Summary
Мы представляем в настоящем исследовании нового флуоресцентного анализа на основе с использованием лимфоцитов, полученных из трансгенной мыши. Этот тест предназначен для высокопроизводительного скрининга (HTS) малых молекул, обладающих мощностью либо ингибирования или содействия активации лимфоцитов.
Abstract
Высокопроизводительный скрининг (HTS) в настоящее время является основой для идентификации химических соединений, способных модулировать биохимические реакции или клеточные процессы. С развитием биотехнологий и высокой поступательной потенциала малых молекул, ряд инновационных подходов в разработке лекарств развились, что объясняет возрождающийся интерес к использованию HTS. Поле онкология в настоящее время наиболее активные исследования области для скрининга лекарственных средств, без большой прорыв сделал для выявления новых иммуномодулирующих соединений, ориентированных на трансплантацию осложнений, связанных или аутоиммунных заболеваний. Здесь мы представляем роман в пробирке мышиного флуоресцентного на основе анализа лимфоцитов легко адаптирован для идентификации новых иммуномодулирующих соединений. В этом анализе используют Т- или В клетки, полученные из трансгенной мыши, в которой промотор Nur77 управляет экспрессией GFP при t- или стимуляции рецептора В-клеток. Как отражает интенсивность GFPактивация / транскрипционной активности клетки-мишени, наш анализ определяет новый инструмент для изучения влияния данного соединения (ов) на клеточных / биологических реакций. Например, первичный скрининг проводили с использованием 4,398 соединений в отсутствие "целевой гипотезы", что привело к идентификации 160 потенциальных хитов, отображающих иммуномодулирующей активностью. Таким образом, использование данного анализа является подходящим для программ поиска новых лекарственных препаратов, исследующих больших химических библиотек до дальнейших исследований в пробирке / в естественных условиях проверки.
Introduction
Высокая пропускная способность скрининга (HTS) является проверенным стратегия широко применяется для идентификации новых терапевтических молекул или репозиционирования FDA утвержденных препаратов в новых медицинских показаний. 1 До сих пор достигнутый успех HTS может быть измерена множеством ранее обнаруженных наркотиков. Например, ингибитор тирозинкиназы лапатиниба, используемый для лечения рака молочной железы, ситаглиптином; дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) ингибитор используют в качестве анти-гипергликемии препарата, и пероральный BCR-ABL ингибитор тирозинкиназы дазатиниб используется для лечения хронического миелолейкоза представляют несколько примеров из длинного перечня утвержденных препаратов, первоначально обнаруженных HTS. 2 Хотя производительность фармацевтической промышленности в последнее время страдает от недостатка в открытии новых химических объектов, вероятность успешного открытия новых лекарств может быть повышена за счет увеличения числа доклинических кандидаTES отображающие модуляторные биологические / биохимические свойства. Соответственно, разработка новых HTS анализов, адаптированных для фенотипического скрининга могли бы предложить потенциал, чтобы обеспечить важные фармакологические средства для открытия новых хитов наркотиков. 3, 4, 5, 6 Кроме того, HTS теперь могут быть выполнены в более быстром темпе из - за значительных технологических преобразований в последние годы в том числе специально разработанных гибких роботизированных установок, новых технологий Считывание и обширной миниатюризации. 2, 7 Среди факторов , способствующих растущий интерес к использованию фенотипического скрининга (он же вперед ФАРМАКОЛОГИЯ) является восприятие , что акцент на функциональных эффектов , а не упрощенными редукционистских предположений относительно молекулярных мишеней (целевых на основе скрининга / биохимических реакций), скорее всего , шо ш клиническая эффективность. Таким образом, фенотипический скрининг держит обещание раскрыть новые потенциально терапевтических соединений и молекулярных механизмов в настоящее время неизлечимых заболеваний. 2
Для правильной идентификации ингибиторов или активаторов для данной молекулярной мишени или клеточной функции, высокочувствительным и надежным анализ необходим для того , чтобы различать добросовестных хитов FIDE и ложных срабатываний. Итак, что делает хороший анализ? Качество данного анализа должны быть сначала судить по соотношению сигнал-шум (отраженный через Z фактор). 8 Во- вторых, целенаправленный эффект или цель экрана должны быть четко определены. Например, функциональные клеточные подходы могут предложить значительные преимущества для скрининга рецепторов, в отличие от анализа, специально предназначенные для оценки связывания лиганд-рецептор. Причина этого заключается в том, что последний подход не может дифференцировать между агонистов и антагонистов лигандов.сс = "Xref"> 9 В отличие от этого , подход на основе клеток, вероятно, будет более эффективным , как функция рецептора может быть непосредственно оценена в биологическом фенотипу (пролиферации, клеточного цикла, апоптоза, и / или дифференцировки). Тем не менее, следует отметить, что биохимические анализы могут обеспечить значительные преимущества по сравнению с фенотипическими анализами, поскольку они нарушают на специфические внутриклеточные мишени. Хорошо оптимизированная биохимический анализ, как правило, имеют меньший разброс данных, чем фенотипического скрининга при одновременном упрощении после исследований, связанных с наркотиками молекулярного механизма действия. Тем не менее, основным недостатком целевых показателей на основе или биохимических анализов является возможность усиливать уровень ложных положительных хитов, которые могут повлиять на неспецифические цели при испытании в биологической системе (потеря специфичности, первоначально изученной в биохимическом анализе). 10 Несмотря на то, хорошо налаженные точка отсечки между отрицательными и положительными хитов можно свести к минимуму число ложных срабатываний яп первичного скрининга, использование физиологически соответствующей системы, имитирующей нативную клеточную среду, таких как интактные клетки, цельной ткани или целого животного остается основой дизайна анализа маятника. Поэтому фенотипический скрининг позволяет открытие свинца с желаемыми биологическими / фенотипических эффектов для заболеваний без каких-либо идентифицированных мишеней для лекарственных средств без предварительного знания о деятельности соединения или способа действия. 11
Исследование здесь, относится к разработке и тестированию оптимизированной и воспроизводимым скрининга фенотипической на основе двух важных компонентов: коммерчески доступной модели мыши и кластерном подсемейство химических соединений. Что касается животной модели, анализ основан на использовании лимфоцитов , полученных из штамма мыши (Nur77 GFP) укрывает бактериальную искусственную хромосому , содержащую кассету , в которой экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) приводится в движение гое Nur77 промотор. 12 Отличительной чертой данной стимуляции основана на том факте , что Nur77 является непосредственным раннего гена повышающей регуляции следующие Т-клеточного рецептора (TCR) или рецептора В-клеток (BCR) стимуляции. 12 Что касается самого метода скрининга, подход был использован , чтобы помочь избежать скрининга тривиальных аналогов при одновременной минимизации времени , необходимого для оценки большой химической библиотеки (> 10 5 соединений). Для этого, база данных химических соединений, выбранных лекарственных химиками с использованием виртуальных инструментов скрининга была использована для выявления топологически подобных соединений, используя известные активные семенные структуры как ссылки. Такой подход позволил нам экран 4398 соединений, представляющих общую библиотеку из более чем 136000 химических объектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы животных были одобрены Animal Care комитета Монреальского университета путем. Мыши были подвергнуты эвтаназии путем постепенного ингаляции СО 2 , пока не жизненно важных признаков не наблюдалось с последующим смещением шейных позвонков. Процедура была выполнена сертифицированным лицом, чтобы гарантировать, что животные были умерщвлены гуманным образом и в соответствии с рекомендациями Канадского совета по уходу за животными.
1. Получение спленоцитов среды и Flow-цитометрии буфера
- Выполните все шаги в соответствии с 70% этанола очищенную биологической капюшоном.
- Удалить 70 мл подогретого Roswell Park Memorial института (RPMI) 1640 1x среда (коммерчески доступный и поставляется в отфильтрованных 500 мл объема стерильные бутылки) и поместить в стерильную пробирку. Снятую среда будет использоваться позже в протоколе.
- Дополнение оставшиеся 430 мл среды RPMI 1640 1x 50 мл инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5мл HEPES, 5 мл несущественные аминокислоты, 5 мл пирувата натрия, и 0,05 мл отфильтрованные (1M) 2-меркаптоэтанола.
Примечание: Предварительно теплая спленоцитов среда с использованием водяной бане при температуре 37 ° С, чтобы избежать тепла шокируя клеток. Это важно, чтобы избежать индукции клеточного апоптоза. - Для подготовки буфера потока цитометрии, добавьте 2 мл ФБС до 98 мл фосфатным буферным раствором (PBS) и хранить в холодильнике до использования (предпочтительно в течение трех дней).
2. Получение спленоцитов суспензии клеток из Nur77 GFP мыши селезенок
- Septically изолировать селезенку от 6-8 недельных самок Nur77 GFP мыши.
- Для достижения этой цели, работают под капотом стерильной. Замочите жертвенного мыши меха, ножницы и пинцет в 70% этаноле.
- Положите мышь на правой стороне, порезать кожу и мышцы в верхнем левом квадранте живота. Осмотрите область разреза, чтобы визуально локализовать селезенку затем вырезать его. Держите селезенкув спленоцитов среде на льду до готовности выполнить следующий шаг.
- Поместите селезенку (ы) в 10 см 2 для культивирования клеток , чашку Петри , содержащую 5 мл подогретого спленоцитов среды.
- Разомните селезенки с помощью стерильного шприца до тех пор, пока раствор не станет мутным. Коллагеновая матрица селезенка должна оставаться в конце процедуры.
- После обширной затирания в спленоцитов среде, собирают клеточную суспензию и передать его через сито 70 ячейки мкм, помещенного на трубке 50 мл отфильтровать любой мусор или сгустки.
- Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. После удаления супернатанта, повторно приостанавливать осадок клеток в 2-3 мл произведенный на заводе или коммерческого красного буфера для лизиса клеток крови. После пипеткой (в 2-3 раза) пусть подвесную отдых в течение 20-30 сек.
- Добавьте 5 мл PBS или подходящий буфер выбора затем центрифугировать клеточной суспензии в течение 5 мин при 500 х г.
- Удалить супернатант (должен быть красным цветом, поскольку она содержит растворенные красные бLOOD клетки) и повторно приостанавливать осадок клеток в 2 мл среды спленоцитов.
- С помощью гемоцитометра, подсчитывают количество клеток, окрашенных трипановым синим, чтобы различать между живыми и мертвыми (некротизированных) клеток.
3. Выделение Т-клеток из клеточной суспензии спленоцитов
- Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 500 х г. Повторное приостановить клеток в свободной от сыворотки среде RPMI среде (50 мл со стадии 1.3) , чтобы получить клеточную концентрацию 10 х 10 6 клеток / мл.
- Передача клеток в 5 мл полистирола трубки и выделить 100 мкл аликвоты спленоцитов чистоты оценки / сравнения в конце стадии очистки.
- Добавить нормальной крысиной сыворотки к клеточной суспензии при концентрации 50 мкл / мл с последующим Т клеток изоляции антитела коктейль (50 мкл / мл).
- Смешайте суспензии клеток и дайте ему отдохнуть в течение 10 мин. Этот шаг позволяет смесь антител связывать все нежелательные клетки.
- Добавьте стрептавидином быстрые сферы (магнитIC гранулы), в течение 2,5 мин, а затем довести объем до 2,5 мл с использованием бессывороточной среды.
- Поместите пробирку в изолятор магнита в течение 3 мин.
- Перенесите клеточную суспензию Т в новую пробирку из полистирола, держа магнит и изливая решение в один ход.
Примечание: Выделенную суспензия содержит очищенные Т-клетки. Все нежелательные клетки удерживаются на стороне трубки, связанной с магнитными стрептавидином бусин. - Количество выделенных Т - клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометра.
Примечание: На этом этапе чистота выделенных Т - клеток может быть проверено ( по желанию), анализируя процент CD3 + событий до и после выделения Т - клеток с помощью проточной цитометрии. 13- В кратком изложении, центрифуга 1 мл клеточной суспензии спленоцитов при 500 х г. Жидкость над осадком сливают и суспендирования клеток в проточной цитометрии буфере при концентрации 1 × 10 6 клеток / мл.
- Добавить флуоресцентно меченого анти-МОДе CD3-антитело в концентрации 1: 100. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Мыть один раз, центрифугу и вновь приостановить в проточной цитометрии буфере (400 мкл) дл анализа методом проточной цитометрии.
4. Выделение В-клеток из клеточной суспензии спленоцитов
- Следуйте за один и тот же протокол , как описано для Т - клеток (шаги 3,1-3,8) , но с использованием набора для выделения В-клеток. Для оценки степени чистоты, использовать CD19 антитело вместо антитела CD3. 13
- Для оценки степени чистоты (по желанию), используйте антитело CD19 вместо антитела CD3. Центрифуга 1 мл клеточной суспензии спленоцитов при 500 х г. Жидкость над осадком сливают и суспендирования клеток в проточной цитометрии буфере при концентрации 1 × 10 6 клеток / мл.
- Добавить флуоресцентной меченый анти-CD19 антитела мыши в концентрации 1: 100 и инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин. Вымойте один раз, центрифугу и вновь приостановить поток-цитометрии буфере (400 мкл) FoАнализ г методом проточной цитометрии.
5. Активация Т-клеток и индукции экспрессии GFP
- Семенной Т - клетки, в виде суспензии, в круглым дном 96-луночного планшета при концентрации 2,5 х 10 5 клеток / лунку.
- Добавить рекомбинантный интерлейкин (IL) -7 на 2 нг / мл и CD3 / CD28 магнитных шариков (25 мкл / 10 6 клеток). Держите часть Т-клеток, не обработанных бусинок, чтобы служить в качестве отрицательного контроля для последующих измерений, представляющих неактивированных Т-клеток.
- Через двенадцать часов, урожай Т-клетки из 96-луночного планшета, осторожно пипеткой клеточной суспензии в каждую лунку вверх и вниз, чтобы разорвать любые шарик-клеточный комплекс / агрегатов. Сбор суспензии из всех лунок в полистирола пробирку 5 мл.
- Поместите пробирку, содержащую суспензию внутри той же изоляции клеток магнит, используемый ранее для очистки Т или В-клеток и дайте ему отдохнуть в течение 5 мин.
- Передача клеточной суспензии T Intоа новый полистирол трубки, держа магнит и изливая решение в один ход.
- Центрифуга клетки при 500 мкг в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в свежей среде спленоцитов для получения концентрации 2 х 10 6 клеток / мл.
- Оценка интенсивности экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии (опция для контроля качества) при 12 до 24 ч после стимуляции по сравнению с неактивированных Т-клеток. 12
ПРИМЕЧАНИЕ: GFP флюоресценции присущего Nur77 GFP Т - клеток и проявляется при успешной активации TCR. 12 - Для оценки жизнеспособности и активации (по желанию) с помощью микроскопа, окрашивают активированные клетки с Hoechst 30 минут до анализа при концентрации 0,2 мкг / мл. Добавьте соответствующий объем клеточной суспензии к сопроводительным слайде или в лунку с плоским дном, черно-сторонний 384-луночный планшет и исследовать под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить живые клетки. Мертвые клетки не будет сохранять ядерноеокрашивание. 14
6. Активация В-клеток и индукции экспрессии GFP
- С помощью культуральный флакон Т-25, вновь приостановить обособленные В - клеток в количестве 1 × 10 6 клеток / мл.
- Добавить антимышиного IgG / IgM (H + L) в количестве 10 мкл / мл и рекомбинантную CD40L при концентрации 200 нг / мл. Ведите часть В-клеток необработанными, чтобы служить в качестве отрицательного контроля для последующих измерений (представляющих неактивированных В-клеток).
- Оценка интенсивности экспрессии GFP с помощью проточной цитометрии на 12 или 24 ч после стимуляции по сравнению с неактивированных В-клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: GFP флуоресценции присуща клеткам Nur77 GFP B и проявляется при успешной активации BCR. 12 - Для оценки жизнеспособности и активации (по желанию) с помощью микроскопа, окрашивают активированные клетки с Hoechst 30 минут до анализа при концентрации 0,2 мкг / мл. Добавьте достаточный объем клеточной суспензиикрышка слайд или в лунку с плоским дном, черно-сторонний 384-луночный планшет и исследовать под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить живые клетки. Мертвые клетки не будет сохранять ядерное окрашивание. 14
7. высокопроизводительный скрининг малых молекул
- Приготовьте суспензию клеток в 2 х 10 6 клеток / мл активированных Т - или В - клеток (магнитные шарики или антитела / CD40L) или неактивированные групп.
- Пластинчатые 75000 клеток / лунку в 384-луночный планшет (объем 40 мкл). Используйте плоским дном черно-сторонний 384-луночного планшета или титульного слайда микроскопа для жизнеспособности и активации оценки с помощью флуоресцентной микроскопии (необязательная стадия контроля качества до HTS) с использованием Hoechst пятно (см шаги 5.8 и 6.4 для деталей). 14
- Вручную или с помощью автоматизированной системы, добавьте препаратами выбора (растворенного в 0,5% ДМСО) в каждую лунку.
- Добавить транспортное средство (ДМСО) к положительному (активации) и отрицательной (не-ACTiстар.кон.п) контрольные лунки. Регулировка концентрации ДМСО до максимум 0,5%.
- Инкубируйте пластин в течение 24 ч (или инкубирования время выбора) при 37 ° С и 5% CO 2.
- В день скрининга, разбавить Hoechst 33342 раствор морилки (1:. 3333; в течение , например 10 мкл к клеткам в 384-луночные планшеты для генерации общего объема до 50 мкл). Пятно 30 мин перед анализом GFP добавлением раствора Hoechst для достижения концентрации 0,2 мкг / мл.
- Аккуратно пипетки клетки вверх и вниз, чтобы получить равномерное распределение в каждую лунку.
Примечание: Этот шаг важен в случае дозирования препаратов (этап 7.3) с помощью автоматизированной системы, так как клетки, как правило, накапливаются на одной стороне скважины, противоположном направлению потока. - Спин пластины при 45 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Оставьте пластин на отдых в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Выполните пластины (ы) для чтения аутов, используя автоматизированные конфокальной высокое содержание Screрение (HCS) система. 15 Загрузите пластину к машине. Установите цель на 40х или большем увеличении. Используйте камеру # 4 для Hoechst (УФ-лампа) и камеры # 1 для GFP (лазер 488). Настройка машины для чтения 6-10 полей на лунку. Отрегулируйте машину, чтобы сделать два последовательных чтений в поле зрения при 488 нм (для чтения GFP) и УФ-излучения (читать Hoechst). Установите цель на 40х или большем увеличении.
Примечание: Система представляет собой компьютеризированную микроскоп, который не требует каких-либо корректировок. Фокусное расстояние, интенсивность падающего света и времени экспозиции все установки автоматически машиной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дизайн анализа HTS
Два важных фактора были приняты во внимание при разработке флуоресцентного анализа в настоящем документе. Во- первых, нам нужно повторить физиологического состояния , в котором активация клеток Т- или В будет представлять собой недугом (например , трансплантат против хозяина заболевания). Во-вторых, оценка клеточной активации должна быть выполнена с использованием чувствительного и количественного метода. Флуоресцентная сегодня является одним из первичного выбора для HTS чтения аутов, поскольку это соответствует этим потребностям. 10, 16 Как надежный GFP считывания могут быть получены следующие Nur77 GFP -derived Т или В - клеток стимуляции как в пробирке или в естественных условиях, 12 наш анализ использовали эту стратегию , чтобы различать неактивированных и активированных клеток в качестве рабочей модели для Identification иммуномодулирующих соединений.
Первоначально, дизайн нашего анализа был основан на оценке GFP с помощью проточной цитометрии с использованием нефракционированного стимулированных спленоцитов. В этом случае оба неактивированных / активированных Т и В-клетки окрашивали анти-CD3 или анти-CD19, соответственно перед оценкой GFP. Как показано на рисунке 1А, Т - клетки (CD3 + клетки) составляют примерно 30% данной селезенки мыши. В устойчивом состоянии, уровень GFP находился в диапазоне от 10% (скорее всего, из-за пост-тимуса отбора через TCR в процессе разработки или гомеостатической стимуляции на периферии). После стимуляции TCR , используя / CD28 шарики CD3, пяти-шестикратное увеличение доли экспрессии GFP (57% вместо 10%) был обнаружен в CD3 + Т - клеток (Фигура 1А - В). Кроме того, В - клетки (CD19 + клетки) представляют собой 50-55% от общего количества спленоцитов и их базальной GFP ехприжимное сравнима с неактивированных Т - клеток (например , ~ 10%, рис 1C). Интересно отметить , однако, BCR стимуляция с помощью анти-мышь IgG / IgM и рекомбинантного CD40L вызвало тривиальное увеличение экспрессии GFP (33% вместо 12%, фиг.1С - D). Как выражение GFP является ключевым элементом для оценки фармакологического эффекта экранированных малых молекул на активированных Т или В-клеток, оптимизируя его интенсивность имеет центральное значение для чувствительности и успех скрининга.
Оценка экспрессии GFP с использованием очищенных или Т-лимфоциты
Несмотря на то, Т и В клеточной стимуляции может быть достигнуто непосредственно с использованием нефракционированного спленоцитов, интенсивность экспрессии GFP, не было достаточно чувствительным для скрининга особенно если выводы значений должны быть выполнены с помощью микроскопии. Для того, чтобы улучшить клеточный ответ, Т-клетки сначала очищают с помощью магнитнойбусинки с использованием коммерчески доступного набора (фиг.2А). Как было показано ранее , используя нефракционированного спленоцитов, 10% изолированных CD3 + Т - клеток были положительными GFP (основной экспрессии). В этом контексте, Т стимуляция клеток с использованием CD3 / CD28 бусинки значительно улучшили свой отклик GFP (Фигура 2А - 2В, 86% по сравнению с 57% , когда использовались нефракционированные спленоциты). Аналогичные улучшения были получены с В - клетками (фиг.2С - 2D, на 80% вместо 33%). Эти результаты ясно показывают, что использование очищенных T- и В-клеток, обеспечивает максимальную экспрессию GFP, который подходит для предлагаемого скрининга фенотипической.
Принципиальная схема разработанного HTS анализа
В целом, анализ может быть подразделена на четыре основных раздела (Рисунок 3). В случае Т-клеток, к примеру, спленоцитовСуспензию клеток готовят с целью очистки Т - клеток (шаги 1-3) , с последующей стадией стимуляции 12 ч в пробирке с использованием CD3 / CD28 бусин (шаги 4-5). Активированные Т-клетки затем высевали и культивировали в течение 24 часов с небольшими молекулами выбора в 384-луночные планшеты (шаги 6-7) до оценки GFP и Hoechst интенсивности с использованием автоматизированной системы HCS. Такой же анализ может быть использован для В-клеток с изменениями, выполняемые на этапах 4-5. В кратком изложении, В-клетки могут быть стимулированы анти-мышиного IgG / IgM и рекомбинантного CD40L вместо бусинок. Так как эти компоненты используются в их растворимой форме (например , не связаны с бусинами), В - клетки можно инкубировать в течение 12 ч , а затем просто промытых до обшивки в 384-луночные планшеты для процесса отбора.
Эффективное выживание Т-клеток изначальна для успеха исследования HTS. Соответственно, два ограничивающих факторов может препятствовать качество анализа и должны быть приняты во внимание. ПервыйМышиные Т - клетки очень чувствительны к апоптозу после стимуляции в пробирке. 17 Во- вторых, все тестируемые соединения разводят в растворе ДМСО, который мог бы добавить второй стрессовый фактор. Для того, чтобы свести к минимуму потерю клеток, рекомбинантный IL-7 (2 нг / мл), дополненной Т-клеткам при TCR стимуляции на этапах 4-5. Этот цитокин гомеостатической поддерживает пролиферацию и повышает выживаемость Т-клеток посредством экспрессии анти-апоптотических молекул, таких как Bcl-2, Bcl-X L и MCL-1. 18, 19, 20, 21, 22
Первичная высокая пропускная способность скрининг 4398 соединений обнаруживает несколько активаторов и ингибиторов активации Т-клеток
Высокая пропускная способность скрининга была проведена металлизированный 75000 неактивированной (отрицательное соуправляете) или активированные Т - клетки (положительный контроль) , как показано на рисунке 4. Для того, чтобы обеспечить высокую воспроизводимость, анализ проводили несколько раз с полученным Z коэффициентом 0,87 (фиг.5А), С помощью системы HCS, наблюдаемое выражение GFP , стимулированных Т - клеток была в 20 раз выше , чем стимулированных Т - клеток , что позволяет генерацию 'окна действия' 'зоны , где ингибирующие соединения GFP может быть легко обнаружено (рис 5А). Это показано на рисунке с точки зрения числа флуоресцирующих клеток, деленное на общее число клеток в сканированных полей. В примере , показанном на фиг.5А, экранировка 320 соединений представили три соединения (заостренной замыканию, красными стрелками) , способные ингибировать экспрессию GFP 1,5-2,5 складок. В этом примере, положительное контрольное значение было 0,44 ± 0,02 и отрицательный контроль составляло 0,02 ± 0,00.
Thе скрининг в общей сложности 4398 соединений (Z фактор 0,85) Затем проводили. Соединения были отобраны лекарственными химиками как семенных / репрезентативных соединений на основе их химической структуры , представляющие общую химическую библиотеку , содержащую 136000 объекты (Рисунок 5б). В конце анализа, анализа ингибирования GFP идентифицированы соединения, способные ингибировать либо (положительных девиаторов) или усиление экспрессии GFP (отрицательные девиаторами).
Рисунок 1: Анализ Т- и экспрессии GFP B-клеток после активации TCR или BCR , проведенного на нефракционированного спленоцитов. (A) , репрезентативный анализ проточной цитометрии Т - клеток , окрашенных антителом анти-CD3 с использованием спленоцитов в отсутствие (верхняя левая панель) или в присутствии CD3 / CD28 бусин (верхняя правая панель). выражение GFP для обеих групп Т-клеток отображаютсявнизу. (Б) Процент экспрессии GFP , полученного с помощью проточной цитометрии анализа Т - клеток. Столбики ошибок представляет собой среднее ± стандартное отклонение. (C) По аналогии с (А) , за исключением , что спленоциты были активированы с помощью анти-IgG мыши / IgM и рекомбинантный CD40L затем окрашивали на CD19. (D) Процент экспрессии GFP , полученного с помощью проточной цитометрии анализа В - клеток. Столбики ошибок представляет собой среднее ± стандартное отклонение. Все представленные эксперименты повторяли по меньшей мере три раза (п = 5 / группа; * Р <0,05 и *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Анализ экспрессии GFP с использованием очищенных Т или В - клеток следующий TCR или BCR активации соответственно. (A) Representative анализ проточной цитометрии очищенных Т-клеток, окрашенных антителом анти-CD3. Для индукции GFP, очищенные Т-клетки стимулировали с использованием CD3 / CD28 бусы (верхняя правая панель). Неактивированной контроль Т-клетки показаны в верхней левой панели. GFP экспрессии обоих неактивированных и активированных Т-клеток, отображается в нижней части. (Б) Процент экспрессии GFP , полученного с помощью проточной цитометрии анализа Т - клеток. Столбики ошибок представляет собой среднее ± стандартное отклонение. (С) По аналогии с (А) , за исключением того, что чистота В - клеток оценивали с помощью CD19 окрашивания и активировать с помощью анти-мышь IgG / IgM и рекомбинантного CD40L. (D) Процент экспрессии GFP , полученного с помощью проточной цитометрии анализа В - клеток. Столбики ошибок представляет собой среднее ± стандартное отклонение. Все представленные эксперименты повторяли по меньшей мере три раза (п = 5 / группа и *** р <0,001). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличеннуюверсия этой фигуры.
Рисунок 3: Общая схема , представляющая этапы скрининга фенотипической. Есть 7 основных шагов, необходимых для подготовки анализа HTS. Женщина Nur77 GFP мышь умерщвляют , чтобы изолировать его селезенку (шаг 1). После генерацию спленоцитов суспензии клеток (стадия 2), Т-клетки отрицательно изолированы (истощением нежелательных клеток) с использованием коммерчески доступного набора (этап 3). Изолированные Т-клетки затем инкубируют с рекомбинантным IL-7 в отсутствие или в присутствии CD3 / CD28-бусинок в круглым дном 96-луночного планшета при 37 ° С (этап 4). Через двенадцать часов (стадия 5), Т-клетки пипеткой несколько раз, чтобы смещать любых агрегатов перед удалением бусинами, используя тот же магнит выделения клеток, используемый первоначально для очистки Т-клеток. Изолированные Т-клетки затем высевали в 384-луночные планшеты (75 000 челLs / лунку, шаг 6) с соединениями в течение еще 24 ч (шаг 7). На следующий день, инкубированные клетки окрашиваются Hoechst 30 мин перед проведением анализа с помощью системы HCS (этап 8). Та же установка может быть прослежены для подготовки анализа на основе клеток Б за исключением того, что стадию 4 и 5, должны быть заменены простой промывкой, как стимуляторы добавляют в растворимые формы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Схема для обшивки Т - клеток в 384-луночных планшетах. Каждая пластина, используемая в анализе содержал три группы. В первой группе, лунки были загружены неактивированных Т-клеток (отрицательный контроль за GFP по каждой стороны пластины, лунки А1-P1 и А24-Р24), в то время как вторая группа состояла из активированные Т-клетки без DruГ.С. (положительный контроль для GFP; скважины A2-P2 и A23-P23). Все остальные лунки, содержащие активированные Т-клетки, дополненного химических соединений, используемых в скрининге. Все лунки содержали 0,5% ДМСО. Примеры сигналов GFP и Hoechst показаны на неактивированных и активированных Т-клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Первичный скрининг фенотипический. (А) репрезентативный пример первичного скрининга выполненного на 320 соединений. Неактивированных Т-клетки являются почти нулевой GFP в отличие от ТКС-стимулированных Т-клеток, которые дисплей 20 раз выше выражение GFP. (Б) Совокупные данные всех соединений скринингу с использованием анализа. Выражение GFP демонстрирует ди соединенийsplaying тормозящее действие, тогда как другие соединения вели себя как стимуляторы Т-клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует несколько способов чтения из эксплуатировались для развития чувствительных и надежных HTS анализов. К ним относятся колориметрический, люминесцентный или флуоресцентные методы. Хотя колориметрические методы просты в настройке, они требуют несколько добавок химических веществ, которые могут препятствовать или нарушать работу клетки проходят испытания. 23 Кроме того, они не позволяют динамической оценки биологической реакции , как фармакологический эффект оценивается в определенной конечной точке. Кроме того, этот метод может потребовать дорогостоящих роботизированные руки при использовании автоматических СНД. Эти факторы делают колориметрические для чтения ауты менее совместимы с целью HTS в связи с их громоздкими требованиями и низкой чувствительности. 23 Несмотря на то, свечение было предложено в качестве альтернативы колориметрического анализа, применение этих тестов люминесцирующих в HTS, как правило , ограничено из - за требования к лизису клеток. Несмотря на то, другие протоколы не-лизиса были исключенывитых, интенсивность сигнала биолюминесценции может быть затруднено многими факторами, такими как поглощение люциферин, наличие сопутствующих факторов, рН и прозрачность культуральной среды или буфера, в результате чего расхождения между обнаруженными биолюминесценции сигналов и фактическими изменениями в клеточной активности. 24 Таким образом, большинство анализов полагаются на флуоресцентных методов. На самом деле, флуоресцентные анализы на основе первоначально были разработаны с использованием небольшие, высоко-флуоресцентных органических молекул, способных обеспечить мониторинг различных клеточных процессов при активации клеток. В целом, флуоресцентные анализы имеют более высокую чувствительность и могут быть легко адаптированы для фенотипических измерений во время HTS. 23
Разработанный флюоресцентные на основе HTS анализа, представленные здесь имеет три основных преимущества. Во-первых, он обладает высокой надежностью, воспроизводимый и был принят для скрининга соединений, способных модулировать два различных первичных клеток (Т и В-лимфоцитов) с использованием того же StimulaТион / считывание концепции. Например, первичный скрининг 4,398 соединений, которое было завершено в течение пяти различных трасс отображается последовательный Вызванные активацией GFP сигнала с минимальным внутри- и между анализами вариабельности (<5% и <15%, соответственно, для анализа Т-клеток). Во-вторых, анализ использует коммерчески доступный трансгенной мышиной модели. Как правило, конструкция флуоресцентного анализа на основе требует генной инженерии первичных клеток или клеточной линии, представляющей интерес, чтобы отобразить флуоресцентный сигнал после стимуляции. Хотя такой подход создает драгоценный лабораторный инструмент, как правило, не всегда доступны для научного сообщества. Чтобы обойти это ограничение, Т- и В - клетки были выделены из трансгенных мышей Nur77 GFP. Преимущество этих лимфоцитов является их способность выражать GFP в течение 24 ч при TCR или BCR стимуляции. Таким образом, скрининг лекарственные средства, способные модулировать транскрипционный механизмы запуска экспрессии GFP или общий клеточныйОтвет представляет собой привлекательный подход. В-третьих, дополняя Т-клеток с CD3 / CD28 шариков в их начальной фазе активации требует удаления этих шариков перед оценкой GFP. Это важно, если микроскопия используется для анализа Т-клеток, активацию / торможение, как оставить шарики будут в противном случае маскировать сигнал GFP. Если поток-цитометрии используется вместо того, чтобы для анализа, шарики можно оставить в скважинах (если это специально не создает дополнительных усложняющих ограничение (ы) для анализа) в качестве специфической популяции интерес может быть закрытого типа с использованием как вперед, так и боковые рассеивает.
Первоначальная цель заключалась в разработке скрининге с минимальной клеточной обработки. Под этой связи, активация Т или В - клеток с использованием нефракционированного спленоцитов , стимулированных бусин или растворимых антител / рекомбинантного CD40L соответственно было ограничено как большая доля лимфоцитов остается GFP отрицательные (Рисунок 1). Поскольку этот шаг имеет решающее значение для успехаиз анализа, протокол был изменен, чтобы очистить Т или В-клеток с использованием коммерчески доступных наборов увеличить процент GFP-экспрессирующих клеток. Такой подход значительно улучшает результат активации обеих клеточных популяций. Хотя еще один метод выбора может быть использован для изоляции Т- и В-клеток, если будет сочтено необходимым, предложенный подход: I) высокой воспроизводимостью, II) легко адаптировать для оценки чистоты изолированной популяции с помощью проточной цитометрии до HTS, III) и время эффективно, как на стадии очистки является относительно коротким (~ 30 мин) и могут быть выполнены с минимальной подготовкой. Тем не менее, следует отметить, что анализ представлен в данном исследовании, основана на использовании первичных клеток мышей. Вторичный (для целей подтверждения) и третичной (конечная проверка на мишень интереса) анализов следует проводить после основной экран для проверки выявленных хитов. Хотя это может быть легко адаптирован к множеству различных клеточных линий, фармакологический эффект Identified хитов нуждается в дальнейшей проверке на других видов (например , человеческие клетки - например , третичного анализа) , поскольку нет возможных способов предсказать устойчивые эффекты между видами. Короче говоря , этот анализ является ценным для выявления новых потенциальных хитов и / или молекулярных мишеней с возможной экстраполяцией результатов от ин витро / тестах на животных для человека.
Даже при том, что разработан анализ может быть использован как для Т-и В-клеток, одно преимущество присваивается в конкретном случае Т-клеток в этом случае. Активация ТКС обычно требует двойной стимуляции , присвоенное через первичный (например , анти-CD3 или анти- TCR) и вторичное взаимодействие активирующий сигнал (например , анти-CD28). 25, 26 Интересно, что и анти-CD3 и анти-CD28 антитела могут быть приобретены непосредственно связаны на поверхности магнитных гранул, и могут быть удалены из клеточной суспензии с использованием стандартного магнита перед добавлением Tон химических соединений, тестируемых в скрининге. Как библиотека с неизвестными химическими компонентами используется, подпорные активированные Т-клетки свободных молекул, связанных с их TCR комплекса может свести к минимуму любые возможные помехи между тестируемых соединений и теми, которые связаны со связывающими канавками TCR. 27 Кроме того, удаление стимулирующего агента после мимике активации Т - клеток физиологических ситуаций в отличие от работы с Т - клетками , подвергнутых длительной супрафизиологического активации TCR. Последняя ситуация может быть проблематичным, так как это может переопределить фармакологический эффект данного соединения, особенно если он был использован в небольших концентрациях в скрининге. Поскольку нет коммерчески доступные шарики, оказывающие такой же эффект на В-клетках, было бы интересно, чтобы выполнить HTS в будущем тестирование ограничивает ли постоянное присутствие стимула на В-клетках эффективность анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Merck Frosst Start-Up средства, предоставленные Университета Монреаля. Мы хотели бы поблагодарить Докторов Жан Дюшен и Доминик Salois с высокой пропускной способностью платформы в Институте исследований в области иммунологии и рака для их обсуждения, комментарии и отзывы. Moutih Рафеи держит Fonds де-ла-Recherche ан Sante Квебека Младший 1 премии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
