Abstract
诺如病毒的人是流行性和世界各地的零星胃肠炎的主要原因。因为大多数感染或者直接经由人对人的路线通过环境表面或食物传播或间接地受污染的非生物媒介和无生命的表面是用于病毒的期间诺罗病毒爆发的传播重要的车辆。
我们开发和评估使用大泡拭子用于检测和从硬表面人类诺如病毒的打字的协议。纤维拭子或防静电抹布相比，大泡拭子允许从高达700 cm 2的马桶座面恢复病毒（范围1.2-33.6％）。该协议包括用于病毒从拭子提取和使用旋转柱的病毒RNA的进一步浓缩的步骤。总共127已经从在游船和长期护理设施的表面，其中诺罗病毒性胃肠炎已经收集到217拭子样品（58.5％）报道药检呈阳性被RT-qPCR的诺如病毒GII。这些29（22.8％）的可以成功基因分型。总之，检测使用我们开发可以帮助确定环境污染的暴发期间水平以及检测病毒的当临床样品是不可用的协议环境表面上诺罗病毒的;它也可能有利于整治策略的有效性进行监测。
Introduction
诺如病毒的人是流行性和散发性急性胃肠炎全世界1，2，3的主要原因。该病毒是极具传染性并通过直接的人发生互动的人或间接通过受污染的食物，水或环境表面接触传播。诺如病毒可棚长时间和长期的环境表面上的病毒的生存已记载1，2，3。在高峰脱落，十亿病毒颗粒被每克释放粪便和呕吐物还含有足够数量的病毒颗粒中，以引起感染4，5，6，7，8，EF“> 9,10，另外，可以很容易地发生无生命的表面和人的皮肤之间的病毒传输2，11，12，因此，环境污染的监测可有助于爆发调查和评估的清理的有效性和消毒程序。
几个环境取样协议已经用于检测轮状病毒了描述，大肠杆菌噬菌体MS2，猫杯状病毒（FCV），和噬菌体P22 13，14，15，16。然而，在这些研究中，包括快速干燥（<1小时）和小的表面区域中所述的验证条件（25×100厘米2）时，可能不能充分代表字段设置。此外，预期ENVIRO的低的污染水平nmental表面需要是能够检测很少的病毒颗粒的协议。
我们开发了诺如病毒的检测和分型基于大泡，表面取样方法。这种方法已经在几次爆发诺沃克病毒被证实。该协议包括1）如何收集环境表面拭子样本（2）如何收集和运输到实验室过程中最好保持样本的完整性，以及3）诺如病毒的实验室测试和打字。
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Protocol
1.棉签取样的场
- 穿一双干净的手套。
- 测量取样区域的大小，而无需使用卷尺或直尺接触到表面。尝试尽可能准确地估计该地区并填写报告表（补充表1）。
- 检查可能的泄漏和标签样本运输袋，包棉签拭子套件。
- 移动拭子穿过取样面积如下：在水平方向的行程，在垂直方向的一个行程，并在对角方向的一个笔划。不要擦拭表面面积超过700 平方厘米大。
- 将每个拭子插入管并拧紧瓶盖。
2.储存和运输拭子的实验室
- 保持在4℃拭子长达48小时。如果需要较长时间的存储，存储所述拭子在-20℃（或-70℃）。
- 保持管在0-4°C（ 即。在隔热容器运送至实验室和船舶中收集的24-48小时内使用冷包）。
3.病毒浓度，病毒RNA提取纯化
注意：所有的离心步骤使用台式离心机以5,000×g离心5分钟，在室温下，除非另有说明。与通用核酸提取（UNEX）缓冲区时要格外小心。戴上护目镜或面罩。
- 标签1个15毫升管，并为每个样品一种RNA的中型柱。包括在每个实验中的负提取控制。
- 要为10拭子准备裂解液，将25ml UNEX缓冲与25毫升的PBST混合（PBS pH值7.2含0.02％吐温80）。
- 添加噬菌体MS2悬浮液（10 6 PFU /微升）50微升到50毫升的裂解溶液。
- 将棉签在15毫升管加入5 ml裂解液。混合并孵育在室温下10分钟。
- 5毫升100％乙醇添加至每个管并涡旋10秒。
- 小心取出15毫升管拭子（它包含UNEX缓冲）轻轻压在管的一侧以除去多余的液体，然后丢弃棉签。其余各卷应该是9-10毫升之间。
4.中型柱病毒核酸提取
- 小心地从步3.6 4.5毫升UNEX /乙醇混合物转移到一个中型柱，离心，弃滤液。
- 装载从同一混合物另4.5毫升到同一列中，离心，并弃去滤液。
- 对于第一次洗涤，添加3.5毫升70％乙醇到中型柱，离心并弃去滤液。
- 对于第二次洗涤，加入另一3.5毫升70％乙醇到中型柱。离心并弃去滤液。
- 对于干式旋，离心迷笛列，除去乙醇所有痕迹（可产生负面影响您的病毒RNA恢复）。
- 放置南部列在一个新的15ml离心管中。加入250微升洗脱缓冲到中型柱;离心分离得到最高的病毒RNA恢复之前等待1分钟。
- 存储所提取的核酸在-70℃或立即进行到步骤5。
5.浓缩病毒核酸RNA使用清洁和集中套件
- 添加的RNA结合缓冲液在上述步骤4.7和涡洗脱10秒RNA的250μL500μL。
- 加入750μL100％乙醇，涡旋10秒。
- 标记每个样品离心柱。加载750微升样品到离心柱。
- 离心旋转柱以12,000 xg离心1分钟。丢弃的流量通过。
- 加载剩余的750微升到旋转柱和离心机以12,000 xg离心1分钟。
- 为预洗，以12,000 xg离心400μL的RNA的准备缓冲器添加到每个旋转柱和离心1分钟。丢弃的流量通过。
- 对于第一次洗涤，以12,000 xg离心添加800μL的RNA洗涤缓冲液到每个旋转柱和离心1分钟。丢弃的流量通过。
- 对于第二次洗涤，加入400μL的RNA的洗涤缓冲液以12,000 xg离心旋转柱和离心1分钟。丢弃的流量通过。
- 对于干式纺丝，离心旋转柱以12,000 xg离心以除去洗涤缓冲液的所有痕迹2分钟。
- 仔细离心柱转移到一个干净的1.5 ml离心管。
- 添加25微升洗脱缓冲液到旋转柱并孵育在室温下1分钟。这会增加从塔病毒RNA的回收。
- 通过以10,000 xg离心离心旋转柱1分钟收集RNA。
- 无论是在-70℃直接进行RT-qPCR的（步骤6）或商店的RNA。
6.基因型组I的Mutiplex RT-qPCR的检测，和II诺如病毒，和大肠杆菌噬菌体的MS 2（补充表2）
- 清洁的工作表面，pipettES，并与核糖核酸酶净化解决方案的离心机，以减少可能的污染。
- 在冰上解冻RT-qPCR的试剂。在冰上解冻RNA（在一个单独的区域/间）。
- 确定反应的数量和它们添加更多的至少10％（ 例如 ，如果需要10反应，使11个主混合物）。
- 涡单个主结构组件，除了25X RT-qPCR的酶，5秒。小心通过用手指轻弹管混合酶。
- 短暂离心母液成分为5秒。
- 根据试剂盒说明书准备诺如病毒GI和GII的实时荧光定量RT-PCR检测预混和添加特定的诺如病毒的寡核苷酸引物和探针在1.5 ml离心管（补充表3）。
- 吹打5-10倍上下混合母液（不推荐涡旋）。等分试样22微升在实时PCR的96孔板的每个孔中的主混合物。
- 涡样品RNA5秒，并进行了简短（5秒）离心收集。
- 加入样品RNA和GI和GII阳性对照3μL到RT-qPCR的板（遵循从表2模板）。添加核酸酶Freewater的3微升在无模板对照（NTC）的孔中。
- 密封用光学粘合剂膜实时板。
- 在1300 xg离心仔细离心实时板1分钟，以除去任何气泡或液滴可能存在于孔中。
- 设置了实时PCR仪和设置下列热循环条件：1）10分钟的RT步骤。在45℃（2）激活Taq聚合酶，10分钟。在95℃，（3）在95℃下45个循环的15秒，60秒，在60℃。
7.诺如病毒的定量的拭子样品
- 检查的阳性和阴性对照的结果来验证，RT-qPCR的结果（ 补充表3）。
- 确定每个标准曲线是否满足可接受值在补充表2中给出，并计算使用公式1的标准曲线的总体标准偏差。
（公式1）％的效率= 100×10（平均Ct值截距）/斜率 。 - 如果在PCR仪软件不计算斜率为每个标准曲线，确定斜率和R使用统计软件2值回归（ 例如 Excel，SPSS，SAS或）。此外，计算公式如下I标准曲线％的效率
- 记录由热循环仪软件基于满足补充表4规定的标准，标准曲线所有测试样本计算出来的RNA拷贝数。重新运行与标准曲线牛逼帽子的样品不符合标准或有假阳性对照。检查大肠杆菌噬菌体MS2，其中加入作为内部对照来监测PCR抑制的Ct值。
- 确定RNA拷贝p的总数由总RNA洗脱剂的体积（25至50μl）的该用于RT-qPCR的反应中的RNA（3-5微升）的比例，在步骤7.2计算出的RNA拷贝数乘法器样品。可替代地，通过用分析的对象的表面积（厘米2）除以总RNA拷贝数计算出的RNA浓度。
8.基因分型实时定量RT-PCR阳性样品由赫米嵌套常规PCR扩增
- 制备第一轮主混合物的每个引物组的RT-PCR测定的（ 补充表1,2和5）。
- 诺如病毒添加RNA阳性的5微升至预混20μL。
- 在下列条件下运行的RT-PCR：在42℃（2）激活Taq聚合酶，15分钟30分钟（1）RT步骤在95℃，和（3）在95℃下的30秒40个循环，30秒，在50℃，并在72℃下60秒。后40个循环，孵育在72℃另外10分钟。
- 准备为每个引物组的RT-PCR测定的（ 补充表2和5）在第二轮脑膜混合物。
- 加入23μl反应混合液，并添加第一轮RT-PCR产物（从第一轮）2微升，每管（最好是第一轮产品应在无RNase水稀释1/10）。
- 重复步骤8.3。
- 制备在100ml 1×Tris-乙酸EDTA的2％琼脂糖凝胶（40毫摩尔Tris，20mM的乙酸，和1mM EDTA，pH为8.3）。通过在微波炉中加热该混合物琼脂糖溶解后，将混合物冷却到60-70℃后加入10微升每100mL制得的凝胶的核酸染色，倒入该凝胶并插入梳子。让凝胶沉降至少30分钟。
- 混合15微升各RT-PCR产物与6×上样染料的3微升。负荷各样品的15微升和electrophorese在100V琼脂糖凝胶1小时。
- 从凝胶合适的大小（330个基点GI和341个基点GII）的消费目标RT-PCR片段d使用商业凝胶提取试剂盒纯化RNA。纯化的PCR产物现在可用于Sanger测序。
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Representative Results
图1呈现拭子采样协议的流程图。这个协议包括四个主要步骤; 1）样品的采集，2）样品存储和运输，3）病毒RNA纯化和浓缩和4），RT-qPCR分析和基因分型。
图1：流量为诺如病毒的环境表面取样最终协议的图表 ，请点击此处查看该图的放大版本。
表1总结了从有航行中报疑似诺如病毒胃肠炎的病例游轮收集了34拭子样本的结果。拭子样品进行提取和TeSTED一式两份由多重实时RT-qPCR的诺罗病毒。十七（18.5％）样本，包括从小木屋，其中诺如病毒症状的乘客已经从公共区域船上呆到9表面8个样品检测呈阳性。每个样品的基因组的拷贝数是从Ct值使用诺罗病毒GII.7 RNA转录物的标准曲线（其范围从16到31）来计算。基因组拷贝的在客舱中位数从拭子样本为3.6日志10（范围：2.4 - 4.5日志10 RNA拷贝），这比从普通区域（范围：1.2 - 2.1日志10个基因组拷贝）的基因组拷贝显著更高（ P <0.001）。在17个阳性拭子样品的四（23.5％）是能够进行基因分型，所有样品具有相同GII.1序列。
| 位置环境交换收集 | | 平均Ct值（＃阳性测试的样品的总数） | 基因型 | 诺如病毒RNA复制每个采样C区号码 | |
| 中庭 | 扶手 | 34.3（1/2） | GII | 16 |
| 客舱 | 马桶座圈 | 31.4（2/2） | GII。 b | 31217 |
| 客舱 | 龙头 | 37.5（1/2） | GII | 491 |
| 客舱 | 门把手 | 35.0（2/2） | GII | 2675 |
| 客舱 | 遥控 | 38.6（2/2） | GII.1 b | 233 |
| 客舱乙 | 马桶座圈 | 33.5（2/2） | GII.1 b | 986 | 冰淇淋机 | 34.2（2/2） | GII | 16 |
| 丽都 | 表调味品 | 35.2（1/2） | GII | 15 |
| 丽都 | 桌上 | 35.3（1/2） | GII | 14 |
| 比萨店 | 柜台面 | 35.7（1/2） | GII | 14 |
| 主营厨房 | 欢乐的时光机 | 37.1（1/2） | GII | 64 |
| 售货机 | 可触摸的表面 | 38.8（1/2） | GII | 18 |
| 船员休息室 | 键盘面和鼠标 | 36.8（1/2） | GII | 80 |
| 客舱ç | 水龙头和门把手 | 31.6（2/2） | GII.1 b | 26458 |
| 客舱ç | 电话 | 36.4（2/2） | GII | 1035 |
| 客舱ç | 键盘 | 33.0（2/2） | GII | 1,317 |
| 医学中心 | 剪贴板 | 36.0（2/2） | GII | 113 |
| 一个舱A，B和C已被谁已病临床与病毒gastoenteristis症状的个人占用。 | ||||
| b将17 GII阳性拭子样本的四个可能进行基因分型。 | ||||
| 基于诺瓦克GII.7 RNA转录的标准曲线c上RNA拷贝被caluated。 | ||||
| 注：上述日期略有从原来的第6条进行修改。 | ||||
表1：从那个曾在航程中报疑似诺如病毒胃肠炎的病例游轮收集了34拭子样本结果。
图2显示了通过RT-qPCR的并测序这些样品的能力来确定Ct值之间的关系。总体而言，127出217拭子样本检测呈阳性的用RT-qPCR的诺如病毒GII。样品显示Ct值的范围广（12-40）。在总体上，RT-qPCR的阳性样品29（22.8％）可被基因分型。与Ct值低于27和28-31之间的范围内拭子样品以分别为100％和72.2％，费率进行基因分型。相比之下，只有22.0％，用的32-36和37-40的Ct值拭子样品的1.6％，分别制作半嵌套扩增子可能被成功测序。
图2：RT-qPCR的筛选和确定过程中诺如病毒暴发已收集了拭子样本的测序结果。白条表示RT-qPCR的阳性拭子样品病毒的数量。诺如病毒的人类核酸的RT-qPCR的阳性标本采用半巢式PCR方法扩增并测序基因分型的确认。黑条和线代表的数量和基因型的比例分别证实拭子样本。 请点击此处查看该图的放大版本。
| Ct值范围 | RT-qPCR的阳性样本数 | 序列证实的样本数（％） 的 |
| 20-23 | 4 | 3（75） |
| 24-27 | 3 | 3（100） |
| 28-31 | 18 | 13（72.2） |
| 32-36 | 41 | 9（22.0） |
| 37-40 | 61 | 1（1.6） |
| 一）半巢式PCR | ||
表2：RT-qPCR的和拭子样本的基因分型结果。
| 样品号 | 位置 | 面的说明 | 表面积（cm 2）的 | 样品采集的日期/时间 | 清洁（Y / N） | 如果清洗，使用的是什么消毒剂？</ STRONG> | 表面材料和位置的详细描述中 |
| 1 | 房间＃7-1302 | 马桶座圈 | 700厘米2 | 2016年6月26日; 9:00 AM | 没有 | 不适用 | 座便器[顶面），和硬plastoc |
| 2 | 房间＃7-1330 | 电话手柄 | 500厘米2 | 2016年6月26日;上午9:25 | 是 | 1000 ppm的漂白剂 | 硬质塑料，橡胶按键 |
补充表1：样品描述形式的例子。
| 基因型组/病毒 | 名的寡核苷酸引物/探针 | 序列5→3＆＃900; | 参考 |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT猫猫TYAÇ | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC汽车CCA TTR一个TAC | 17 | |
| Ring1E探头 | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ 一个 | 这项研究 | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG公司 | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TTC TCA ACA | 17 | |
| 分享帮助底漆 | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <TD> 17||
| 分享帮助探头 | Cy5的或QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC CCG TCT TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA GCG CGG CCA ACC TGA CGAÇ | 18 | |
| MS2P探头 | HEX - CAC ATC GAT AGA AGG TCA CTA TGC CAAGC - BHQ1Ç | 18 | |
| 一 GI TaqMan探针是5'-标记6-羧基荧光素（FAM）和3'-标记的MGBNFQ（次要槽结合位点） | |||
| b GII TaqMan探针是5'-Cy5标记或类星体670和3'-标有黑洞淬灭剂;黑洞猝灭剂（BHQ）2使用，由于可用性，BHQ 3是首选。 | |||
| çMS2 TaqMan探针是5R17;标记的十六进制和5'-标记BHQ1 | |||
补充表2：寡核苷酸引物和探针信息。
| 零件 | 每反应体积（微升） | 最终浓度 |
| 2×RT-PCR缓冲液* | 12.5 | 1X |
| 无核酸酶的水* | 1.08 | N / A |
| 检测增强* | 1.67 | N / A |
| 嵌齿1F（10μM） | 1 | 400纳米 |
| 嵌齿1R（10μM） | 1 | 400纳米 |
| 环1E-探针（10μM） | 0.5 | 200纳米 | 1 | 400纳米 |
| 嵌齿2R（10μM） | 1 | 400纳米 |
| 环-2-探针（10μM） | 0.5 | 200纳米 |
| MS2F（10μM） | 0.25 | 100纳米 |
| MS2R（10μM） | 0.25 | 100纳米 |
| MS2P探针（10μM） | 0.25 | 100纳米 |
| 2×RT-PCR酶* | 1 | 1X |
| 预混量 | 22 | |
| *包括在实时RT-PCR试剂盒 | ||
补充信息表3：主结构为多重实时GI / GII / MS2诺如病毒RT-PCR
| 控制类型 | 结果解释 | ||
| 样品 | 阴性对照 | 应为阴性 | |
| 阳性对照 | 应为正 | ||
| 阴性样品 | 为阴性如果每个Ct值是检测不到的GI / GII | ||
| 阳性样品 | 这两个重复的Ct值（GI / GII）是<38;这（任意）截止，需要为每个实时PCR平台和试剂盒，以通过实验确定 | ||
| 暂定阳性样品 | 样品暂定正面的，如果一个复制的Ct值（GI / GII）是<38 | ||
| 内部过程控制（MS2） | ≥32的F与阈周期的采样值（Ct）或MS2应重新测试未稀释和稀释10倍。 | ||
| 参数 | 可接受值 | ||
| 诺如病毒使用RNA转录标准曲线 | R 2 | > 0.97 | |
| 效率 | 90％至115％ | ||
补充表4：控制每个RT-qPCR的测试环境拭子样本检测诺如病毒包括。
| 零件 | 最终浓度 | 体积/ RXN（微升） |
| 5×RT-PCR缓冲液 | 1X | 5.00 |
| dNTP混合物（10毫摩尔） 0.4毫米 | 1.00 | |
| 酶混合物（RT和Taq） | 1.00 | |
| 正向引物 | 0.5μM | 0.50 |
| 反向引物 | 0.5μM | 0.50 |
| RNA酶抑制剂（20U /微升） | 20单位 | 1.00 |
| 无RNA酶的水 | 11.00 | |
| 总容积 | 20.00 | |
| 正向和反向的引物组对GI和GII组是Cog1F + G1SKR和Cog2F + G2SKR分别。 | ||
| 第二轮RT-PCR | ||
| 零件 | 最终浓度 | 体积/ RXN（微升） |
| 5×RT-PCR缓冲液< / TD> | 1X | 5.00 |
| dNTP混合物（10毫摩尔） | 0.4毫米 | 1.00 |
| 酶混合物（RT和Taq） | 1.00 | |
| 正向引物B | 0.5μM | 0.50 |
| 反向引物B | 0.5μM | 0.50 |
| RNA酶抑制剂（20U /微升） | 20单位 | 1.00 |
| 无RNA酶的水 | 14.00 | |
| 总容积 | 23.0 | |
| b正向和反向引物对GI和GII组是G1SKF + G1SKR，并分享帮助底漆+ G2SKR分别。 | ||
| 注：以上咨询无论略有从原来的第19条修改 | ||
| 第一阶段 | 现场采样 | 1.检查大泡拭子试剂盒（ 例如 ，到期日，管泄漏，和拭子湿润） |
| 2.擦拭表面（限表面积≤100英寸2评论（645 平方厘米）） | ||
| 3.将棉签放入输送管，并拧紧盖子，以防止在运输过程中泄漏 | ||
| 在拉链袋4.将棉签盒 | ||
| 二期 | 样品运输和储存 | 1.采样拭子应储存-70℃（或-20℃） |
| 2.运输拭子采集拭子48小时内隔热容器和船舶样本的实验室在0-4°C（冷包） | ||
| 第三阶段 | RNA etraction | 1.检查裂解液（ 例如 ，过期数据） |
| 2.加入100％乙醇之前添加MS2作为内部对照入裂解缓冲液 | ||
| RNA纯化和浓缩 | 3.清洁实验台，并利用RNA核糖核酸酶去除解决小型设备 | |
| 经常在步骤4.更换手套，避免了RNA交叉污染 | ||
| 第四阶段 | RT-PCR检测（QA / QC） | 1.包括每个RT-qPCR分析定量诺罗病毒的RNA转录（GI和GII）来控制对每个PCR运行在Ct值的变化 |
| 2。使用缺席MS2信号来监测PCR抑制剂的存在 |
补充表6：检查清单CDC的环境取样过程。
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Discussion
诺如病毒有18和10 3病毒颗粒20之间的50％的人感染剂量。因此，即使表面的低水平的污染可能对公共健康危险。拭子采样协议的若干方面进行了评价，包括：1）不同拭子的材料，2）在运输过程中贮存条件拭子，3）病毒RNA的浓度，和4）噬菌体MS2作为内提取的控制。
直到最近，才由棉，涤纶，锦纶和抗静电擦拭）制成拭子的性能进行了评估，并提出适合现场使用13，14，15，21，22。其中，棉签已建议由ISO 15216协议检测诺如病毒和肝炎从食物制备表面和非生物媒介23病毒。怎么样以往，有对棉签大的高触感的表面，如门把手，计算机和马桶座已在诺如病毒24，25的传输经常被牵连在野外条件下的性能测试数据有限。此外，这些环境表面的大小超过纤维拭子的容量。在我们的研究中，我们证明了大泡棉签，其中有一个更大的拭子头部比光纤尖拭子，面积采样环境表面时可达700 平方厘米有诺如病毒的人更高的回收率。
在溶液诺如病毒是在环境温度下相对不稳定和至少致冷要求。因此，运输到实验室应在0-4℃，48小时内的拭子采集后发生。这通常可以在PCR反应中进行试验样品的体积比的量小得多从棉签（3-5μL与5-10毫升），未经浓度显著降低阳性率洗脱后的样本。在环境病毒学，聚乙二醇（PEG）已被成功地用于从大量环境水的浓缩病毒。然而，体积达10毫升，可以很容易地提取并用MIDI离心柱到卷低至250μL集中，进一步浓缩10倍，使用高回收率离心柱。
虽然，RT-qPCR的是金标准灵敏检测和诺如病毒的定量，这些测定法的灵敏度能够容易地通过PCR抑制剂的存在从拭子样本被共同提取的影响。因此，夹杂物的提取控制，如大肠杆菌噬菌体MS2病毒颗粒，在多重PCR格式，其检测两诺罗病毒以及MS2，有助于监测PCR抑制的存在并评估不同实验之间变化。</ P>
实验室验证方法的测试的变量是临界来确定测试方法的鉴别能力，并进一步转换成该方法的可能字段采样的性能。以现实世界的现场条件（ 如延迟出样，高达700 平方厘米大的表面积）考虑在内，诺如病毒检出限为3.4日志10（不锈钢）和4日志10（马桶座）每面份诺如病毒样本6。因此，消极的棉签结果是不确定的，没有病毒污染已发生。诺如病毒疾病的临床和流行病学信息总是胜过环境的调查结果2,6。
我们从游轮的数据显示，高触感的表面，如电话机，电脑键盘，和门把手在小木屋里的人诺如病毒测试呈阳性有报道病毒性肠胃炎住过。这些表面或成为通过直接接触，通过冲洗厕所或呕吐发作6，7，8，9，10中产生的微滴污染或间接的影响。
总之，使用这种新开发的拭子协议可以协助在爆发期间确定的环境的污染水平的环境表面上诺罗病毒的检测，检测出病毒时临床样品不可用，并在清洁实践的有效性进行监测。纤维放倒基于表面取样方法已被广泛用于研究其它肠道病毒拭子（棉和人造丝）（ 例如轮状病毒，和腺病毒）27，28，29。考虑到高对大泡拭子对这些纤维的诺罗病毒回收效率拭子6，我们预计，大泡拭子将能够检测其它肠道病毒，以及。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
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