Summary
Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.
Abstract
Yüksek verimli tarama (HTS) halen biyokimyasal reaksiyonları veya hücresel süreçleri modüle edebilen bileşiklerin kimyasal tanımlanması için dayanak noktası. biyoteknolojiler ilerlemesi ve küçük moleküllerin yüksek öteleme potansiyeli ile ilaç keşfi yenilikçi yaklaşımların bir dizi HTS kullanımında dirilen ilgi açıklıyor, gelişmiştir. onkoloji alan şu anda transplantasyon ilişkili komplikasyonlar ya da otoimmün hastalıkları hedefleyen yeni immünmodülatör bileşikler belirlenmesi için yapılan hiçbir büyük bir atılım ile ilaç taraması için en aktif araştırma alanıdır. Burada, nitro sıçangil floresans esasına dayalı bir lemfosit deneyinde yeni kolayca yeni bağışıklık bileşimlerin belirlenmesi için uyarlanmış sunuyoruz. Bu deney, Nur77 promotör T veya B-hücresi reseptör uyarılması üzerine GFP ekspresyonu sağlayan transgenik bir fare, elde edilen T veya B hücreleri kullanır. GFP yoğunluğu yansıtırhedef hücre aktivasyonu / transkripsiyon aktivitesi, bizim deney hücre / biyolojik yanıt verilen bileşik (ler) etkilerini incelemek için yeni bir araç tanımlar. Örneğin, bir birincil tarama bağışıklık aktivitelerini gösteren 160 potansiyel hit tanımlanmasına yol açan bir "hedef hipotezi" yokluğunda 4.398 bileşikler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu durumda, bu deneyde kullanılması, in vitro / in vivo doğrulama çalışmaları daha da önce geniş kimyasal kütüphanelerin keşfetmek ilaç keşfi programları için de uygundur.
Introduction
Yüksek verimli tarama (HTS) yaygın yeni tedavi moleküllerin tanımlanması için ya da yeni tıbbi endikasyonlarda FDA onaylı ilaçların yeniden konumlandırılması için kabul edilen kanıtlanmış bir stratejidir. 1. Şu ana kadar elde edilen HTS başarısı, daha önce keşfedilen ilaçların bolluk ile ölçülebilir. Örneğin, bir tirosin kinaz inhibitörü, Lapatinib, göğüs kanseri, sitagliptin tedavisinde kullanılan; dipeptidil peptidaz-4 (DPP-4) inhibitörü, bir anti-hiperglisemik ilaç olarak kullanılır ve kronik miyeloid lösemi tedavisi için, oral Bcr-Abl tirozin kinaz önleyici dasatinib başlangıçta tarafından keşfedilen onaylanmış ilaçlar uzun bir liste birkaç örneği temsil eder HTS. İlaç endüstrisinin verimliliği son zamanlarda yeni kimyasal yapılar keşfi eksikliğinden muzdarip olmasına rağmen 2, başarılı ilaç keşfi olasılığı klinik öncesi Candida sayısında bir artış ile geliştirilebilirdüzenleyici biyolojik / biyokimyasal özelliklerini gösteren tes. Buna göre, fenotipik tarama için uyarlanmış yeni HTS tahlillerin gelişimi yeni ilaç hit keşfi için önemli farmakolojik araçlar sağlamak için potansiyel sunabilir. 3, 4, 5, 6 Ayrıca, HTS şimdi nedeniyle özel tasarlanmış esnek robot tesisler, roman okuma-out teknolojileri ve kapsamlı minyatür dahil son yıllarda önemli teknolojik dönüşümlere daha hızlı bir tempoda yapılabilir. Fenotipik tarama (aka ileri farmakoloji) kullanımında artan ilgi katkıda faktörler arasında 2, 7 fonksiyonel etkileri ziyade moleküler hedeflerin (hedef tabanlı tarama / biyokimyasal reaksiyonların) ile ilgili basitleştirilmiş indirgemeci varsayımlara odaklanarak daha muhtemel olduğunu algı sho için w klinik etkinliği. Böylece, fenotipik tarama yeni potansiyel tedavi bileşikler ve şu anda tedavi edilemeyen hastalıkların moleküler yollar ortaya çıkarmak için umut vaat ediyor. 2
Düzgün bir şekilde, belirli bir moleküler hedef ya da hücre fonksiyonu için inhibitörler ya da aktivatörler belirlemek için, son derece hassas ve güvenilir bir analiz niyetli lan ve yanlış pozitif arasında ayrım yapmak için gereklidir. Peki, iyi bir tahlil yapar? Belirli bir testin önce kalite (Z faktörü yansıtıldığı) sinyal-gürültü oranı ile değerlendirilmelidir. 8 İkinci olarak, hedeflenen etki veya ekranın hedefi açıkça belirlenmelidir. spesifik ligand-reseptör değerlendirmek için tasarlanmış bir tahlil karşı Örneğin, fonksiyonel hücre bazlı yaklaşımlar reseptör taranması için önemli avantajlar sunabilir. Bunun nedeni ikinci yaklaşım agonist ve antagonist ligandlar ayırt edemez olmasıdır.P = "xref" tersine> 9, hücre bazlı bir yaklaşım, reseptör fonksiyonu, biyolojik bir fenotip ile değerlendirilebilir daha etkili olması muhtemeldir (çoğalması, hücre döngüsünün durması, apoptoz ve / veya farklılaşma). Bununla birlikte, belli bir hücre içi hedef ihlal olarak biyokimyasal denemelerde, fenotipik testlere göre önemli avantajlar sağlayabilir belirtmek gerekir. Daha sonra eylem ilaç moleküler mekanizmasına ilişkin soruşturmalar basitleştirilmesi sırasında bir iyi optimize biyokimyasal tahlil genellikle fenotipik tarama daha az veri dağılım olacaktır. Bununla birlikte, hedef bazlı veya biyokimyasal deneylerin büyük dezavantajı, bir biyolojik sistem (orijinal biyokimyasal deneyde incelenmiştir özgüllük kaybı) test edildiğinde, spesifik olmayan hedeflerini etkileyen yanlış pozitif isabet oranı çoğaltabilen şanstır. 10 negatif ve pozitif isabet arasında köklü bir kesme noktası yanlış pozitiflerin sayısını en aza rağmen benn primer tarama gibi sağlam hücreler, tüm doku veya bütün hayvan gibi yerli hücresel ortamı taklit bir fizyolojik ilgili sisteminin kullanılması tahlil tasarımı sarkacın çekirdek kalır. Bu nedenle, fenotipik tarama bileşiğin etkinliğinin ya da etki mekanizmasına önceden bilgi sahibi olmadan tanımlanmış ilaç hedefleri ile hastalıklar için arzu / biyolojik fenotipik etkileri ile baş keşif sağlar. 11
ticari olarak satılan fare modeli ve kimyasal bileşiklerin bir kümelenmiş alt ailesi: Burada çalışma iki önemli bileşenleri dayalı optimize edilmiş ve tekrarlanabilir fenotipik tarama geliştirme ve test ilgilidir. Hayvan modeli ile ilgili olarak, deney yeşil flüoresan protein (GFP) sentezleme th tarafından tahrik edilen, bir fare suşu (Nur77 GFP) bir kaset içeren bir bakteriyel suni kromozom barındıran türetilen lenfositlerin kullanımına dayanıre Nur77 promoteri. 12, bu uyarım damgasını Nur77 T-hücre reseptörü (TCR) veya B-hücresi reseptörü (BCR) uyarımını takiben up-regüle hemen erken gen olduğu gerçeğine dayanmaktadır. Tarama yöntemi kendisi de 12, bir yaklaşım büyük kimyasal kütüphane (> 10 5 bileşikler) değerlendirmek için gerekli olan zamanı en aza indirirken, önemsiz analoglarının tarama kaçınarak yardım etmek için kullanıldı. Bunu yapmak için, bir sanal eleme araçlarını kullanarak ilaç kimyacılar tarafından seçilmiş kimyasal bir bileşik veritabanı referans olarak bilinen aktif tohum yapıları kullanan topolojik içindeki bileşiklerin belirlenmesi için kullanılabilir edildi. Bu yaklaşım bize 136.000 üzerinde kimyasal varlıkların genel bir kütüphane temsil 4.398 bileşiklerin taranması için izin verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri Université de Montréal Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı. Fareler Hayati işaretler, servikal dislokasyon gözlenene kadar, CO 2 aşamalı inhalasyonu ile ötenazi yapıldı. Prosedür hayvanlar insani bir şekilde ötenazi ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi önerileri doğrultusunda emin olmak için bir sertifikalı kişi tarafından yürütülmüştür.
Splenocyte Orta ve Akış sitometri Buffer 1. Hazırlık
- % 70 etanol-temizlenir biyolojik kaputun altındaki tüm adımları uygulayın.
- önceden ısıtılmış Roswell Park Memorial Enstitüsü 70 mL (RPMI) steril bir tüp içinde (piyasada mevcut ve filtre 500 ml hacim steril şişelerde verilir) ve yer 1640 1x ortamı çıkarın. kaldırıldı orta protokolünde daha sonra kullanılacaktır.
- 50 mi ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 5 ml penisilin / streptomisin, 5, RPMI kalan 430 ml 1.640 1x EkmL Hepes, 5 mi temel olmayan amino asitler, 5 ml sodyum piruvat, ve süzüldü 0.05 ml (1 M) 2-merkaptoetanol.
NOT: Isı şok hücreleri önlemek için 37 ºC ayarlanmış bir su banyosu kullanılarak Pre-sıcak splenosit ortamı. Bu hücresel apoptoz indüksiyonu önlemek için önemlidir. - Akış sitometri tampon hazırlanması 98 ml fosfat tamponlu salin (PBS) ile FBS 2 ml ilave edilir ve kullanıma kadar (tercihen içinde üç gün) frigorifik tutmak.
Nur77 GFP fare dalak gelen Splenocyte Hücre Süspansiyon 2. Nesil
- Bir septically 6-8 haftalık dişi Nur77 GFP fare dalak izole eder.
- Bunu başarmak için, steril kaputun altında çalışırlar. % 70 etanol kurban fare kürk, makas ve forseps bekletin.
- Onun sağ tarafında fare Lay sol üst kadranda cilt ve kasları kesti. gözle görülür daha sonra dalak bulun onu kesip kesi alanını kontrol edin. dalak tutmakhazır olana kadar buz üzerinde splenosit ortamında bir sonraki adımı gerçekleştirmek için.
- Önceden ısıtılmış splenosit ortam 5 ml ihtiva eden bir 10 cm2 hücre kültürü Petri kabındaki dalak (ler) yerleştirin.
- çözüm bulanık olana kadar steril bir şırınga pistonu kullanarak dalak püre. Bir dalak kollajen matriks prosedürü sonuna kadar kalmalıdır.
- splenosit ortamında geniş ezme ardından, hücre süspansiyonu toplamak ve filtre-out herhangi bir enkaz veya pıhtı 50 ml tüp yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden geçirin.
- 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin. yüzen sıvısı atıldıktan sonra, in-house üretilen veya ticari kırmızı kan hücresi lizis tamponu 2-3 mL hücre pelet yeniden askıya. Aşağıdaki pipet (2-3 kez) 20-30 s için süspansiyon dinlendirin.
- g ve x 500, 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj 5 ml PBS ya da seçim uygun bir tampon ekleme.
- kırmızı renkte olmalıdır (Süpernatantı kırmızı b lize içerir olarakLood hücreleri) ve yeniden askıya splenosit ortamının 2 ml hücre pelletini.
- hemasitometre kullanarak, canlı ve ölü (nekrotik) hücreleri ayırt tripan mavisi ile boyanmış hücrelerin sayısını.
Splenocyte Celi Süspansiyon 3. T-hücresi izolasyon
- x g 500 ° C'de 5 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu santrifüj. 10 x 10 6 hücre / mL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için, serum içermeyen RPMI ortamında hücreleri (adım 1.3 50 mi) yeniden askıya.
- 5 ml polistiren tüp hücreleri transferi ve arıtma basamağının sonunda kenara saflık değerlendirmesi / karşılaştırma için dalak 100 uL alikot olarak ayarlayın.
- T hücresi izolasyon antikor kokteyli (50 uL / mL) ile 50 ul / ml hücre süspansiyonuna normal sıçan serumu ekleyin.
- hücre süspansiyonu karıştırın ve 10 dakika bekletin. Bu adım, antikor kokteyli tüm istenmeyen hücreler bağlamak sağlar.
- streptavidin hızlı küreleri ekleyin (mıknatıs2.5 dakika için IC boncuklar), daha sonra, serum içermeyen ortam kullanılarak, 2.5 mL hacmi getir.
- 3 dakika için bir hücre izolasyon mıknatıs tüp yerleştirin.
- mıknatıs tutan ve tek bir hareketle çözüm dökerek yeni bir polistiren tüp içine T hücresi süspansiyonu aktarın.
NOT: İzole süspansiyon saflaştırılmış T hücrelerini içerir. Tüm istenmeyen hücreler manyetik streptavidin boncuk bağlı tüp tarafında yapılır. - Tripan mavisi ve hemasitometre kullanarak izole edilmiş T hücreleri saymak.
NOT: Bu adımda izole edilmiş T hücrelerinin saflığı önce ve akış sitometrisi ile, T hücresi izolasyon sonra CD3 + etkinlikleri yüzde analizi ile (isteğe bağlı) kontrol edilebilir. 13- Kısaca, santrifüj 500 x g'de splenosit hücre süspansiyonu 1 mi. Süpernatantı atın ve 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda akım sitometri tampon hücreleri askıya.
- Floresan etiketli anti-Mous ekleme1: 100 arasında bir konsantrasyonda e CD3 antikoru. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. bir kez yıkayın, santrifüj ve akış-sitometri ile analiz için akım sitometri tamponu (400 uL) içinde yeniden askıya.
Splenocyte Hücre Süspansiyon 4. B-hücresi İzolasyon
- T hücreleri (3.1-3.8 adım), fakat bir B-hücresi izolasyon kiti kullanılarak için anlatılan ile aynı protokol takip edin. Saflık değerlendirmesi için, bunun yerine CD3 antikoru CD 19 antikoru kullanımı. 13
- (Isteğe bağlı) saflık değerlendirmesi için, CD3 antikoru yerine CD 19 antikoru kullanımı. 500 x g splenosit hücre süspansiyonu santrifüj 1 ml. Süpernatantı atın ve 1 x 10 6 hücre / ml konsantrasyonda akım sitometri tampon hücreleri askıya.
- Ekleme flüoresan 1 bir konsantrasyonda anti-fare CD 19 antikoru etiketlenmiş: 100 ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin. bir kez yıkayın, santrifüj ve akış sitometri tamponu (400 uL) fo yeniden askıyaakış sitometri ile r analizi.
5. T-hücresi aktivasyonu ve GFP ifade indüksiyon
- / Oyuk 2.5 x 10 5 hücre konsantrasyonunda yuvarlak dipli 96 oyuklu bir plakaya, süspansiyon içinde, T hücrelerinin tohumu.
- 2 ng / ml ve CD3 / CD28 manyetik boncuk (25 uL / 10 6 hücre) rekombinant interlökin (IL) -7 ekleyin. aktif olmayan T hücrelerinin temsil sonraki ölçümler için bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere boncuklar ile muamele edilmemiş T hücrelerinin bir kısmı tutun.
- Oniki saat sonra, yavaşça her hücre süspansiyonu pipetle de yukarı ve aşağı bir kordon hücresi kompleks / agrega kırmak için 96 oyuklu plaka T hücreleri hasat edilir. 5 ml polistiren tüp içine tüm kuyulardan süspansiyon toplayın.
- T ve B hücrelerinin saflaştırılması için daha önce kullanılan aynı hücre izolasyon mıknatıs içindeki süspansiyonu içeren Tüp, ve 5 dakika boyunca dinlenmeye bırakın.
- T hücre süspansiyonu int aktarınmıknatıs tutan ve tek bir hareketle çözüm dökerek oa yeni polistiren tüp.
- 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri Santrifüj. Yeniden askıya 2 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyonu elde etmek için, taze splenosit ortam içinde hücreler.
- olmayan aktive edilmiş T hücreleri ile karşılaştırıldığında 12 ile 24 saat sonra uyarımları (kalite kontrolü için opsiyonel) akış sitometrisi ile GFP yoğunluğunu değerlendirmek. 12
NOT: GFP floresan Nur77 GFP T hücrelerine içsel ve TCR başarılı etkinleştirilmesi üzerine kendini gösteriyor. 12 - mikroskopi ile canlılığı ve aktivasyonu (isteğe bağlı) değerlendirilmesi için, 0.2 ng / ml 'lik bir konsantrasyonda, 30 dakika Hoechst analizden önce aktive hücreleri leke. bir kapak sürgüsü veya bir düz-tabanlı siyah yüzlü 384 oyuklu plaka iyi hücre süspansiyonu yeterli hacim ekleyin ve canlı hücreleri değerlendirmek için floresan mikroskobu altında incelenmişlerdir. Ölü hücreler nükleer tutmazboyama. 14
6. B hücresi aktivasyonu ve GFP ifade indüksiyon
- Bir T-25 kültür şişelerinde kullanılarak, 1 x 10 6 hücre / mL B hücre proliferasyonu yeniden askıya.
- 200 ng / ml bir konsantrasyonda 10 ul / ml anti-fare IgG / IgM (H + L) ve yeniden birleştirici CD40L ekleyin. (Aktif olmayan B hücreleri temsil eden), daha sonra ölçümler için bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere muamele edilmemiş B hücrelerinin bir kısmını muhafaza edin.
- aktif olmayan B hücreleri ile karşılaştırıldığında, 12 veya 24 saat sonra stimülasyon akış-sitometrisi ile GFP yoğunluğunu değerlendirmek.
NOT: GFP floresan Nur77 GFP B hücrelerine içsel ve BCR başarılı etkinleştirilmesi üzerine kendini gösteriyor. 12 - mikroskopi ile canlılığı ve aktivasyonu (isteğe bağlı) değerlendirilmesi için, 0.2 mg / ml bir konsantrasyonda Hoechst 30 dakika, analizden önce aktive hücreleri leke. hücre süspansiyonu yeterli hacmi ekleyinflöresanlı bir mikroskop altında bir kapak sürgü veya düz tabanlı siyah yüzlü 384 oyuklu plaka iyi ve incelemek canlı hücreleri değerlendirmek. Ölü hücreler nükleer boyanma tutmaz. 14
Küçük moleküllerin 7. yüksek veri akışı tarama
- 2 x 10 6 hücre / aktive edilmiş T ve B hücrelerinin ml (manyetik boncuk veya antikorlar / CD40L) ya da aktif olmayan gruplar bir hücre süspansiyonu hazırlanır.
- Levha 75,000 hücre / kuyu bir 384-oyuklu plaka (40 uL hacmi). Düz dipli siyah-taraflı 384-plaka veya Hoechst leke kullanarak floresan mikroskobu (önceki HTS isteğe bağlı kalite kontrol adımı) tarafından canlılığı ve aktivasyon değerlendirmesi için bir mikroskop kapak slayt kullanın (adım 5.8 ve detaylar için 6.4 bakınız). 14
- Elle ya da otomatik bir sistem kullanarak, her oyuğa (% 0.5 DMSO içinde çözülmüş) tercih edilen ilaçlar ekleyin.
- (Aktif) pozitif ve negatif (dışı Acti araç (DMSO) ilaveçıkartılmış) kontrol kuyuları. % 0.5'lik bir maksimum DMSO konsantrasyonu ayarlayın.
- 24 saat (ya da kuluçka tercih saat) 37 ° C 'de ve% 5 CO2 için inkübe edin.
- (. 1: 3,333; örneğin, 50 uL bir toplam hacmi üretmek için 384-delikli plakalardaki hücreler 10 mcL) tarama gününde, Hoechst 33342 boyası seyreltilir. 0.2 ug / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için Hoechst çözeltisinin eklenmesiyle GFP analizden önce 30 dakika leke.
- Yavaşça iyi her bir homojen dağılımını elde etmek için yukarı ve aşağı hücreleri pipetle.
Not: Bu adım, hücrelerin ters akış yönüne iyi bir tarafında birikme eğilimi gibi bir otomatik sistem kullanılarak ilaçlar (aşama 7.3) tevzi durumunda önemlidir. - Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 45 xg'de plakaları dönerler.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca geri kalanına plakaları bırakın.
- Otomatik konfokal içeriği yüksek scre kullanarak, plaka (lar) okuma-çıkışları gerçekleştirinakşamlar (HCS) sistemi. 15 makineye plaka yükleyin. 40X veya daha yüksek büyütmede hedef olarak belirlemiştir. Hoechst (UV lamba) ve GFP için kamera # 1 (lazer 488) için kamera 4. kullanın. kuyu başına 6-10 alanları okumak için makineyi ayarlamak. 488 nm (GFP okumak için) ve UV ışık (Hoechst okumak için) sahada başına iki ardışık okuma yapmak için makineyi ayarlayın. 40X veya daha yüksek büyütmede hedef olarak belirlemiştir.
NOT: Sistem herhangi bir ayarlama gerektirmez bilgisayarlı mikroskop olduğunu. odak mesafesi, gelen ışığın yoğunluğu ve maruziyet süresi makine tarafından otomatik olarak tüm kurulum bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HTS analizi tasarımı
Burada floresan tahlil tasarlarken iki önemli faktör dikkate alınmıştır. İlk olarak, T veya B hücre aktivasyonu bir hastalık (örneğin graft-versus-host hastalığı) temsil eder fizyolojik bir durumun çoğaltmak için gereken. İkinci olarak, hücre aktivasyonunun değerlendirilmesi duyarlı ve nicel bir yöntem kullanılarak yapılmalıdır. bu ihtiyaçlara karşılık olarak floresan günümüzde HTS okuma-çıkışları için birincil seçim biridir. 10, 16 Güçlü bir GFP Okuması Nur77 GFP suretiyle elde edilebilmektedir gibi in vitro veya in vivo olarak T veya B hücre uyarılmasını -türevli, 12 eden deney i için bir çalışma modeli olarak-aktif olmayan ve aktif hücreleri ayırt etmek üzere bı stratejiyi yararlananimmünomodülatör bileşikler ters düşer.
Başlangıçta, bizim tayinin tasarımı anfraksiyone uyarılmış splenositlerin kullanarak akış sitometri ile GFP değerlendirmesine dayanmaktadır. Bu durumda, her iki aktif olmayan / aktive edilmiş T ve B hücreleri anti-CD3 veya sırasında önceden GFP değerlendirmesi, anti-CD19 ile boyanır. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, T hücrelerinin (CD3 + hücreleri), belirli bir fare dalak yaklaşık% 30 temsil etmektedir. Kararlı durumda, GFP seviyesi (nedeniyle çevrede gelişme veya homeostatik uyarılması sırasında TCR ile post-timus seçimi büyük olasılıkla)% 10 aralığında idi. CD3 / CD28 boncukları ile TCR uyarımı takiben GFP tanımının yüzdesi beş, altı katlık bir artış (% 10 yerine% 57) (- B Şekil 1 A) CD3 + T hücreleri tespit edildi. Aynı şekilde, B hücreleri (CD19 + hücreler) toplam splenositlerin 50-55% temsil eden ve bazal GFP eskiBasıncı olmayan aktive edilmiş T hücreleri karşılaştırılabilir (örneğin ~% 10, Şekil 1C). İlginçtir, ancak, anti-fare IgG / IgM ve rekombinant CD40L kullanarak BCR stimülasyon GFP ifade önemsiz bir artış (- D% 33 yerine% 12, Şekil 1C) tetiklenir. GFP aktive T veya B hücreleri üzerinde ekranlı küçük moleküllerin farmakolojik etkisini değerlendirmek için önemli bir unsur olduğu için, onun yoğunluğunu optimize tarama hassasiyeti ve başarısı için merkezi bir konumdur.
Saflaştırılmış T veya B hücreleri kullanılarak GFP tanımının değerlendirilmesi
T ve B hücre uyarımı fraksiyonlanmamış splenositlerin kullanılarak doğrudan elde edilebilir, ancak okumaları mikroskobu ile yapılması, özellikle GFP tanımı yoğunluğu taranması için yeterince hassas değildir. hücresel yanıtı artırmak için, T hücreleri ilk manyetik ile saflaştırılmıştırBir ticari olarak temin edilebilen bir kit (Şekil 2A) ile boncuk. Daha önce fraksiyonlanmamış splenositlerin kullanılarak gösterildiği gibi, izole edilmiş bir CD3 + T hücreleri,% 10 GFP pozitif (bazal sentezleme) idi. Bu bağlamda, CD3 / CD28 boncukları ile T hücresi uyarımı önemli ölçüde GFP yanıtını (- 2B, fraksiyonlanmamış splenositler kullanıldığı zaman% 57 karşı% 86 Şekil 2A) geliştirmiştir. Benzer gelişmeler B hücreleri (- 2D,% 80 yerine% 33 Şekil 2C) ile elde edilmiştir. Bu sonuçlar açık bir şekilde saflaştınldı, T ve B hücrelerinin kullanılması da önerilmektedir fenotipik tarama için uygun olan GFP ekspresyonunu maksimize göstermektedir.
tasarlanmış HTS tahlil şematik diyagramı
Genel olarak, tahlil alt bölünmüş dört ana bölümden (Şekil 3) içine olabilir. Örneğin, T hücreleri durumunda, bir splenositlerHücre süspansiyonu (4-5 adımlar) CD3 / CD28 boncukları kullanılarak in vitro 12 saat stimülasyondan aşaması takip T hücrelerinin saflaştırılması için (1-3 adımlar) olarak hazırlanmıştır. Aktifleştirilmiş T-hücreleri daha sonra kaplama ve otomatik HCS sistemi kullanılarak GFP ve Hoechst yoğunluklarının değerlendirilmesi önce 384 gözlü levhalar tercih edilen küçük moleküller (6-7 adımlar) ile, 24 saat boyunca kültürlenir. Aynı deney, adım 4-5 yapılan modifikasyonlarla B hücreleri için kullanılabilir. Kısaca, B hücreleri anti-fare IgG / IgM ve rekombinant CD40L yerine boncuklar ile uyarılabilir. Bu bileşenler (örneğin, boncuklar üzerinde değil) bunların çözünür biçimde kullanıldığı için, B hücreleri, daha sonra, sadece bir tarama işlemi için 384 delikli plakanın kaplanmasından önce yıkanıp 12 saat boyunca kuluçkaya yatırılır.
Verimli T-hücre sağkalım HTS çalışmanın başarısı için ilkel olduğunu. Bu duruma göre, iki sınırlayıcı faktörler deneyin kalitesini engelleyebilir ve dikkate alınmalıdır. İlkSıçangil T hücreleri, in vitro stimülasyonunu takiben apoptoz karşı oldukça hassastır. 17 İkinci olarak, test edilen tüm bileşikler, ikinci bir baskı unsuru ekleyebiliriz bir DMSO çözeltisi, içinde seyreltilir. hücre kaybını, rekombinant IL-7 (2 ng / ml) en aza indirmek için adımlar 4-5 TCR stimülasyonu üzerine T hücrelerine desteklendi. Bu homeostatik sitokin çoğalması destekler ve Bcl-2, Bcl-XL ve Mcl-1 ve anti-apoptotik molekülleri sentezlenmesi yoluyla T-hücresi hayatta kalmasına katkıda bulunur. 18, 19, 20, 21, 22
4.398 bileşiklerin primer yüksek veri akışı tarama T hücresi aktivasyonunun çok aktivatör ve inhibitörler ortaya
Bir yüksek veri akışı tarama aktif olmayan (negatif CO 75.000 kaplama ile gerçekleştirilmiştirntrol) ya da Şekil 4'te gösterildiği gibi, aktive edilmiş T hücreleri (pozitif kontrol). Yüksek yeniden üretilebilirlik sağlamak için, deney 0.87 (Şekil 5A) bir elde edilen Z faktörü ile bir kaç kez yapıldı. HCS sistemini kullanarak uyarılmış T hücrelerinin görülen GFP GFP önleyici bileşikler, kolayca tespit edilebilir bölge "A" 'eylem pencere' (Şekil 5A) üretilmesini sağlayan stimüle edilmemiş T hücrelerine göre 20 kat daha yüksektir. Bu taranmış alanlar toplam hücre sayısına bölünmesi flüoresan hücrelerin sayısı açısından şekilde gösterilmiştir. Şekil 5A'da gösterilen örnekte, 320 bileşiklerin taranması 1.5-2.5 kat, GFP ifade inhibe edebilen üç bileşiğin (kırmızı oklarla işaret aşımı) sundu. Bu örnekte, pozitif bir kontrol değeri 0.44 ± 0.02 ve negatif kontrol 0.02 ± 0.00 idi.
th4398 bileşikleri (0.85 Z faktörü) toplam e taraması daha sonra gerçekleştirilmiştir. Bileşikler, 136,000 varlıkları (Şekil 5B) ihtiva eden bir genel kimyasal kütüphane temsil kimyasal yapısına göre tohum / Örnek bileşikler olarak tıbbi kimyacılar tarafından seçilmiştir. Deneyin sonunda, GFP inhibisyon analizi (pozitif saptıranlardan) inhibe veya GFP (negatif saptıranlardan) artırılması da edebilen bileşikler tespit edilmiştir.
Şekil 1: TCR'nin ya da fraksiyone edilmemiş splenositler üzerinde yapılan BCR aktivasyondan sonra özellikle T analizi ile B hücresi GFP. (A) anti-CD3 yokluğunda splenositlerin kullanılarak antikor (üst sol panel) veya CD3 / CD28 boncukları varlığında (sağ üst panel) ile boyandı T hücrelerinin Örnek akış sitometri analizi. Her iki T-hücre grupları için GFP tanımı gösterildialtta. T hücrelerinin akış sitometri analizi ile elde edilen GFP (B) oranı. Hata çubukları ortalama ± SD temsil eder. Splenositler anti-fare IgG / IgM kullanılarak aktive ve rekombinant CD40L ardından CD19 için boyandı dışında (A) 'ya benzer (C). B hücrelerinin akış sitometri analizi ile elde edilen GFP ifade (D) oranı. Hata çubukları ortalama ± SD temsil eder. Gösterilen tüm deneyler (* P <0.05 ve *** p <0.001, n = 5 / grup), en az üç kez tekrar edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Sırasıyla, TCR veya BCR aktivasyonunu takiben, saflaştırılmış T ya da B hücreleri kullanılarak GFP ekspresyonunun analizi. (A) represbir anti-CD3 antikoru ile boyanmış saflaştınldı T hücrelerinin entative akış sitometri analizi. GFP indüksiyonu için, saflaştırılmış T hücreleri CD3 / CD28 boncukları (üst sağ panel) ile uyarıldı. -Sigara aktif kontrol T hücreleri sol üst panelde gösterilmektedir. Her iki-olmayan aktif ve aktive T hücrelerinin GFP altında görüntülenir. T hücrelerinin akış sitometri analizi ile elde edilen GFP (B) oranı. Hata çubukları ortalama ± SD temsil eder. B hücrelerinin saflığı CD19 boyaması yolu ile değerlendirildi ve anti-fare IgG / IgM ve rekombinant CD40L ile aktive edilmesi dışında (A) 'ya benzer (C). B hücrelerinin akış sitometri analizi ile elde edilen GFP ifade (D) oranı. Hata çubukları ortalama ± SD temsil eder. Gösterilen tüm deneyler (n = 5 / grup ve *** p <0.001), en az üç kez tekrar edilmiştir. Bir büyük görmek için tıklayınızBu rakamın sürümü.
Şekil 3: fenotipik tarama aşamaları temsil genel şematik diyagramıdır. HTS tahlili hazırlamak için gerekli 7 önemli adımlar vardır. Bir kadın Nur77 GFP fare onun dalak (Adım 1) izole etmek için kurban. Bir splenositler hücre süspansiyonu (Aşama 2) oluşturulmasını takiben, T hücreleri negatif bir ticari olarak temin edilebilir bir kit (aşama 3) kullanılarak (istenmeyen hücrelere tükenmesi) izole edilir. Izole edilmiş T hücreleri, daha sonra yeniden birleştirici IL-7 37 ° C (aşama 4) yuvarlak-tabanlı 96-çukurlu plaka içinde bulunmaması veya CD3 / CD28 boncukları mevcudiyetinde inkübe edilir. Oniki saat sonra (aşama 5), T-hücreleri T-hücresi saflaştırılması için başlangıçta kullanılan aynı hücre izolasyon mıknatıs kullanarak önceden boncuklar çıkarılması için bir agrega çıkarmak için birkaç kez pipetlenir. Izole edilmiş T hücreleri, daha sonra, 384-gözlü levhalar (75 000 cel tohumlanmıştırLS / oyuk, 24 saat daha (basamak 7) benzer bileşikler ile adım 6). Ertesi gün, kuluçkaya Hücreler HCS System (adım 8) ile analiz için Hoechst, 30 dakika ile boyanır. Aynı ayar bu aşama 4 hariç bir B hücresi bazlı tayinin hazırlanması için takip olabilir ve 5 uyarıcıları çözünür biçimlerde de ilave olarak basit bir yıkama ile ikame edilecektir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: Bir 384-oyuklu plakalarda T hücrelerinin kaplanması için düzeni. Deneyde kullanılan her plaka üç grup ihtiva etmiştir. İlk grupta, kuyular olmayan aktive edilmiş T hücreleri ile yüklenmiş (plakanın her iki tarafına GFP negatif kontrol; Wells A1-P1 ve A24-P24), ikinci grup Dru olmayan T hücrelerinin aktive bulunurken,gs (pozitif GFP için kontrolü; kuyular A2-P2 ve A23-P23). Geri kalan bütün gözlere taramasında kullanılan kimyasal yapılar ile takviye edilmiş T hücrelerinin aktive içeren. Tüm oyuklar,% 0.5'lik DMSO ihtiva etmiştir. GFP ve Hoechst sinyal örnekleri-olmayan aktif ve aktive T hücreleri için gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Birincil fenotipik tarama. (A) 320 bileşikler üzerinde gerçekleştirilen bir primer tarama Örnek örneği. Aktif olmayan T hücrelerinin yüksek GFP kat 20 görüntülü TCR ile uyarılmış T-hücreleri, aksine hemen GFP boş. (B) bileşiklerin toplu veri tahlili kullanılarak taranır. GFP tanımı, bileşikler, di göstermektedirdiğer bileşikler ise meyletme inhibitör etkisi T hücre uyarıcıları olarak davranıyor bulundu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çeşitli okuma-out yöntemleri hassas ve güvenilir HTS testlerin geliştirilmesi için istismar edilmiştir. Bu kolorimetrik, Işıklı veya floresan yöntemleri içerir. Kolorimetrik yöntemler kurulumu kolay olmakla birlikte, bu müdahale ya da hücre, test edilen bölebilir kimyasal birden eklenen gerektirir. Farmakolojik etkisi, belirli bir uç değerlendirilir olarak 23 ek olarak, biyolojik bir yanıt dinamik değerlendirilmesine imkan yoktur. otomatik HTS kullanılırsa Ayrıca, bu yöntem, pahalı bir robotik kol gerektirebilir. Bu faktörler nedeniyle hantal gereksinimleri ve düşük duyarlılığı HTS amacı ile kolorimetrik okuma-çıkışları daha az uyumlu hale getirir. Lüminesans kolorimetrik analizler için bir alternatif olarak önerilmiştir, ancak 23, HTS bu lüminesan testlerinin uygulanması nedeniyle genellikle hücre lizizi gereksinimi ile sınırlıdır. Hatta olmayan diğer lizis protokoller de sankiveloped, biyoparlaklık sinyal yoğunluğu tespit biyolüminesans sinyalleri ve hücresel aktivite gerçek değişiklikler arasında tutarsızlıklar neden böyle luciferin emilimi, ko-faktörler, pH durumu ve kültür ortamı veya tampon şeffaflık gibi birçok faktöre engel olabilir. 24 Bu nedenle, en deneyleri floresan yöntemlerine dayanır. Aslında, flüoresan bazlı deneyler, ilk hücre aktivasyonuna bağlı olarak hücresel süreçlerin çeşitli izleme yeteneğine sahip küçük, çok-flüoresan organik molekülleri kullanılarak geliştirilmiştir. Sonuç olarak, flüoresan deneyleri, yüksek hassasiyet ve kolayca HTS içinde fenotipik ölçümler için uyarlanabilir. 23
Burada sunulan geliştirilmiş floresan bazlı HTS tahlil üç büyük avantajlara sahiptir. İlk olarak, yeniden üretilebilir, son derece güvenilir ve aynı stimula kullanarak iki farklı birincil hücreler modüle edebilen bileşikler (T ve B lenfositler) elenmesi için benimsenmiştirtion / Okuması kavram. Örneğin, beş farklı çalışan üzerinde tamamlanmış 4.398 bileşiklerinin primer tarama, (T hücresi tahlilinde sırasıyla <% 5 ve <% 15), tutarlı aktivasyon uyandırdığı GFP az intra ve inter-analiz değişkenlikler ile bir sinyal verir. İkinci olarak, deney bir ticari olarak temin edilebilir transjenik fare modelini kullanır. Genellikle, bir floresans bazlı tahlilin tasarımı, primer hücreler, genetik mühendislik veya stimülasyonu üzerine bir flüoresan sinyal görüntülemek için ilgi konusu bir hücre hattı gerekir. Bu yaklaşım, bir değerli laboratuvar aracı üretir rağmen, genel olarak bilimsel topluluk hazır değildir. Bu sınırlamayı aşmak için, T ve B hücreleri Nur77 GFP transgenik farelerden izole edilmiştir. Bu lenfositlerin avantajı TCR veya BCR stimülasyon üzerine 24 saat içinde GFP ifade etme yeteneğidir. Bu nedenle, yetenekli GFP veya hücresel genel sürüş transkripsiyonal aygıtı modüle edilmesi tarama ilaçlarınyanıt cazip bir yaklaşımı temsil etmektedir. Üçüncü olarak, başlangıç aktivasyon aşamasında CD3 / CD28 boncukları ile T hücrelerinin ilave GFP değerlendirme öncesinde, bu boncukların çıkarılması gerekir. mikroskopi, aksi takdirde GFP sinyali maske olacak boncuk bırakarak T hücre aktivasyonu / inhibisyonunun analiz etmek için kullanılır, bu çok önemlidir. akım sitometri analizi için yerine kullanılırsa hem ileri ve yan scatter kullanılarak kapılı olabilir ilgi belirli nüfus olarak (bu özellikle tahlil ek karıştırıcı sınırlama (ler) oluşturur sürece), boncuk kuyularda sol olabilir.
İlk hedef minimal hücre işleme ile bir tarama tahlili tasarlamak oldu. Bu açıdan bakıldığında, T ya da fraksiyone edilmemiş splenositlerin kullanılarak B hücrelerinin aktivasyonu, GFP negatif (Şekil 1) kalan boncuk veya sırasıyla, lenfositlerin büyük oran olarak sınırlı çözünebilir antikorlar / yeniden birleştirici CD40L ile uyarılır. Bu adım, başarı için kritik olduğundanDeneyin, protokol yüzdesi GFP ifade eden hücreleri geliştirmek için ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak T veya B hücreleri saflaştırmak için değiştirildi. Bu yaklaşım, önemli ölçüde her iki hücre popülasyonlarının aktivasyon sonucu geliştirilmiş. Gerekli görüldüğü takdirde bir seçim için bir başka yöntem, T ve B hücre izolasyonu için de kullanılabilir, ancak önerilen yaklaşım aşağıdaki gibidir: i) yüksek tekrarlanabilir, ii) almadan önce kolaylıkla HTS'ye akış sitometrisi ile izole nüfus saflığını değerlendirmek üzere uyarlanmış, iii) ve arıtma adımı olarak etkin bir zaman nispeten kısadır (~ 30 dakika) ve en az hazırlık yapılabilir. Ancak, bu çalışmada sunulan deney fare primer hücreler kullanılarak dayandığını belirtmek gerekir. tahlillerin ikincil (onay amaçlı) ve üçüncül (ilgi hedef nihai doğrulama) tespit hit doğrulamak için birincil ekran aşağıdaki yapılmalıdır. kolayca farklı hücre hatları çeşitliliği, i farmakolojik etkisi için adapte edilebilir, ancaktürler arasında sürekli etkilerini tahmin etmek hiç yolu vardır olarak - dentified hit diğer türler (tersiyer tahlil örneği gibi insan hücreleri) hakkında daha fazla doğrulama gerekmektedir. Özetle, bu tahlil, insanlarda in vitro / hayvan testlerinde elde edilen sonuçlar olası ekstrapolasyon ile yeni potansiyel hit ve / veya moleküler hedeflerin belirlenmesi için değerlidir.
tasarlanan deney hem de T ve B hücreleri için yararlanılabilir olsa bile, tek bir avantajı, bu durumda, T hücrelerinin özel kullanım aktarılmamaktadır. TCR aktivasyon genellikle primer (örneğin, anti-CD3 veya anti-TCR) yoluyla verilmiş iki uyarma ve ikincil ortak aktifleştirici (örneğin, anti-CD28) sinyali gerektirmektedir. 25, 26 İlginç bir şekilde, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorlar, hem doğrudan hem de manyetik boncuk yüzeyi üzerine bağlanmış satın alınabilir ve t eklemeden önce, standart bir mıknatıs kullanılarak hücre süspansiyonunun çıkarılabilirO, kimyasal bileşiklerin taranması test edilecek. bilinmeyen kimyasal öğe bir kütüphane ile kullanılıyor olarak, test edilen bileşiklerin ve TCR bağlanması oluklarına bağlıdır arasında herhangi bir olası müdahalesini en aza olabilir da, TCR kompleksine bağlanan moleküllerin serbest T hücrelerini aktive tutabilmektedir. Sürekli suprafizyolojik TCR aktivasyonu tabi T hücreleri ile çalışan karşı 27 ek olarak, T hücre aktivasyonu taklit aşağıdaki fizyolojik durumlarda uyarma maddesi çıkarılması. Bu tarama küçük konsantrasyonlarda kullanılmıştır özellikle de belirli bir bileşiğin farmakolojik etkinliğini geçersiz kılabilir olarak ikinci durum, sorunlu olabilir. B hücreleri üzerinde aynı etkiyi uygulamakla hiçbir piyasada mevcut boncuklar var gibi, B hücreleri üzerinde uyarıcı sürekli varlığının tayinin performansını sınırlar olsun gelecekte test bir HTS gerçekleştirmek için ilginç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Université de Montréal tarafından sağlanan Merck Frosst Start-up fonları tarafından desteklenmiştir. Biz onların tartışma, yorum ve yorumlarından İmmünoloji ve Kanser Araştırma Enstitüsü Yüksek verim platformundan Dr Jean Duchaine ve Dominic Salois teşekkür etmek istiyorum. Moutih Rafei bir Fonds de la Recherche en Santé du Québec Genç 1 Ödülü sahibidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70 µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B-Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomek FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 h incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
