Abstract
인간의 noroviruses는 전염병이 전 세계적으로 산발적 위장염의 주요 원인입니다. 대부분의 감염이 어느 환경 표면 또는 음식을 통해 간접적으로 개인 대 개인 경로를 통해 직접 전파 또는 때문에, 오염 fomites과 무생물 표면은 노로 바이러스의 발생시 바이러스의 확산을위한 중요한 차량이다.
우리는 개발 검출 및 하드 표면에서 인간의 noroviruses의 입력에 대한 macrofoam 면봉을 사용하여 프로토콜을 평가 하였다. 섬유로 만들어진 면봉 또는 정전기 방지 물티슈에 비해 macrofoam 면봉는 최대 700cm 2의 변기 표면에서 바이러스 복구 (범위 1.2-33.6 %)을 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 스핀 열을 사용하여 바이러스 성 RNA의 면봉에서 바이러스의 추출과 더 집중하는 단계를 포함한다. 노로 바이러스 위장염이 있었다 유람선 및 장기 요양 시설의 표면에서 수집 한 217 면봉 샘플의 총, 127 (58.5 %)RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응보고했다. 이 29 (22.8 %)의 성공적 유전자형을 할 수있다. 결론적으로, 우리는 임상 샘플을 사용할 수없는 경우 바이러스의 검출뿐만 아니라 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 개발 된 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출; 또한 치료 전략의 효과의 모니터링을 용이하게 할 수있다.
Introduction
인간의 noroviruses는 전염병과 산발적 급성 위장염 전 세계적으로 1, 2, 3의 주요 원인이다. 이 바이러스는 매우 전염성이 전송은 사람의 상호 작용으로 또는 간접적으로 오염 된 음식, 물 또는 환경 표면과 접촉을 통해 직접 사람을 통해 발생합니다. Noroviruses는 장시간 흘리고 연장 환경면에서의 바이러스 생존 1, 2, 3에 설명 된 수있다. 피크 흘리는 동안 바이러스 입자 수십억 대변 그램 당 방출하고, 구토 같은 감염 4, 5, 6, 7, 8 일으키는 바이러스 입자의 충분한 개수를 포함EF "> 9,10. 또한 무생물 표면과 사람의 피부의 바이러스의 이동이 발생하기 쉬운 2, 11, 12. 따라서, 환경 오염의 모니터링이 발생 조사 돕기 및 정화의 효과를 평가할 수 있으며 소독 절차.
몇몇 환경 샘플링 프로토콜 로타 바이러스의 검출에 대해 설명되었지만, coliphage MS2, 고양이 calicivirus (FCV) 및 박테리오파지 P22 13, 14, 15, 16. 그러나, 고속 탈수 (<1 시간) 작은 표면적을 포함하여이 연구에 기술 검증 조건 (25 X 100cm 2), 적절 필드 설정을 표현하지 않을 수 있습니다. 또한 ENVIRO 낮은 오염 수준을 예상nmental 표면은 거의 바이러스 입자를 감지 할 수있는 프로토콜을 필요로한다.
우리는 노로 바이러스의 검출 및 입력을위한 macrofoam 기반 표면 샘플링 방법을 개발했다. 이 방법은 여러 노로 바이러스 발생시 검증되었습니다. 프로토콜이 포함 1) (2) 최선의 방법 실험실에 수집 및 운송 중에 샘플의 무결성을 유지하고, 노로 바이러스 3) 실험실 테스트 및 타이핑 환경면에서 면봉 샘플을 수집하는 방법에 대해 설명합니다.
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Protocol
필드 1. 면봉 샘플링
- 장갑의 깨끗한 쌍을 착용 할 것.
- 측정 테이프자를 사용하여 표면을 만지지 않고 샘플링 에리어의 크기를 측정한다. 가능한 한 정확하게 영역을 추정하고 보고서 양식 (보충 표 1)를 작성하려고합니다.
- 가능한 누출 및 라벨 샘플 수송 가방과 면봉 키트에 대한 면봉 키트를 확인합니다.
- 다음 샘플링 에리어 걸쳐 면봉 이동 : 수평 방향의 하나의 선, 세로 방향으로 하나의 스트로크와, 대각 방향에 하나의 획. 700cm 2보다 표면적이 큰 면봉하지 마십시오.
- 튜브에 각각 면봉을 놓고 안전하게 뚜껑을 조입니다.
실험실에 면봉 2. 보관 및 운송
- 최대 48 시간 동안 4 ° C에서 면봉을 유지합니다. 오랜 기간 동안 보관이 필요한 경우, -20 ° C에서 면봉을 저장 (또는 -70 ° C).
- 0-4 ℃에서 튜브를 유지 (즉,. 컬렉션의 24 ~ 48 시간 이내에 실험실 및 선박에 운송 중 절연 된 용기에) 콜드 팩을 사용합니다.
3. 바이러스 농도 바이러스 RNA 추출 및 정제
주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 원심 분리 단계는 실온에서 5 분 동안 5,000 XG에서 테이블 탑 원심 분리기를 사용한다. 보편적 인 핵산 추출 (UNEX) 버퍼로 작업 할 때 추가로주의해야합니다. 고글 또는 안면 보호대를 착용하십시오.
- 한 15 ML의 튜브와 각 샘플에 대해 하나의 RNA 미디 열 레이블. 각 실험에 부정적인 추출 컨트롤을 포함합니다.
- 10 면봉 대한 분해 용액을 제조 PBST 25 mL로 UNEX 완충액 25 ㎖를 혼합하여 (0.02 %를 함유하는 PBS pH를 7.2 트윈 80).
- 용해 액 50 ㎖에 coliphage의 MS2 서스펜션 (10 6 PFU / μL) 50 μL를 추가합니다.
- 15 ㎖의 튜브에 면봉을 넣고 5 ml의 용해 액을 추가합니다. 혼합하고 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- 10 초 동안 각 튜브와 소용돌이에 5 ml의 100 % 에탄올을 추가합니다.
- 조심스럽게 15 ML의 튜브에서 면봉을 제거 초과 액체를 제거하고 면봉을 폐기 튜브의 측면에 살짝 누르면 (이 UNEX 버퍼를 포함). 나머지 볼륨은 9 ~ 10 mL의 사이에 있어야한다.
4. 미디 열 바이러스 핵산 추출
- 조심스럽게 미디 컬럼, 원심 분리기에 단계 3.6에서 4.5 mL의 UNEX / 에탄올 혼합물을 전송하고, 여과 액을 버린다.
- 동일한 열, 원심 분리기에 같은 혼합물로부터 또 다른 4.5 mL로로드하고, 여과 액을 버린다.
- 제 씻지 미디 칼럼, 원심 분리기에 70 % 에탄올 3.5 mL를 추가하고, 여과 액을 버린다.
- 제 씻지 미디 컬럼에 70 % 에탄올의 또 다른 3.5 mL의 추가. 원심 분리기 여과 액을 버리고.
- 건조 스핀를 들어, 에탄올의 모든 흔적을 (부정적인 바이러스 성 RNA 복구에 영향을 미칠 수있는)을 제거하기 위해 미디 열을 원심 분리기.
- 새로운 15 ML의 원심 분리기 튜브의 미디 열을 놓습니다. 미디 칼럼에 250 μL 용출 버퍼를 추가; 가장 높은 바이러스 성 RNA 복구를 얻기 위해 원심 분리하기 전에 1 분 동안 기다립니다.
- -70 ° C에서 추출 된 핵산을 저장하거나 5 단계로 바로 진행합니다.
RNA 깨끗하고 집중 키트를 사용하여 바이러스 핵산의 5 농도
- RNA는 10 초 동안 위의 단계 4.7과 와동에 용출 된 RNA의 250 μL에 버퍼를 바인딩의 500 μL를 추가합니다.
- 10 초 동안 750 μL 100 %를 에탄올과 소용돌이를 추가합니다.
- 각 샘플에 대한 스핀 열 레이블. 스핀 칼럼에 750 μL 샘플을로드합니다.
- 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리기. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- 1 분 동안 12,000 XG에 스핀 컬럼 및 원심 분리기 상에 남아있는 750 μL를로드합니다.
- 프리 워시를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 400 μL RNA 준비 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- 첫 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 각 스핀 컬럼 및 원심 분리기 800 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- 두 번째 세척를 들어, 1 분 동안 12,000 XG에서 열 원심 분리기를 회전 400 μL RNA 세척 버퍼를 추가합니다. 흐름 -을 통해 폐기하십시오.
- 건조 스핀를 들어, 2 분 동안 12,000 XG에 세척 버퍼의 모든 흔적을 제거하는 스핀 컬럼을 원심 분리기.
- 조심스럽게 깨끗한 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 스핀 컬럼을 전송합니다.
- 스핀 컬럼 상에 25 μL의 용출 완충액을 첨가하고 실온에서 1 분 동안 배양한다. 이 컬럼으로부터 RNA 바이러스의 회수를 증가시킬 것이다.
- 1 분 동안 10,000 XG에 스핀 컬럼을 원심 분리하여 RNA를 수집합니다.
- 어느 -70 ° C에서 RT-qPCR에 (6 단계) 또는 저장 RNA에 직접 진행합니다.
6. 유전자형 I의 Mutiplex RT-qPCR에 탐지 및 II Noroviruses 및 Coliphage MS 2 (보충 표 2)
- 청소 작업 표면 pipettES,의 RNase의 오염 제거 용액와 원심 분리기는 오염 가능성을 줄일 수 있습니다.
- 얼음에 RT-qPCR에 시약을 녹여. (별도의 영역 / 방에) 얼음에 해동 RNA.
- 반응의 수를 결정하고 적어도 10 % 이상을 추가 (열 반응이 필요한 경우, 예를 들면, 11의 마스터 믹스를 확인).
- 5 초 동안 25 배 RT-qPCR에 효소를 제외 소용돌이 개별 마스터 믹스 구성 요소. 조심스럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 효소를 혼합한다.
- 5 초 동안 간단히 원심 분리기 마스터 믹스 구성 요소.
- 키트 지침에 따라 노로 바이러스 GI과 GII의 실시간 RT-PCR 검출을위한 마스터 믹스를 준비하고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 (보충 표 3)에서 노로 바이러스 특이 적 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 추가합니다.
- 위아래로 5 ~ 10 회 피펫 팅하여 마스터 믹스 믹스 (텍싱하지 않는 것이 좋습니다). 실시간 PCR을 96 웰 플레이트의 각 웰에서의 마스터 믹스를 22 μL 분취.
- 소용돌이 샘플 RNA5 초 동안, 그리고 짧은 (5 초) 원심 분리하여 수집합니다.
- RT-qPCR에 판 (표 2에서 템플릿을 따라)에 샘플 RNA와 GI과 GII 양성 대조군의 3 μL를 추가합니다. 노 템플릿 제어 (NTC) 우물에 클레아 제-freewater의 3 μL를 추가합니다.
- 광학 접착제 필름 실시간 플레이트를 밀봉.
- 1 분 웰에 존재할 수있는 임의의 기포 또는 액체 방울을 제거하기 위해주의 깊게 1300 XG에서 실시간 플레이트를 원심 분리.
- 10 분 동안 1) RT 단계 : 실시간 PCR 장비 및 설정 다음 열 순환 조건을 설정합니다. Taq 중합 효소의 45 ° C (2) 활성화, 10 분에서. 95 ° C에서 및 (3) 95 ℃에서 15 초간 45 사이클, 그리고 60 ℃에서 60 초.
면봉 샘플에서 노로 바이러스의 7 정량화
- RT-qPCR의 결과 (보충 표 3)의 유효성을 검사 양성 및 음성 대조군의 결과를 확인합니다.
- 각각의 표준 곡선이 사항을 만족하는지 확인사용할 수있는 값은 보조 표 2에 주어진 수학 식 (1)를 사용하여 표준 곡선의 전체 표준 편차를 계산합니다.
(식 1) %의 효율 = 100 × 10 (평균 코네티컷 값 절편) / 경사. - PCR을 열 순환기 소프트웨어는 각각의 표준 곡선에 대한 기울기를 계산하지 않으면 기울기 R 통계 소프트웨어를 이용하여 회귀 2 값 (예를 들어 엑셀, SPSS 또는 SAS)를 결정한다. 또한, 방정식 나는 다음과 같은 표준 곡선에 대한 %의 효율을 계산
- 보충 표 4에 명시된 기준에 맞는 표준 곡선에 기초하여 모든 테스트 샘플에 대한 열 순환기 소프트웨어에 의해 산출 된 RNA 카피 수를 기록한다. 기준을 충족하거나 거짓 양성 대조군이없는 표준 곡선 t 모자와 함께 어떤 샘플을 다시 실행하십시오. PCR 억제를 모니터링 할 수있는 내부 통제로 추가 된 coliphage MS2의 코네티컷 값을 확인합니다.
- RNA 카피 (P)의 총 개수를 결정는 RT-qPCR의 반응에 사용 된 RNA (3 μL 5)의 것과 총 RNA의 용출 부피 (25 내지 50 μL)의 비율로 단계 7.2에서 계산 된 RNA 복사 개수를 곱하여 ER 샘플. 대안 적으로, 분석 대상물의 표면적 (cm 2)에 의해 총 RNA 복사 개수를 분할함으로써 RNA 농도를 계산한다.
헤미 중첩 된 기존의 PCR 증폭에 의해 실시간 RT-PCR 긍정적 인 샘플의 8 유전자형
- RT-PCR 분석의 각 프라이머 세트에 대한 마스터 믹스의 첫 번째 라운드를 준비합니다 (보충 표 2, 5).
- 마스터 믹스 20 μL에 노로 바이러스 양성 RNA의 5 μL를 추가합니다.
- 다음과 같은 조건에서 RT-PCR을 실행하여, (1) 실온에서 95 ° C에서 Taq 중합 효소의 42 ° C (2) 활성화, 15 분에서 30 분 동안 단계, 및 (3) 95 ℃에서 30 초, 40주기 50 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 60 초. 40 사이클 후, 72 ℃에서 추가로 10 분 동안 배양한다.
- RT-PCR 분석 각각의 프라이머 세트 (보충 표 2와 5)에 대한 이잖아요 믹스의 두 번째 라운드를 준비합니다.
- 23 μL 마스터 믹스를 추가하고 각 튜브 (이상적으로 1 차 제품의 RNase없는 물에 1/10 희석한다)에 (첫 라운드에서) 1 라운드 RT-PCR 제품의 2 μL를 추가합니다.
- 단계를 반복 8.3.
- (PH 8.3에서 40 mM 트리스, 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA) 100 ㎖ 1X 트리스 - 아세테이트 EDTA 2 % 아가 로스 겔을 제조. 전자 레인지의 혼합물을 가열하여 아가로 용해한 후, 60 ~ 70 ℃로 냉각 한 후, 혼합물을 제조 된 겔을 100㎖ 당 핵산 얼룩 10 μL를 추가 겔 붓고 콤 삽입. 겔은 적어도 30 분 동안 정착하자.
- 6X 로딩 염료 3 μL 각 RT-PCR 생성물의 15 μl를 섞는다. 로드 각 시료 15 μL 및 1 시간 동안 100 V의 아가로 오스 겔 electrophorese.
- 겔에서 적절한 크기 (GI 330 BP와 GII 341 BP)의 소비세 대상 RT-PCR 단편상업적 겔 추출 키트를 사용하여 RNA를 정제 거라고. 정제 된 PCR 생성물은 이제 생거 시퀀싱에 사용될 수있다.
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Representative Results
도 1은 면봉 샘플링 프로토콜의 흐름도를 나타낸다. 이 프로토콜은 네 가지 주요 단계로 구성; 1) 샘플 수집, 2) 시료의 저장 및 수송, 3) 바이러스 성 RNA의 정제 및 농도 4) RT-qPCR의 분석 및 유전자형.
그림 1 : 노로 바이러스의 환경 표면 샘플링에 대한 최종 프로토콜의 차트 흐름 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1은 항해 중 의심되는 노로 바이러스 위장염의 사례를보고했다 유람선에서 수집 된 34 면봉 샘플의 결과를 요약 한 것입니다. 면봉 표본 추출 하였다 TE멀티 플렉스 실시간 RT-qPCR에 의한 노로 바이러스에 대한 중복 STED. 세븐틴 (18.5 %) 샘플은 노로 바이러스의 증상이있는 승객이 배에 공용 공간에서 체재하고 9했다 통나무 집의 표면에서 8 샘플을 포함 양성. 샘플 당 게놈 사본의 수는 노로 바이러스 GII.7 RNA 전 사체의 표준 곡선을 사용하여 (16 31였다) 중부 표준시 값으로부터 계산 하였다. 공통 영역 (범위 : 1.2-2.1 로그 10 게놈 사본)의 게놈 복사본보다 유의하게 높았다 - (4.5 로그 (10) RNA로 복사 2.4 범위), (통나무 집에서 면봉 샘플에서 게놈 사본의 평균 수는 3.6 로그 10 살 P <0.001). 17 긍정적 면봉 샘플 포 (23.5 %)의 유전자형을 할 수 있었고, 모든 샘플이 동일 GII.1 서열을 가졌다.
| 위치 환경 스왑 모은 | | 코네티컷 평균 값 (시험 샘플의 총 수의 양 #) | 유전자형 | 노로 바이러스 RNA는 샘플 영역 C에 따라 번호를 복사 | |
| 아트리움 | 손잡이 | 34.3 (1/2) | GII | (16) |
| 캐빈 A를 | 변기 | 31.4 (2/2) | GII. 비 | 31217 |
| 캐빈 A를 | 수도꼭지 | 37.5 (1/2) | GII | 491 |
| 캐빈 A를 | 문 손잡이 | 35.0 (2/2) | GII | 2,675 |
| 캐빈 A를 | 리모콘 | 38.6 (2/2) | GII.1의 B | (233) |
| 캐빈 B | 변기 | 33.5 (2/2) | GII.1의 B | 986 | 아이스크림 기계 | 34.2 (2/2) | GII | (16) |
| 리도 | 표 양념 | 35.2 (1/2) | GII | (15) |
| 리도 | 테이블 탑 | 35.3 (1/2) | GII | (14) |
| 피자 집 | 카운터 표면 | 35.7 (1/2) | GII | (14) |
| 메인 갤리 | 재미있는 시간 기계 | 37.1 (1/2) | GII | (64) |
| 자판기 | 만질 표면 | 38.8 (1/2) | GII | (18) |
| 승무원 라운지 | 키보드 표면 및 마우스 | 36.8 (1/2) | GII | (80) |
| 캐빈 C | 수도꼭지와 문 손잡이 | 31.6 (2/2) | GII.1의 B | 26458 |
| 캐빈 C | 전화 | 36.4 (2/2) | GII | 1,035 |
| 캐빈 C | 건반 | 33.0 (2/2) | GII | 1,317 |
| 의료 센터 | 클립 보드 | 36.0 (2/2) | GII | (113) |
| 오두막 A는, B와 C는 바이러스 gastoenteristis 증상과 임상 적으로 병이 있었다 개인에 의해 점령되었다. | ||||
| B 17 GII 양성 면봉 샘플 중 4 유전자형을 할 수있다. | ||||
| C RNA 복사본은 노로 바이러스의 GII.7의 RNA 전 사체의 표준 곡선에 따라 caluated했다. | ||||
| 참고 : 날짜보다 약간 원래의 제 6 조에서 수정되었습니다. | ||||
표 1 : 항해 중 의심되는 노로 바이러스 위장염의 사례를보고했다 유람선에서 수집 된 34 면봉 샘플의 결과.
도 2는 RT-qPCR에 이들 샘플 시퀀스 능력에 의해 결정 코네티컷 값의 관계를 나타낸다. 총 127 (217) 중 면봉 샘플은 RT-qPCR에 의한 GII의 노로 바이러스 양성 반응. 샘플은 코네티컷 값의 넓은 범위 (12-40)을 디스플레이. 총, RT-qPCR에 긍정적 인 샘플의 29 (22.8 %)의 유전자형을 할 수있다. 코네티컷 값 27 이하 및 28 ~ 31 사이의 범위와 면봉 샘플은 각각 100 %와 72.2 %의 비율로 유전자형했다. 대조적으로, 단지 22.0 % 및 32-36 및 37-40의 코네티컷 값이 면봉 샘플의 1.6 %는, 각각 성공적으로 시퀀싱 될 수 헤미 중첩 증폭 물을 생산했다.
그림 2 : RT-qPCR에 검사 및 확인 노로 바이러스 발병 동안 수집했다 면봉 샘플 시퀀싱 결과. 흰색 막대는 RT-qPCR에 긍정적 면봉 샘플 바이러스의 개수를 나타낸다. 그 RT-qPCR에 긍정적 인 샘플에서 인간의 노로 바이러스 핵산 헤미 - 중첩 된 PCR 분석을 사용하여 증폭 한 다음 유전자형의 확인을 위해 서열했다. 블랙 바, 라인 수 및 유전자형의 비율이 각각 면봉 샘플을 확인 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| CT 값 범위 | RT-qPCR에 긍정적 인 샘플의 수 | 순서 확인 샘플의 수 (%)을 |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 삼 | 3 (100) |
| 28-31 | (18) | 13 (72.2) |
| 32-36 | (41) | 9 (22.0) |
| 37-40 | (61) | 1 (1.6) |
| A) 헤미는 PCR 중첩 | ||
표 2 : RT-qPCR에와 면봉 샘플의 유전자형 결과.
| 샘플 수 | 위치 | 표면의 설명 | 표면 면적 (cm 2) | 시료 채취 날짜 / 시간 | 청소 (Y / N) | 정리하면, 어떤 소독제를 사용 하였다 <?> / 강해 | 표면 재질과 위치의 자세한 설명 |
| 1 | 룸 # 7-1302 | 변기 | 700cm 2 | 2016년 6월 26일; 오전 9시 | 아니 | 해당 사항 없음 | 변기 [상면) 및 하드 plastoc |
| 이 | 룸 # 7-1330 | 전화 핸들 | 500cm 2 | 2016년 6월 26일; 오전 9시 25분 | 예 | 1,000 ppm의 표백제 | 하드 플라스틱, 고무 버튼 |
보충 표 1 : 샘플 설명 양식의 예.
| 유전자형 / 바이러스 | 이름 올리고 뉴클레오티드 프라이머 / 프로브 | 순서 5 → 3 & #(900); | 참고 |
| 미군 병사 | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | (17) |
| Cog1R | CTT AGA CGC 고양이 고양이 CAT TYA C | (17) | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | (17) | |
| G1SKR | CCA ACC의 CAR CCA TTR TAC | (17) | |
| Ring1E 프로브 | FAM - TGG ACA GGR 게이 CGC - MGBNFQ a를 | 이 연구 | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | (17) |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | (17) | |
| Ring2 프라이머 | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | (17) | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <TD> (17)||
| Ring2 프로브 | CY5 또는 QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2의 B | (17) | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | (18) |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | (18) | |
| MS2P 프로브 | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1의 C | (18) | |
| GI의 TaqMan 프로브는 6 카르복시 (FAM)와 3'-표시 MGBNFQ (마이너 - 홈 결합 부위)와 함께-5' 표지 | |||
| B GII의 TaqMan 프로브 Cy5에 또는 퀘이사 (670)과 함께 5 '가 표지되어 3'-라벨 블랙 홀 끄는와; 이용 가능 여부에 따라 사용되는 블랙 홀 소광 (BHQ)이 2, BHQ 3가 바람직하다. | |||
| C MS2의 TaqMan 프로브 5R입니다(17);로 표지 된 HEX 및 BHQ1와 5'-표시 | |||
보충 표 2 : 올리고 뉴클레오티드 프라이머 및 프로브 정보를 제공합니다.
| 구성 요소 | 반응에 따라 볼륨 (μL) | 최종 농도 |
| 배 RT-PCR 버퍼 * | 12.5 | 1 배 |
| 클레아없는 물 * | 1.08 | N / A |
| 검출 증강 * | 1.67 | N / A |
| 코그 층 (10 μM) | 1 | 400 nm의 |
| 코그 1R (10 μM) | 1 | 400 nm의 |
| 링 1E-프로브 (10 μM) | 0.5 | 200 nm의 | 1 | 400 nm의 |
| 코그 2R (10 μM) | 1 | 400 nm의 |
| 링 2 프로브 (10 μM) | 0.5 | 200 nm의 |
| MS2F (10 μM) | 0.25 | 100 nm의 |
| MS2R (10 μM) | 0.25 | 100 nm의 |
| MS2P 프로브 (10 μM) | 0.25 | 100 nm의 |
| 배 RT-PCR 효소 * | 1 | 1 배 |
| 마스터 믹스 볼륨 | (22) | |
| * 실시간 RT-PCR 키트에 포함 | ||
보충 표 3 : 다중 실시간 GI / GII / MS2 노로 바이러스 RT-PCR을위한 마스터 믹스
| 컨트롤의 종류 | 결과 해석 | ||
| 견본 | 음성 대조군 | 부정적인해야한다 | |
| 양성 대조군 | 긍정적이어야한다 | ||
| 부정적인 샘플 | 각 코네티컷 값이 GI / GII에 대한 발견 할 수없는 경우 샘플 음 | ||
| 긍정적 인 샘플 | 모두 복제의 CT 값 (GI / GII)은 <38; 이것은 (임의로) 컷오프 각 실시간 PCR 플랫폼 및 키트 실험적으로 결정되어야 | ||
| 미정 양의 샘플 | 샘플은 하나의 복제의 코네티컷 값 (GI / GII) 인 경우 임시 긍정적이다 <38 | ||
| 내부 프로세스 제어 (MS2) | ≥32 F의 임계 사이클 샘플 (CT) 값또는 MS2는 희석 재검사해야하며 1/10 희석. | ||
| 매개 변수 | 허용되는 값 | ||
| 표준 곡선 노로 바이러스의 RNA 전 사체를 사용하여 | R 2 | > 0.97 | |
| 능률 | 115 % 90 % | ||
보충 표 4 : 환경 면봉 샘플에서 노로 바이러스의 검출을위한 각각의 RT-qPCR에 시험에 포함 제어합니다.
| 구성 요소 | 최종 농도 | 권 / RXN (μL) |
| 배 RT-PCR 버퍼 | 1 배 | 5.00 |
| 의 dNTP 믹스 (10 mM)을 0.4 밀리미터 | 1.00 | |
| 효소 믹스 (RT와의 Taq) | 1.00 | |
| 앞으로 프라이머 | 0.5 μM | 0.50 |
| 역방향 프라이머 | 0.5 μM | 0.50 |
| 의 RNase 억제제 (20 U / μL) | 20 U | 1.00 |
| 의 RNase없는 물 | 11.00 | |
| 총 양 | 20.00 | |
| 앞으로 및 GI과 GII 그룹에 대한 프라이머 세트를 역은 각각 Cog1F + G1SKR 및 Cog2F + G2SKR 있습니다. | ||
| 두 번째 라운드 RT-PCR | ||
| 구성 요소 | 최종 농도 | 권 / RXN (μL) |
| 배 RT-PCR 버퍼 < / TD> | 1 배 | 5.00 |
| 의 dNTP 믹스 (10 mM)을 | 0.4 밀리미터 | 1.00 |
| 효소 믹스 (RT와의 Taq) | 1.00 | |
| 앞으로 프라이머 나 | 0.5 μM | 0.50 |
| 역방향 프라이머 나 | 0.5 μM | 0.50 |
| 의 RNase 억제제 (20 U / μL) | 20 U | 1.00 |
| 의 RNase없는 물 | 14.00 | |
| 총 양 | 23.0 | |
| B 앞으로 GI과 GII 그룹에 대한 프라이머 세트를 역은 각각 G1SKF + G1SKR 및 Ring2 프라이머 + G2SKR 있습니다. | ||
| 참고 : 안내 전화보다 약간 원래의 제 19에서 수정 | ||
| 위상 I | 이 필드를 샘플링 | 1. macrofoam 면봉 키트 (예를 들어, 유효 기간, 튜브 누설 및 면봉 습기) |
| 2. 면봉 표면 (제한 표면적 ≤100 인치 2 (645cm 2)에) | ||
| 3.는 전송 튜브에 면봉 및 운송 중에 누출 방지 안전 캡을 조 | ||
| 애 가방에서 4. 면봉 키트 | ||
| 단계 II | 샘플 운송 및 보관 | 1. 샘플링 면봉이 저장되는 -70 ° C ~ (또는 -20 ° C) |
| 2. 운반 면봉수집 면봉의 48 시간 내에 절연 컨테이너 선박에 0-4 ° C (콜드 팩)에서 실험실에 샘플 | ||
| 단계 III | RNA의 etraction | 1. 용해 완충액 (예를 들면, 유효 데이터) |
| 2. 100 % 에탄올을 추가하기 전에 용해 버퍼에 내부 통제로 MS2 추가 | ||
| RNA 정제 및 농축 | 3. 면도 실험실 벤치 RNA의 RNase 제거 용액을 이용하여 소형 장치 | |
| RNA의 교차 오염을 방지하기 자주 단계 중 4. 변경 장갑 | ||
| 단계 IV | RT-PCR 분석 (QA / QC) | 1. 각 PCR 실행을위한 코네티컷 값의 변화를 제어하기 위해 각각의 RT-qPCR에 분석을위한 정량 노로 바이러스의 전사 RNA를 (GI과 GII)를 포함 |
| 2.PCR 억제제의 존재를 모니터링하는 MS2 신호의 부재를 사용하여 |
보충 도표 6 : CDC의 환경 샘플링 절차에 대한 점검.
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Discussion
Noroviruses 18 10 3 바이러스 입자 20 ~ 50 %의 인간 감염 복용량을 가지고있다. 따라서, 표면도 낮은 수준의 오염은 공중 보건 위험을 초래할 수 있습니다. 내부 대조군으로서 추출 운송 중 1) 면봉 다른 재료, 2) 저장 조건 면봉 3) 바이러스 성 RNA 농도, 4) coliphage MS2 : 면봉 샘플링 프로토콜의 여러 측면을 포함하여 평가 하였다.
최근까지,면, 폴리 에스테르, 나일론 등) 닦아 대전에서 만든 면봉의 성능을 평가했다 및 필드 사용 13, 14, 15, 21, 22에 대해 제안했다. 이들 중, 면봉은 노로 바이러스 간염 음식 준비 표면과 fomites (23)로부터의 바이러스의 검출을위한 ISO 15216 프로토콜에 의해 권장되고있다. 방법지금까지 자주 noroviruses (24), (25)의 전송에 연루되어 같은 문 손잡이, 컴퓨터, 변기 큰 하이 터치 표면 필드 조건에서 면봉의 테스트 성능에 제한적인 데이터가있다. 또한 이러한 환경면의 크기는 섬유로 만들어진 면봉의 용량을 초과한다. 우리의 연구에서, 우리는 700cm 2까지 지역과 환경 표면을 샘플링 할 때 섬유 팁 면봉보다 더 큰 면봉 머리를 macrofoam 면봉은, 인간의 노로 바이러스에 대한 높은 회수율을 가지고 있음을 보여 주었다.
솔루션 Noroviruses은 주위 온도에서 상대적으로 불안정하고 적어도 냉각에 필요합니다. 따라서, 실험실에 배송비는 면봉의 수집 후 48 시간 이내에 0-4 ° C에서 발생한다. 일반적으로 PCR 반응에서 테스트 될 수있는 샘플의 부피의 양보다 훨씬 작다샘플 농도 않고, 크게 양성 속도를 감소, 면봉 (5 ~ 10 mL의 대 3-5 μL)에서 용출 후. 환경 바이러스학에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 환경 물 다량의 바이러스를 농축 성공적으로 사용되어왔다. 그러나, 최대 10 ㎖에 볼륨을 쉽게 추출하여 250 μL의 낮은 볼륨에 미디 스핀 열을 사용하여 농축하고, 더 높은 복구를 사용하여 스핀 열이 10 배 농축 될 수있다.
RT-qPCR에 민감한 탐지 및 노로 바이러스의 정량화를위한 골드 표준이기는하지만,이 분석의 민감도는 쉽게 면봉 샘플로부터 공동 추출 PCR 억제제의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 따라서 MS2뿐만 아니라 둘 노로 바이러스를 검출하는 멀티 플렉스 PCR 형식 이러한 coliphage MS2 바이러스 입자로서 추출 제어의 포함은 PCR 억제의 존재를 모니터링하고 다른 실험 간의 변동을 평가하는 것을 돕는다. </ P>
실험실 검증 방법의 시험 변수는 시험 방법의 차별적 전력을 결정하는 것이 중요하며, 상기 방법의 가능성 필드 샘플링 성능으로 변환된다. 실제 필드 상태를 가지고 (예를 들어, 최대 700cm (2)의 큰 표면적 지연 샘플링) 계정으로는, 노로 바이러스에 대한 검출 한계는 3.4 로그 (10) (스테인레스) 및 4- 로그 10 (변기) 면당 복사 노로 채취 6. 따라서, 부정적인 면봉 결과는 더 바이러스 오염이 발생하지 않습니다 것을 확정되지 않습니다. 노로 바이러스 질병의 임상 및 역학적 정보는 항상 6, 환경 조사 결과 2를 압도.
유람선에서 우리의 데이터는 전화기, 컴퓨터 키보드, 문 등의 하이 터치 표면이 통나무 집 어디 사람 노로 바이러스에 양성 반응을 처리하는 보여 주었다보고 된 바이러스 성 위장염이 머물렀다. 이들 표면은 화장실 수세 또는 구토 에피소드 6, 7, 8, 9, 10 중 제조 방울 통해 간접적으로 직접적인 접촉을 통하여 오염 된 또는 하나.
임상 샘플이 가능하고 세정 방법의 유효성을 모니터링하지 않을 때 결론적 발생시 환경 오염의 수준을 결정하는데 도움이 될 수 새롭게 개발 면봉 프로토콜을 사용하여 환경 표면 노로 바이러스의 검출은, 바이러스를 검출한다. 섬유 (예를 들면 로타 바이러스 및 아데노 바이러스) 27, 28, 29면 샘플링 방법이 널리 다른 장내 바이러스를 조사하기 위해 사용 된 기초 면봉 (면과 레이온)를 스쳐. 높은 고려그 섬유를 통해 macrofoam 면봉의 노로 바이러스에 대한 회수 효율은 우리가 macrofoam 면봉뿐만 아니라 다른 장내 바이러스를 감지 할 수있을 것으로 예상, 면봉 6을 냈습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
