Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En fluorescensbaserade lymfocyter analys Lämplig för high-throughput screening av små molekyler

doi: 10.3791/55199 Published: March 10, 2017

Summary

Vi presenterar i den aktuella studien en ny fluorescensbaserad analys med användning av lymfocyter härledda från en transgen mus. Denna analys är lämplig för high-throughput screening (HTS) av små molekyler utrustade med egenskap av antingen inhibering eller främjande av lymfocytaktivering.

Abstract

High-throughput screening (HTS) är för närvarande stöttepelaren för identifiering av kemiska enheter med förmåga att modulera biokemiska reaktioner eller cellulära processer. Med utvecklingen av bioteknik och den höga translationell potential av små molekyler, har ett antal innovativa metoder i läkemedelsutveckling utvecklats, vilket förklarar den återuppväckta intresse för användning av HTS. Onkologiområdet är för närvarande den mest aktivt forskningsområde för drogscreening, med inga större genombrott gjorts för identifiering av nya immunmodulerande substanser som transplantationsrelaterade komplikationer eller autoimmuna sjukdomar. Här presenterar vi en ny in vitro murina fluorescensbaserade lymfocyter analys enkelt anpassas för identifiering av nya immunmodulerande föreningar. Denna analys använder T- eller B-celler som härrör från en transgen mus, i vilken Nur77 promotom driver uttryck av GFP på T- eller B-cell-receptorstimulering. Eftersom GFP intensitet återspeglar denaktivering / transkriptionell aktivitet av målcellen, definierar vår assay ett nytt verktyg för att studera effekten av given förening (ar) på cellulära / biologiska responser. Till exempel var en primär screening utfördes med användning av 4,398 föreningar i frånvaro av ett "mål hypotes", vilket ledde till identifiering av 160 potentiella träffar som uppvisar immunmodulerande aktiviteter. Således är lämplig för läkemedelsutveckling program utforskar stora kemiska bibliotek före ytterligare in vitro / in vivo-valideringsstudier användningen av denna analys.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

High throughput screening (HTS) är en beprövad strategi allmänt antagits för identifiering av nya terapeutiska molekyler eller för omplacering av FDA-godkända läkemedel i nya medicinska indikationer. 1 Hittills kan uppnås HTS framgång mätas genom de många tidigare upptäckta droger. Till exempel, används inhibitor lapatinib tyrosinkinaset för behandling av bröstcancer, sitagliptin; en dipeptidylpeptidas-4 (DPP-4) -hämmare som används som ett anti-hyperglykemiskt läkemedlet, och den orala Bcr-Abl-tyrosinkinashämmare dasatinib används för behandling av kronisk myeloisk leukemi representerar några exempel på en lång lista av godkända läkemedel som ursprungligen upptäcktes av HTS. 2 Även om produktiviteten i läkemedelsindustrin har nyligen drabbats av en brist i upptäckten av nya kemiska enheter, kan sannolikheten för en framgångsrik läkemedelsforskning förbättras genom en ökning av antalet preklinisk candidates visar moduler biologiska / biokemiska egenskaper. Följaktligen kan utvecklingen av nya HTS analyser anpassade för fenotypisk screening erbjuder möjligheten att ge viktiga farmakologiska verktyg för upptäckten av nya läkemedels träffar. 3, 4, 5, 6 Dessutom kan HTS nu utföras i en snabbare takt på grund av betydande tekniska omvandlingar under de senaste åren bland annat skräddarsydda flexibla robotinstallationer, nya avläsningsteknik och omfattande miniatyrisering. 2, 7 Bland de faktorer som bidrar till det växande intresset för användningen av fenotypisk screening (aka framåt farmakologi) är uppfattningen att fokusera på funktionella effekter snarare än förenklade reduktionistiska antaganden om molekylära mål (mål baserade screeningprogram / biokemiska reaktioner) är mer troligt att sho w klinisk effekt. Således håller fenotypisk screening löftet att avslöja nya potentiellt terapeutiska föreningar och molekylära vägar som för närvarande icke behandlingsbara sjukdomar. 2

För att korrekt identifiera inhibitorer eller aktivatorer för en given målmolekyl eller cellulär funktion, är en mycket känslig och tillförlitlig analys som krävs för att skilja mellan bona fide träffar och falska positiva. Så, vad som gör en bra analys? Kvaliteten på en given analys måste först bedömas av signal-till-brus-förhållande (reflekteras genom en Z-faktor). 8 andra bör vara tydligt fastställt riktad verkan eller målet på skärmen. Till exempel kan funktionella cellbaserade strategier erbjuda betydande fördelar för receptorscreening i motsats till en analys särskilt utformade för att bedöma ligand-receptorbindning. Anledningen till detta är att den senare metoden inte kan skilja mellan agonist- och antagonistligander.ss = "xref"> 9 Däremot är ett cellbaserat tillvägagångssätt sannolikt att vara mer effektiva som receptorfunktion kan direkt utvärderas i ett biologiskt fenotyp (proliferation, cellcykelstopp, apoptos, och / eller differentieringen). Dock måste det påpekas att biokemiska analyser kan ge betydande fördelar jämfört med fenotypiska analyser som de gör intrång på en specifik intracellulär mål. En väl optimerad biokemisk analys har i allmänhet mindre uppgifter spridning än en fenotypisk screening samtidigt förenkla efteråt utredningar i samband med läkemedlet molekylära verkningsmekanism. Emellertid är den stora nackdelen av mål-baserade eller biokemiska analyser chansen att amplifiera Frekvensen av falskt positiva träffar som kan påverka icke-specifika mål när de testas i ett biologiskt system (förlust av specificiteten ursprungligen studerats i den biokemiska analysen). 10 Även om en väletablerad brytpunkten mellan negativa och positiva träffar kan minimera antalet falska positiva in den primära screeningen, användningen av ett fysiologiskt relevant system för att härma den nativa cellulära miljö såsom intakta celler, hela vävnader eller hela djur fortfarande central för analysens utformning pendeln. Därför möjliggör fenotypisk screening leder upptäckt med önskvärda biologiska / fenotypiska effekter för sjukdomar utan identifierade läkemedelsmål utan förkunskaper om föreningens verksamhet eller verkningsmekanism. 11

Den här studien handlar om utveckling och testning av en optimerad och reproducerbar fenotypisk screening baserad på två viktiga komponenter: en kommersiellt tillgänglig musmodell och en klustrade under familj av kemiska föreningar. Med avseende på djurmodellen, förlitar analysen på användningen av lymfocyter härledda från en musstam (Nur77 GFP) som härbärgerar en bakteriell artificiell kromosom som innehåller en kassett i vilken uttrycket av det grönt fluorescerande protein (GFP) drivs av the Nur77 promotor. 12 Det kännetecknande för denna stimulering är baserad på det faktum att Nur77 är en omedelbar tidig gen uppreglerad efter T-cellreceptor (TCR) eller B-cell receptor (BCR) stimulering. 12 När det gäller screening själva metoden, var en metod som används för att bidra till att undvika screening av triviala analoger samtidigt minimera den tid som behövs för att bedöma ett stort kemiskt bibliotek (> 10 5 föreningar). För att göra detta, var en databas av kemiska föreningar valda av läkemedelskemister använder virtuella screeningverktyg utnyttjas för att identifiera topologiskt liknande föreningar med hjälp av kända aktiva utsäde strukturer som referenser. Detta tillvägagångssätt tillät oss att screena 4,398 föreningar som representerar en total bibliotek med över 136 tusen kemiska enheter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurprotokoll godkändes av Animal Care kommittén Université de Montréal. Möss avlivades genom gradvis inhalation av CO2 tills inga vitala tecken observerades följt av cervikal dislokation. Förfarandet genomfördes av en certifierad person att se till att djuren avlivades på ett humant sätt och i enlighet med rekommendationerna från den kanadensiska rådet om Animal Care.

1. Beredning av splenocyter Medium och flödescytometri buffert

  1. Utför alla steg under en 70% etanol-rengjorda biologiska huva.
  2. Ta 70 ml förvärmda Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medium (kommersiellt tillgängliga och levereras i filtrerade 500 ml volym sterila flaskor) och placera i ett sterilt rör. Den avlägsnade mediet kommer att användas senare i protokollet.
  3. Komplettera de återstående 430 ml av RPMI 1640 1x med 50 ml inaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 5 ml penicillin / streptomycin, 5ml HEPES, 5 ml icke-essentiella aminosyror, 5 ml natriumpyruvat, och 0,05 ml filtrerade (1M) 2-merkaptoetanol.
    OBS: Pre varm splenocyt medium med användning av ett vattenbad inställt på 37 ° C för att undvika värmechockerande celler. Detta är viktigt för att undvika induktion av cellulär apoptos.
  4. För att förbereda flödescytometri buffert, tillsätt 2 ml FBS till 98 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och hålla kylt fram till användning (företrädesvis inom tre dagar).

2. Framställning av splenocyter cellsuspensionen från Nur77 GFP musmjältar

  1. En septically isolera mjälten från en 6-8 veckor gammal kvinna Nur77 GFP mus.
    1. För att uppnå detta, arbeta under sterila huven. Blötlägg offrade mus päls, sax och pincett i 70% etanol.
    2. Lägg musen på sin högra sida, skära in i huden och musklerna i den övre vänstra delen av buken kvadranten. Inspektera snittet området synligt lokalisera mjälte sedan klippa ut. Håll mjälteni splenocyt medium på is tills redo att utföra nästa steg.
  2. Placera mjälten (s) i en 10 cm 2 cellodling petriskål innehållande 5 ml förvärmda splenocyt medium.
  3. Mosa mjälten med användning av en steril spruta kolven tills lösningen är grumlig. En mjälte kollagenmatris bör förbli i slutet av förfarandet.
  4. Efter omfattande mäsk i splenocyter mediet, samla cellsuspensionen och passera det genom en 70 ìm cell sil placerad på en 50 ml rör för att filtrera ut skräp eller blodproppar.
  5. Centrifugera vid 500 x g under 5 min. Efter kassering av supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 2-3 ml i egentillverkade eller kommersiell röda blodkroppar lysbuffert. Efter pipettering (2-3 gånger) låta suspensionen vila i 20-30 sekunder.
  6. Tillsätt 5 ml PBS eller en lämplig buffert om val centrifugera sedan cellsuspensionen i 5 min vid 500 x g.
  7. Avlägsna supernatanten (bör vara röd till färgen eftersom det innehåller lyserade röda bdärvarande celler) och återsuspendera cellpelleten i 2 ml splenocyter medium.
  8. Med användning av en hemocytometer, räkna antalet celler färgade med trypanblått för att skilja mellan levande och döda (nekrotiska) celler.

3. T-cellisolering från splenocyter cellsuspensionen

  1. Centrifugera cellsuspensionen i 5 min vid 500 x g. Återsuspendera cellerna i serumfritt RPMI-medium (50 ml från steg 1,3) för att erhålla en cellulär koncentration av 10 x 10 6 celler / ml.
  2. Överföra celler till en 5 ml polystyrenrör och avsätta en 100 mikroliter alikvot av splenocyter för renhet utvärdering / jämförelse i slutet av reningssteget.
  3. Lägga normalt råttserum till cellsuspensionen vid 50 pl / ml följt av T-cellisolering antikroppscocktail (50 | il / ml).
  4. Blanda cellsuspensionen och låt den vila i 10 min. Detta steg gör att antikroppen cocktail att binda alla oönskade celler.
  5. Tillsätt streptavidin snabba sfärer (magnetic pärlor) under 2,5 min, sedan bringa volymen till 2,5 ml med användning av det serumfria mediet.
  6. Placera röret i en cellisolering magnet för 3 min.
  7. Överför cellsuspensionen T i en ny polystyrenrör genom att hålla magneten och hälla ut lösningen i ett drag.
    OBS: Den isolerade suspensionen innehåller de renade T-celler. Alla oönskade celler hålls på den sida av röret bundet till de magnetiska streptavidinpärloma.
  8. Räkna de isolerade T-celler med användning av trypanblått och en hemocytometer.
    OBS: I detta steg kan verifieras renheten hos isolerade T-celler (tillval) genom att analysera andelen CD3 + händelser före och efter T-cell isolering genom flödescytometri. 13
    1. I korthet centrifug 1 ml splenocyt cellsuspensionen vid 500 x g. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i flödescytometri-buffert vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml.
    2. Lägga fluorescent-märkt anti-mouse CD3-antikropp vid en koncentration av 1: 100. Inkubera vid 4 ° C under 30 min. Tvätta en gång, centrifug och återsuspendera i flödescytometri-buffert (400 | il) för analys med flödescytometri.

4. B-cell isolering från splenocyter cellsuspensionen

  1. Följa samma protokoll som beskrivits för T-celler (steg 3,1-3,8) men med användning av en B-cellisoleringskit. För renhet bedömning använder CD19-antikroppen i stället för CD3-antikroppen. 13
    1. Renhet bedömning (tillval) använder CD19 antikroppen i stället för CD3-antikroppen. Centrifugera 1 ml splenocyt cellsuspensionen vid 500 x g. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i flödescytometri-buffert vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml.
    2. Lägg fluorescent taggade anti-mus-CD19-antikropp vid en koncentration av 1: 100 och inkubera vid 4 ° C under 30 min. Tvätta en gång, centrifug och återsuspendera i flödescytometri-buffert (400 | il) for analys med flödescytometri.

5. T-cellsaktivering och Induktion av GFP uttryck

  1. Seed T-cellerna, i suspension, i en rundbottnad platta med 96 brunnar i en koncentration av 2,5 x 10 5 celler / brunn.
  2. Lägg rekombinant interleukin (IL) -7 vid 2 ng / ml och CD3 / CD28 magnetiska pärlor (25 | il / 10 6 celler). Behålla en del av T-cellerna obehandlade med pärlor för att tjäna som en negativ kontroll för senare mätningar som representerar icke-aktiverade T-celler.
  3. Tolv timmar senare, skörda T-celler från den 96-brunnar genom att försiktigt pipettera cellsuspensionen i varje brunn upp och ner för att bryta eventuella bead-cellkomplex / aggregat. Samla avstängning från alla brunnar i en 5 ml polystyren rör.
  4. Placera röret innehållande suspensionen i samma cell isolering magnet som tidigare använts för rening av T eller B-celler och låt den vila i fem minuter.
  5. Överför T cellsuspensionen intoa nya polystyrenrör genom att hålla magneten och hälla ut lösningen i ett drag.
  6. Centrifugera cellerna vid 500 xg under 5 min. Återsuspendera cellerna i färskt splenocyter medium för att få en koncentration av 2 x 10 6 celler / ml.
  7. Bedöma GFP uttryck intensiteten genom flödescytometri (tillval för kvalitetskontroll) vid 12 till 24 h efter stimulering i jämförelse med icke-aktiverade T-celler. 12
    OBS! GFP fluorescens är inneboende till Nur77 GFP T-celler och manifesteras vid lyckad aktivering av TCR. 12
  8. För bedömning av viabilitet och aktivering (valfritt) genom mikroskopi, färga de aktiverade celler med Hoechst 30 min före analys vid en koncentration av 0,2 | ig / ml. Lägg tillräcklig volym av cellsuspensionen till en locket eller en brunn i en flatbottnad svart-sidig 384-brunnar och undersöka under fluorescensmikroskop för att bedöma levande celler. Döda celler kommer inte att behålla kärnfärgning. 14

6. B-cellsaktivering och induktion av GFP uttryck

  1. Med användning av en T-25 odlingskolv, återsuspendera de isolerade B-cellerna vid 1 x 10 6 celler / ml.
  2. Lägg anti-mus-IgG / IgM (H + L) vid 10 pl / ml och rekombinant CD40L vid en koncentration av 200 ng / ml. Behålla en del av de B-celler obehandlade för att tjäna som en negativ kontroll för senare mätningar (som representerar icke-aktiverade B-celler).
  3. Bedöm GFP uttryck intensitet genom flödescytometri på 12 eller 24 timmar efter stimulering i jämförelse med icke-aktiverade B-celler.
    OBS! GFP fluorescens är inneboende till Nur77 GFP B-celler och manifesteras vid lyckad aktivering av BCR. 12
  4. För bedömning av viabilitet och aktivering (valfritt) genom mikroskopi, färga de aktiverade celler med Hoechst 30 min före analys vid en koncentration av 0,2 mikrogram / ml. Lägga lämplig volym av cellsuspension tillett täckglas eller till en brunn i en flatbottnad svart-sidig 384-brunnars platta och undersöka, under ett fluorescensmikroskop för att bedöma levande celler. Döda celler kommer inte att behålla nukleär färgning. 14

7. högkapacitetstestning av små molekyler

  1. Bered en cellsuspension på 2 x 10 6 celler / ml av de aktiverade T eller B-celler (magnetiska pärlor eller antikroppar / CD40L) eller icke-aktiverade grupper.
  2. Plate 75000 celler / brunn i en 384-brunnsplatta (volym av 40 mikroliter). Använd en flatbottnad svart-sidig 384-brunnar eller ett mikroskop locket för livskraft och aktivering bedömning fluorescensmikroskopi (valfritt kvalitetskontroll steg före HTS) med hjälp av Hoechst fläcken (se steg 5.8 och 6.4 för detaljer). 14
  3. Manuellt eller med användning av ett automatiserat system, tillsätt de utvalda läkemedel (löst i 0,5% DMSO) till varje brunn.
  4. Lägg fordonet (DMSO) till positiv (aktiverat) och negativa (icke-ACTIras) kontrollbrunnar. Justera DMSO-koncentrationen till ett maximum av 0,5%.
  5. Inkubera plattorna under 24 h (eller inkubationstid på val) vid 37 ° C och 5% CO2.
  6. På dagen för screening, späd Hoechst 33342 färglösningen (1:. 3333; för t ex lägga till 10 mikroliter till cellerna i de 384-brunnsplattor för att generera en total volym till 50 mikroliter). Färga 30 min innan GFP-analys genom tillsats av Hoechst lösning för att uppnå en koncentration av 0,2 mikrogram / ml.
  7. pipett försiktigt cellerna upp och ned för att erhålla en homogen fördelning i varje brunn.
    Anmärkning: Detta steg är viktigt i fallet med utmatning av läkemedel (steg 7,3) med användning av ett automatiserat system som de celler som tenderar att ackumuleras på den ena sidan av brunnen, motsatt riktningen av flödet.
  8. Snurra plattorna vid 45 xg under 3 min vid rumstemperatur.
  9. Lämnar plattorna att vila under 15 min vid rumstemperatur.
  10. Utför skylt (ar) avläsningar med hjälp av automatiserade konfokala hög innehållsskärmningsmedel (HCS) -system. 15 Ladda plattan till maskinen. Ställ in mål på 40X eller större förstoring. Använd kamera # 4 för Hoechst (UV-lampa) och kamera # 1 för GFP (laser 488). Ställ in maskinen att läsa 6-10 fält per brunn. Justera maskinen på två sekventiella läsningar per fält vid 488 nm (för att läsa GFP) och UV-ljus (att läsa Hoechst). Ställ in mål på 40X eller större förstoring.
    OBS: Systemet är ett datoriserat mikroskop som inte kräver några justeringar. Brännvidden, intensiteten hos det infallande ljuset och exponeringstiden är alla inställnings automatiskt av maskinen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Utformning av HTS-analysen

Två viktiga faktorer beaktas vid utformningen av häri fluorescenstest. Först var vi tvungna att replikera ett fysiologiskt tillstånd där T- eller B-cellsaktivering skulle innebära en sjukdom (t.ex. graft-versus-host disease). För det andra bör utföras bedömning av cellulär aktivering med användning av en känslig och kvantitativ metod. Fluorescens är numera en av de primära valet för HTS avläsningar som motsvarar dessa behov. 10, 16 Som en robust GFP utläsning kan erhållas efter Nur77 GFP härledd T eller B-cellsstimulering både in vitro eller in vivo, 12 vår analys utnyttjas denna strategi för att skilja mellan icke-aktiverade och aktiverade celler som en arbetsmodell för iDENTIFIERING av immunmodulerande föreningar.

Ursprungligen var utformningen av vår analys baserad på GFP bedömning flödescytometri med användning av ofraktionerade stimulerade splenocyter. I detta fall är både icke-aktiverade / aktiverade T- och B-celler färgades med anti-CD3 eller anti-CD19, respektive före GFP bedömning. Såsom visas i figur 1 A, T-celler (CD3 + celler) utgör cirka 30% av en given musmjälte. Vid steady state var GFP-nivån inom området från 10% (mest sannolikt på grund av post-tymisk urval genom TCR under utveckling eller homeostatiska stimulering i periferin). Följande TCR-stimulering med användning av CD3 / CD28-pärlor tillsattes en 5-6-faldig ökning av den procentuella andelen GFP-uttryck (57% i stället för 10%) detekterades i CD3 + T-celler (figur 1 A - B). Likaså B-celler (CD19 + celler) utgör 50-55% av den totala splenocyter och deras basala GFP expression är jämförbar med icke-aktiverade T-celler (t.ex. ~ 10%, Figur 1C). Intressant dock BCR stimulering med användning av anti-mus-IgG / IgM och rekombinant CD40L utlöste en trivial ökning av GFP uttryck (33% i stället för 12%, Figur 1C - D). Eftersom GFP uttryck är en nyckelfaktor för att bedöma den farmakologiska effekten av screenade små molekyler på aktiverade T eller B-celler, optimerar dess intensitet är centralt för känsligheten och framgång för screening.

Bedömning av GFP-uttryck med användning av renade T eller B-celler

Även T- och B-cellsstimulering kan åstadkommas direkt med hjälp av ofraktionerade splenocyter, GFP uttryck intensiteten var inte tillräckligt känslig för screening, särskilt om avläsningar ska utföras av mikroskopi. För att förbättra det cellulära svaret, var T-celler först renades genom magnetiskpärlor med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (Figur 2A). Som tidigare visas med ofraktionerade splenocyter, var 10% av isolerade CD3 + T-celler GFP positiv (basal uttryck). I detta sammanhang, T-cellstimulering med hjälp av CD3 / CD28-pärlor förbättrats avsevärt deras GFP respons (Figur 2A - 2B, 86% i motsats till 57% när ofraktionerade splenocyter användes). Liknande förbättringar erhölls med B-celler (figur 2C - 2D, 80% i stället för 33%). Dessa resultat visar tydligt att användningen av renade T-och B-celler maximerar GFP-uttryck, som är lämplig för den föreslagna fenotypisk screening.

Schematisk beskrivning av utformade HTS-analysen

Totalt sett kan analysen vara uppdelad i fyra huvuddelar (Figur 3). I fallet med T-celler till exempel, en splenocytercell suspension framställs för att rena T-celler (steg 1-3) följt av en 12 h stimulering steg in vitro med hjälp av CD3 / CD28 pärlor (steg 4-5). Aktiverade T-celler stryks sedan och odlades under 24 timmar med små molekyler av val i 384-brunnsplattor (steg 6-7) innan bedömningen av GFP och Hoechst intensiteter med hjälp av automatiserade HCS systemet. Samma analys skulle kunna användas för B-celler med modifieringar som utförs vid stegen 4-5. I korthet kan B-celler stimuleras med anti-mus-IgG / IgM och rekombinant CD40L i stället för pärlor. Eftersom dessa komponenter används i sin löslig form (t.ex. som inte är kopplade till pärlor), kan B-celler inkuberas under 12 timmar sedan helt enkelt tvättas före plätering i 384-brunnsplattor för screening process.

Effektiv T-cellöverlevnad är primordial för framgång HTS studien. Följaktligen kan två begränsande faktorer hindra kvaliteten hos analysen och bör tas i beaktande. Först, Murina T-celler är mycket mottagliga för apoptos efter stimulering in vitro. 17 För det andra, alla testade föreningar utspädd i en DMSO-lösning, som kan lägga till en andra stressfaktor. För att minimera cellförlust, rekombinant IL-7 (2 ng / ml) kompletterades till T-celler vid TCR-stimulering vid stegen 4-5. Detta homeostatisk cytokin stödjer spridning och förbättrar T-cellöverlevnad genom uttrycket av anti-apoptotiska molekyler såsom Bcl-2, Bcl-xL och Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22

Primära high throughput screening av 4,398 föreningar avslöjar flera aktivatorer och inhibitorer av T-cellaktivering

En high throughput screening utfördes genom utstrykning 75000 av icke-aktiverade (negativ control) eller aktiverade T-celler (positiv kontroll) såsom visas i Figur 4. För att säkerställa hög reproducerbarhet, utfördes analysen genomfördes flera gånger med en erhållen Z faktor på 0,87 (fig 5A). Med användning av HCS-systemet, den observerade GFP expression av stimulerade T-celler var 20 gånger högre än ostimulerade T-celler som möjliggör genereringen av en '' fönster handlings '' zon där GFP inhiberande föreningarna lätt kunde detekteras (figur 5A). Detta visas i figuren i termer av antalet fluorescerande celler delat med det totala antalet celler i de avsökta fält. I det i figur 5A exempel screening av 320 föreningar presenterade tre föreningar (pekade-out av röda pilar) förmåga att inhibera GFP uttryck med 1,5-2,5 veck. I detta exempel, var den positiva kontrollen värdet 0,44 ± 0,02 och den negativa kontrollen var 0,02 ± 0,00.

the screening av totalt 4398 föreningar (Z faktor 0,85) utfördes sedan. Föreningarna valdes av läkemedelskemister som utsädes / representativa föreningar baserade på deras kemiska struktur som representerar en total kemisk bibliotek innehållande 136.000 enheter (Figur 5B). Vid slutet av analysen, analys av GFP hämning identifierat föreningar med förmåga att antingen hämma (positiva avvikare) eller öka GFP-uttryck (negativa avvikare).

Figur 1
Figur 1: Analys av T- och B-cells GFP uttryck efter TCR eller BCR aktivering genomförs på ofraktionerade splenocyter. (A) Representativa flödescytometri-analys av T-celler färgade med en anti-CD3-antikropp med användning av splenocyter i frånvaro (övre vänster fält) eller närvaro av CD3 / CD28-pärlor (övre höger panel). GFP-uttryck för både T-cellgrupper visaspå botten. (B) Procent av GFP uttryck erhålls genom flödescytometri-analys av T-celler. Felstaplar representerar medelvärde ± SD. (C) På liknande sätt som (A) förutom att splenocyter aktiverades med användning av anti-mus-IgG / IgM och rekombinant CD40L färgades sedan för CD19. (D) Procent av GFP uttryck erhålls genom flödescytometri-analys av B-celler. Felstaplar representerar medelvärde ± SD. Alla experiment som visas upprepades åtminstone tre gånger (n = 5 / grupp; * P <0,05 och *** P <0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Analys av GFP uttryck med hjälp av renat T eller B-celler efter TCR eller BCR aktivering respektive. (A) Represdare flödescytometri-analys av renade T-celler färgade med en anti-CD3-antikropp. För GFP induktion ades renade T-celler stimuleras med hjälp av CD3 / CD28 pärlor (övre högra panelen). Icke-aktiverade kontroll T-celler visas längst upp till vänster. GFP-uttryck av både icke-aktiverade och aktiverade T-celler visas längst ner. (B) Procent av GFP uttryck erhålls genom flödescytometri-analys av T-celler. Felstaplar representerar medelvärde ± SD. (C) På liknande sätt som (A) förutom att renheten hos B-celler bedömdes genom CD19-färgning och aktiveras med användning av anti-mus-IgG / IgM och rekombinant CD40L. (D) Procent av GFP uttryck erhålls genom flödescytometri-analys av B-celler. Felstaplar representerar medelvärde ± SD. Alla experiment som visas upprepades åtminstone tre gånger (n = 5 / grupp och *** P <0,001). Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Total schematiskt diagram som representerar de olika stegen i fenotypisk screening. Det finns 7 viktiga steg som krävs för att förbereda HTS-analysen. En kvinnlig Nur77 GFP mus offras för att isolera sin mjälte (steg 1). Efter genereringen av en splenocyter cellsuspensionen (steg 2), T-celler negativt isolerades (genom utarmning av oönskade celler) med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (steg 3). Isolerade T-celler inkuberas sedan med rekombinant IL-7 i avsaknad eller närvaro av CD3 / CD28-pärlor i rundbottnad 96-brunnars platta vid 37 ° C (steg 4). Tolv timmar senare (steg 5), är T-celler pipetteras flera gånger för att få bort eventuella aggregat före pärlor avlägsnande som använder samma cellisolering magnet används ursprungligen för T-cell-rening. Isolerade T-celler såddes sedan i 384-brunnsplattor (75 000 cells / brunn, steg 6) med föreningarna i ytterligare 24 timmar (steg 7). Följande dag, inkuberas celler färgas med Hoechst 30 min före analys genom HCS-systemet (steg 8). Samma set-up kan vara följas upp för framställning av en B-cell-baserad analys, förutom att steg 4 och 5 är för att ersättas med en enkel tvättning som stimulatorerna tillsättes i lösliga former. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: Layout för plätering av T-celler i en 384-brunnsplattor. Varje platta som används i analysen innehöll tre grupper. I den första gruppen, var brunnar laddad med icke-aktiverade T-celler (negativ kontroll för GFP på varje sida av plattan, brunnarna A1-P1 och A24-P24), medan den andra gruppen innehöll aktiverade T-celler utan drugs (positiv kontroll för GFP, brunnar A2-P2 och A23-P23). Alla återstående brunnar innehåller aktiverade T-celler kompletterade med de kemiska enheter som används i screeningen. Alla brunnar innehöll 0,5% DMSO. Exempel på GFP och Hoechst signaler visas för icke-aktiverade och aktiverade T-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Primär fenotypisk screening. (A) Ett representativt exempel på en primär screening utfördes på 320 föreningar. Icke-aktiverade T-celler är nästan GFP null i motsats till TCR-stimulerade T-celler, vilka uppvisar 20-faldigt högre uttryck av GFP. (B) Ackumulerade data för alla föreningar screenas med användning av analysen. GFP uttryck visar föreningar displaying hämmande verkan medan andra föreningar beter sig som T-cell-stimulatorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flera avläsnings metoder har utnyttjats för utveckling av känsliga och pålitliga HTS-analyser. Dessa inkluderar kolorimetriska, luminiscerande eller fluorescerande metoder. Även om kolorimetriska metoder är enkla att installera, kräver de flera tillsatser av kemikalier, som kan störa eller störa cellerna testas. 23 Dessutom har de inte tillåta dynamisk bedömning av ett biologiskt svar som den farmakologiska effekten bedöms vid en specifik endpoint. Dessutom kan denna metod kräver dyra robotarmar om automatiserade HTS används. Dessa faktorer gör kolorimetriska avläsningar mindre förenligt med målet HTS på grund av deras besvärliga krav och låg känslighet. 23 Även luminiscens har föreslagits som ett alternativ till kolorimetriska analyser, är tillämpningen av dessa självlysande tester i HTS vanligtvis begränsad på grund av kravet på cellys. Även om andra icke-lys protokoll frånutvecklats, intensiteten i mareld signalen kan hindras av många faktorer såsom luciferin absorption, tillgänglighet av co-faktorer, pH, och insyn i odlingsmedia eller buffert, vilket skillnader mellan detekterade mareld signaler och faktiska förändringar i cellulär aktivitet. 24 Följaktligen har de flesta analyser är baserade på fluorescensmetoder. I själva verket var fluorescensbaserade analyser utvecklades initialt med användning av små, mycket-fluorescerande organiska molekyler med förmåga att övervaka en mängd olika cellulära processer vid cellaktivering. Sammanfattningsvis fluorescerande analyser har högre känslighet och kan enkelt anpassas för fenotypiska mätningar under HTS. 23

Den framkallade fluorescensbaserade HTS analys som presenteras här har tre stora fördelar. Det första är det mycket tillförlitlig, reproducerbar och har antagits för screening av föreningar med förmåga att modulera två olika primära celler (T och B-lymfocyter) med användning av samma stimulation / utläsning koncept. Till exempel, den första undersökningen av 4,398 föreningar, som avslutades under fem olika körningar visade en konsekvent aktivering-inducerad GFP signal med minimal intra och inter-analys variabilitet (<5% och <15%, respektive för T-cellanalys). För det andra använder analysen ett kommersiellt tillgängligt transgen musmodell. Vanligtvis, utformningen av en fluorescensbaserad analys kräver genteknik av primära celler eller en cellinje av intresse i syfte att visa en fluorescerande signal vid stimulering. Även om detta tillvägagångssätt genererar ett värdefullt laboratorium verktyg, är det i allmänhet inte är lätt tillgängliga för forskarsamhället. Att kringgå denna begränsning, har T- och B-celler isoleras från Nur77 GFP transgena möss. Fördelen med dessa lymfocyter är deras förmåga att uttrycka GFP inom 24 timmar vid TCR eller BCR stimulering. Därför screening av läkemedel med förmåga att modulera transkriptionsmaskineriet drivande GFP uttryck eller den totala cellulärasvar utgör en tilltalande metod. För det tredje, att komplettera T-celler med CD3 / CD28 pärlor i sin ursprungliga aktiveringsfasen kräver avlägsnandet av dessa pärlor innan GFP bedömning. Detta är viktigt om mikroskopi används för att analysera T-cellsaktivering / inhibering som att lämna pärlorna kommer annars maskera den GFP-signal. Om flödes-cytometri används istället för analysen, skulle pärlor vara kvar i brunnarna (såvida det specifikt skapar ytterligare confounding begränsning (er) till analys) som den specifika populationen av intresse kan gated med användning av både framåt- och sido scatters.

Det ursprungliga målet var att utforma en screeninganalys med minimal cell hantering. Inom ramen för detta sammanhang, aktivering av T- eller B-celler med användning av ofraktionerade splenocyter stimulerade med pärlor eller lösliga antikroppar / rekombinant CD40L respektive var begränsad eftersom en stor andel av lymfocyter förblev GFP negativa (Figur 1). Eftersom detta steg är avgörande för framgångav analysen, varefter protokollet modifieras för att rena T- eller B-celler med användning av kommersiellt tillgängliga kit för att öka de procentuella GFP-uttryckande celler. Detta tillvägagångssätt förbättrats avsevärt aktiverings resultatet av båda cellpopulationer. Även en annan metod för val kan användas för T- och B-cellisolering om så bedöms nödvändigt, är den föreslagna metoden: i) mycket reproducerbar, ii) enkelt anpassas för att bedöma renheten av den isolerade populationen genom flödes-cytometri före HTS, iii) och tidseffektivt som reningssteget är relativt kort (~ 30 min) och kan utföras med minimal beredning. Emellertid måste det noteras att analysen som presenteras i denna studie är baserad på användningen av mus primära celler. Sekundär (för bekräftelseändamål) och tertiära (slutliga valideringen på målet av intresse) analyser ska utföras efter den primära skärmen för att validera de identifierade träffar. Även om det kan lätt anpassas till en mängd olika cellinjer, den farmakologiska effekten av identified träffar behöver ytterligare validering på andra arter (t.ex. mänskliga celler - Exempel på tertiär analys) som det inte finns några möjligheter att förutsäga fördröjd effekt mellan arter. Sammanfattningsvis är denna analys värdefullt för identifiering av nya potentiella hits och / eller molekylära mål med möjlig extrapolering av resultat från i djur vitro-tester / för människor.

Även om det utformade analys kan utnyttjas för både T- och B-celler, är en fördel som den specifika användningen av T-celler i detta fall. TCR aktivering kräver oftast dubbla stimulering ges genom en primär (t.ex. anti-CD3 eller anti-TCR) och en co-aktiverande signal sekundära (t.ex. anti-CD28). 25, 26 Intressant både anti-CD3 och anti-CD28-antikroppar kan köpas direkt kopplade på ytan av magnetiska pärlor, och kan tas bort från cellsuspensionen med en vanlig magnet innan du lägger than kemiska föreningar som ska testas i screeningen. Som ett bibliotek med okända kemiska enheter används, behålla aktiverade T-celler som är fria från molekyler bundna till deras TCR-komplexet kan minimera varje möjlig störning mellan de testade föreningarna och de som är bundna till de TCR-bindningsspåren. 27 Dessutom, ta bort den stimulerande medel efter T-cellsaktivering härmar fysiologiska situationer i stället att arbeta med T-celler som utsatts för en varaktig suprafysiologisk TCR aktivering. Den senare situationen kan vara problematiskt eftersom det kan åsidosätta den farmakologiska effekten av en given förening, särskilt om det användes vid små koncentrationer i screeningen. Eftersom det inte finns några kommersiellt tillgängliga pärlor utövar samma effekt på B-celler, skulle det vara intressant att utföra en HTS i framtiden att testa om den kontinuerliga närvaron av stimulus på B-celler begränsar utförandet av analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Merck Frosst Start-up medel från Université de Montréal. Vi vill tacka Dr. Jean Duchaine och Dominic Salois från hög kapacitet plattform vid Institutet för forskning i immunologi och cancer för deras diskussion, kommentarer och återkopplingar. Moutih Rafei har en Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10, (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7, (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11, (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9, (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17, (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13, (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2, (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18, (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208, (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28, (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163, (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1, (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186, (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9, (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301, (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183, (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157, (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187, (11), 5921-5930 (2011).
En fluorescensbaserade lymfocyter analys Lämplig för high-throughput screening av små molekyler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).More

Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter