenocytt Medium og Flow-cytometri Buffer
- Utfør alle trinnene under en 70% etanol-renset biologisk hette.
- Fjern 70 ml forvarmet Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium (kommersielt tilgjengelig og leveres i filtrerte 500 ml volum sterile flasker) og plasser i et sterilt rør. Den fjernede medium vil bli brukt senere i protokollen.
- Supplere de resterende 430 ml av RPMI 1640 med 1 x 50 ml inaktivert føtalt bovint serum (FBS), 5 ml penicillin / streptomycin, 5ml HEPES, 5 ml, ikke-essensielle aminosyrer, 5 ml natriumpyruvat, og 0,05 ml filtrert (1M) 2-merkaptoetanol.
MERK: Forvarm splenocytt medium med et vannbad innstilt på 37 ºC for å unngå varmesjokkerende celler. Dette er viktig for å unngå induksjon av cellulær apoptose. - For å fremstille den flow-cytometri-buffer, tilsett 2 ml FBS til 98 ml fosfatbufret saltvann (PBS) og oppbevares i kjøleskap inntil bruk (fortrinnsvis i løpet av tre dager).
2. Generering av splenocytt Cell Suspension fra Nur77 GFP Muse Milter
- En septically isolere milten fra en 6-8 ukers gammel kvinne Nur77 GFP mus.
- For å oppnå dette, arbeider under sterile panseret. Bløt ofret mus pels, saks og pinsett i 70% etanol.
- Lå musen på sin høyre side, kutt i huden og musklene i øvre venstre abdominal kvadrant. Inspiser innsnitt området til synlig finne milten deretter skjære den ut. Hold milteni splenocytt medium på is inntil de er klare til å utføre det neste trinn.
- Plasser milt (e) i en 10 cm2 cellekulturpetriskål inneholdende 5 ml forvarmet splenocytt medium.
- Mos milt ved bruk av en steril sprøytestempelet inntil løsningen er uklar. En milt kollagenmatriksen bør forbli ved slutten av prosedyren.
- Etter omfattende mose i splenocytt medium, samle cellesuspensjonen og passerer det gjennom en 70 mikrometer celle sil plassert på en 50 ml tube å filtrere ut eventuelle rester eller blodpropp.
- Sentrifuger ved 500 xg i 5 minutter. Etter kaste supernatanten, re-suspendere cellepelleten i 2-3 ml in-house produsert eller kommersiell røde blodcellelyse buffer. Etter pipettering (2-3 ganger) la suspensjonen hvile i 20-30 s.
- Tilsett 5 ml PBS, eller en egnet buffer for valg sentrifuger deretter cellesuspensjonen i 5 min ved 500 x g.
- Fjern supernatanten (skal være rød i fargen som den inneholder lysert røde bLood celler) og re-suspendere cellepelleten i 2 ml splenocytt medium.
- Ved hjelp av et hemocytometer, telle antallet celler farget med trypanblått for å differensiere mellom levende og døde (nekrotiske celler).
3. T-celle isolasjon fra splenocytt Cell Suspension
- Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 500 x g. Re-suspendere cellene i serumfritt RPMI-medium (50 ml fra trinn 1,3) for å oppnå en cellekonsentrasjon på 10 x 10 6 celler / ml.
- Overfør cellene til en 5 ml polystyrenrør og satt til side en 100 ul alikvot av splenocytter for renhetsvurdering / sammenligning ved slutten av rensetrinnet.
- Legg normalt rotteserum til cellesuspensjonen ved 50 pl / ml, etterfulgt av T-celle-isolasjon Antistoffblandingen (50 ul / ml).
- Bland cellesuspensjonen, og la det hvile i 10 min. I dette trinnet kan antistoffet cocktail for å binde alle uønskede celler.
- Legg streptavidin raske kuler (magnetic perler) i 2,5 min, og deretter bringe volumet til 2,5 ml ved hjelp av serumfritt medium.
- Plasser røret på en celleisolasjon magnet i 3 min.
- Overfør T cellesuspensjonen inn i en ny polystyren rør ved å holde magneten og helle ut løsningen i ett trekk.
MERK: Den isolerte suspensjon inneholder de rensede T-celler. Alle uønskede celler blir holdt på den siden av røret er bundet til de magnetiske kuler streptavidin. - Tell de isolerte T-celler ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer.
MERK: Ved dette trinnet renhet av de isolerte T-celler kan bekreftes (valgfritt) ved å analysere prosentandelen av CD3 + hendelser før og etter T-celle-isolering ved flow-cytometri. 1. 3- I korthet, sentrifuger 1 ml av splenocytt-cellesuspensjon ved 500 x g. Kast supernatanten og suspendere cellene i flow-cytometri-buffer ved en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml.
- Legg fluorescerende-merket anti-mouse CD3-antistoff i en konsentrasjon på 1: 100. Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter. Vask en gang, sentrifuger og re-suspen i flow-cytometri buffer (400 ul) for analyse ved flow-cytometri.
4. B-celle isolasjon fra splenocytt Cell Suspension
- Følg samme protokoll som beskrevet for T-celler (trinn 3.1 til 3.8), men ved hjelp av en B-celle isolasjon kit. For renhet vurdering, bruke CD19 antistoff i stedet for CD3 antistoff. 1. 3
- For renhet vurdering (valgfritt), bruker CD19 antistoff i stedet for CD3 antistoff. Sentrifuge 1 ml av splenocytt cellesuspensjon ved 500 x g. Kast supernatanten og suspendere cellene i flow-cytometri-buffer ved en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler / ml.
- Legg fluorescerende merket anti-muse-CD19-antistoff i en konsentrasjon på 1: 100 og inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter. Vask en gang, sentrifuger og re-suspendere i flow-cytometri buffer (400 mL) for analyse av flow-cytometri.
5. T-celleaktivering og induksjon av GFP Expression
- Seed T-cellene, i suspensjon, i en rundbunnet 96-brønns plate ved en konsentrasjon på 2,5 x 10 5 celler / brønn.
- Legg rekombinant interleukin (IL) -7 ved 2 ng / ml og CD3 / CD28 magnetiske perler (25 ul / 10 6 celler). Beholde en del av T-cellene med ubehandlede kuler for å tjene som en negativ kontroll for senere målinger som representerer den ikke-aktiverte T-celler.
- Tolv timer senere høste T-celler fra den 96-brønns plate ved forsiktig pipettering cellesuspensjonen i hver brønn opp og ned for å bryte noen vulst-celle-kompleks / aggregater. Samle suspensjonen fra alle brønnene til en 5 ml polystyrenrør.
- Plasser røret som inneholder suspensjonen i den samme celleisolasjon magnet anvendt tidligere for rensing av T- eller B-celler og la den hvile i 5 minutter.
- Overfør den T-cellesuspensjon intoa ny polystyren rør ved å holde magneten og helle ut løsningen i ett trekk.
- Sentrifuger cellene ved 500 xg i 5 minutter. Re-suspendere cellene i friskt splenocytt medium for å få en konsentrasjon på 2 x 10 6 celler / ml.
- Vurdere GFP uttrykk intensitet ved flow-cytometri (valgfritt for kvalitetskontroll) på 12 til 24 timer etter stimulering sammenlignet med ikke-aktiverte T-celler. 12
MERK: GFP fluorescens er iboende til Nur77 GFP T-celler og er manifestert ved vellykket aktivering av TCR. 12 - For vurdering av levedyktighet og aktivering (valgfritt) ved mikroskopi, beis de aktiverte cellene med Hoechst 30 minutter før analyse ved en konsentrasjon på 0,2 ug / ml. Legg tilstrekkelig volum av cellesuspensjonen til et deksel lysbilde eller til en brønn i en flatbunnet svart-sidig 384-brønners plate og undersøke henhold fluorescensmikroskop for å vurdere levende celler. Døde celler vil ikke beholde atomfarging. 14
6. B-celleaktivering og induksjon av GFP Expression
- Ved hjelp av en T-25-kulturflaske, re-suspendere de isolerte B-celler ved 1 x 10 6 celler / ml.
- Legg anti-muse-IgG / IgM (H + L) ved 10 pl / ml og rekombinante CD40L ved en konsentrasjon på 200 ng / ml. Beholde en del av B-cellene ubehandlet for å tjene som en negativ kontroll for senere målinger (som representerer ikke-aktiverte B-celler).
- Vurdere GFP uttrykk intensitet ved flow-cytometri ved 12 eller 24 timer etter stimulering sammenlignet med ikke-aktiverte B-celler.
MERK: GFP fluorescens er iboende til Nur77 GFP B-celler og er manifestert ved vellykket aktivering av BCR. 12 - For vurdering av levedyktighet og aktivering (valgfritt) ved mikroskopi, beis de aktiverte cellene med Hoechst 30 minutter før analyse ved en konsentrasjon på 0,2 ug / ml. Legg tilstrekkelig volum av cellesuspensjonen tilet deksel lysbilde eller til en brønn i en flatbunnet svart-sidig 384-brønners plate og undersøke under et fluorescensmikroskop for å vurdere levende celler. Døde celler vil ikke beholde atom farging. 14
7. Høy throughput screening av små molekyler
- Fremstille en cellesuspensjon fra 2 x 10 til 6 celler / ml av de aktiverte T- eller B-celler (magnetiske kuler eller antistoffer / CD40L) eller ikke-aktiverte grupper.
- Plate 75.000 celler / brønn i en 384-brønners plate (volum på 40 ul). Bruk en flatbunnet svart-sided 384-brønners plate eller et mikroskop dekk sklie for levedyktighet og aktivering vurdering av fluorescerende mikroskopi (valgfritt kvalitetskontroll skritt før HTS) med Hoechst flekk (se trinn 5.8 og 6.4 for detaljer). 14
- Manuelt eller ved hjelp av et automatisert system, legger narkotika av valg (oppløst i 0,5% DMSO) til hver brønn.
- Tilsett bærer (DMSO) til en positiv (aktivert) og negative (ikke-aktiblet) kontrollbrønner. Juster DMSO-konsentrasjon til et maksimum på 0,5%.
- Inkuber platene i 24 timer (eller inkubasjonstid på valg) ved 37 ° C og 5% CO2.
- På dagen for screening, fortynne den Hoechst 33342 fargende oppløsning (1:. 3333; for eksempel legge til 10 mL til cellene i 384-brønns plater for å generere et totalvolum på 50 ul). Flekk 30 min før GFP analyse ved tilsetning av Hoechst løsning for å oppnå en konsentrasjon på 0,2 ug / ml.
- Forsiktig pipette cellene opp og ned for å oppnå en homogen fordeling i hver brønn.
MERK: Dette trinnet er viktig i tilfelle av dispensering av medikamenter (trinn 7.3) ved anvendelse av et automatisert system som cellene har en tendens til å hope seg opp på den ene side av brønnen, motsatt til retningen av strømningen. - Spinne platene ved 45 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
- La platene til hvile i 15 minutter ved romtemperatur.
- Utfør plate (r) leser-outs, ved hjelp av automatiserte confocal høyt innhold skruevekkings (HCS) system. 15 Installering av platen til maskinen. Sett mål på 40X eller høyere forstørrelse. Bruk kamera # 4 for Hoechst (UV lampe) og kamera # 1 for GFP (laser 488). Sett opp maskinen til å lese 6-10 felt per brønn. Juster maskinen til å gjøre to påfølgende målinger per felt ved 488 nm (for å lese GFP) og UV-lys (for å lese Hoechst). Sett mål på 40X eller høyere forstørrelse.
MERK: Systemet er en datastyrt mikroskop som ikke krever noen justeringer. Det sentrale avstand, av intensiteten av det innfallende lys og eksponeringstiden er alle oppsett automatisk av maskinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Design av HTS analysen
To viktige faktorer er tatt i betraktning ved utformingen av dokumentet fluorescerende analysen. Først, trengte å gjenskape en fysiologisk tilstand der T- eller B-celleaktivering vil representere en sykdom (f.eks graft-versus-host disease). For det andre bør vurderingen av cellulær aktivering utføres ved å bruke en følsom og kvantitativ metode. Fluorescens er i dag en av de primære valg for HTS lest-outs som det tilsvarer disse behovene. 10, 16 Som et robust GFP avlesnings kan erholdes følgende Nur77 GFP-avledede T- eller B-cellestimulering både in vitro eller in vivo, 12 vår analyse utnyttes denne strategien for å skille mellom ikke-aktiverte og aktiverte celler som en arbeidsmodell for identification av immunmodulerende forbindelser.
Opprinnelig utformingen av vår analyse var basert på GFP vurdering av flow-cytometri bruker fraksjonerte stimulert splenocytes. I dette tilfellet er begge ikke-aktiverte / aktiverte T- og B-celler farget med anti-CD3 eller anti-CD19, henholdsvis før GFP vurdering. Som vist i figur 1 A, T-celler (CD3 + celler) utgjør omtrent 30% av en gitt musemilt. Ved steady state GFP nivå var i størrelsesorden 10% (mest sannsynlig på grunn av post-thymus utvalg gjennom TCR under utvikling eller homeostatic stimulering i periferien). Etter TCR-stimulering ved hjelp av CD3 / CD28-perler, ble en fem til seks ganger økning i prosentandelen av GFP uttrykk (57% i stedet for 10%) som detekteres i CD3 + T-celler (figur 1 A - B). Likeledes, B-celler (CD19 + celler) utgjør 50-55% av totale splenocytter og deres basal GFP expression er sammenlignbare med ikke-aktiverte T-celler (for eksempel ~ 10%, figur 1C). Interessant er imidlertid BCR stimulering ved hjelp av anti-mus-IgG / IgM og rekombinante CD40L utløste en ubetydelig økning i GFP uttrykk (33% i stedet for 12%, figur 1C - D). Som GFP uttrykk er et viktig element for å vurdere den farmakologiske effekten av skjermede små molekyler på aktiverte T eller B-celler, optimalisere sin intensitet er sentrale for følsomhet og suksessen til screening.
Vurdering av GFP uttrykk ved hjelp rensede T eller B-celler
Selv om T- og B-cellestimulering kan oppnås direkte ved bruk av ikke-fraksjonerte miltceller, GFP uttrykk intensitet var ikke følsom nok for screening spesielt hvis avlesinger skal utføres ved mikroskopi. For å forbedre den cellulære responsen, ble T-celler først renset ved hjelp av magnetiskperler med en kommersielt tilgjengelig kit (Figur 2A). Som tidligere vist ved hjelp av ikke-fraksjonerte miltceller, 10% av isolerte CD3 + T-celler ble GFP positive (basal ekspresjon). I denne sammenheng, T-cellestimulering ved hjelp av CD3 / CD28-perler betydelig forbedret deres GFP respons (figur 2A - 2B, 86% i motsetning til 57% når ikke-fraksjonerte miltceller ble anvendt). Lignende forbedringer ble oppnådd med B-celler (figur 2C - 2D, 80% i stedet for 33%). Disse resultatene viser klart at bruk av renset T- og B-celler maksimerer GFP uttrykk, som er egnet for den foreslåtte fenotypiske screening.
Skjematisk diagram av HTS utformet analysen
Totalt sett er analysen kan være delt inn i fire hoveddeler (figur 3). I tilfellet av T-celler, for eksempel, en splenocyttercellesuspensjon fremstilles for å rense T-celler (trinn 1-3) etterfulgt av en 12 timers stimulering trinnet in vitro ved bruk av CD3 / CD28-kuler (trinn 4-5). Aktiverte T-celler blir deretter sådd ut og dyrket i 24 timer med de små molekyler av valg i 384-brønns plater (trinn 6-7) før vurderingen av GFP og Hoechst intensiteter ved hjelp av automatiserte HCS-systemet. Den samme analysen kan brukes for B-celler med modifikasjonene utført ved trinnene 4-5. I korthet, kan B-celler stimuleres med anti-muse-IgG / IgM og rekombinante CD40L i stedet for kuler. Ettersom disse komponentene er benyttet i sin oppløselige form (dvs. ikke bundet til perler), kan B-celler inkuberes i 12 timer og deretter ganske enkelt vasket før plettering i 384-brønns plater for screening prosessen.
Effektiv T-celle overlevelse er primordial for suksessen til HTS studien. Følgelig kan to begrensende faktorer hindrer kvaliteten av analysen og bør tas i betraktning. Først, Murine T-celler er svært utsatt for apoptose etter in vitro stimulering. 17 For det andre, blir alle testede forbindelser fortynnet i en DMSO-oppløsning, som kan legge til en andre stressfaktor. For å minimalisere celletap, rekombinant IL-7 (2 ng / ml) ble tilsatt til T-celler ved TCR-stimulering ved trinnene 4-5. Denne homeostatiske cytokin støtter spredning og forbedrer T-celle overlevelse gjennom ekspresjon av anti-apoptotiske molekyler slik som Bcl-2, Bcl-xL og Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22
Primær high throughput screening av 4,398 forbindelser avslører flere aktivatorer og inhibitorer av T-celleaktivering
A high throughput screening ble utført ved utsåing av 75 000 av ikke-aktivert (negativ control) eller aktiverte T-celler (positiv kontroll) som vist i figur 4. For å sikre høy reproduserbarhet, ble analysen gjennomført flere ganger med en erholdt Z-faktor på 0,87 (figur 5A). Ved hjelp av HCS-systemet, den observerte GFP ekspresjon av stimulerte T-celler som var 20 ganger høyere enn ikke-stimulerte T-celler som tillater generering av en "" window of action "" sone hvor GFP inhiberende forbindelser som lett kan påvises (figur 5A). Dette er vist i figuren i forhold til antallet fluorescerende celler dividert med det totale antall celler i de skannede feltene. I det eksempel som er vist i figur 5A, screening av 320 forbindelsene presentert tre forbindelser (påpekt-out av røde piler) som er i stand til å hemme ekspresjon av GFP 1,5-2,5 folder. I dette eksemplet, den positive kontrollverdien var 0,44 ± 0,02 og den negative kontroll var 0,02 ± 0,00.
the screening av i alt 4398 forbindelser (Z faktor på 0,85) ble deretter utført. Forbindelsene ble valgt ut av medisinske kjemikere som frø / representative forbindelser basert på deres kjemiske struktur som representerer en samlet kjemisk bibliotek som inneholder 136.000 enheter (figur 5B). Ved slutten av analysen, analyse av GFP inhibering identifisert forbindelser som er istand til enten å inhibere (positive gale veier) eller forsterke ekspresjon GFP (negative gale veier).
Figur 1: Analyse av T- og B-celle-GFP uttrykket etter TCR eller BCR aktivering utført på ikke-fraksjonerte miltceller. (A) Representative flow-cytometri analyse av T-celler farget med et anti-CD3-antistoff ved hjelp av splenocytter i fravær (øverst til venstre panel) eller nærvær av CD3 / CD28-kuler (panel øverst til høyre). GFP uttrykk for både T-cellegrupper visespå bunnen. (B) Prosent av GFP ekspresjon oppnådd ved flow-cytometri analyse av T-celler. Feilstolpene representerer middelverdi ± SD. (C) På samme måte som (A) med unntagelse av at splenocytter ble aktivert ved anvendelse av anti-muse-IgG / IgM og rekombinante CD40L deretter farget for CD19. (D) Prosent av GFP ekspresjon oppnådd ved flow-cytometri analyse av B-celler. Feilstolpene representerer middelverdi ± SD. Alle viste Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger (n = 5 / gruppe, * P <0,05 og *** p <0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Analyse av GFP uttrykk ved hjelp av renset T- eller B-celler etter henholdsvis TCR eller BCR aktivering. (A) Representative flow-cytometri-analyse av rensede T-celler farget med et anti-CD3 antistoff. For GFP induksjon, ble rensede T-celler stimulert ved hjelp av CD3 / CD28 perler (panel øverst til høyre). Ikke-aktiverte kontroll T-celler vises øverst til venstre panel. GFP uttrykk for både ikke-aktiverte og aktiverte T-celler vises nederst. (B) Prosent av GFP ekspresjon oppnådd ved flow-cytometri analyse av T-celler. Feilstolpene representerer middelverdi ± SD. (C) På samme måte som (A) med unntagelse av at renheten av B-celler ble vurdert ved CD19-farging og aktivert ved hjelp av anti-mus-IgG / IgM og rekombinante CD40L. (D) Prosent av GFP ekspresjon oppnådd ved flow-cytometri analyse av B-celler. Feilstolpene representerer middelverdi ± SD. Alle viste Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger (n = 5 / gruppe og *** p <0,001). Klikk her for å se et størreversjon av denne figuren.
Figur 3: Generell skjematisk diagram som representerer trinnene i fenotypisk screening. Det er 7 store skritt som kreves for å forberede HTS analysen. En kvinnelig Nur77 GFP mus er ofret for å isolere sin milt (trinn 1). Etter genereringen av en splenocytter cellesuspensjon (trinn 2), er T-celler negativt isoleres (ved fjerning av uønskede celler) ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig kit (trinn 3). Isolerte T-celler ble deretter inkubert med rekombinant IL-7 i fravær eller nærvær av CD3 / CD28-perler i rundbunnede 96-brønners plate ved 37 ° C (trinn 4). Tolv timer senere (trinn 5), er T-cellene pipettert flere ganger for å fjerne eventuelle aggregater før kulene fjernes ved hjelp av den samme celleisolasjon magnet anvendt opprinnelig for T-celle-rensing. Isolerte T-celler blir deretter sådd ut i 384-brønns plater (75 000 cells / brønn, trinn 6) med forbindelsene i ytterligere 24 timer (trinn 7). Den følgende dag, inkuberes cellene farget med Hoechst 30 minutter før analyse ved HCS-systemet (trinn 8). Det samme oppsett kan bli fulgt opp for fremstilling av et B-celle-baserte assay, bortsett fra at trinn 4 og 5 er til å bli erstattet av en enkel vask som stimulatorer tilsettes i oppløselige former. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Layout for plettering av T-celler i en 384-brønners plater. Hver plate benyttet i analysen inneholdt tre grupper. I den første gruppen, ble brønnene fylt med ikke-aktiverte T-celler (negativ kontroll for GFP på begge sider av platen, brønnene A1-P1 og A24-P24), mens den andre gruppen inneholdt aktiverte T-celler uten drugs (positiv kontroll for GFP, brønner A2-P2 og A23-P23). Alle gjenværende brønnene inneholdende aktiverte T-celler supplert med kjemiske enheter som brukes i screening. Alle brønner inneholdt 0,5% DMSO. Eksempler på GFP og Hoechst signaler er vist for ikke-aktiverte og aktiverte T-celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Primær fenotypisk screening. (A) representativt eksempel på en primær screening utført på 320 forbindelser. Ikke-aktiverte T-celler er nesten GFP null i motsetning til TCR-stimulerte T-celler, som vises 20 ganger høyere GFP uttrykk. (B) Kumulative data for alle forbindelsene screenet ved hjelp av analysen. GFP uttrykk demonstrerer forbindelser displaying hemmende virkning mens andre forbindelser var oppfører seg som T-celle stimulatorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Flere avlesningsmetoder er blitt utnyttet for utvikling av følsomme og pålitelige HTS-analyser. Disse inkluderer kolo, selvlysende eller fluorescerende metoder. Selv om kolorimetriske metoder er enkle å sette opp, krever de flere tilsetninger av kjemikalier, som kan påvirke eller forstyrre cellene som blir testet. 23 I tillegg har de ikke tillater dynamisk evaluering av en biologisk respons som den farmakologiske virkning vurderes ved et bestemt endepunkt. Videre kan denne fremgangsmåten krever dyre robotarmer hvis automatiserte HTS anvendes. Disse faktorene gjør kolorimetriske read-outs mindre forenlig med målet om HTS grunn av sine uhåndterlige krav og lav følsomhet. 23 Selv om luminescens er blitt foreslått som et alternativ til kolorimetriske assays, er anvendelsen av disse luminescerende testene i HTS vanligvis begrenset på grunn av kravet om cellelysering. Selv om andre ikke-lysis protokollene ble deklet, intensiteten av Bioluminescens signalet kan bli hindret av mange faktorer som luciferin absorpsjon, tilgjengelighet av co-faktorer, pH-verdi, og gjennomsiktigheten av kulturmediet eller buffer, forårsaker avvik mellom detekterte Bioluminescens signaler og faktiske endringer i cellulær aktivitet. 24 Derfor, de fleste analyser er avhengige av fluorescens metoder. Faktisk ble fluorescerende baserte analyser opprinnelig utviklet ved hjelp av små, sterkt fluorescerende-organiske molekyler som er i stand til å overvåke en rekke cellulære prosesser ved celleaktivering. I sum, fluoriserende analyser har høyere følsomhet og kan enkelt tilpasses for fenotypisk målinger under HTS. 23
Den utviklet fluorescerende baserte HTS analysen som presenteres her har tre store fordeler. For det første er det meget pålitelig, reproduserbar og har blitt tatt i bruk for screening av forbindelser som er i stand til å modulere to forskjellige primære celler (T og B-lymfocytter) ved bruk av samme Stimulasjon / lese-konsept. For eksempel vises det primære screening av 4,398 forbindelser, som ble gjennomført over fem forskjellige løyper en konsekvent aktivisering-indusert GFP signal med minimal intra og inter-assay variabilities (<5% og <15%, henholdsvis for T-celleanalyse). For det andre analysen benytter en kommersielt tilgjengelig transgen musemodell. Vanligvis, utforming av en fluorescens-basert assay krever genetisk modifisering av primære celler eller en cellelinje av interesse for å vise et fluorescerende signal ved stimulering. Selv om denne tilnærmingen skaper en dyrebar laboratorium verktøy, er det generelt ikke lett tilgjengelig for det vitenskapelige samfunn. For å omgå denne begrensningen ble T- og B-celler isolert fra Nur77 GFP transgene mus. Fordelen med disse lymfocyttene er deres evne til å uttrykke GFP innen 24 timer ved TCR eller BCR stimulering. Derfor screening narkotika stand til å modulere transkripsjonen maskiner kjører GFP uttrykk eller den totale mobilsvar representerer en tiltalende måte. For det tredje, supplere T-celler med CD3 / CD28-perler i sin første aktivering fase krever fjerning av disse perlene før GFP vurdering. Dette er viktig hvis mikroskopi blir brukt for å analysere T-celleaktivering / hemming som forlater kulene ellers vil maskere den GFP signal. Hvis flow-cytometri brukes i stedet for analysen, kan perler være igjen i brønnene (med mindre det spesifikt skaper ekstra forvirrende begrensning (er) til analyse) som bestemt populasjon av interesse kan inngjerdet med både forover og side sprer.
Det første målet var å designe en screening analysen med minimal cellular håndtering. Under denne sammenheng aktiveringen av T- eller B-celler ved hjelp av ikke-fraksjonerte miltceller stimulert med perler eller oppløselige antistoffer / rekombinante CD40L henholdsvis var begrenset som en stor andel av lymfocytter forble GFP negativ (figur 1). Når dette trinnet er kritisk for suksessav analysen, var protokollen modifisert for å rense T- eller B-celler ved hjelp av kommersielt tilgjengelige sett for å øke den prosentvise GFP-uttrykkende celler. Denne tilnærmingen betydelig forbedret aktivering utfallet av begge cellepopulasjoner. Selv om en annen metode for valg kan benyttes til T- og B-celleisolasjon dersom det anses nødvendig, er den foreslåtte metode: i) meget reproduserbar, ii) lett tilpasses for å bedømme renheten av det isolerte populasjon ved flow-cytometri før HTS, iii) og tidseffektiv som rensetrinnet er forholdsvis kort (~ 30 min), og kan utføres med minimal forberedelse. Imidlertid må det bemerkes at analysen presentert i denne studien er basert på bruk av mus primære celler. Sekundær (for bekreftelse formål) og tertiær (endelig godkjenning på mål av interesse) analyser bør gjennomføres etter grunn skjermen for å validere de identifiserte treff. Selv om det kan lett tilpasses til en rekke forskjellige cellelinjer, den farmakologiske effekten av jegdentified treff trenger ytterligere bekreftelse på andre arter (f.eks menneskelige celler - eksempel på tertiær assay) som det er ingen mulige måter å forutse vedvarende effekter mellom arter. I sum, er denne analysen nyttig for identifisering av nye potensielle treff og / eller molekylære mål med mulig å ekstrapolere resultater fra in vitro / dyreforsøk for mennesker.
Selv om det utformet analysen kan utnyttes for både T- og B-celler, er en fordel overdratt til den spesifikke bruken av T-celler i dette tilfellet. TCR aktivering krever vanligvis to stimulering dratt gjennom en primær (for eksempel anti-CD3 eller anti-TCR) og en sekundær ko-aktivering (for eksempel anti-CD28) signal. 25, 26. Det er interessant både anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer kan kjøpes direkte knyttet til overflaten av magnetiske kuler, og kan fjernes fra cellesuspensjonen ved hjelp av en vanlig magnet før tilsetning av than kjemiske forbindelser som skal testes i screening. Som et bibliotek med ukjente kjemiske enheter er i bruk, beholder aktiverte T-celler uten molekyler bundet til sitt TCR-komplekset kan minimalisere eventuell interferens mellom de testede forbindelser og de som er bundet til TCR-bindende sporene. 27 I tillegg fjernes den stimulerende middel etter T-celleaktivering simulerer fysiologiske situasjoner i motsetning til å arbeide med T-celler utsatt for en vedvarende suprafysiologiske TCR aktivering. Sistnevnte situasjon kan være problematisk da det kan overstyre den farmakologiske effekten av en gitt forbindelse, spesielt hvis den ble brukt ved små konsentrasjoner i screening. Da det ikke finnes kommersielt tilgjengelige kuler som utøver den samme virkning på B-celler, ville det være interessant å utføre en HTS i fremtiden å teste om den kontinuerlige tilstedeværelsen av stimulus på B-celler begrenser utførelsen av analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Merck Frosst Oppstart midler fra Université de Montréal. Vi ønsker å takke dr Jean Duchaine og Dominic Salois fra High-throughput plattform ved Institutt for forskning innen immunologi og kreft for deres diskusjon, kommentarer og tilbakemeldinger. Moutih Rafei har en Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior en Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
