Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

doi: 10.3791/55199 Published: March 10, 2017

Summary

نقدم في الدراسة الحالية مقايسة على أساس مضان رواية باستخدام الخلايا الليمفاوية المستمدة من الفئران المحورة جينيا. هذا الاختبار هو مناسبة لفحص عالية الإنتاجية (HTS) من جزيئات صغيرة هبوا قدرة أي عرقلة أو تعزيز تنشيط الخلايا اللمفاوية.

Abstract

فحص عالية الإنتاجية (HTS) هو حاليا الدعامة الأساسية لتحديد الكيانات الكيميائية القادرة على تحوير التفاعلات الكيميائية الحيوية أو العمليات الخلوية. مع تقدم التكنولوجيا الحيوية والقدرة متعدية عالية من جزيئات صغيرة، تطورت عدد من الأساليب المبتكرة في اكتشاف المخدرات، وهو ما يفسر اهتمام طالبان في استخدام HTS. مجال علم الأورام ويعمل حاليا في مجال البحوث الأكثر نشاطا لفحص المخدرات، مع عدم وجود تقدم كبير جعل لتحديد المركبات المناعية جديدة تستهدف مضاعفات زرع أو أمراض المناعة الذاتية. هنا، نقدم رواية في المختبر الفئران أساس فلوري فحص الخلايا اللمفاوية تتكيف بسهولة لتحديد المركبات المناعية جديدة. يستخدم هذا الاختبار T أو B الخلايا المشتقة من الفئران المحورة جينيا، التي المروج Nur77 يدفع التعبير GFP على تي أو B-خلية تحفيز مستقبلات. كما تعكس كثافة GFP لتفعيل / النشاط النسخي للخلية المستهدفة، ويعرف لدينا فحص أداة جديدة لدراسة تأثير مركب معين (ق) على الاستجابات الخلوية / البيولوجية. على سبيل المثال، تم إجراء فحص أساسي باستخدام 4398 مركبات في ظل عدم وجود "فرضية الهدف"، والتي أدت إلى تحديد 160 الزيارات المحتملة عرض الأنشطة المناعية. وهكذا، فإن استخدام هذا الاختبار هو مناسبة لبرامج اكتشاف المخدرات استكشاف مكتبات كيميائية كبيرة قبل لزيادة في المختبر / في الدراسات المجراة التحقق من الصحة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

فحص عالية الإنتاجية (HTS) هو استراتيجية مؤكدة اعتمدت على نطاق واسع لتحديد جزيئات علاجية جديدة أو لإعادة تنظيم الأدوية وافقت عليها الهيئة في مؤشرات طبية جديدة. 1 وحتى الآن، فإن نجاح HTS حققت يمكن قياسها من قبل عدد كبير من الأدوية المكتشفة سابقا. على سبيل المثال، استخدام المانع lapatinib التيروزين كيناز لعلاج سرطان الثدي، سيتاقلبتين. تمثل dipeptidyl ببتيداز-4 (DPP-4) المانع تستخدم العقاقير المضادة للفرط سكر الدم، والفم BCR-المحمول جوا التيروزين كيناز المانع dasatinib المستخدمة لعلاج سرطان الدم النقوي المزمن أمثلة قليلة من قائمة طويلة من الأدوية المعتمدة اكتشفت أصلا HTS. 2 على الرغم من أن إنتاجية مجال الصناعات الدوائية قد عانت في الآونة الأخيرة من نقص في اكتشاف كيانات كيميائية جديدة، يمكن أن تحسن من احتمالات اكتشاف المخدرات ناجحة من خلال زيادة عدد المبيضات ما قبل السريريةقسم التدريب والامتحانات التي تظهر الخصائص البيولوجية / الكيمياء الحيوية تغييري. وفقا لذلك، يمكن وضع المقايسات HTS جديدة تكييفها لفحص المظهري توفر القدرة على توفير أدوات الدوائية هامة لاكتشاف يضرب دواء جديد. 6 وعلاوة على ذلك، HTS يمكن الآن إجراء بوتيرة أسرع بسبب التحولات التكنولوجية الكبيرة في السنوات الأخيرة بما في ذلك منشآت مصممة خصيصا مرنة الروبوتية، تقنيات قرأ الرواية والتصغير واسعة النطاق. 7 من بين العوامل التي تسهم في الاهتمام المتزايد في استخدام الفحص المظهري (ويعرف أيضا باسم الأمام الصيدلة) هو الاعتقاد بأن تركز على الآثار الوظيفية بدلا من الافتراضات الاختزالية التبسيط بشأن أهداف جزيئية (فحص / التفاعلات الكيميائية الحيوية القائمة على الهدف) هو الأرجح إلى sho الفعالية السريرية ث. وهكذا، وفحص المظهري يبشر لكشف المركبات يحتمل أن تكون علاجية جديدة والمسارات الجزيئية للأمراض غير قابلة للعلاج حاليا. 2

لتحديد مثبطات أو تفعيل لهدف الجزيئية معين أو وظيفة الخلوية بشكل صحيح، لا بد من فحص حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها من أجل التفريق بين يضرب النية الحسنة وايجابيات كاذبة. لذلك، ما يجعل فحص جيد؟ نوعية فحص معين يجب أن يكون الحكم لأول مرة من قبل نسبة الإشارة إلى الضوضاء (يتجلى من خلال عامل Z). 8 ثانيا، ينبغي أن توضع بوضوح التأثير المستهدف أو الهدف من الشاشة. على سبيل المثال، يمكن للنهج القائم على خلية وظيفية توفر مزايا هامة لفحص مستقبلات بدلا من مقايسة مصممة خصيصا لتقييم يجند مستقبلات ملزمة. والسبب في ذلك هو أن النهج الأخير لا يمكن التفريق بين ناهض وخصم بروابط.SS = "XREF"> 9 في المقابل، هو النهج القائم على خلية من المرجح أن تكون أكثر فعالية وظيفة مستقبلات يمكن تقييم مباشرة في النمط الظاهري البيولوجي (انتشار واعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، و / أو التمايز). ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن فحوصات الكيمياء الحيوية يمكن أن توفر مزايا هامة على فحوصات المظهري لأنها تتعدى على هدف داخل الخلايا المحددة. وهناك فحص كيميائي حيوي جيدا الأمثل عموما أقل مبعثر البيانات من الفحص المظهري في الوقت الذي تبسط بعد ذلك التحقيقات المتعلقة بالآلية الجزيئية المخدرات من العمل. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لفحوصات القائم على الهدف أو البيوكيميائية هو فرصة لتضخيم معدل ضربات إيجابية كاذبة التي قد تؤثر على أهداف غير محددة عند اختباره في نظام بيولوجي (فقدان خصوصية درس في الأصل في مقايسة البيوكيميائية). 10 على الرغم من أن النقطة الفاصلة الراسخة بين يضرب السلبية والإيجابية يمكن أن تقلل من عدد من ايجابيات كاذبة طن غربلة أولية، واستخدام نظام ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية محاكاة البيئة الخلوية المحلية مثل خلايا سليمة، النسيج كله أو الحيوان كله يبقى جوهر البندول تصميم الفحص. لذلك، وفحص المظهري يمكن اكتشاف الرصاص مع آثار المظهري البيولوجية / مرغوب فيه للأمراض مع أي أهداف المخدرات التي تم تحديدها دون معرفة مسبقة من نشاط المجمع أو طريقة العمل. 11

وتتعلق دراسة هذا القانون وتطوير واختبار وفحص المظهري الأمثل وقابلة للتكرار على أساس عنصرين هامين: نموذج الفأر المتاحة تجاريا وتتجمع الفرعية عائلة من المركبات الكيميائية. وفيما يتعلق نموذج حيواني، ويعتمد الفحص على استخدام الخلايا الليمفاوية المستمدة من سلالة الماوس (Nur77 GFP) بايواء كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي على الكاسيت الذي هو الدافع وراء التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من خلال الالبريد Nur77 المروج. 12 ويستند السمة المميزة لهذا التحفيز على حقيقة أن Nur77 هو جين الفورية المبكرة يصل ينظم التالية مستقبلات الخلايا التائية (TCR) أو تحفيز مستقبلات B-الخلية (BCR). 12 أما بالنسبة للطريقة الفرز نفسها، وكان يستخدم نهجا للمساعدة في تجنب فحص نظائرها تافهة مع التقليل من الوقت اللازم لتقييم مكتبة الكيميائية كبيرة (> 10 5 مركبات). للقيام بذلك، واستغلال قاعدة بيانات من المركبات الكيميائية التي اختارها الكيميائيين الطبية باستخدام أدوات الفحص الظاهري لتحديد مركبات مماثلة طبوغرافيا باستخدام هياكل البذور الفعالة المعروفة باسم المراجع. يسمح هذا النهج لنا لفحص المركبات 4398 وهو ما يمثل مكتبة شاملة لأكثر من 136،000 الكيانات الكيميائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة مونتريال. الموت الرحيم كانت الفئران عن طريق استنشاق التدريجي من CO 2 حتى وحظت يتبع أي علامات حيوية عن طريق خلع عنق الرحم. تم تنفيذ الإجراء من قبل شخص معتمد للتأكد من أن الحيوانات الموت الرحيم كانت بطريقة إنسانية وفقا لتوصيات المجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. إعداد خلية طحالية المتوسطة والتدفق الخلوي-العازلة

  1. تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء البيولوجي تنظيف الايثانول 70٪.
  2. إزالة 70 مل من معهد روزويل بارك التذكاري استعد مسبقا (RPMI) 1640 1X المتوسطة (متوفرة تجاريا وتوفيرها في المصفاة 500 مل حجم زجاجات معقمة) ووضعه في أنبوب العقيمة. وسوف تستخدم وسيلة إزالة في وقت لاحق في البروتوكول.
  3. تكملة 430 مل المتبقية من RPMI 1640 1X مع 50 مل المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين، 5مل HEPES، 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل البيروفات الصوديوم، و 0.05 مل تصفيتها (1M) 2-المركابتويثانول.
    ملاحظة: قبل الدافئ خلية طحالية المتوسطة باستخدام حمام مائي وضعت في 37 درجة مئوية لتجنب خلايا الحرارة صدمة. وهذا أمر مهم لتجنب استحثاث موت الخلايا المبرمج الخلوية.
  4. لإعداد عازلة التدفق الخلوي، إضافة 2 مل من FBS إلى 98 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويحفظ في الثلاجة حتى استخدامها (ويفضل في غضون ثلاثة أيام).

2. جيل من خلية طحالية تعليق خلية من Nur77 GFP الطحال ماوس

  1. وseptically عزل الطحال من الإناث الماوس Nur77 GFP 6-8 الاسبوع القديمة.
    1. ولتحقيق ذلك، تعمل تحت غطاء العقيمة. نقع التضحية الماوس والفراء، ومقص وملقط في 70٪ من الإيثانول.
    2. وضع الماوس على جانبها الأيمن، وقطع الجلد والعضلات في الربع البطن العلوي الأيسر. تفقد منطقة شق لتحديد مكان واضح في الطحال ثم قطع بها. الحفاظ على الطحالفي المتوسط ​​خلية طحالية على الجليد حتى جاهزة للتنفيذ الخطوة التالية.
  2. وضع الطحال (ق) في 10 سم 2 خلية طبق الثقافة بتري تحتوي على 5 مل من المتوسط خلية طحالية قبل تحسنت.
  3. الهريس والطحال باستخدام المكبس حقنة معقمة حتى الحل هو عكر. ينبغي أن يظل الكولاجين مصفوفة الطحال بحلول نهاية هذا الإجراء.
  4. بعد يهرس واسعة في وسط خلية طحالية، وجمع تعليق خلية وتمريرها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب 50 مل لتصفية خارج أي حطام أو جلطات.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من طاف، وإعادة تعليق بيليه خلية في 2-3 مل من تحلل العازلة داخل المنتجة أو التجاري خلايا الدم الحمراء. بعد pipetting ل(2-3 مرات) السماح للبقية تعليق لمدة 20-30 ثانية.
  6. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني أو منطقة عازلة مناسبة للاختيار ثم الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
  7. إزالة طاف (يجب أن يكون أحمر اللون لأنه يحتوي هي lysed ب الحمراءخلايا lood) وإعادة تعليق بيليه خلية في 2 مل من المتوسط ​​خلية طحالية.
  8. باستخدام عدادة الكريات، والاعتماد على عدد من الخلايا الملون باللون الأزرق التريبان للتمييز بين (نخرية) الخلايا الحية والميتة.

3. خلايا T عزل من تعليق خلية خلية طحالية

  1. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 500 × ز. إعادة تعليق الخلايا في مصل الدم خالية من RPMI المتوسطة (50 مل من الخطوة 1.3) للحصول على تركيز الخلوية من 10 × 10 6 خلية / مل.
  2. نقل الخلايا إلى أنبوب البوليسترين 5 مل وتوضع جانبا قسامة 100 ميكرولتر من splenocytes للنقاء تقييم / مقارنة في نهاية الخطوة تنقية.
  3. إضافة مصل الفئران العادية لتعليق الخلية في 50 ميكرولتر / مل تليها تي العزلة خلية الأجسام المضادة كوكتيل (50 ميكرولتر / مل).
  4. مزيج تعليق الخلية والسماح لها راحة لمدة 10 دقيقة. هذه الخطوة تسمح للكوكتيل الأجسام المضادة لربط كل الخلايا غير المرغوب فيها.
  5. إضافة المجالات السريع streptavidin (المغناطيسحبات جيم) لمدة 2.5 دقيقة، ثم جعل وحدة التخزين إلى 2.5 مل باستخدام المصل خالية المتوسطة.
  6. وضع أنبوب في المغناطيس العزلة خلية لمدة 3 دقائق.
  7. نقل تعليق الخلايا التائية في أنبوب البوليسترين الجديد من خلال عقد المغناطيس وسكب الحل في خطوة واحدة.
    ملاحظة: تعليق معزول يحتوي على خلايا T النقاء. تقام جميع الخلايا غير المرغوب فيها على جانب الأنبوب منضمة إلى حبات streptavidin المغناطيسي.
  8. عد خلايا تي المعزولة باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
    ملاحظة: في هذه الخطوة على نقاء خلايا تي المعزولة يمكن التحقق (اختياري) عن طريق تحليل نسبة CD3 + الأحداث قبل وبعد T العزلة الخلية عن طريق التدفق الخلوي. 13
    1. لفترة وجيزة، الطرد المركزي 1 مل من تعليق خلية خلية طحالية في 500 × ز. تجاهل طاف وتعليق الخلايا في المخزن التدفق الخلوي بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل.
    2. إضافة فلوري الموسومة مكافحة مذكرات التفاهمالأجسام المضادة ه CD3 بتركيز 1: 100. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يغسل مرة واحدة، الطرد المركزي وإعادة تعليق العازلة في التدفق الخلوي (400 ميكرولتر) لتحليلها من قبل التدفق الخلوي.

4. عزل B-خلية من تعليق خلية خلية طحالية

  1. اتبع نفس البروتوكول كما هو موضح للخلايا T (الخطوات 3،1-3،8) ولكن باستخدام طقم العزلة B-الخلية. لتقييم النقاء، استخدام الأجسام المضادة CD19 بدلا من الأجسام المضادة CD3. 13
    1. لتقييم النقاء (اختياري)، واستخدام الأجسام المضادة CD19 بدلا من الأجسام المضادة CD3. الطرد المركزي 1 مل من تعليق خلية خلية طحالية في 500 × ز. تجاهل طاف وتعليق الخلايا في المخزن التدفق الخلوي بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل.
    2. الموسومة إضافة الفلورسنت مكافحة فأر CD19 الأجسام المضادة بتركيز 1: 100 واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يغسل مرة واحدة، الطرد المركزي وإعادة تعليق العازلة في التدفق الخلوي (400 ميكرولتر) FOتحليل ص بواسطة التدفق الخلوي.

5. تنشيط خلايا T وتحريض من التعبير GFP

  1. البذور الخلايا T، في تعليق، في لوحة 96-جيدا القاع ذهابا وبتركيز 2.5 × 5 10 خلايا / جيد.
  2. إضافة انترلوكين المؤتلف (IL) -7 في 2 نانوغرام / مل و CD3 / CD28 حبات مغناطيسية (25 ميكرولتر / 10 6 خلايا). الحفاظ على جزء من الخلايا T غير المعالجة مع حبات لتكون بمثابة سيطرة سلبية للقياسات في وقت لاحق أن تمثل خلايا T غير مفعلة.
  3. بعد اثني عشر ساعة، حصاد الخلايا T من لوحة 96-جيدا من قبل pipetting بلطف تعليق خلية في كل بئر صعودا وهبوطا لكسر أي مجمع حبة خلية / الركام. جمع تعليق من جميع الآبار في أنبوب البوليسترين 5 مل.
  4. وضع الأنبوب الذي يحتوي على تعليق داخل نفس المغناطيس عزل الخلايا المستخدمة سابقا لتنقية T أو B الخلايا والسماح لها للراحة لمدة 5 دقائق.
  5. نقل الباحث تي تعليق خليةالزراعة العضوية أنبوب البوليسترين الجديد من خلال عقد المغناطيس وسكب الحل في خطوة واحدة.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في وسط خلية طحالية جديدة للحصول على تركيز 2 × 10 6 خلية / مل.
  7. تقييم GFP التعبير كثافة من التدفق الخلوي (اختياري لمراقبة الجودة) في 12-24 ساعة بعد التحفيز في مقارنة مع خلايا غير المفعلة تي. 12
    ملاحظة: مضان GFP متأصل في خلايا Nur77 GFP T ويتجلى على تفعيل الناجح لTCR. 12
  8. لتقييم الجدوى وتفعيل (اختياري) بواسطة المجهر، وصمة عار على الخلايا تفعيلها مع هويشت 30 دقيقة قبل التحليل بتركيز 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة حجم كاف لتعليق الخلية إلى شريحة غطاء أو إلى بئر من لوحة 384 جيدا مسطحة القاع الأسود من جانب وفحص تحت المجهر مضان لتقييم الخلايا الحية. والخلايا الميتة لا تحتفظ النوويةتلطيخ. 14

6. تفعيل B-الخلية وتحريض التعبير GFP

  1. عن طريق ثقافة قارورة T-25، اعادة تعليق الخلايا البائية معزولة في 1 × 10 6 خلية / مل.
  2. إضافة المضادة للماوس مفتش / الغلوبولين المناعي (H + L) في 10 ميكرولتر / مل وCD40L المؤتلف في تركيز 200 نانوغرام / مل. الحفاظ على جزء من الخلايا البائية غير المعالجة لتكون بمثابة سيطرة سلبية للقياسات في وقت لاحق (تمثل الخلايا البائية غير مفعلة).
  3. تقييم GFP التعبير كثافة من التدفق الخلوي في 12 أو 24 ساعة بعد التحفيز في مقارنة مع خلايا غير المفعلة B.
    ملاحظة: مضان GFP متأصل في خلايا Nur77 GFP باء ويتجلى على تفعيل الناجح لBCR. 12
  4. لتقييم الجدوى وتفعيل (اختياري) بواسطة المجهر، وصمة عار على الخلايا تفعيلها مع هويشت 30 دقيقة قبل التحليل بتركيز 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة حجم كاف لتعليق الخلية لشريحة غطاء أو إلى بئر من لوحة 384 جيدا مسطحة القاع الأسود من جانب وفحص تحت المجهر مضان لتقييم الخلايا الحية. والخلايا الميتة لا تحتفظ تلطيخ النووي. 14

فحص 7. ارتفاع الإنتاجية من الجزيئات الصغيرة

  1. إعداد تعليق خلية في 2 × 10 6 خلية / مل من الخلايا T أو B المنشط (حبات مغناطيسية أو الأجسام المضادة / CD40L) أو مجموعات غير المفعلة.
  2. لوحة 75،000 خلية / بئر في لوحة 384 جيدا (حجم 40 ميكرولتر). استخدام لوحة 384 جيدا السوداء من جانب القاع المسطح أو المجهر غطاء شريحة لبقاء وتفعيل تقييم بواسطة المجهر الفلورسنت (اختياري مراقبة الجودة خطوة قبل HTS) باستخدام هويشت صمة عار (راجع الخطوات 5.8 و 6.4 لمزيد من التفاصيل). 14
  3. يدويا أو باستخدام نظام الآلي، إضافة إلى عقاقير مفضلة (المنحلة في 0.5٪ DMSO) إلى كل بئر.
  4. إضافة السيارة (DMSO) إلى إيجابي (تفعيل) والسلبية (غير أكتي-vated) آبار المراقبة. ضبط تركيز DMSO إلى حد أقصى قدره 0.5٪.
  5. احتضان لوحات لمدة 24 ساعة (أو حضانة وقت الاختيار) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  6. في يوم الفرز، يخفف من هويشت 33342 صمة عار حل (1: 3333، على سبيل المثال لإضافة 10 ميكرولتر من الخلايا في لوحات 384 جيدا لتوليد الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر). وصمة عار مدة 30 دقيقة قبل تحليل GFP بإضافة حل هويشت لتحقيق تركيز 0.2 ميكروغرام / مل.
  7. ماصة بلطف الخلايا صعودا وهبوطا للحصول على توزيع متجانس في كل بئر.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة في حالة الاستغناء عن المخدرات (الخطوة 7.3) باستخدام نظام آلي كما تميل الخلايا تتراكم في جانب واحد من البئر، عكس اتجاه التدفق.
  8. تدور لوحات في 45 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. ترك لوحات لبقية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. أداء لوحة (ق) قراءة الرافضة، وذلك باستخدام مبائر للأفلام ا نسبة عالية الآليملمسه (HCS) النظام. 15 تحميل لوحة لآلة. تعيين الهدف في 40X أو أعلى التكبير. استخدام الكاميرا رقم 4 لهويشت (مصباح الأشعة فوق البنفسجية) وكاميرا رقم 1 لGFP (ليزر 488). إعداد الجهاز لقراءة 6-10 الحقول لكل بئر. ضبط الجهاز للقيام اثنين من قراءات متتابعة لكل حقل في 488 نانومتر (لقراءة GFP) والأشعة فوق البنفسجية (لقراءة هويشت). تعيين الهدف في 40X أو أعلى التكبير.
    ملاحظة: هذا النظام هو المجهر المحوسب الذي لا يتطلب أي تعديلات. المسافة البؤرية، وشدة الضوء الساقط ووقت التعرض كلها الإعداد تلقائيا من قبل الجهاز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تصميم للمقايسة HTS

تم نقل اثنين من العوامل الهامة في الاعتبار عند تصميم فحص الفلورسنت هنا. أولا، نحن في حاجة إلى تكرار حالة الفسيولوجية التي تي أو B تنشيط الخلايا سوف يمثل مرض (مثل مرض الطعم ضد المضيف). ثانيا، ينبغي إجراء تقييم لتفعيل الخلوي باستخدام طريقة حساسة والكمي. مضان في الوقت الحاضر هو واحد من الاختيار الأساسي لHTS قراءة الرافضة لأنه يتوافق مع هذه الاحتياجات. 10 و 16 كما يمكن الحصول على GFP قوي للقراءة في أعقاب Nur77 GFP -derived تي أو الخلايا البائية التحفيز على حد سواء في المختبر أو في الجسم الحي، يستغل 12 مقايسة لدينا هذه الاستراتيجية إلى التفريق بين الخلايا غير المفعلة والمفعلين كنموذج عمل لطتلون العاج من المركبات المناعية.

في الأصل، واستند تصميم فحص لدينا على تقييم GFP بواسطة التدفق الخلوي باستخدام splenocytes حفز غير المجزأ. في هذه الحالة، هي ملطخة تنشيط غير المفعلة خلايا T و B على حد سواء / مع anti-CD3 أو مكافحة CD19، قبل التوالي لتقييم GFP. كما هو مبين في الشكل 1A، خلايا تي (CD3 + الخلايا) تمثل حوالي 30٪ من الطحال الماوس معين. في حالة مستقرة، كان مستوى GFP في حدود 10٪ (على الأرجح بسبب اختيار ما بعد الغدة الصعترية من خلال TCR خلال تطوير أو التحفيز التماثل الساكن في محيط). بعد التحفيز TCR باستخدام الخرز / CD28 CD3، تم الكشف عن 5-6 أضعاف الزيادة في نسبة التعبير GFP (57٪ بدلا من 10٪) في الخلايا CD3 + T (الشكل 1A - B). وبالمثل، الخلايا البائية (CD19 + الخلايا) تمثل 50-55٪ من إجمالي splenocytes والتي القاعدية GFP سابقاالضغط وتعادل خلايا غير المفعلة T (على سبيل المثال ~ 10٪، الشكل 1C). ومن المثير للاهتمام، ومع ذلك، أثار BCR تحفيز استخدام الألغام المضادة للماوس مفتش / الغلوبولين المناعي والمؤتلف CD40L زيادة تافهة في التعبير GFP (33٪ بدلا من 12٪، الشكل 1C - D). كما التعبير GFP هو عنصر أساسي لتقييم تأثير دوائي من جزيئات صغيرة يعرض على خلايا T أو B تفعيلها، وتحسين شدته أمر أساسي للحساسية ونجاح الفحص.

تقييم التعبير GFP باستخدام T أو B خلايا النقاء

على الرغم من أن T و B تحفيز الخلايا لا يمكن أن يتحقق مباشرة باستخدام splenocytes غير المجزأ، كانت كثافة التعبير GFP يست حساسة بما فيه الكفاية لفحص خاصة إذا قراءة الرافضة هي التي يتعين القيام بها بواسطة المجهر. من أجل تحسين الاستجابة الخلوية، وتنقية خلايا T لأول مرة المغناطيسيحبات استخدام عدة متاحة تجاريا (الشكل 2A). كما هو موضح سابقا باستخدام splenocytes غير المجزأ، وكانت 10٪ من خلايا CD3 + T معزولة GFP إيجابية (التعبير القاعدية). في هذا السياق، الخلايا التائية التحفيز باستخدام حبات CD3 / CD28 تحسنت بشكل ملحوظ استجابة GFP بها (الشكل 2A - 2B، 86٪ في مقابل 57٪ عندما استخدمت splenocytes غير المجزأ). وقد تم الحصول على تحسينات مماثلة مع الخلايا البائية (الشكل 2C - 2D، 80٪ بدلا من 33٪). هذه النتائج تظهر بوضوح أن استخدام الخلايا T و B تنقية يزيد التعبير GFP، الذي هو مناسبة لفحص المظهري المقترحة.

رسم تخطيطي للHTS فحص تصميم

عموما، يمكن للفحص أن يكون شبه مقسمة إلى أربعة أقسام رئيسية (الشكل 3). في حالة الخلايا T على سبيل المثال، splenocytesيتم إعداد تعليق خلية من أجل تنقية خلايا تي (الخطوات 1-3) تليها خطوة التحفيز 12 ساعة في المختبر باستخدام حبات CD3 / CD28 (الخطوات 4-5). ومطلي ثم تنشيط خلايا تي وتربيتها لمدة 24 ساعة مع جزيئات صغيرة من خيار في لوحات 384 جيدا (الخطوات 6-7) قبل تقييم شدة GFP وهويشت باستخدام نظام HCS الآلي. ويمكن استخدام نفس فحص لخلايا B مع تعديلات أجريت في الخطوات 4-5. لفترة وجيزة، وخلايا B ويمكن حفز مع المضادة للماوس مفتش / الغلوبولين المناعي والمؤتلف CD40L بدلا من الخرز. كما تستخدم هذه المكونات في شكلها القابلة للذوبان (على سبيل المثال لا ترتبط الخرز)، وخلايا B ويمكن المحتضنة لمدة 12 ساعة ثم تغسل ببساطة قبل الطلاء في لوحات 384 جيدا لعملية الفرز.

كفاءة بقاء خلايا T هو الأساسي لنجاح الدراسة HTS. وفقا لذلك، قد اثنين من العوامل التي تحد من إعاقة نوعية الفحص ويجب أن تؤخذ بعين الاعتبار. الأولوخلايا تي الفئران هي عرضة للموت الخلايا المبرمج التالية في المختبر التحفيز. 17 ثانيا، وتضعف جميع مركبات اخضعت للاختبار في حل DMSO، والتي قد تضيف عامل الإجهاد الثاني. للحد من فقدان الخلية، IL-7 المؤتلف (2 نانوغرام / مل) واستكملت لخلايا T على التحفيز TCR في الخطوات 4-5. هذا خلوى التماثل الساكن يدعم انتشار ويعزز بقاء الخلايا التائية من خلال التعبير عن جزيئات مضادة للأفكارك مثل بي سي إل 2، بي سي-XL ومكل-1. 18، 19، 20، 21، 22

الابتدائية عالية فحص الإنتاجية من 4398 مركبات الكشف عن العديد من المنشطات والمثبطات من تنشيط الخلايا T

وأجري فحص إنتاجية عالية من قبل الطلاء 75،000 عدم تنشيط (شارك سلبيntrol) أو تنشيط خلايا تي (مراقبة إيجابية) كما هو معروض في الشكل (4). لضمان استنساخ عالية، أجري الفحص عدة مرات مع عامل Z تم الحصول عليها من 0.87 (الشكل 5A). باستخدام نظام HCS، كان التعبير GFP لوحظ من خلايا تي حفز أعلى 20 مرة من خلايا تي unstimulated السماح للجيل من '' نافذة العمل '' منطقة حيث GFP المركبات المثبطة يمكن اكتشافه بسهولة (الشكل 5A). هذا هو مبين في الشكل من حيث عدد الخلايا الفلورسنت مقسوما على العدد الكلي للخلايا في مجالات الممسوحة ضوئيا. في المثال هو موضح في الشكل 5A، فحص 320 مركبات النقاب عن ثلاثة مجمعات (أشار التدريجي من السهام الحمراء) قادرة على تثبيط التعبير GFP من 1.5-2.5 أضعاف. في هذا المثال، بلغت القيمة السيطرة الإيجابية 0.44 ± 0.02 وكان الشاهد السلبي 0.02 ± 0.00.

عشروبعد ذلك أجرى ه فحص ما مجموعه 4398 مركبات (Z عامل من 0.85). وقد تم اختيار هذه المركبات من قبل الكيميائيين الطبية كبذور / المركبات نيابية على أساس تركيبها الكيميائي يمثل مكتبة الكيميائية الشاملة التي تحتوي على 136،000 الكيانات (الشكل 5B). في نهاية الفحص، وتحليل تثبيط GFP تحديد المركبات القادرة على تثبيط إما (deviators إيجابي) أو تعزيز GFP التعبير (deviators سلبي).

شكل 1
الشكل 1: تحليل T- والتعبير GFP B-الخلية التالية TCR أو تفعيل BCR التي أجريت على splenocytes غير المجزأ. (أ) الممثل تحليل تدفق الخلوي للخلايا T الملون مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3 باستخدام splenocytes في غياب (أعلى يسار لوحة) أو وجود حبات CD3 / CD28 (لوحة أعلى اليمين). يتم عرض التعبير GFP لكلا الفريقين خلايا Tفي الأسفل. (ب) النسبة المئوية التعبير GFP التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل التدفق الخلوي للخلايا تي. أشرطة الخطأ تمثل يعني SD ±. (C) على غرار (A) إلا أنه تم تنشيط splenocytes استخدام الألغام المضادة للماوس مفتش / الغلوبولين المناعي والمؤتلف CD40L ثم الملون لCD19. (D) النسبة المئوية التعبير GFP التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل التدفق الخلوي الخلايا البائية. أشرطة الخطأ تمثل يعني SD ±. تكررت جميع التجارب أظهرت ثلاث مرات على الأقل (ن = 5 / مجموعة؛ * P <0.05 و*** P <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تحليل التعبير GFP باستخدام T المنقى أو الخلايا البائية التالية TCR أو تفعيل BCR على التوالي. (A) Representative تحليل التدفق الخلوي للخلايا T تنقية الملون مع الأجسام المضادة لمكافحة CD3. لتحريض GFP، وحفز خلايا T النقاء باستخدام الخرز CD3 / CD28 (لوحة أعلى اليمين). وتظهر خلايا T غير المفعلة تحكم في اللوحة اليمنى العليا. يتم عرض التعبير GFP كل من الخلايا غير تنشيط وتفعيل تي في القاع. (ب) النسبة المئوية التعبير GFP التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل التدفق الخلوي للخلايا تي. أشرطة الخطأ تمثل يعني SD ±. (C) على غرار (أ) إلا أن نقاء الخلايا البائية تم تقييمها من قبل CD19 تلطيخ والمفعلين استخدام الألغام المضادة للماوس مفتش / الغلوبولين المناعي والمؤتلف CD40L. (D) النسبة المئوية التعبير GFP التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل التدفق الخلوي الخلايا البائية. أشرطة الخطأ تمثل يعني SD ±. تكررت جميع التجارب أظهرت ثلاث مرات على الأقل (ن = 5 / مجموعة و*** P <0.001). الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: رسم تخطيطي العام تمثل خطوات الفحص المظهري. هناك 7 خطوات رئيسية اللازمة لإعداد مقايسة HTS. وضحى فأر Nur77 GFP الإناث لعزل الطحال في (الخطوة 1). وبعد جيل من تعليق خلية splenocytes (الخطوة 2)، وعزل خلايا T سلبا (عن طريق استنزاف الخلايا غير المرغوب فيها) باستخدام عدة المتاحة تجاريا (الخطوة 3). ثم يتم تحضين الخلايا التائية معزولة مع IL-7 المؤتلف في غياب أو وجود CD3 الخرز / CD28 في لوحة 96-جيدا القاع ذهابا وفي 37 درجة مئوية (الخطوة 4). بعد اثني عشر ساعة (خطوة 5)، و pipetted خلايا T عدة مرات لطرد أي المجاميع قبل إزالة حبات باستخدام نفس المغناطيس عزل الخلايا المستخدمة في الأصل لتنقية خلايا تي. ثم هي المصنفة خلايا تي المعزولة في لوحات 384 جيدا (75 000 سلليرة سورية / جيد، الخطوة 6) مع المركبات لمدة 24 ساعة أخرى (الخطوة 7). في اليوم التالي، وصبغ الخلايا المحتضنة مع هويشت 30 دقيقة قبل التحليل من قبل النظام HCS (الخطوة 8). نفس انشاء يمكن أن تكون متابعتها لإعداد مقايسة على أساس خلية-B إلا أن خطوة 4 و 5 لتحل محلها غسل بسيط كما يتم إضافة التحفيز والتشجيع في أشكال قابلة للذوبان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: تخطيط لتصفيح خلايا تي في لوحات 384 جيدا. كل لوحة المستخدمة في الفحص تضمنت ثلاث مجموعات. في المجموعة الأولى، تم تحميل الآبار مع الخلايا غير المفعلة T (السيطرة السلبية لGFP على كل من جانبي لوحة؛ الآبار A1-P1 و A24-P24)، في حين أن المجموعة الثانية احتوت على تنشيط خلايا T دون دروع (مراقبة إيجابية لGFP، الآبار A2-P2 و A23-P23). جميع الآبار المتبقية تحتوي على تنشيط خلايا T تستكمل مع الكيانات الكيميائية المستخدمة في الفحص. جميع الآبار تحتوي على 0.5٪ DMSO. وترد أمثلة للإشارات GFP وهويشت للخلايا غير المفعلة والمفعلين تي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الفحص المظهري الابتدائي. (أ) مثال توضيحي لغربلة أولية أجريت على 320 مركبات. خلايا غير المفعلة تي تكاد تكون فارغة GFP على النقيض من الخلايا T حفز TCR، الذي عرض 20 أضعاف التعبير GFP العالي. (ب) فحصهم البيانات التراكمية للجميع المركبات باستخدام الفحص. يوضح التعبير GFP مركبات ديالعمل المثبطة التفلطح في حين غيرها من المركبات يتصرفون كما محفزات الخلايا التائية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد تم استغلال العديد من الطرق للقراءة من أجل تطوير فحوصات HTS حساسة وموثوق بها. وتشمل هذه اللونية، الانارة أو أساليب الفلورسنت. على الرغم من أن وسائل اللونية هي بسيطة لانشاء، فإنها تتطلب إضافات متعددة من المواد الكيميائية التي قد تتداخل أو تعطيل الخلايا التي يجري اختبارها. 23 وبالإضافة إلى ذلك، فإنها لا تسمح التقييم الديناميكي للاستجابة بيولوجية كما يتم تقييم التأثير الدوائي في نقطة نهاية محددة. وعلاوة على ذلك، قد تتطلب هذه الطريقة الأسلحة الروبوتية مكلفة إذا تم استخدام HTS الآلي. هذه العوامل تجعل اللونية للقراءة الرافضة أقل توافقا مع هدف HTS بسبب متطلباتهم مرهقة وانخفاض الحساسية. 23 على الرغم من التألق وقد اقترح كبديل لفحوصات اللونية، وتطبيق هذه الاختبارات الانارة في HTS عادة محدودا نظرا لمتطلبات تحلل الخلية. حتى لو كانت على فك بروتوكولات عدم تحلل أخرىveloped، لشدة الإشارة تلألؤ بيولوجي يمكن أن تعرقل العديد من العوامل مثل امتصاص وسيفيرين، وتوافر العوامل المشتركة، ودرجة الحموضة، والشفافية في وسائل الإعلام أو الثقافة أو العازلة، مما تسبب اختلافات بين إشارات تلألؤ بيولوجي الكشف عن والتغيرات الفعلية في النشاط الخلوي. 24 وبالتالي، فإن معظم المقايسات تعتمد على أساليب مضان. في الواقع، تم تطوير المقايسات مقرها الفلورسنت في البداية باستخدام الجزيئات العضوية عالية الفلورسنت صغيرة قادرة على رصد مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية على تنشيط الخلايا. وخلاصة القول، المقايسات الفلورسنت لها حساسية أعلى ويمكن أن تتكيف بسهولة لقياس المظهرية خلال HTS. 23

وHTS أساس الفلورسنت فحص وضعت المقدمة هنا ديه ثلاث مزايا رئيسية. الأول، هو موثوق بها للغاية ومفيد واعتمد لفحص المركبات القادرة على تحوير اثنين من الخلايا الأولية المختلفة (T والخلايا الليمفاوية B) باستخدام نفس stimulaنشوئها / مفهوم تلا. على سبيل المثال، عرض غربلة أولية من 4،398 المركبات، التي أنجزت على مدى خمسة أشواط مختلفة متسقة الناجم عن تفعيل إشارة GFP مع الحد الأدنى من داخل والمتغيرات بين فحص (<5٪ و <15٪ على التوالي عن الخلايا التائية فحص). ثانيا، يستخدم فحص نموذج الفأر وراثيا متوفرة تجاريا. عادة، تصميم مقايسة على أساس مضان يتطلب الهندسة الوراثية من الخلايا الأولية أو خط خلية من الاهتمام من أجل عرض إشارة الفلورسنت على التحفيز. على الرغم من أن هذا النهج يولد أداة مختبر الثمينة، ومن المسلم به عموما يست متاحة بسهولة للمجتمع العلمي. لتجاوز هذا القيد، تم عزل خلايا T و B من الفئران المعدلة وراثيا Nur77 GFP. وميزة هذه الخلايا الليمفاوية هي قدرتها على التعبير عن GFP خلال 24 ساعة على TCR أو BCR التحفيز. لذلك، والمخدرات، وفحص قادرة على تحوير الآلية الانتساخية القيادة التعبير GFP أو عموما الخلويةتمثل استجابة نهج جاذبية. ثالثا، المكمل خلايا T مع حبات CD3 / CD28 في مرحلة تفعيل الأولية يتطلب إزالة هذه الخرز قبل تقييم GFP. وهذا أمر مهم إذا تم استخدام المجهر لتحليل الخلايا التائية تنشيط / تثبيط كما ترك حبات سوف تحجب إلا إشارة GFP. إذا تم استخدام التدفق الخلوي بدلا من التحليل والخرز يمكن أن يترك في الآبار (ما لم يخلق على وجه التحديد قيود إضافية الخلط (ق) إلى فحص) مثل سكانية محددة من الفائدة يمكن بوابات باستخدام كل من يفرق الجانب إلى الأمام و.

وكان الهدف الأولي لتصميم فحص فحص مع معالجة الخلوي الحد الأدنى. في إطار هذا السياق، فإن تفعيل تي أو الخلايا البائية باستخدام splenocytes غير المجزأ حفز مع الخرز أو الأجسام المضادة للذوبان / المؤتلف CD40L على التوالي اقتصر كنسبة كبيرة من الخلايا الليمفاوية بقيت سلبية GFP (الشكل 1). كما هذه الخطوة هو أمر حاسم لنجاحمن الفحص، تم تعديل بروتوكول لتنقية T أو B الخلايا باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا لزيادة نسبة الخلايا معربا عن GFP. تحسن هذا النهج كبير في النتيجة تفعيل كل من السكان الخلية. على الرغم من أن طريقة أخرى لاختيار يمكن استخدامها لT و B العزلة خلية إذا اقتضت الضرورة، والنهج المقترح هو: أ) تكرار للغاية، والثاني) تتكيف بسهولة لتقييم نقاء السكان المعزولين عن طريق التدفق الخلوي قبل HTS، الثالث) والوقت كفاءة كخطوة تنقية قصيرة نسبيا (~ 30 دقيقة)، ويمكن أن يؤديها مع الحد الأدنى من الإعداد. ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن الفحص الواردة في هذه الدراسة تقوم على استخدام خلايا فأر الابتدائي. وينبغي إجراء الثانوي (لأغراض تأكيد) والثالث (التحقق النهائي على الهدف من الفائدة) فحوصات التالية الشاشة الرئيسية للتحقق من صحة الزيارات التي تم تحديدها. على الرغم من أنه يمكن أن تتكيف بسهولة مع مجموعة متنوعة من خطوط مختلفة من الخلايا، والتأثير الدوائي طيضرب dentified بحاجة إلى مزيد من التحقق من الصحة على الأنواع الأخرى (على سبيل المثال الخلايا البشرية - مثال من فحص التعليم العالي) حيث لا توجد السبل الممكنة للتنبؤ آثار مستمرة بين الأنواع. باختصار، هذا الاختبار هو قيمة لتحديد ضربات محتملة جديدة و / أو أهداف جزيئية مع استقراء ممكن من النتائج من المختبر في الاختبارات / الحيوانات إلى البشر.

على الرغم من أن الفحص مصمم يمكن استغلالها لكل من خلايا T و B، وتمنح ميزة واحدة لاستخدام محدد من الخلايا T في هذه الحالة. وعادة ما يتطلب تفعيل TCR التحفيز المزدوج الممنوحة من خلال الأساسي (مثل مكافحة CD3 أو مكافحة TCR) وتفعيل التعاون إشارة (مثل مكافحة CD28) الثانوية. 25، 26 ومن المثير للاهتمام، على حد سواء لمكافحة CD3 وأضداد CD28 يمكن شراؤها ارتباطا مباشرا على سطح حبات مغناطيسية، ويمكن إزالتها من تعليق الخلية باستخدام مغناطيس القياسية قبل أن يضيف رانه المركبات الكيميائية لفحصها في الفحص. كما يتم استخدام مكتبة مع كيانات كيميائية غير معروفة، والإبقاء على تنشيط خلايا T خالية من جزيئات بد أن مجمع TCR بهم قد لحد من أي تداخل محتمل بين مركبات اخضعت للاختبار وأولئك المرتبطون الأخاديد ملزمة TCR. 27 وبالإضافة إلى ذلك، إزالة عامل تحفيز التالية يقلد تنشيط الخلايا T الحالات الفسيولوجية بدلا من العمل مع خلايا T تعرض لتفعيل TCR supraphysiological المستدام. في الحالة الأخيرة يمكن أن يكون مشكلة لأنه قد تجاوز تأثير دوائي من مركب معين وخاصة إذا تم استخدامه بتركيزات ضئيلة في الفرز. كما لا توجد الخرز المتاحة تجاريا تمارس نفس التأثير على الخلايا البائية، سيكون من المثير للاهتمام أن إجراء HTS في اختبار في المستقبل ما إذا كان الوجود المستمر للتحفيز على الخلايا البائية يحد من أداء الاختبار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل صناديق ميرك Frosst البدء المقدمة من جامعة مونتريال. ونود أن نشكر الدكاترة جان Duchaine ودومينيك Salois من منصة عالية الإنتاجية في معهد للبحوث في علم المناعة والسرطان لمن المناقشة والتعليقات والتغذية المرتدة. Moutih رافع يحمل للبحوث أون سانتيه كيبيك جائزة فون جديد 1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B-Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10, (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7, (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11, (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9, (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17, (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13, (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2, (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18, (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208, (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28, (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163, (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1, (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16, (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186, (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9, (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301, (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183, (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157, (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187, (11), 5921-5930 (2011).
ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).More

Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter