Summary
Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.
Abstract
lo screening high-throughput (HTS) è attualmente il pilastro per l'identificazione delle entità chimiche in grado di modulare le reazioni biochimiche o processi cellulari. Con l'avanzamento delle biotecnologie e l'alto potenziale traslazionale di piccole molecole, un certo numero di approcci innovativi nella scoperta di nuovi farmaci si sono evoluti, il che spiega il rinnovato interesse per l'uso di HTS. Il campo oncologico è attualmente l'area di ricerca più attive per lo screening di stupefacenti, senza alcun importante passo avanti fatto per l'identificazione di nuovi composti immunomodulanti di targeting complicazioni trapianto legati o disturbi autoimmuni. Qui, vi presentiamo un romanzo in test di linfociti fluorescente a base murino vitro facilmente adattato per l'identificazione di nuovi composti immunomodulatori. Questo saggio utilizza cellule T o B derivati da un topo transgenico, in cui il promotore Nur77 spinge espressione GFP upon T- o stimolazione del recettore B-cellule. Poiché l'intensità GFP riflette laAttivazione / attività trascrizionale della cellula bersaglio, il nostro saggio definisce un nuovo strumento per studiare l'effetto di dato composto (s) in risposte cellulari / biologiche. Per esempio, uno screening primario è stato eseguito utilizzando 4.398 composti in assenza di un "ipotesi target", che ha portato all'identificazione di 160 potenziali risultati che mostrano attività immunomodulante. Pertanto, l'uso di questo dosaggio è adatto per i programmi di scoperta di nuovi farmaci che esplorano grandi librerie chimiche prima di proseguire in vitro che in vivo studi / validazione.
Introduction
screening ad alto rendimento (HTS) è una strategia collaudata ampiamente adottata per l'identificazione di nuove molecole terapeutiche o per il riposizionamento dei farmaci approvati dalla FDA a nuove indicazioni mediche. 1 Finora, il successo ottenuto HTS può essere misurata dalla pletora di farmaci precedentemente scoperto. Per esempio, l'inibitore lapatinib tirosina chinasi utilizzato per il trattamento del cancro al seno, sitagliptin; un inibitore della dipeptidil peptidasi-4 (DPP-4) inibitore utilizzato come un farmaco anti-iperglicemici, e la Bcr-Abl dasatinib inibitore della tirosin-chinasi orale, usati per il trattamento della leucemia mieloide cronica rappresentano alcuni esempi di una lunga lista di farmaci approvati originariamente scoperti da HTS. 2 Sebbene la produttività dell'industria farmaceutica ha recentemente sofferto di una mancanza nella scoperta di nuove entità chimiche, la probabilità di scoperta di farmaci successo può essere migliorata attraverso un aumento del numero di candida pre-clinicates visualizzazione modulatori proprietà biologiche / biochimiche. Di conseguenza, lo sviluppo di nuovi test HTS adatti per lo screening fenotipico potrebbe offrire il potenziale per fornire importanti strumenti farmacologici per la scoperta di nuovi successi di droga. 3, 4, 5, 6, inoltre, HTS possono ora essere eseguiti a un ritmo più veloce a causa di significative trasformazioni tecnologiche degli ultimi anni inclusi gli impianti progettati su misura flessibili robot, tecnologie di read-out nuovi e ampie miniaturizzazione. 2, 7 Tra i fattori che contribuiscono al crescente interesse per l'uso dello screening fenotipico (aka avanti farmacologia) è la percezione che concentrarsi sugli effetti funzionali, piuttosto che ipotesi riduzioniste semplificate in materia di bersagli molecolari (di screening / reazioni biochimiche di obiettivi) è più probabile per sho w efficacia clinica. Così, lo screening fenotipico mantiene la promessa per scoprire nuovi composti potenzialmente terapeutici e meccanismi molecolari di malattie attualmente incurabili. 2
Per identificare correttamente inibitori o attivatori di un determinato bersaglio molecolare o la funzione cellulare, un saggio altamente sensibile e affidabile è necessario al fine di differenziare tra i colpi in buona fede e falsi positivi. Quindi, ciò che rende un buon test? La qualità di un determinato dosaggio deve essere dapprima giudicato dal rapporto segnale-rumore (riflessa attraverso un fattore Z). 8 In secondo luogo, l'effetto mirato o l'obiettivo dello schermo devono essere chiaramente stabiliti. Ad esempio, gli approcci basati su cellule funzionali in grado di offrire vantaggi significativi per lo screening dei recettori in contrapposizione a un test specificamente progettato per valutare ligando-recettore vincolante. La ragione di questo è che quest'ultimo approccio non può distinguere tra agonisti e antagonisti ligandi.ss = "xref"> 9 Al contrario, un approccio a base di cellule è probabilmente più efficace in funzione del recettore può essere valutata direttamente in un fenotipo biologica (proliferazione, arresto del ciclo cellulare, apoptosi, e / o differenziazione). Tuttavia, si deve notare che saggi biochimici possono fornire vantaggi significativi rispetto saggi fenotipici poiché violano su uno specifico bersaglio intracellulare. Un test biochimico ben ottimizzato in genere hanno meno dispersione dei dati di uno screening fenotipico, semplificando dopo indagini connesse con il meccanismo molecolare della droga di azione. Tuttavia, il grave inconveniente di saggi di obiettivi o biochimica è la possibilità di amplificare il tasso di risultati falsi positivi che possono influenzare obiettivi non specifici quando testato in un sistema biologico (perdita della specificità originariamente studiato nel saggio biochimico). 10 Anche se un punto di cut-off ormai consolidata tra i colpi negativi e positivi può ridurre al minimo il numero di falsi positivi in screening preliminare, l'uso di un sistema fisiologicamente rilevanti mimando l'ambiente cellulare nativo come le cellule intatte, tessuti interi o intero animale rimane il nucleo del pendolo disegno dosaggio. Pertanto, lo screening fenotipico consente scoperta vantaggio con effetti fenotipici biologici / desiderabili per le malattie senza bersagli farmacologici identificati senza avere una conoscenza preventiva di attività o modalità di azione del composto. 11
Lo studio qui riguarda lo sviluppo e la sperimentazione di uno screening fenotipico ottimizzato e riproducibili sulla base di due componenti importanti: un modello di topo disponibile in commercio e un cluster sotto-famiglia di composti chimici. Rispetto al modello animale, il saggio si basa sull'impiego di linfociti derivati da un ceppo di topi (Nur77 GFP) ospitare un cromosoma artificiale batterico contenente una cassetta in cui l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) è azionato da the Nur77 promotore. 12 La caratteristica di questa stimolazione è basata sul fatto che Nur77 è immediatamente gene precoce up-regolata seguente recettore delle cellule T (TCR) o stimolazione del recettore delle cellule B (BCR). 12 Per quanto riguarda il metodo di screening per sé, un approccio è stato utilizzato per contribuire ad evitare la proiezione di analoghi banali riducendo al minimo il tempo necessario per valutare una grande libreria chimica (> 10 5 composti). Per fare ciò, una banca dati di composti chimici selezionati dai chimici medicinali che utilizzano strumenti di screening virtuali è stata sfruttata per identificare i composti topologicamente simili utilizzando note strutture di semi attivi come riferimenti. Questo approccio ci ha permesso di selezioniamo 4.398 composti che rappresentano una libreria complessiva di oltre 136.000 entità chimiche.
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Protocol
Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali della Université de Montréal. I topi sono stati sacrificati da un graduale inalazione di CO 2 fino a quando non segni vitali sono stati osservati seguiti da dislocazione cervicale. La procedura è stata effettuata da una persona certificata per garantire che gli animali sono stati sacrificati in modo umano e secondo le raccomandazioni del Consiglio canadese sulla cura degli animali.
1. Preparazione di splenocyte Medium e citometria a flusso Buffer
- Eseguire tutti i passaggi sotto una cappa biologica 70% di etanolo-pulito.
- Rimuovere 70 ml di pre-riscaldato Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x medio (disponibile in commercio e fornito in filtrati 500 bottiglie sterili ml di volume) e posto in una provetta sterile. Il mezzo rimosso sarà utilizzato in seguito nel protocollo.
- Supplemento per il restante 430 ml di RPMI 1640 1x con 50 ml inattivato siero fetale bovino (FBS), 5 ml di penicillina / streptomicina, 5mL HEPES, 5 ml aminoacidi non essenziali, 5 mL piruvato di sodio e 0,05 mL filtrati (1M) 2-mercaptoetanolo.
NOTA: medio splenocyte Pre-caldo con un bagno d'acqua a 37 ° C per evitare le cellule di calore scioccante. Questo è importante per evitare induzione di apoptosi cellulare. - Per preparare il buffer di citometria a flusso, aggiungere 2 ml di FBS al 98 ml di tampone fosfato salino (PBS) e conservare in frigorifero fino al momento dell'uso (preferibilmente entro tre giorni).
2. Generazione di splenocyte cellulare sospensione da Nur77 GFP mouse milze
- Un septically isolare la milza da un 6-8 settimane di età femminile del mouse Nur77 GFP.
- Per raggiungere questo obiettivo, lavorare sotto cappa sterile. Mettere a bagno i sacrificati del mouse pelliccia, forbici e pinze in etanolo al 70%.
- Posare il mouse sul lato destro, tagliare la pelle ed i muscoli nel quadrante in alto a sinistra addominale. Controllare l'area di incisione per individuare visibilmente la milza poi tagliato fuori. Mantenere la milzain medium splenocyte in ghiaccio fino ad eseguire il passaggio successivo.
- Posizionare la milza (s) in 10 cm 2 cella cultura piatto Petri contenente 5 ml di terreno splenocyte pre-riscaldato.
- Schiacciate la milza utilizzando uno stantuffo siringa sterile fino a quando la soluzione è torbida. Una matrice di collagene milza deve rimanere entro la fine della procedura.
- In seguito a un'ampia mashing in media splenocyte, raccogliere la sospensione cellulare e farla passare attraverso un colino cella di 70 micron posto su un tubo da 50 ml per filtrare-out eventuali detriti o coaguli.
- Centrifugare a 500 g per 5 min. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 2-3 ml di tampone di lisi di produzione interna o commerciale globuli rossi. A seguito di pipettaggio (2-3 volte) lasciare che il resto sospensione per 20-30 s.
- Aggiungere 5 ml di PBS o un tampone adatto di scelta quindi centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g.
- Rimuovere il surnatante (dovrebbe essere di colore rosso in quanto contiene lisati rosso bcellule Lood) e risospendere il pellet cellulare in 2 ml di terreno splenocyte.
- Utilizzando un emocitometro, contare il numero di cellule colorate con trypan blu per distinguere tra le cellule necrotiche (vivi e morti).
3. Isolamento cellule T dalla cella di sospensione splenocyte
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 500 x g. Risospendere le cellule in terreno RPMI privo di siero (50 ml dal punto 1.3) per ottenere una concentrazione cellulare di 10 x 10 6 cellule / ml.
- Trasferire le cellule in una provetta da 5 polistirene ed annullare una un'aliquota di 100 ml di splenociti di purezza valutazione / confronto alla fine della fase di purificazione.
- Aggiungere siero normale topo per la sospensione cellulare a 50 microlitri / ml seguito da T anticorpi isolamento cellulare cocktail (50 microlitri / ml).
- Mescolare la sospensione cellulare e lasciare riposare per 10 minuti. Questo passaggio consente il cocktail di anticorpi di legarsi tutte le cellule indesiderate.
- Aggiungere le sfere rapidi streptavidina (magneteperline ic) per 2,5 min, quindi portare il volume a 2,5 ml utilizzando il mezzo privo di siero.
- Posizionare il tubo in un magnete isolamento delle cellule per 3 min.
- Trasferire la sospensione cellulare T in un nuovo tubo polistirene tenendo il magnete e versando la soluzione in un movimento.
NOTA: La sospensione isolato contiene le cellule T purificate. Tutte le cellule indesiderate si svolgono sul lato del tubo legato alle perline streptavidina magnetiche. - Contare le cellule isolate T utilizzando trypan blu e un emocitometro.
NOTA: A questo punto la purezza delle cellule T isolate può essere verificata (opzionale) analizzando la percentuale di CD3 + eventi prima e dopo l'isolamento delle cellule T da citofluorimetria. 13- Brevemente, centrifuga 1 ml di sospensione cellulare splenocyte a 500 x g. Eliminare il supernatante e sospendere le cellule in tampone di flusso-citometria ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml.
- Aggiungere fluorescente-tag anti-mousanticorpi e CD3 ad una concentrazione di 1: 100. Incubare a 4 ° C per 30 min. Risciacquare una volta, centrifugare e risospendere in tampone di flusso-citometria (400 mL) per l'analisi mediante citometria a flusso.
4. L'isolamento delle cellule B della cella sospensione splenocyte
- Seguire lo stesso protocollo descritto per le cellule T (passi 3,1-3,8), ma utilizzando un kit di isolamento B-cellule. Per la valutazione purezza, utilizzare l'anticorpo CD19 invece che l'anticorpo CD3. 13
- Per la valutazione purezza (opzionale), utilizzare l'anticorpo CD19 invece che l'anticorpo CD3. Centrifugare 1 ml di sospensione cellulare splenocyte a 500 x g. Eliminare il supernatante e sospendere le cellule in tampone di flusso-citometria ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml.
- Aggiungere fluorescente etichettato antitopo-anticorpo CD19 ad una concentrazione di 1: 100 e incubare a 4 ° C per 30 min. Lavare una volta, centrifugare e risospendere in tampone citometria a flusso (400 ml) FOanalisi R da citofluorimetria.
5. L'attivazione delle cellule T e l'induzione di espressione GFP
- Seme le cellule T, in sospensione, in una piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a una concentrazione di 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto.
- Aggiungere interleuchina ricombinante (IL) -7 a / ml e CD3 / CD28 perline 2 ng magnetiche (25 ml / 10 6 celle). Mantenere una parte delle cellule T non trattate con perline per servire come controllo negativo per misurazioni successive che rappresentano le cellule T non attivati.
- Dodici ore dopo, raccogliere le cellule T dalla piastra a 96 pozzetti pipettando delicatamente la sospensione cellulare in ciascun pozzetto su e giù per rompere le complesse tallone cellule / aggregati. Raccogliere la sospensione da tutti i pozzetti in una provetta di polistirolo 5 ml.
- Posizionare il tubo contenente la sospensione all'interno del magnete stesso isolamento cellulare precedentemente utilizzato per la purificazione delle cellule T o B e lasciare riposare per 5 min.
- Trasferire la sospensione di cellule T intOA nuovo tubo di polistirene tenendo il magnete e versando la soluzione in una sola mossa.
- Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreno splenocyte fresca per ottenere una concentrazione di 2 x 10 6 cellule / ml.
- Valutare GFP intensità di espressione da citofluorimetria (opzionale per il controllo di qualità) a 12 a 24 ore post-stimolazione in confronto con le cellule T non attivati. 12
NOTA: La fluorescenza GFP è intrinseca alle cellule Nur77 GFP T e si manifesta all'attivazione successo del TCR. 12 - Per la valutazione della vitalità e attivazione (opzionale) mediante microscopia, macchiare le cellule attivate con Hoechst 30 minuti prima dell'analisi ad una concentrazione di 0,2 mg / ml. Aggiungere adeguato volume di sospensione cellulare ad una diapositiva copertura o ad un pozzetto di una piastra a 384 pozzetti nero-sided a fondo piatto ed esaminare al microscopio a fluorescenza per valutare le cellule viventi. Le cellule morte non manterranno nuclearecolorazione. 14
6. L'attivazione delle cellule B e l'induzione di espressione GFP
- Utilizzando un pallone di coltura T-25, risospendere le cellule B isolate a 1 x 10 6 cellule / ml.
- Aggiungere anti-topo IgG / IgM (H + L) a 10 microlitri / ml e CD40L ricombinante ad una concentrazione di 200 ng / mL. Mantenere una parte delle cellule B non trattate per servire come controllo negativo per misurazioni successive (rappresentando cellule B non attivati).
- Valutare GFP intensità di espressione da citofluorimetria a 12 o 24 ore post-stimolazione in confronto con le cellule non attivati B.
NOTA: La fluorescenza GFP è intrinseco alle cellule Nur77 GFP B e si manifesta all'attivazione successo del BCR. 12 - Per la valutazione della vitalità e attivazione (opzionale) mediante microscopia, macchiare le cellule attivate con Hoechst 30 minuti prima dell'analisi ad una concentrazione di 0,2 mg / mL. Aggiungere un adeguato volume di sospensione cellulare perun vetrino di copertura o per un pozzo di una piastra a 384 pozzetti nero-sided a fondo piatto ed esaminare al microscopio a fluorescenza per valutare le cellule viventi. Le cellule morte non mantengono la colorazione nucleare. 14
7. High Throughput Screening di piccole molecole
- Preparare una sospensione di cellule a 2 x 10 6 cellule / ml delle cellule T o B attivate (sfere magnetiche o anticorpi / CD40L) o gruppi non attivati.
- Piastra 75.000 cellule / pozzetto in una piastra da 384 pozzetti (volume di 40 mL). Utilizzare una piastra a 384 pozzetti nero-sided a fondo piatto o un vetrino da microscopio copertura per la vitalità e l'attivazione di valutazione al microscopio a fluorescenza (fase di controllo della qualità opzionale prima di HTS) usando Hoechst macchia (vedere i passaggi 5.8 e 6.4 per i dettagli). 14
- Manualmente o tramite un sistema automatizzato, aggiungere i farmaci di scelta (disciolto in 0,5% DMSO) in ciascun pozzetto.
- Aggiungere il veicolo (DMSO) a positivo (attivato) e negativo (non activato) pozzetti di controllo. Regolare la concentrazione DMSO ad un massimo dello 0,5%.
- Incubare le piastre per 24 h (o l'incubazione momento della scelta) a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Il giorno dello screening, diluire la soluzione 33342 macchia Hoechst (1:. 3.333; per esempio, aggiungere 10 microlitri di cellule in piastre da 384 pozzetti per generare un volume totale di 50 microlitri). Stain 30 min prima dell'analisi GFP aggiungendo soluzione Hoechst per ottenere una concentrazione di 0,2 mg / mL.
- Delicatamente pipetta le cellule su e giù per ottenere una distribuzione omogenea in ciascun pozzetto.
NOTA: Questo passaggio è importante in caso di erogazione dei farmaci (passo 7.3) utilizzando un sistema automatico le cellule tendono ad accumularsi su un lato del pozzo, opposta alla direzione del flusso. - Spin le piastre a 45 xg per 3 min a temperatura ambiente.
- Lasciare le piastre a riposo per 15 min a temperatura ambiente.
- Eseguire piastra (s) read-out, utilizzando i confocale SCRE automatizzati ad alto contenutoSistema zare (HCS). 15 Caricare la lastra alla macchina. Impostare l'obiettivo a 40X o superiore ingrandimento. Usa fotocamera # 4 per Hoechst (lampada UV) e fotocamera # 1 per GFP (laser 488). Impostare la macchina per leggere 6-10 campi per bene. Regolare la macchina per fare due letture sequenziali per campo a 488 nm (per leggere GFP) e ai raggi UV (per leggere Hoechst). Impostare l'obiettivo a 40X o superiore ingrandimento.
NOTA: Il sistema è un microscopio computerizzato che non richiede alcuna regolazione. La distanza focale, l'intensità della luce incidente e il tempo di esposizione sono tutti configura automaticamente dalla macchina.
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Representative Results
Progettazione del saggio HTS
Due fattori importanti sono stati presi in considerazione quando si progetta il test qui fluorescente. In primo luogo, abbiamo bisogno di replicare una condizione fisiologica in cui l'attivazione delle cellule T o B rappresenterebbe una malattia (ad esempio la malattia del trapianto contro l'ospite). In secondo luogo, la valutazione di attivazione cellulare deve essere effettuata utilizzando un metodo sensibile e quantitativa. La fluorescenza è oggi uno dei la scelta primaria per HTS read-out in quanto corrisponde a queste esigenze. 10, 16 Come un robusto GFP lettura-out può essere ottenuta seguendo Nur77 GFP -derived stimolazione T o cellule B sia in vitro o in vivo, 12 nostra analisi sfruttato questa strategia di distinguere tra cellule non attivate ed attivati come modello di lavoro per l'iIdentificazione del composti immunomodulanti.
In origine, il design del nostro test si è basata sulla valutazione GFP da citofluorimetria utilizzando splenociti stimolati non frazionata. In questo caso, entrambi attivati non cellule / T attivati e B sono colorate con anti-CD3 o anti-CD19, rispettivamente, prima della valutazione GFP. Come mostrato in figura 1A, le cellule T (cellule CD3 +) rappresentano circa il 30% di un dato spleen mouse. Allo stato stazionario, il livello di GFP era nella gamma del 10% (molto probabilmente a causa della selezione post-timica attraverso il TCR durante lo sviluppo o la stimolazione omeostatico nella periferia). Dopo stimolazione TCR usando le sfere / CD28 CD3, un cinque a sei volte aumento della percentuale di espressione GFP (57% invece del 10%) è stata rilevata nelle cellule T CD3 + (Figura 1A - B). Allo stesso modo, le cellule B (cellule CD19 +) rappresentano il 50-55% del totale e la loro splenociti basale GFP expression è paragonabile alle cellule non attivati T (es ~ 10%, Figura 1C). È interessante notare, tuttavia, la stimolazione BCR usando anti-topo IgG / IgM e ricombinante CD40L innescato un aumento banale espressione GFP (33% invece del 12%, Figura 1C - D). Come espressione di GFP è un elemento chiave per valutare l'effetto farmacologico di piccole molecole proiettati sulle cellule T o B attivate, ottimizzando la sua intensità è centrale per la sensibilità e il successo della proiezione.
Valutazione di espressione GFP usando cellule T o B purificati
Sebbene la stimolazione delle cellule T e B può essere ottenuto direttamente usando splenociti non frazionate, l'intensità di espressione GFP non era abbastanza sensibile per lo screening soprattutto se read-out devono essere eseguite al microscopio. Al fine di migliorare la risposta cellulare, le cellule T sono stati purificati mediante magneticaperline usando un kit disponibile in commercio (Figura 2A). Come precedentemente illustrato usando splenociti non frazionate, 10% di cellule T CD3 + isolate erano GFP positive (espressione basale). In questo contesto, la stimolazione delle cellule T usando le sfere CD3 / CD28 ha migliorato significativamente la loro risposta GFP (Figura 2A - 2B, 86% rispetto al 57% quando sono stati usati splenociti non frazionate). Miglioramenti simili sono stati ottenuti con cellule B (Figura 2C - 2D, 80% invece del 33%). Questi risultati dimostrano chiaramente che l'uso di cellule T e B purificate massimizza espressione GFP, che è adatto per lo screening fenotipico proposto.
Schema del saggio HTS progettato
In generale, il dosaggio può essere suddiviso in quattro sezioni principali (Figura 3). Nel caso di cellule T, per esempio, un splenocitisospensione cellulare viene preparato per purificare cellule T (passi 1-3) seguita da una fase di stimolazione 12 h in vitro usando perline CD3 / CD28 (passaggi 4-5). Le cellule T attivate sono poi placcati e coltivate per 24 ore con le piccole molecole di scelta in piastre da 384 pozzetti (passi 6-7) prima della valutazione di GFP e Hoechst intensità utilizzando il sistema HCS automatizzato. Lo stesso test potrebbe essere utilizzato per le cellule B con le modifiche eseguite a passi 4-5. Brevemente, le cellule B possono essere stimolate con anti-topo IgG / IgM e ricombinante CD40L invece di perline. Poiché questi componenti sono utilizzati nella loro forma solubile (ad esempio, non legata a perline), le cellule B possono essere incubate per 12 ore poi semplicemente lavati prima di placcatura in piastre da 384 pozzetti per il processo di screening.
la sopravvivenza delle cellule T efficiente è primordiale per il successo dello studio HTS. Di conseguenza, due fattori limitanti possono ostacolare la qualità del saggio e devono essere presi in considerazione. Primo, Cellule T murine sono molto sensibili alla apoptosi dopo stimolazione in vitro. 17 In secondo luogo, tutti i composti esaminati vengono diluiti in una soluzione DMSO, che potrebbe aggiungere un secondo fattore di stress. Per minimizzare la perdita di cellule, IL-7 ricombinante (2 ng / ml) si aggiungono alle cellule T dopo stimolazione TCR a passi 4-5. Questa citochina omeostatico supporta la proliferazione e migliora la sopravvivenza delle cellule T attraverso l'espressione di molecole anti-apoptotici, come Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1. 18, 19, 20, 21, 22
Throughput screening primario elevato di 4.398 composti rivela diversi attivatori e inibitori di attivazione delle cellule T
A high throughput screening è stata effettuata da placcatura 75.000 non attivato (co negativontrol) o cellule T attivate (controllo positivo) come visualizzato nella Figura 4. Per garantire un'elevata riproducibilità, il test è stato condotto più volte con un fattore Z ottenuto di 0.87 (Figura 5A). Utilizzando il sistema HCS, l'espressione GFP osservata di cellule T stimolate era 20 volte superiore rispetto alle cellule T stimolate consentono la generazione di un '' finestra di azione '' zona dove composti inibitori GFP potrebbe essere facilmente rilevata (Figura 5A). Questo è mostrato nella figura in termini di numero di cellule fluorescenti diviso per il numero totale di cellule nei campi digitalizzati. Nell'esempio mostrato nella Figura 5A, lo screening di 320 composti svelato tre composti (sottolineato-out da frecce rosse) in grado di inibire l'espressione GFP da 1,5-2,5 pieghe. In questo esempio, il valore di controllo positivo era 0,44 ± 0,02 e il controllo negativo era 0,02 ± 0,00.
the proiezione di un totale di 4398 composti (fattore Z di 0,85) è stato quindi condotto. I composti sono stati selezionati da chimici medicinali come composti rappresentativi seme / base alla loro struttura chimica rappresentano una libreria chimica generale contenente 136.000 entità (Figura 5B). Al termine del test, analisi di inibizione GFP identificato composti capaci di inibire o (deviatori positivi) o migliorare l'espressione della GFP (deviatori negativi).
Figura 1: Analisi di T e di espressione GFP cellule B dopo TCR o l'attivazione BCR condotta su splenociti non frazionata. (A) Rappresentante analisi citofluorimetria di cellule T colorate con un anticorpo anti-CD3 usando splenociti in assenza (pannello superiore di sinistra) o presenza di perline CD3 / CD28 (pannello superiore destra). vengono visualizzati espressione GFP per entrambi i gruppi di cellule Tnella parte inferiore. (B) Percentuale di espressione GFP ottenuto con analisi di flusso-citometria di cellule T. Le barre di errore rappresentano SD media ±. (C) Simile a (A), tranne che splenociti sono stati attivati con anti-topo IgG / IgM e ricombinante CD40L poi colorate per CD19. (D) Percentuale di espressione GFP ottenuto con analisi di flusso-citometria delle cellule B. Le barre di errore rappresentano SD media ±. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti visualizzati almeno tre volte (n = 5 / gruppo; * P <0.05 e *** P <0.001). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi di espressione GFP utilizzando T purificato o linfociti B in seguito, rispettivamente, TCR o l'attivazione BCR. Repres (A)entative analisi del flusso-citometria di cellule T purificate colorate con un anticorpo anti-CD3. Per l'induzione GFP, le cellule T purificate sono state stimolate con perline CD3 / CD28 (pannello in alto a destra). le cellule T non attivato di controllo vengono visualizzate nel pannello in alto a sinistra. espressione GFP di entrambe le cellule non attivate e T attivati viene visualizzato nella parte inferiore. (B) Percentuale di espressione GFP ottenuto con analisi di flusso-citometria di cellule T. Le barre di errore rappresentano SD media ±. (C) Simile a (A) eccetto che la purezza delle cellule B è stata valutata mediante colorazione CD19 e attivato con anti-topo IgG / IgM e ricombinante CD40L. (D) Percentuale di espressione GFP ottenuto con analisi di flusso-citometria delle cellule B. Le barre di errore rappresentano SD media ±. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti visualizzati almeno tre volte (n = 5 / gruppo e *** P <0.001). Clicca qui per visualizzare un più grandeversione di questa figura.
Figura 3: schema complessivo che rappresentano le fasi di screening fenotipica. Ci sono 7 passaggi principali necessari per preparare il test HTS. Una femmina del mouse Nur77 GFP è sacrificato per isolare la sua milza (Fase 1). Dopo la generazione di una sospensione cellulare splenociti (Fase 2), le cellule T sono isolate negativamente (dalla deplezione di cellule indesiderate) utilizzando un kit disponibile in commercio (passaggio 3). Le cellule T isolate vengono poi incubate con ricombinante IL-7 in assenza o presenza di CD3 perline / CD28 in piastra a 96 pozzetti a fondo tondo a 37 ° C (fase 4). Dodici ore più tardi (fase 5), le cellule T sono pipettati più volte per rimuovere eventuali aggregati prima della rimozione perline utilizzando lo stesso magnete isolamento delle cellule utilizzato originariamente per la purificazione delle cellule T. Le cellule T isolate sono quindi seminate in piastre da 384 pozzetti (75 000 cells / bene, punto 6) con i composti per altre 24 ore (STEP 7). Il giorno seguente, le cellule incubate sono colorate con Hoechst 30 minuti prima dell'analisi da parte del sistema HCS (punto 8). Lo stesso set-up potrebbe essere seguiti per la preparazione di un saggio a base di cellule B eccetto che passo 4 e 5 sono sostituiti da un semplice lavaggio come vengono aggiunti i stimolatori in forme solubili. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Schema di fasciame di cellule T in 384 pozzetti. Ogni lamina impiegata nel saggio conteneva tre gruppi. Nel primo gruppo, pozzetti sono stati caricati con cellule non attivati T (controllo negativo per GFP su entrambi i lati della piastra; pozzetti A1-P1 e A24-P24), mentre il secondo gruppo conteneva attivato cellule T senza druGS (controllo positivo per GFP, i pozzi A2-P2 e A23-P23). Tutti i pozzetti rimanenti contenenti cellule T attivate integrate con le entità chimiche utilizzate nello screening. Tutti i pozzetti contenevano 0,5% DMSO. Esempi per i segnali GFP e Hoechst sono indicati per cellule non attivate e T attivati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: lo screening fenotipico primaria. (A) Esempio rappresentativo di uno screening primario eseguita su 320 composti. Le cellule non-T attivate sono quasi nulle GFP in contrasto con le cellule T TCR-stimolati, che mostra di 20 volte l'espressione della GFP superiore. (B) i dati cumulativi di tutti i composti a screening con il test. L'espressione GFP dimostra composti distrombatura azione inibitoria mentre gli altri composti sono stati comporta come stimolatori delle cellule T. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Diversi metodi read-out sono stati sfruttati per lo sviluppo di saggi HTS sensibili ed affidabili. Questi includono colorimetrica, luminescenti o metodi fluorescenti. Anche se i metodi colorimetrici sono semplici da set-up, che richiedono più aggiunte di sostanze chimiche, che possono interferire o disturbare le cellule in fase di sperimentazione. 23 Inoltre, essi non consentono valutazione dinamica di una risposta biologica come effetto farmacologico è valutata a un endpoint specifico. Inoltre, questo metodo può richiedere costosi bracci robotici se viene utilizzato HTS automatizzati. Questi fattori rendono colorimetriche read-out meno compatibile con l'obiettivo di HTS a causa delle loro esigenze ingombrante e bassa sensibilità. 23 Sebbene luminescenza è stata proposta come alternativa al test colorimetrici, l'applicazione di queste prove luminescenti in HTS è di solito limitata a causa del requisito di lisi cellulare. Anche se altri protocolli non sono stati lisi desviluppata, l'intensità del segnale di bioluminescenza può essere ostacolata da molti fattori come l'assorbimento luciferina, disponibilità di cofattori, pH, e la trasparenza dei terreni di coltura o tampone, provocando discrepanze tra i segnali bioluminescenza rilevati e delle modifiche effettive attività cellulare. 24 Di conseguenza, la maggior parte delle analisi si basano su metodi di fluorescenza. Infatti, saggi fluorescenti basati Inizialmente sviluppati utilizzando piccole molecole organiche altamente fluorescenti in grado di monitorare una varietà di processi cellulari su attivazione cellulare. In sintesi, saggi fluorescenti hanno una sensibilità superiore e può essere facilmente adattato per misure fenotipiche durante HTS. 23
Il saggio HTS fluorescenti-based sviluppata qui presentata ha tre vantaggi principali. Innanzitutto, è altamente affidabile, riproducibile ed è stato adottato per lo screening di composti capaci di modulare due diverse cellule primarie (T e linfociti B) usando la stessa stimolizione / read-out concept. Ad esempio, lo screening primario di 4.398 composti, che è stato completato in cinque diverse piste visualizzato un segnale costante di attivazione indotta GFP con intra minima e variabilità inter-saggio (<5% e <15%, rispettivamente, per il dosaggio delle cellule T). In secondo luogo, il saggio utilizza un modello di topo transgenico disponibile in commercio. Di solito, la progettazione di un saggio basato sulla fluorescenza richiede l'ingegneria genetica di cellule primarie o una linea cellulare di interesse per visualizzare un segnale fluorescente dopo stimolazione. Sebbene questo approccio genera un prezioso strumento da laboratorio, generalmente non è prontamente disponibile alla comunità scientifica. Per aggirare questa limitazione, le cellule T e B sono stati isolati da topi transgenici Nur77 GFP. Il vantaggio di questi linfociti è la loro capacità di esprimere la GFP entro 24 h su stimolazione del TCR o BCR. Pertanto, lo screening farmaci in grado di modulare la macchina di trascrizione di guida espressione GFP o il complesso cellularerisposta rappresenta un approccio interessante. In terzo luogo, integrando le cellule T con perline CD3 / CD28 nella loro fase di attivazione iniziale richiede la rimozione di queste perle prima di valutazione GFP. Ciò è importante se la microscopia è utilizzato per l'analisi delle cellule T di attivazione / inibizione come lasciare le perline saranno altrimenti mascherare il segnale GFP. Se il flusso-citometria viene utilizzato invece per l'analisi, perline potrebbe essere lasciati nei pozzetti (a meno che non crea specificamente ulteriore limitazione confondenti (s) per il test) come la popolazione di interesse specifico può essere gated utilizzando sia avanti e disperde laterali.
L'obiettivo iniziale era quello di progettare un test di screening con la manipolazione cellulare minima. In questo contesto, l'attivazione di T o linfociti B utilizzando splenociti non frazionate stimolato con perline o anticorpi solubili / ricombinante CD40L, rispettivamente, è stato limitato da una grande percentuale dei linfociti è rimasta GFP negativo (Figura 1). Poiché questo passaggio è fondamentale per il successodel dosaggio, il protocollo è stato modificato per purificare cellule T o B utilizzando kit commerciali per aumentare le cellule GFP-esprimono percentuali. Questo approccio ha migliorato significativamente l'esito di attivazione di entrambe le popolazioni cellulari. Anche se un altro metodo di scelta può essere utilizzato per T e B isolamento delle cellule, se ritenuto necessario, l'approccio proposto è: i) altamente riproducibili, ii) facilmente adattato per valutare la purezza della popolazione isolata dal flusso-citometria prima HTS, iii) e il tempo efficiente la fase di purificazione è relativamente breve (~ 30 min) e può essere eseguita con una minima preparazione. Tuttavia, si deve notare che il saggio presentato in questo studio si basa sull'utilizzo di cellule primarie del mouse. Secondaria (per conferma) e terziario (validazione finale sul target di interesse) analisi dovrebbe essere condotta in seguito alla schermata principale per convalidare i colpi identificati. Anche se potrebbe essere facilmente adattato ad una varietà di differenti linee cellulari, l'effetto farmacologico di icolpi dentified ha bisogno di ulteriori conferme su altre specie (ad esempio le cellule umane - esempio di saggio terziaria), come non ci sono modi possibili per prevedere gli effetti subiti tra le specie. In sintesi, questo test è utile per l'identificazione di nuovi potenziali successi e / o bersagli molecolari con eventuale estrapolazione dei risultati di entrata / test su animali in vitro per gli esseri umani.
Anche se il dosaggio progettato può essere sfruttata sia per le cellule T e B, un vantaggio è conferito all'uso specifico di cellule T in questo caso. Attivazione TCR di solito richiede doppia stimolazione conferito attraverso una primaria (ad esempio anti-CD3 o anti-TCR) e un segnale secondario co-attivazione (ad esempio anti-CD28). 25, 26 È interessante notare che, sia anti-CD3 e anti-CD28 può essere acquistato direttamente collegati sulla superficie di sfere magnetiche, e può essere rimosso dalla sospensione cellulare con un magnete standard prima di aggiungere tlui composti chimici da testare nello screening. Come viene usata una biblioteca con entità chimiche sconosciute, mantenendo cellule T attivate gratuitamente da molecole legate alla loro complesso TCR possono minimizzare ogni possibile interferenza tra i composti testati e quelli legati alle scanalature vincolanti TCR. 27 Inoltre, rimuovendo l'agente stimolante seguente imita attivazione delle cellule T situazioni fisiologiche anziché operare con le cellule T sottoposte ad un'attivazione TCR sovrafisiologici sostenuta. Quest'ultima situazione può essere problematico in quanto potrebbe ignorare l'effetto farmacologico di un dato composto soprattutto se è stato usato a piccole concentrazioni di screening. Poiché non vi sono perline disponibili in commercio che esercitano lo stesso effetto sulle cellule B, sarebbe interessante effettuare un HTS in futuro testare se la continua presenza dello stimolo sulle cellule B limita le prestazioni del dosaggio.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Merck Frosst fase di avviamento concessi da Université de Montréal. Vorremmo ringraziare i dottori Jean Duchaine e Dominic Salois dalla piattaforma high-throughput presso l'Istituto di Ricerca in Immunologia e il cancro per la loro discussione, commenti e feedback. Moutih Rafei detiene una Fonds de la Recherche en Santé du Québec Junior 1 premio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
