Abstract
Menschliche Noroviren sind eine führende Ursache für Epidemie und sporadische Gastroenteritis weltweit. Da die meisten Infektionen entweder direkt über die Person-to-Person Route oder indirekt durch Umwelt Oberflächen oder Lebensmittel übertragen werden, kontaminierte fomites und leblose Oberflächen sind wichtige Vehikel für die Verbreitung des Virus während Norovirusausbrüchen.
Wir entwickelt und evaluiert ein Protokoll Makroschaums Tupfer zum Nachweis und zur Typisierung von humanen Noroviren von harten Oberflächen verwendet wird. Im Vergleich zu faser bestückte Tupfer oder antistatische Wischtücher ermöglichen Makroschaum Tupfer Virus Recovery (Bereich 1,2 bis 33,6%) von Toilettensitzflächen von bis zu 700 cm 2. Das Protokoll enthält die Schritte zur Extraktion des Virus aus den Tupfer und eine weitere Konzentration der viralen RNA unter Verwendung von Spin-Säulen. Insgesamt 127 (58,5%) von 217 Tupferproben, die von den Oberflächen auf Kreuzfahrtschiffen und Langzeitpflegeeinrichtungen, wo Norovirus-Gastroenteritis war gesammelt worden warenpositiv getestet GII Norovirus durch RT-qPCR berichtet. Von diesen 29 (22,8%) erfolgreich genotypisiert werden konnte. Abschließend Nachweis von Noroviren auf Umgebungsoberflächen unter Verwendung des Protokolls wir bei der Bestimmung des Grades der Umweltverschmutzung während der Ausbrüche sowie Nachweis von Virus kann helfen entwickelt, wenn klinische Proben nicht zur Verfügung stehen; es kann auch die Überwachung der Wirksamkeit von Sanierungsstrategien erleichtern.
Introduction
Menschliche Noroviren sind eine führende Ursache für Epidemie und sporadischen akuten Gastroenteritis weltweit 1, 2, 3. Das Virus ist sehr ansteckend und Übertragung erfolgt durch direkten Mensch zu Mensch Interaktion oder indirekt durch Kontakt mit kontaminierten Lebensmitteln, Wasser oder Umwelt-Oberflächen. Noroviren können für längere Zeit vergossen werden und verlängert das Überleben des Virus auf Umwelt Oberflächen hat 1 dokumentiert, 2, 3. Während der Spitzenabwurf, Milliarden von Viruspartikeln pro Gramm Faeces freigesetzt werden, und Erbrochenem enthält auch eine ausreichende Anzahl von Viruspartikeln 4 Infektion zu verursachen, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. Darüber hinaus wird die Übertragung des Virus zwischen leblosen Oberflächen und die menschliche Haut kann leicht 2, 11, 12. Daher Überwachung der Umweltverschmutzung in Ausbruchsuntersuchungen auftreten unterstützen können und in der Wirksamkeit der Clean-up - Bewertung und Desinfektionsverfahren.
Mehrere Umweltprobenahme Protokolle zum Nachweis von Rotavirus, Coliphage MS2, feline Calicivirus (FCV) und Bakteriophagen P22 13, 14, 15, 16 beschrieben worden. Jedoch sind die Validierungsbedingungen in diesen Studien beschrieben, einschließlich der schnellen Austrocknung (<1 h) und kleine Oberflächenbereiche (25 x 100 cm 2), möglicherweise nicht ausreichend Feldeinstellungen repräsentieren. Darüber hinaus ist die geringe Belastung von Enviro erwartetnmental Oberflächen erfordern Protokolle, die der Lage sind, sehr wenige Viruspartikel zu detektieren.
Wir entwickelten eine Makroschaum-basierte Oberfläche Probenahmeverfahren zum Nachweis und zur Typisierung von Norovirus. Dieses Verfahren wurde bei mehreren Norovirusausbrüchen validiert. Das Protokoll enthält 1), wie Tupferproben von Umwelt Oberflächen (2), wie die Integrität der Proben während der Entnahme und Versand an das Labor, und 3) Labortests und Typisierung von Norovirus am besten halten zu sammeln.
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Protocol
1. Swab Probenahme im Feld
- Tragen Sie ein sauberes Paar Handschuhe.
- Messen Sie die Größe des Beprobungsfläche ohne Berührung der Oberfläche mit einem Maßband oder Lineal. Versuchen Sie, den Bereich so genau wie möglich zu ermitteln und füllen Sie ein Berichtsformular (Supplementary Tabelle 1).
- Überprüfen Sie den Tupfer-Kit für mögliche Leckagen und Etikettenprobentransporttaschen und Tupfer-Kits.
- Bewegen des Tupfers über die Flächenabtastung folgendermaßen: einen Hub in horizontaler Richtung, einen Hub in vertikaler Richtung und einem Hub in einer diagonalen Richtung. Seien Sie nicht eine Fläche größer als 700 cm 2 Tupfer.
- Legen Sie jedes Tupfer in ein Röhrchen und ziehen Sie die Kappe.
2. Lagerung und Transport von Putzlappen zum Labor
- Halten Tupfer bei 4 ° C für bis zu 48 h. Falls eine Lagerung für einen längeren Zeitraum erforderlich ist, lagern die Abstriche bei -20 ° C (oder -70 ° C).
- Halten Sie die Röhrchen bei 0-4 ° C (dh. verwenden, Kältepackungen) in einem isolierten Behälter während des Transports zum Labor und werden innerhalb von 24 bis 48 h der Sammlung.
3. Viruskonzentration, Viral RNA Extraktion und Reinigung
HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte verwenden, um eine Tischzentrifuge bei 5.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie mit der universellen Nukleinsäure-Extraktion (UNEX) Puffer arbeiten. Schutzbrille oder Gesichtsschutz.
- Beschriften Sie ein 15 ml-Röhrchen und einer RNA-Midi-Säule für jede Probe. Fügen Sie eine negative Extraktionskontrolle in jedem Experiment.
- Die Lyse-Lösung für 10 Tupfer vorzubereiten, mit 25 ml PBST (PBS, pH 7,2, enthaltend 0,02% Tween-80) 25 ml UNEX Puffer mischen.
- Je 50 ul der Coliphage MS2 - Suspension (10 & sup6 ; PFU / & mgr; l) zu 50 ml Lysis - Lösung.
- Legen Sie einen Tupfer in einem 15 ml-Röhrchen und mit 5 ml Lyselösung. Mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
- 5 ml 100% Ethanol zu jedem Röhrchen und Vortex für 10 s.
- Vorsichtig den Tupfer aus dem 15 ml-Röhrchen zu entfernen (es enthält UNEX Puffer) es leicht gegen die Seite des Schlauchpress überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und dann den Tupfer verwerfen. Die restlichen Mengen sollten zwischen 9-10 ml sein.
4. Midi Säule viralen Nukleinsäureextraktion
- Transfer vorsichtig 4,5 ml UNEX / Ethanol-Mischung aus Schritt 3.6 auf einem Midi-Säule, Zentrifuge und Filtrat verwerfen.
- Legen Sie eine andere 4,5 ml aus der gleichen Mischung auf die gleiche Säule, Zentrifuge und verwerfen Sie das Filtrat.
- Für die erste Wäsche, fügen Sie 3,5 ml 70% Ethanol auf die Midi-Säule, Zentrifuge und das Filtrat verwerfen.
- Für die zweite Wäsche, weitere 3,5 ml 70% Ethanol auf die Midi-Spalte hinzufügen. Zentrifuge und Filtrat verwerfen.
- Für die Trockenschleuder Zentrifugation der Midi Spalten alle Spuren von Ethanol zu entfernen (was sich negativ auf Ihre virale RNA-Gewinnung beeinflussen können).
- Legen Sie die Midi-Spalte in einer neuen 15 ml Zentrifugenröhrchen. In 250 ul Elutionspuffer auf die Midi-Säule; 1 min warten, bevor das Zentrifugieren der höchsten viralen RNA-Gewinnung zu erhalten.
- Die extrahierten Nukleinsäure bei -70 ° C oder sofort zu Schritt 5.
5. Die Konzentration der viralen Nukleinsäure Verwendung von RNA-Clean and Concentrator Kits
- In 500 & mgr; l RNA Binding Buffer zu 250 & mgr; l in Schritt eluierte RNA 4.7 oben und Vortex für 10 s.
- In 750 & mgr; l 100% Ethanol und Vortex für 10 s.
- Beschriften Sie eine Spin-Säule für jede Probe. Laden Sie die 750 & mgr; l Probe auf eine Spin-Säule.
- Zentrifugieren Sie die Spin-Säulen bei 12.000 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- Legen Sie die restlichen 750 & mgr; l auf eine Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min.
- Für die Vorwäsche, werden 400 & mgr; l RNA Prep Puffer zu jeder Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- Für die erste Wäsche, fügen 800 & mgr; l RNA Waschpuffer in jede Spin-Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- Für das zweite Waschen werden 400 & mgr; l RNA Waschpuffer Säule und Zentrifuge bei 12.000 g für 1 min zu spinnen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
- Für die Trockenschleuder Zentrifugation der Spin-Säule alle Spuren von Waschpuffer für 2 min bei 12.000 xg zu entfernen.
- Transfer vorsichtig Spin-Säule in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zugeben von 25 & mgr; l Elutionspuffer auf die spin-Säule und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur. Dadurch wird die Rückgewinnung von viraler RNA aus der Säule zu erhöhen.
- Sammeln RNA durch die Spin-Säule bei 10.000 × g für 1 min zentrifugiert.
- Entweder gehen Sie direkt auf RT-qPCR (Schritt 6) oder Speicher-RNA bei -70 ° C.
6. Mutiplex RT-qPCR Nachweis von Genogruppe I und II Noroviren und Coliphage MS 2 (Supplementary Tabelle 2)
- Saubere Arbeitsflächen, pipettes und Zentrifugen mit RNase Dekontaminationslösung auf eine mögliche Kontamination zu reduzieren.
- Auftauen RT-qPCR-Reagenzien auf Eis. Thaw RNA auf Eis (in einem separaten Bereich / Zimmer).
- Bestimmen Sie die Anzahl der Reaktionen und fügen Sie mindestens 10% mehr von ihnen (zB wenn 10 Reaktionen benötigt werden, machen Master - Mix für 11).
- Vortex einzelnen Master-Mix-Komponenten, mit Ausnahme von 25x RT-qPCR Enzym, für 5 s. durch Ausklopfen der Röhre mit einem Finger vorsichtig das Enzym mischen.
- Kurz Zentrifuge Master-Mix-Komponenten für 5 s.
- Bereiten Sie den Master - Mix für die Echtzeit - RT-PCR - Nachweis von Noroviren GI und GII gemäß dem Kit - Anweisungen und Norovirus-spezifischen Oligonukleotid - Primer und Sonden in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (Supplementary Tabelle 3) hinzuzufügen.
- Mischen Sie den Master-Mix durch Pipettieren von 5-10 mal nach oben und unten (Verwirbelung wird nicht empfohlen). Aliquot 22 ul des Master-Mix in jeder Vertiefung der Echtzeit-PCR-96-Well-Platte.
- Vortex Probe RNA5 Sekunden, und sammeln Sie durch kurzes (5 s) Zentrifugation.
- In 3 ul der Probe RNA und GI und GII positive Kontrollen an den RT-qPCR Platte (folgen Vorlage aus Tabelle 2). In 3 ul Nuklease-Freewater in den No-Template-Steuerung (NTC) Brunnen.
- Verschließen Sie die Echtzeit-Platte mit optischen Klebefilm.
- Zentrifuge vorsichtig die Echtzeit-Platte bei 1300 × g für 1 min alle Luftblasen oder Flüssigkeitstropfen zu entfernen, die in den Vertiefungen vorhanden sein können.
- Stellen Sie eine Echtzeit-PCR-Instrument und Set-up folgende Thermozyklisierung Bedingungen: 1) RT-Schritt 10 min. bei 45 ° C (2) Aktivierung der Taq-Polymerase, 10 min. bei 95 ° C und (3) 45 Zyklen von 15 s bei 95 ° C und 60 s bei 60 ° C.
7. Quantifizierung von Norovirus in Tupferproben
- Überprüfen Sie die Ergebnisse der positiven und negativen Kontrollen RT-qPCR Ergebnisse (Ergänzende Tabelle 3) zu validieren.
- Bestimmen Sie, ob jede Standardkurve erfüllt dieakzeptable Werte in Ergänzungs Tabelle 2 und berechnen die Gesamtstandardabweichung für die Standardkurve unter Verwendung von Gleichung 1 gegeben.
(Gleichung 1)% Wirkungsgrad = 100 x 10 (Durchschnitt CT - Werte-Intercept) / Slope. - Wenn die PCR - Thermocycler - Software wird die Steigung nicht für jede Standardkurve zu berechnen, bestimmen Steigung und R 2 Werte , die durch Regression Statistik - Software (zB Excel, SPSS oder SAS). Darüber hinaus berechnen für Standardkurven folgende Gleichung I die% Wirkungsgrad
- Notieren Sie sich die RNA - Kopienzahl von Thermocycler - Software berechnet für alle Testproben auf der Basis von Standardkurven, die den Kriterien in Ergänzende Tabelle 4 erfüllen. Rerun alle Proben mit Standard - t Hut Kurven erfüllen nicht die Kriterien oder haben falsch-positive Kontrollen. Überprüfen Ct-Werte von Coliphage MS2, die als interne Kontrolle zur Überwachung PCR Hemmung aufgenommen.
- Bestimmen Sie die Gesamtzahl der RNA-Kopien per Probe durch die in Schritt 7.2 berechnet, um die RNA-Kopienzahl multipliziert mit dem Verhältnis des Volumens (25 bis 50 & mgr; l) der gesamten RNA Eluent derjenigen der RNA (3 bis 5 & mgr; l), die für die RT-qPCR-Reaktion. Alternativ berechnen die RNA - Dichte durch die Gesamt - RNA - Kopienzahl durch die Objektfläche (cm 2) analysiert geteilt wird .
8. Genotypisierung von Echtzeit-RT-PCR-positiven Proben von Hemi Nested Herkömmliche PCR-Amplifikation
- Bereiten Sie die erste Runde des Master - Mix für jeden Primersatz der RT-PCR - Assays (Supplementary Tabellen 2 und 5).
- In 5 ul Norovirus positive RNA zu 20 & mgr; l Master-Mix.
- Führen Sie die RT-PCR unter den folgenden Bedingungen: (1) RT-Schritt 30 min bei 42 ° C (2) Aktivierung der Taq-Polymerase, 15 min bei 95 ° C, und (3) 40 Zyklen von 30 s bei 95 ° C , 30 s bei 50 ° C und 60 sec bei 72 ° C. Nach 40 Zyklen bei 72 ° C für weitere 10 min inkubiert.
- Bereiten Sie die zweite Runde der mater - Mix für jeden Primersatz der RT-PCR - Assays (Supplementary Tabellen 2 und 5).
- In 23 & mgr; l Master-Mix und mit 2 & mgr; l der ersten Runde RT-PCR-Produkte (von der ersten Runde) zu jedem Röhrchen (idealerweise der ersten Runde Produkt 1/10 in RNase-freiem Wasser verdünnt werden sollte).
- Wiederholen Sie Schritt 8.3.
- Vorbereiten eines 2% igen Agarose-Gel in 100 ml 1x Tris-Acetat-EDTA (40 mM Tris, 20 mM Essigsäure und 1 mM EDTA bei pH 8,3). Nach dem Auflösen von Agarose, indem die Mischung in einem Mikrowellenofen erhitzt wird, 10 ul Nukleinsäurefarbstoff pro 100 ml der vorbereiteten Gel hinzu, nachdem die Mischung auf 60-70 ° C abgekühlt, um das Gel gießen und die Kämme einzufügen. Lassen Sie das Gel für mindestens 30 min absetzen.
- Mischen Sie 15 ul jeder RT-PCR-Produkt mit 3 & mgr; l 6-fachem Beladungs Farbstoff. Last 15 ul jeder Probe und dem Agarosegel elektrophoretisch bei 100 V für 1 h.
- Excise Ziel RT-PCR-Fragmente von geeigneter Größe (330 bp für GI und 341 bp für GII) aus dem Gel eind RNA unter Verwendung eines kommerziellen Gel-Extraktions-Kits reinigen. Das gereinigte PCR-Produkt kann jetzt Sanger-Sequenzierung verwendet werden.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm des Tupferprobenahmeprotokoll. Dieses Protokoll besteht aus vier Hauptschritten; 1) Probenentnahme, 2) Probenlagerung und Transport, 3) die virale RNA-Reinigung und Konzentration und 4) RT-qPCR-Assay und die Genotypisierung.
Abbildung 1: Ablaufdiagramm des endgültigen Protokolls für Umweltoberflächenproben von Norovirus Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1 fasst die Ergebnisse von 34 Tupferproben , die von einem Kreuzfahrtschiff gesammelt wurden , die Fälle von Verdacht auf Norovirus - Gastroenteritis während einer Reise berichtet hatte. Tupferproben wurden extrahiert und tested in zweifacher Ausfertigung für Norovirus durch Multiplex-Echtzeit-RT-qPCR. Siebzehn (18,5%) Proben positiv getestet, darunter 8 Proben von Oberflächen in Kabinen, wo die Passagiere mit Norovirus-Symptome geblieben war und 9 aus öffentlichen Bereichen auf dem Schiff. Die Anzahl der genomischen Kopien pro Probe wurden aus den Ct-Werte berechnet (die vom 16. bis 31. reichte) eine Standardkurve eines Norovirus GII.7 RNA-Transkript mit. Die mittlere Anzahl von Genomkopien aus Tupferproben in Kabinen betrug 3,6 log 10 (Bereich: 2,4 bis 4,5 log 10 RNA - Kopien), die aus öffentlichen Bereichen (Bereich: 1,2 bis 2,1 log 10 Genomkopien) deutlich höher als die Genomkopien war ( P <0,001). Vier (23,5%) der 17 positiven Abstrichproben konnten genotypisiert werden, und alle Proben wiesen identische GII.1 Sequenzen.
| Standort Umwelt-Swap einen Verteidiger | | Durchschnittliche Ct - Wert (# positiv von der Gesamtzahl der getesteten Proben) | Genotyp | Norovirus RNA - Kopienzahl pro abgetastete Bereich c | |
| Atrium | Balustraden | 34,3 (1/2) | GII | 16 |
| Cabin A | Toilleten Sitz | 31,4 (2/2) | GII. b | 31217 |
| Cabin A | Wasserhahn | 37,5 (1/2) | GII | 491 |
| Cabin A | Türschnalle | 35,0 (2/2) | GII | 2675 |
| Cabin A | Fernbedienung | 38,6 (2/2) | GII.1 b | 233 |
| Cabin B | Toilleten Sitz | 33,5 (2/2) | GII.1 b | 986 | Eis-Maschiene | 34,2 (2/2) | GII | 16 |
| Freibad | Tabelle Gewürze | 35,2 (1/2) | GII | 15 |
| Freibad | Tischplatte | 35,3 (1/2) | GII | 14 |
| Pizzeria | Gegenlauffläche | 35,7 (1/2) | GII | 14 |
| Hauptküche | Fun-Time Machine | 37,1 (1/2) | GII | 64 |
| Verkaufsautomat | berührbarer Oberflächen | 38,8 (1/2) | GII | 18 |
| Crew-Lounge | Tastaturoberfläche und Maus | 36.8 (1/2) | GII | 80 |
| Cabin C | Hahn und Türgriff | 31,6 (2/2) | GII.1 b | 26458 |
| Cabin C | Telefon | 36,4 (2/2) | GII | 1035 |
| Cabin C | Tastatur | 33,0 (2/2) | GII | 1317 |
| Ärztezentrum | Zwischenablage | 36,0 (2/2) | GII | 113 |
| eine Kabine A, B und C von Personen in Anspruch genommen wurde , die klinisch krank mit viralen gastoenteristis Symptome gewesen war. | ||||
| b Vier der 17 GII-positive Tupferproben könnte genotypisiert. | ||||
| c RNA Kopien wurden basierend auf einer Standardkurve von Norovirus GII.7 RNA Transkripte caluated. | ||||
| Hinweis: ab diesem Zeitpunkt wurden aus dem ursprünglichen Artikel 6 leicht modifiziert. | ||||
Tabelle 1: Ergebnisse aus 34 Tupferproben , die von einem Kreuzfahrtschiff gesammelt wurden , die Fälle von Verdacht auf Norovirus - Gastroenteritis während einer Reise berichtet hatte.
Figur 2 zeigt die Beziehung von Ct - Werte , bestimmt durch RT-qPCR und die Fähigkeit , diese Proben zu sequenzieren. Insgesamt 127 von 217 Tupferproben positiv getestet GII Norovirus durch RT-qPCR. Die Proben zeigten eine breite Palette (12-40) von Ct-Werte. Insgesamt 29 (22,8%) der RT-qPCR-positiven Proben genotypisiert werden konnte. Tupferproben mit Ct-Werte unter 27 und im Bereich zwischen 28 bis 31 wurden mit einer Rate von 100% und 72,2% genotypisiert sind. Dagegen nur 22,0% und 1,6% des Tupferproben mit Ct-Werte von 32-36 und 37-40 jeweils hergestellt hemi-nested Amplicons, die erfolgreich sequenziert werden konnten.
Abbildung 2: Ergebnisse der RT-qPCR - Screening und Sequenzierung von Abstrichproben , die während bestätigt Norovirusausbrüchen gesammelt worden waren. Weiße Balken repräsentieren die Anzahl der RT-qPCR positive Tupferproben-Virus. Menschliche Norovirus Nukleinsäuren in diesen RT-qPCR-positiven Proben wurden unter Verwendung von Hemi-verschachtelt PCR-Assay verstärkt und dann zur Bestätigung der Genotypisierung sequenziert. Schwarze Balken und Linien repräsentieren die Anzahl und der Prozentsatz der Genotyp Tupferproben bestätigt sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Ct Wertebereich | Anzahl der RT-qPCR-positiven Proben | Anzahl (%) der bestätigten Sequenz Proben a |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72.2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22,0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1.6) |
| a) Hemi verschachtelte PCR | ||
Tabelle 2: RT-qPCR und Genotypisierung Ergebnisse von Abstrichproben.
| Probennummer | LAGE | Beschreibung der Oberfläche | Fläche (cm 2) | Datum / Uhrzeit der Probenentnahme | Clean (Y / N) | Wenn gereinigt, was für Desinfektionsmittel verwendet wurde? </ Strong> | Ausführliche Beschreibung von Oberflächenmaterial und Standort |
| 1 | Room # 7-1302 | Toilleten Sitz | 700 cm 2 | 2016.06.26; 9:00 morgens | Nein | unzutreffend | WC-Sitz [Deckflächen) und hart plastoc |
| 2 | Room # 7-1330 | Telefon Griff | 500 cm 2 | 2016.06.26; 9.25 | Ja | 1.000 ppm Bleich | Hartplastik, Gummi-Taste |
Ergänzende Tabelle 1: Beispiel Probenbeschreibung Form.
| Genogruppe / Virus | Name des Oligonukleotid - Primer / Sonde | Sequenz 5 → 3 & #900; | Referenz |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC A | 17 | |
| Ring1E-Sonde | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ ein | Diese Studie | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| Ring2-Primer | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <td> 17||
| Ring2-Sonde | Cy5 oder QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| MS2P-Sonde | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c | 18 | |
| ein GI TaqMan Sonde 5'-markiert mit 6-Carboxyfluorescein (FAM) und 3'-markierte mit MGBNFQ (Minor-Groove Binding Site) | |||
| b GII TaqMan Sonde 5'-markiert mit Cy5 oder Quasar 670 und 3'-markiert mit Black Hole Quencher; Black Hole Quencher (BHQ) 2 aufgrund der Verfügbarkeit verwendet, 3 BHQ bevorzugt. | |||
| c MS2 TaqMan - Sonde ist 5R17; -markiertem mit HEX und 5'-markiert mit BHQ1 | |||
Ergänzende Tabelle 2: Oligonukleotid - Primer und Sonden Informationen.
| Komponente | Volumen pro Reaktion (ul) | Die Endkonzentration |
| 2x RT-PCR Buffer * | 12.5 | 1x |
| Nuklease-freies Wasser * | 1,08 | n / a |
| Der Nachweis Enhancer * | 1,67 | n / a |
| Cog 1F (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Cog 1R (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Ring 1E-Sonde (10 & mgr; M) | 0,5 | 200 nM | 1 | 400 nM |
| Cog 2R (10 uM) | 1 | 400 nM |
| Ring 2-Sonde (10 & mgr; M) | 0,5 | 200 nM |
| MS2F (10 uM) | 0,25 | 100 nM |
| MS2R (10 uM) | 0,25 | 100 nM |
| MS2P-Sonde (10 & mgr; M) | 0,25 | 100 nM |
| 2x RT-PCR-Enzym * | 1 | 1x |
| Master Mix Volumen | 22 | |
| * In der Echtzeit-RT-PCR Kit enthalten | ||
Ergänzende Tabelle 3: Master - Mix für Multiplex - Echtzeit - GI / GII / MS2 Norovirus RT-PCR
| Art der Steuerung | Ergebnisinterpretation | ||
| Sample | Negative Kontrolle | Sollte negativ sein | |
| Positive Kontrolle | Sollte positiv sein | ||
| Negative Probe | Probe ist negativ, wenn jeder Ct-Wert nicht nachweisbar ist für GI / GII | ||
| Positive Probe | Ct-Werte (GI / GII) beider Replikate ist <38; diese (willkürlich) Cut-off muss für jeden Real-Time PCR-Plattform und Kit experimentell ermittelt werden | ||
| Vorläufig positive Probe | Probe ist vorläufig positiv, wenn Ct-Wert (GI / GII) einer Wiederholung ist <38 | ||
| Interne Prozesskontrolle (MS2) | Proben mit einem Schwellenzyklus (Ct) Wert von ≥32 foder MS2 sollte unverdünnt werden erneut getestet und 1/10 verdünnt. | ||
| Parameter | Akzeptable Wert | ||
| Standardkurve Norovirus RNA - Transkripte mit | R 2 | > 0,97 | |
| Wirksamkeit | 90% bis 115% | ||
Ergänzende Tabelle 4: Die Kontrollen bei jedem RT-qPCR - Test zum Nachweis von Noroviren in Umwelttupferproben aufzunehmen.
| Komponente | Die Endkonzentration | vol / Reaktion (ul) |
| 5x RT-PCR-Puffer | 1x | 5.00 |
| dNTP-Mix (10 mM) 0,4 mM | 1,00 | |
| Enzym-Mix (RT und Taq) | 1,00 | |
| Vorwärtsprimer ein | 0,5 & mgr; M | 0,50 |
| Reverse - Primer ein | 0,5 & mgr; M | 0,50 |
| RNase-Inhibitor (20 U / ul) | 20 U | 1,00 |
| RNase-freies Wasser | 11.00 | |
| Volle Lautstärke | 20.00 | |
| eine Vorwärts- und Rückwärts - Primer - Sets für GI und GII Gruppe sind Cog1F + G1SKR und Cog2F + G2SKR sind. | ||
| Zweite Runde RT-PCR | ||
| Komponente | Die Endkonzentration | vol / Reaktion (ul) |
| 5x RT-PCR-Puffer < / Td> | 1x | 5.00 |
| dNTP-Mix (10 mM) | 0,4 mM | 1,00 |
| Enzym-Mix (RT und Taq) | 1,00 | |
| Vorwärtsprimer b | 0,5 & mgr; M | 0,50 |
| Reverse - Primer b | 0,5 & mgr; M | 0,50 |
| RNase-Inhibitor (20 U / ul) | 20 U | 1,00 |
| RNase-freies Wasser | 14.00 | |
| Volle Lautstärke | 23.0 | |
| b Vorwärts- und Rückwärts - Primer - Sets für GI und GII Gruppe sind G1SKF + G1SKR und Ring2 Primer + G2SKR sind. | ||
| Hinweis: oben informaion geringfügig von der Original - Artikel geändert wurde 19 | ||
| Phase I | Feld Sampling | 1. Überprüfen Sie Makroschaums Tupfer - Kits (zB Ablaufdatum, Rohrleckagen und Tupfer Nässe) |
| 2. Swab Oberfläche (Grenzfläche zu ≤100 Zoll 2 (645 cm 2)) | ||
| 3. Legen Sie Tupfer in die Transportrohre, und ziehen Sie die Kappen sicher während des Transports zu verhindern undicht | ||
| 4. Legen Sie Tupfer-Kit in einem Ziplock-Beutel | ||
| Phase II | Probentransport und Lagerung | 1. Gesampelte Tupfer sollte -70 ° C gelagert werden (oder -20 ° C) |
| 2. Transporting TupferProben an das Labor bei 0-4 ° C (Kalt Packungen) in einem isolierten Behälter und werden innerhalb von 48 Stunden zu sammeln Tupfer | ||
| Phase III | RNA etraction | 1. Überprüfen Sie Lysepuffer (zB Ablaufdaten) |
| 2. Fügen MS2 als interne Kontrolle in Lysepuffer vor der Zugabe von 100% Ethanol | ||
| RNA - Reinigung und Konzentration | 3. Reinigen Labortisch und Kleingeräten unter Verwendung von RNA RNase Entfernung Lösung | |
| 4. Wechseln Sie die Handschuhe häufig während der Schritte eines RNA eine Kreuzkontamination zu vermeiden | ||
| Phase IV | RT-PCR - Assay (QA / QC) | 1. Fügen Sie quantifiziert Norovirus-Transkript RNAs (GI und GII) für jeden RT-qPCR-Assay für Variationen in Ct-Werte für jede PCR-Lauf zu steuern |
| 2.Verwenden Abwesenheit von MS2 Signal Anwesenheit von PCR-Inhibitoren zu überwachen |
Ergänzende Tabelle 6: Checkliste für Umweltprobenahmeverfahren der CDC.
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Discussion
Noroviren haben eine 50% human infektiöse Dosis zwischen 18 und 10 drei Viruspartikel 20. Deshalb, auch Low-Level-Kontamination von Oberflächen kann eine Gefahr für die Gesundheit darstellen. Verschiedene Aspekte der Tupfer Probenahmeprotokoll wurden einschließlich ausgewertet: 1) verschiedene Tupfer Materialien, 2) Lagerbedingungen Tupfer während des Transports, 3) Virus-RNA-Konzentration und 4) Coliphage MS2 als interne Extraktionskontrolle.
Bis vor kurzem nur die Leistung von Tupfern aus Baumwolle, Polyester, Nylon und antistatische abzuwischen) wurden für den Feldeinsatz 13, 14, 15, 21 ausgewertet und vorgeschlagen, 22. Von diesen Wattestäbchen durch die ISO 15216 - Protokoll zum Nachweis von Noroviren und Hepatitis - A - Virus aus der Lebensmittelzubereitung Oberflächen und fomites wurden 23 empfohlen. Wieimmer gibt es nur wenige Daten über die Testleistung von Wattestäbchen unter Feldbedingungen mit großen High-Touch - Oberflächen wie Türklinken, Computer und WC - Sitze , die bei der Übertragung von Noroviren 24, 25 häufig eine Rolle spielen . Darüber hinaus übersteigt die Größe dieser Umweltflächen die Kapazität der Faser bestückte Tupfer. In unserer Studie haben wir gezeigt , dass Makroschaum Tupfer, die einen größeren Tupfer als die Faserspitze Tupfer haben, für die menschliche Norovirus höhere Gewinnungsraten haben , wenn sie mit einer Fläche von bis zu 700 cm 2 Umwelt Oberflächen abgetastet wird .
Noroviruses in Lösung relativ instabil bei Raumtemperatur und erfordern mindestens Kühlung. Daher Versand an das Labor sollte bei 0-4 ° C innerhalb von 48 h nach der Entnahme der Tupfer auftreten. Das Volumen der Probe, die typischerweise in einer PCR-Reaktion getestet werden kann, ist viel kleiner als die der Menge anProbe nach Elution aus dem Tupfer (3-5 & mgr; l vs. 5-10 ml), die ohne Konzentration, reduziert deutlich die Positivitätsrate. In Umwelt Virologie, Polyethylenglykol (PEG) wurde erfolgreich zu konzentrieren Viren von großen Mengen von Umgebungswasser verwendet. mit Midi-Spin-Säulen auf Volumen konzentriert so günstig wie 250 & mgr; l, und weitere 10-fach mit hoher Rückgewinnung unter Verwendung von Spin-Säulen jedoch Volumina werden können bis zu 10 ml leicht extrahiert und konzentriert.
Obwohl RT-qPCR der Goldstandard für die empfindliche Detektion und Quantifizierung von Norovirus ist, kann die Empfindlichkeit dieser Assays leicht durch die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren beeinflusst werden, die von den Tupferproben mitextrahiert werden. Daher Aufnahme eines Extraktionskontrolle wie Coliphage MS2 Viruspartikel, in einem Multiplex-PCR-Format, das sowohl norovirus sowie MS2 erkennt, hilft die Anwesenheit von PCR-Hemmung zu überwachen und die Variation zwischen verschiedenen Experimenten zu untersuchen. </ P>
Die Testvariablen eines Laborvalidierungsverfahren sind entscheidend, um die Unterscheidungskraft eines Testverfahrens zu ermitteln und weiter in die wahrscheinlich Feld Abtastleistungsfähigkeit Methode übersetzt. Unter realen Feldbedingungen (zB verzögerte Probenahme, größere Flächen von bis zu 700 cm 2) Rechnung zu tragen, wurde die Nachweisgrenze für Norovirus 3,4 log 10 (Edelstahl) und 4 log 10 (Klobrille) Kopien Norovirus pro Fläche gesampelten 6. Folglich sind negativ Abstrich Ergebnisse nicht definitiv, dass keine virale Kontamination aufgetreten ist. Klinische und epidemiologische Daten von Norovirus - Erkrankung trumpft immer Umwelt Befunde 2, 6.
Unsere Daten von einem Kreuzfahrtschiff zeigte, dass High-Touch-Oberflächen, wie zB Telefone, Computer-Tastaturen und Tür für Norovirus-positiv getestet Griffe in den Kabinen, wo die Menschenmit berichtete viralen Gastroenteritis war geblieben. Diese Flächen entweder wurde durch den direkten Kontakt verunreinigt oder indirekt durch Tröpfchen während die Toilettenspülung hergestellt oder Erbrechen Episoden 6, 7, 8, 9, 10.
Abschließend Nachweis von Noroviren auf Umwelt Oberflächen mit dieser neu entwickelten Tupfer-Protokoll bei der Bestimmung des Grades der Umweltverschmutzung während der Ausbrüche helfen können, erkennen Virus, wenn klinische Proben nicht zur Verfügung stehen und bei der Überwachung der Wirksamkeit von Reinigungspraktiken. Fiber Tupfer (Baumwolle und Viskose) , basierend Oberflächenproben Methoden weit andere Enteroviren zu untersuchen , verwendet wurden (zB Rotavirus und Adenovirus) 27, 28, 29. In Anbetracht der höherenRückgewinnungseffizienz für Norovirus von Makroschaum Tupfer über jene Fasern bestückte Tupfer 6, wir erwarten , dass die Makroschaum Tupfer der Lage sein werden, auch andere Enteroviren zu erkennen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
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