Abstract
Menneske noroviruses er en ledende årsak til epidemien og sporadisk gastroenteritt på verdensbasis. Fordi de fleste infeksjoner er enten spres direkte via person-til-person rute eller indirekte gjennom miljø overflater eller mat, forurenset fomites og livløse overflater er viktige kjøretøy for spredning av viruset i løpet av norovirus-utbrudd.
Vi utviklet og evaluert en protokoll ved hjelp macrofoam vattpinner for påvisning og typing av menneskelige noroviruses fra harde overflater. Sammenlignet med fiber-tipped vattpinner eller antistatiske våtservietter, macrofoam vattpinner tillate virus recovery (range 1,2 til 33,6%) fra toalettsete flater på opp til 700 cm 2. Protokollen omfatter trinn for utvinning av viruset fra vattpinner og ytterligere konsentrasjon av det virale RNA ved å bruke spinnkolonner. Totalt 127 (58,5%) av 217 penselprøver som hadde blitt samlet inn fra overflater i cruiseskip og langsiktig omsorg anlegg hvor norovirus gastroenteritt hadde værtrapportert testet positivt for GII norovirus ved RT-qPCR. Av disse var 29 (22,8%) kunne med hell genotypede. I konklusjonen, påvisning av norovirus om miljø overflater ved hjelp av protokollen vi utviklet kan bistå i å bestemme nivået av miljøforurensning ved utbrudd samt påvisning av virus når kliniske prøver er ikke tilgjengelig; det kan også legge til rette for overvåking av effektiviteten av utbedring strategier.
Introduction
Menneske noroviruses er en ledende årsak til epidemien og sporadisk akutt gastroenteritt på verdensbasis en, to, tre. Viruset er svært smittsom og overføring skjer ved direkte person til person interaksjon eller indirekte gjennom kontakt med forurenset mat, vann eller miljømessige overflater. Noroviruses kan kaste i lengre perioder og forlenget overlevelse av virus på miljø overflater er dokumentert en, to, tre. Under topp shedding, er milliarder av viruspartikler frigjort pr gram avføring, og oppkast også inneholder et tilstrekkelig antall viruspartikler for å forårsake infeksjon 4, 5, 6, 7, 8,ef "> 9, 10. I tillegg kan overføring av viruset mellom døde overflater og human hud lett oppstå i 2, 11, 12. Det kan således overvåkning av miljøforurensning bistå i utbrudds undersøkelser og i å vurdere effektiviteten av rensing og desinfeksjonsrutiner.
Flere miljøprøvetakings protokoller er blitt beskrevet for deteksjon av rotavirus, coliphage MS2, feline calicivirus (FCV), og bakteriofag P22 13, 14, 15, 16. Imidlertid validerings betingelser som er beskrevet i disse studier, inkludert rask uttørking (<1 time) og små overflateområder (25 x 100 cm 2), kan det ikke tilstrekkelig representere feltinnstillinger. I tillegg forventes lave forurensningsnivåer av Environmental overflater krever protokoller som er i stand til å oppdage svært få viruspartikler.
Vi utviklet en macrofoam basert overflate prøvetaking metode for påvisning og typing av norovirus. Denne metoden er validert i flere norovirus-utbrudd. Protokollen inkluderer 1) hvordan å samle penselprøver fra miljø overflater (2) hvordan du best kan opprettholde integriteten av prøvene under innsamling og forsendelse til laboratoriet, og 3) laboratorietesting og typing av norovirus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Swab Prøvetaking i felt
- Bruk en ren par hansker.
- Måle størrelsen på samplingsområdet uten å berøre overflaten ved hjelp av et målebånd eller linjal. Prøv å anslå området så nøyaktig som mulig og fylle ut et rapportskjema (Supplerende tabell 1).
- Sjekk pinne kit for mulige lekkasjer og etiketten prøvetransportveske og penselsett.
- Flytt pinnen over prøvetakingsområdet som følger: ett slag i horisontal retning, ett slag i vertikal retning, og ett slag i en diagonal retning. Ikke vattpinne et areal større enn 700 cm2.
- Plasser hver pinne i et rør og stram lokket ordentlig.
2. oppbevaring og transport av vattpinner til Laboratory
- Hold vattpinner ved 4 ° C i opptil 48 timer. Ved lagring i lengre perioder er nødvendig, lagre vattpinner ved -20 ° C (eller -70 ° C).
- Hold rørene ved 0-4 ° C (dvs.. Ved å bruke kaldt pakker) i en isolert beholder under transport til laboratoriet og skipet innen 24-48 timer etter innsamling.
3. Virus Konsentrasjon, Viral RNA ekstraksjon og rensing
MERK: Alle sentrifugeringstrinn bruke en bordsentrifuge ved 5000 xg i 5 minutter ved romtemperatur, med mindre annet er angitt. Vær ekstra forsiktig når du arbeider med universell nukleinsyre utvinning (UNEX) buffer. Bruk vernebriller eller ansiktsskjerm.
- Merk av et 15 ml rør og en RNA Midi kolonne for hver prøve. Inkluder en negativ utvinning kontroll i hvert forsøk.
- For å fremstille den Lysis løsning for 10 kompresser, bland 25 ml UNEX buffer med 25 ml PBST (PBS pH 7,2 inneholdende 0,02% Tween-80).
- Tilsett 50 ul av coliphage MS2 suspensjon (10 6 PFU / mL) til 50 ml av Lysis-løsning.
- Plasser en vattpinne i et 15 ml rør og tilsett 5 ml Lysis løsning. Bland og inkuber i 10 min ved romtemperatur.
- Tilsett 5 ml 100% etanol til hvert rør og vortex i 10 s.
- fjerner pinnen fra 15 ml tube forsiktig (den inneholder UNEX buffer) trykke den forsiktig mot siden av røret for å fjerne overflødig væske og kast pinnen. De øvrige mengder bør være mellom 9-10 ml.
4. Midi kolonne Viral Nucleic Acid Extraction
- overføre nøye 4,5 ml UNEX / etanol blandingen fra trinn 3,6 på en midi kolonne, sentrifuger og kast filtratet.
- Legge i 4,5 ml fra den samme blandingen på den samme kolonne, sentrifuger, og forkaste filtratet.
- For første vask, tilsett 3,5 ml av 70% etanol på Midi-kolonnen, sentrifuger og kast filtratet.
- For det andre vask, legge til en annen 3,5 ml av 70% etanol på Midi kolonnen. Sentrifuger og kast filtratet.
- For tørr-spin, sentrifuger Midi kolonnene for å fjerne alle spor av etanol (som kan negativt påvirke din viral RNA recovery).
- Plasser Midi kolonnen i en ny 15 ml sentrifugerør. Tilsett 250 ul elueringsbuffer på Midi kolonne; vent i 1 min før sentrifugering for å oppnå den høyeste viralt RNA utvinning.
- Oppbevar hentet nukleinsyre ved -70 ° C eller fortsette umiddelbart til trinn 5.
5. Konsentrasjon av Viral Nucleic Acid Bruke RNA Clean og konsentrator Kits
- Legg 500 mL av RNA bindingsbuffer til 250 mL av RNA eluert i trinn 4.7 ovenfor og vortex i 10 s.
- Legg 750 pl 100% etanol og vortex i 10 s.
- Etikett en spinnkolonne for hver prøve. Last inn 750 mL prøve på en spinnkolonne.
- Sentrifuger sentrifugekolonner ved 12.000 xg i 1 min. Kast gjennomstrømnings.
- Last de resterende 750 mL bort på en spinnkolonne og sentrifuger ved 12 000 xg i 1 min.
- For forvask, tilsett 400 mL RNA Prep buffer til hver spin kolonne og sentrifuger ved 12 000 xg i 1 min. Kast gjennomstrømnings.
- For første vask, tilsett 800 mL RNA Wash Buffer til hvert spinn kolonne og sentrifuger ved 12 000 xg i 1 min. Kast gjennomstrømnings.
- For det andre vask, tilsett 400 mL RNA Wash Buffer å spinne kolonnen og sentrifuger ved 12 000 xg i 1 min. Kast gjennomstrømnings.
- For tørrspinn, sentrifuger spinnkolonne for å fjerne alle spor av vaskebuffer ved 12.000 xg i 2 min.
- overføre spinnkolonne nøye til et rent 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Tilsett 25 ul elueringsbuffer på spinnkolonne og inkuberes i 1 min ved romtemperatur. Dette vil øke utvinningen av viral RNA fra kolonnen.
- Utlevering RNA ved sentrifugering av spinnkolonne ved 10.000 x g i 1 min.
- Enten gå direkte til RT-qPCR (trinn 6) eller butikk RNA ved -70 ° C.
6. Mutiplex RT-qPCR Påvisning av Genogroup I, og II noroviruses, og Coliphage MS 2 (Supplerende tabell 2)
- Rengjør arbeidsflater, pipettes, og sentrifuger med RNase dekontaminering løsning for å redusere mulig forurensning.
- Tine RT-qPCR reagenser på is. Tine RNA på is (i et eget område / rom).
- Bestem antall reaksjoner og legge til minst 10% mer av dem (for eksempel hvis 10 reaksjoner er nødvendig, gjør mester mix for 11).
- Vortex enkelte mester mix komponenter, med unntak av 25x RT-qPCR enzym, 5 s. blande enzymet nøye ved å dra fingeren røret med en finger.
- Kort oppsummering sentrifuge mester mix komponenter for 5 s.
- Forbered master mix for realtime RT-PCR påvisning av norovirus GI og GII i henhold til instruksjonene i settet og legge norovirus-spesifikke oligonukleotid primere og prober i et 1,5 ml mikrosentrifugerør (Supplementary tabell 3).
- Bland Master Mix ved å pipettere 5-10 ganger opp og ned (virvling anbefales ikke). Delmengde 22 mL av master mix i hver brønn i sanntid PCR 96-brønns plate.
- Vortex prøve RNAi 5 sek, og samle med kort (5 s) sentrifugering.
- Tilsett 3 il prøve RNA og GI og gii positive kontroller for RT-qPCR plate (følg templat fra tabell 2). Legg 3 mL av nukleasefritt Free i no-mal-kontroll (NTC) brønner.
- Tett sanntid plate med optisk selvklebende film.
- Nøye sentrifuger sanntids plate ved 1300 xg i 1 min for å fjerne eventuelle luftbobler eller væskedråper som kan være til stede i brønnene.
- Sett opp en real-time PCR instrument og oppsett følgende termo forhold: 1) RT trinn i 10 min. ved 45 ° C (2) aktivering av Taq-polymerase, 10 min. ved 95 ° C og (3) 45 sykluser på 15 sek ved 95 ° C og 60 s ved 60 ° C.
7. Kvantifisering av Norovirus i penselprøver
- Sjekk resultatene av positive og negative kontroller for å validere resultatene RT-qPCR (Supplerende Tabell 3).
- Finn ut om hver standardkurve møterAkseptable verdier gitt i Tabell 2 Tilsetnings og beregne den totale standardavviket for den standardkurve ved bruk av ligning 1.
(Ligning 1)% virkningsgrad = 100 x 10 (gjennomsnittlig Ct verdier-Intercept) / Slope. - Dersom PCR termosykleren programvaren ikke beregne stigningstallet for hver standardkurve, bestemme skråning og R 2 verdier av regresjon ved hjelp av statistikk programvare (f.eks Excel, SPSS eller SAS). I tillegg beregne% virkningsgrad for standardkurver følgende ligning I
- Spill RNA kopitallet beregnes ved termosykleren programvare for alle testprøver basert på standardkurver som oppfyller kriteriene angitt i Tilleggs Tabell 4. Kjør noen prøver med standardkurver t lue ikke oppfyller kriteriene eller har falske positive kontroller. Sjekk Ct-verdier på coliphage MS2, som ble tilsatt som en intern kontroll for å overvåke PCR-inhibering.
- Bestemme det totale antallet av RNA kopier per prøven ved å multiplisere RNA-kopitallet beregnet i trinn 7.2 ved forholdet mellom volumet (25 til 50 ul) av total RNA elueringsmiddel til den av RNA (3 til 5 ul) anvendt for RT-qPCR reaksjon. Alternativt kan beregne tettheten RNA ved å dividere det totale RNA-kopitallet av objektet overflateareal (cm 2) analysert.
8. Genotyping av Real-time RT-PCR positive prøver av Hemi Nøstet Konvensjonell PCR Amplification
- Klargjør den første runden av masterblanding for hver primer sett av RT-PCR-analyse (Utfyllende tabell 2 og 5).
- Tilsett 5 mL av norovirus positive RNA til 20 mL av master-mix.
- Kjør RT-PCR under de følgende betingelser: (1) RT trinn i 30 minutter ved 42 ° C (2) aktivering av Taq-polymerase, 15 min ved 95 ° C, og (3) 40 sykluser på 30 sek ved 95 ° C , 30 s ved 50 ° C og 60 sek ved 72 ° C. Etter 40 sykluser, inkuberes i ytterligere 10 minutter ved 72 ° C.
- Fremstille den andre runden av mater blanding for hvert primersett av RT-PCR-analyse (Utfyllende tabell 2 og 5).
- Legg 23 mL mester mix og tilsett 2 mL av første runde RT-PCR-produkter (fra første runde) til hvert rør (ideelt sett den første runden produktet skal fortynnes 1/10 i RNase-fritt vann).
- Gjenta trinn 8.3.
- Fremstille en 2% agarosegel i 1 x 100 ml Tris-acetat EDTA (40 mM Tris, 20 mM eddiksyre, og 1 mM EDTA, ved pH 8,3). Etter oppløsning av agarose ved oppvarming av blandingen i en mikrobølgeovn, tilsett 10 ul av nukleinsyre flekk pr 100 ml klare gel etter avkjøling av blandingen til 60-70 ° C, Hell gelen og sett kammer. La gelen bosette i minst 30 min.
- Bland 15 mL av hver RT-PCR produkt med 3 mL av 6x lasting fargestoff. Belastning 15 ul av hver prøve og electrophorese agarosegelen ved 100 V i 1 time.
- Vesenet target RT-PCR fragmenter av passende størrelse (330 bp for GI og 341 bp for GII) fra gelen end rense RNA ved hjelp av en kommersiell gel utvinning kit. Det rensede PCR-produktet kan nå brukes til Sanger-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et flytskjema av prøvetagnings vattpinnen protokollen. Denne protokollen består av fire hovedtrinn; 1) prøvetaking, 2) prøveoppbevaring og transport, 3) viralt RNA rensning og konsentrasjon og 4) RT-qPCR-analyse og genotyping.
Figur 1: Flytskjema av den endelige protokollen for miljø overflaten prøvetaking av norovirus Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1 oppsummerer resultatene fra 34 penselprøver som ble samlet inn fra et cruiseskip som hadde rapportert tilfeller av mistanke om norovirus gastroenteritt under en reise. Penselprøver ble hentet ut og teSTED i to eksemplarer for norovirus ved multiplex real-time RT-qPCR. Sytten (18,5%) prøver testet positivt med 8 prøver fra overflater i hytter der passasjerer med norovirus symptomer hadde bodd og 9 fra fellesarealene på skipet. Antallet genomiske kopier per prøve ble beregnet ut fra Ct-verdier (som varierte 16-31) under anvendelse av en standardkurve av en norovirus GII.7 RNA-transkript. Median antall genom eksemplarer fra penselprøver i hytter var 3,6 log 10 (spredning: 2,4 - 4,5 log 10 RNA kopier), som var betydelig høyere enn de genom kopier fra fellesarealer (range: 01.02 til 02.01 log 10 genom kopier) ( P <0,001). Fire (23,5%) av de 17 positive pensel prøvene var i stand til å bli genotypet, og alle prøver hadde identiske GII.1 sekvenser.
| Beliggenhet miljø swap samlet en | | Gjennomsnitt Ct-verdien (# positiv av det totale antall prøver som ble testet) | genotype | Norovirus RNA kopier antall per prøveområdet c | |
| Atrium | rekkverk | 34,3 (1/2) | GII | 16 |
| Cabin A | toalettsete | 31.4 (2/2) | GII. b | 31217 |
| Cabin A | Kran | 37,5 (1/2) | GII | 491 |
| Cabin A | Dørhåndtak | 35.0 (2/2) | GII | 2675 |
| Cabin A | Fjernkontroll | 38.6 (2/2) | GII.1 b | 233 |
| hytte B | toalettsete | 33.5 (2/2) | GII.1 b | 986 | Ice Cream Machine | 34.2 (2/2) | GII | 16 |
| Lido | Tabell sauser | 35,2 (1/2) | GII | 15 |
| Lido | Bordplate | 35,3 (1/2) | GII | 14 |
| Pizzeria | Counter overflaten | 35,7 (1/2) | GII | 14 |
| Hoved Galley | Fun-time Machine | 37,1 (1/2) | GII | 64 |
| Salgsautomat | berøringsoverflater | 38,8 (1/2) | GII | 18 |
| Crew salong | Tastatur Surface og mus | 36,8 (1/2) | GII | 80 |
| hytte C | Tappekran og dørhåndtak | 31.6 (2/2) | GII.1 b | 26458 |
| hytte C | Telefon | 36.4 (2/2) | GII | 1035 |
| hytte C | Tastatur | 33,0 (2/2) | GII | 1317 |
| Medisinsk senter | Clipboard | 36,0 (2/2) | GII | 113 |
| en hytte A, B og C har vært okkupert av personer som hadde vært klinisk syk med virus gastoenteristis symptomer. | ||||
| b Fire av de 17 GII-positive penselprøver kan genotypede. | ||||
| c RNA kopier ble caluated basert på en standardkurve for norovirus GII.7 RNA transkripsjoner. | ||||
| Merk: ovennevnte dato ble litt endret fra den opprinnelige artikkelen 6. | ||||
Tabell 1: Resultater fra 34 penselprøver som ble samlet inn fra et cruiseskip som hadde rapportert tilfeller av mistanke om norovirus gastroenteritt under en reise.
Figur 2 viser forholdet mellom Ct-verdiene bestemt ved hjelp av RT-qPCR og evnen til å sekvensere disse prøvene. I alt 127 av 217 penselprøver testet positivt for GII norovirus ved RT-qPCR. Prøvene viste et bredt spekter (12-40) av Ct-verdier. I alt ble 29 (22,8%) av RT-qPCR positive prøver bli genotypede. Penselprøver med Ct verdier under 27 og som strekker seg mellom 28-31 ble genotypet ved hastigheter på 100% og 72,2%, henholdsvis. I motsetning til dette, bare 22,0% og 1,6% av pensel prøver med Ct-verdier på 32-36 og 37-40, respektivt, produsert hemi-nestet amplikonene som kan bli sekvensert med hell.
Figur 2: Resultater fra RT-qPCR screening og sekvensering av penselprøver som hadde blitt samlet inn under bekreftet norovirus-utbrudd. Hvite striper representerer antall RT-qPCR positiv penselprøver virus. Menneske Norovirus nukleinsyrer i disse RT-qPCR positive prøver ble forsterket ved hjelp av hemi-nestet PCR-analyse og deretter sekvensert for bekreftelse av genotyping. Svarte striper og linje representerer antall og andel av genotype bekreftet penselprøver, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ct verdiområde | Antall RT-qPCR positive prøver | Nummer (%) av sekvens bekreftet prøvene a |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72,2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22,0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1,6) |
| a) hemi nestet PCR | ||
Tabell 2: RT-qPCR og genotyping resultatene av penselprøver.
| Prøvenummer | PLASSERING | Beskrivelse av overflaten | Flateareal (cm 2) | Dato / klokkeslett for prøvetaking | Clean (Y / N) | Hvis rengjort, hva desinfiserende ble brukt? </ Strong> | Detaljert beskrivelse av overflatemateriale og plassering |
| 1 | Room # 7-1302 | toalettsete | 700 cm 2 | 6/26/2016; 9:00 om morgenen | Nei | ikke relevant | Toalettsete [topp overflater), og vanskelig plastoc |
| 2 | Room # 7-1330 | telefon håndtak | 500 cm 2 | 6/26/2016; 09:25 | Ja | 1000 ppm blekemiddel | Hard plast, gummi knappen |
Supplerende Tabell 1: Eksempel på prøven beskrivelse form.
| genogroup / virus | Navn oligonukleotid primer / sonde | Sequence 5 → 3 & #900; | Henvisning |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CAT CAT CAT Tya C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC A | 17 | |
| Ring1E-sonde | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ en | Denne studien | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| Ring2-primer | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <td> 17||
| Ring2-sonde | Cy5 eller Quasar 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 b | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| MS2P-sonde | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 c | 18 | |
| en GI TaqMan probe 5'-merket med 6-carboxyfluorescein (FAM) og 3'-merket med MGBNFQ (Minor-groove Binding stedet) | |||
| b GII TaqMan probe 5'-merket med Cy5 eller Quasar 670 og 3'-merket med Black Hole drikk; Black Hole Quencher (BHQ) 2 brukes på grunn av tilgjengelighet, er BHQ 3 trekkes. | |||
| c MS2 TaqMan probe er 5R17; -merket med HEX og 5'-merket med BHQ1 | |||
Supplerende Tabell 2: Oligonukleotidprimere og prober informasjon.
| Komponent | Volum pr reaksjon (pl) | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP |
| 2x RT-PCR-buffer * | 12,5 | 1x |
| Nukleasefritt vann * | 1,08 | n / a |
| Detection Enhancer * | 1,67 | n / a |
| Cog 1F (10 mm) | 1 | 400 nM |
| Cog 1R (10 mm) | 1 | 400 nM |
| Ring 1E-probe (10 mm) | 0.5 | 200 nM | 1 | 400 nM |
| Cog 2R (10 mm) | 1 | 400 nM |
| Ring 2-sonde (10 mm) | 0.5 | 200 nM |
| MS2F (10 mm) | 0,25 | 100 nM |
| MS2R (10 mm) | 0,25 | 100 nM |
| MS2P-probe (10 mm) | 0,25 | 100 nM |
| 2x RT-PCR enzymet * | 1 | 1x |
| Master Mix volum | 22 | |
| * Inkludert i sann tid RT-PCR kit | ||
Utfyllende Tabell 3: Master mix for multiplex real-time GI / GII / MS2 norovirus RT-PCR
| Type kontroll | resultat tolkning | ||
| Prøve | negativ kontroll | Bør være negativ | |
| positiv kontroll | Bør være positivt | ||
| negativ prøve | Prøven er negativ hvis hver Ct verdi er umulig å oppdage for GI / GII | ||
| positiv prøve | Ct-verdier (GI / GII) av begge gjentak er <38; dette (vilkårlig) cut-off må bestemmes eksperimentelt for hver enkelt realtime PCR plattform og kit | ||
| Tentativ positiv prøve | Eksempel er forsøksvis positivt hvis Ct-verdi (GI / GII) av en gjengivelse er <38 | ||
| Intern prosesskontroll (MS2) | Prøver med en terskel syklus (Ct) verdien av ≥32 feller MS2 bør testes på nytt ufortynnet og 1/10 utvannet. | ||
| Parameter | akseptabel verdi | ||
| Standard kurve ved hjelp av norovirus RNA transkripsjoner | R2 | > 0,97 | |
| Effektivitet | 90% til 115% | ||
Tilleggs Tabell 4: Styrer inkludere i hver RT-qPCR test for påvisning av norovirus i miljøpenselprøver.
| Komponent | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP | vol / Rxn (il) |
| 5x RT-PCR-buffer | 1x | 5,00 |
| dNTP mix (10 mm) 0,4 mm | 1.00 | |
| Enzyme mix (RT og Taq) | 1.00 | |
| Forward primer en | 0,5 mikrometer | 0,50 |
| Omvendt primer en | 0,5 mikrometer | 0,50 |
| RNase inhibitor (20 U / mL) | 20 U | 1.00 |
| RNase-fritt vann | 11.00 | |
| total~~POS=TRUNC | 20.00 | |
| en forover og bakover primersett for GI og GII gruppen er Cog1F + G1SKR, og Cog2F + G2SKR hhv. | ||
| Andre runde RT-PCR | ||
| Komponent | Sluttkonsentrasjon konsentrasjon~~POS=HEADCOMP | vol / Rxn (il) |
| 5x RT-PCR-buffer < / Td> | 1x | 5,00 |
| dNTP mix (10 mm) | 0,4 mm | 1.00 |
| Enzyme mix (RT og Taq) | 1.00 | |
| Forward primer b | 0,5 mikrometer | 0,50 |
| Omvendt primer b | 0,5 mikrometer | 0,50 |
| RNase inhibitor (20 U / mL) | 20 U | 1.00 |
| RNase-fritt vann | 14.00 | |
| total~~POS=TRUNC | 23,0 | |
| b forover og bakover primersett for GI og GII gruppen er G1SKF + G1SKR, og Ring2 primer + G2SKR hhv. | ||
| Merk: ovenfor informaion ble litt endret fra den opprinnelige artikkelen 19 | ||
| fase I | feltet Sampling | 1. Sjekk macrofoam penselsett (f.eks, utløpsdato, rør lekkasjer og fuktighet pinne) |
| 2. Swab overflate (grense areal til ≤100 tommers 2 (645 cm 2)) | ||
| 3. Plasser vattpinner i transportrørene, og stram caps sikkert for å unngå lekkasje under transport | ||
| pinne kit 4. Sett i en ziplock-pose | ||
| fase II | Eksempel transport og lagring | 1. Samplet vattpinner bør oppbevares -70 ° C (eller -20 ° C) |
| 2. Transportere pinneprøver til laboratoriet ved 0-4 ° C (kald-pakker) i en isolert beholder og skipet innen 48 timer for å samle vattpinner | ||
| fase III | RNA etraction | 1. Sjekk lysis buffer (f.eks utløps data) |
| 2. Legg MS2 som en intern kontroll i lysis buffer før du legger 100% etanol | ||
| RNA rensing og konsentrasjon | 3. Rengjør lab benk og lite utstyr ved hjelp av RNA RNase fjerning løsning | |
| 4. Skift hansker ofte under tiltak for å unngå en RNA krysskontaminering | ||
| fase IV | RT-PCR-analyse (QA / QC) | 1. Ta med kvantifiserte norovirus transkripsjon RNA (GI og GII) for hver RT-qPCR analyse for å kontrollere for variasjoner i Ct-verdier for hver PCR-kjøring |
| 2.Bruk fravær av MS2 signal å overvåke tilstedeværelsen av PCR-hemmere |
Utfyllende Tabell 6: Sjekkliste for CDC miljø prøvetaking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Noroviruses har en 50% menneskelig smittende dose mellom 18 og 10 tre viruspartikler 20. Derfor kan til og med lavt nivå forurensning av overflater utgjør et offentlig helserisikoen. Flere aspekter av prøvetakingspinne protokollen ble evaluert inkludert: 1) ulike pensel materialer, 2) oppbevaring tilstand spinner under transport, 3) viral RNA konsentrasjon, og 4) coliphage MS2 som intern utvinning kontroll.
Inntil nylig hadde bare resultatene for kompresser fremstilt av bomull, polyester, nylon og antistatisk tørk) blitt undersøkt og foreslått for feltbruk 13, 14, 15, 21, 22. Av disse er bomullspinner blitt anbefalt av ISO 15216-protokoll for påvisning av norovirus og hepatitt A virus fra matlaging overflater og fomites 23. Hvordannoensinne, det er begrensede data på testene som ble gjennomført av bomullspinner under feltforhold med store high-touch flater som dørhåndtak, datamaskiner og toalettseter som har blitt hyppig involvert i overføring av noroviruses 24, 25. I tillegg er størrelsen av disse miljø flater overskrider kapasiteten til fiberspiss vattpinner. I vår studie, viste vi at macrofoam vattpinner, som har en større pinne hode enn de fiber tips vattpinner, har høyere utvinningsgraden for mennesker norovirus ved prøvetaking av miljø overflater med et område på opptil 700 cm 2.
Noroviruses i oppløsningen er relativt ustabile ved romtemperatur og krever minst kjøling. Derfor, forsendelse til laboratoriet skal finne sted ved 0-4 ° C i løpet av 48 timer etter samling av de vattpinner. Volumet av prøven som kan typisk bli testet i en PCR-reaksjon er mye mindre enn den for mengden avprøve etter eluering fra pinnen (3-5 mL vs. 5-10 ml) som, uten konsentrasjon, reduserer positivitet rate. I miljø virologi, har polyetylenglykol (PEG) blitt brukt med hell til å konsentrere virus fra store mengder miljø farvann. Imidlertid kan volumer opptil 10 ml lett bli trukket ut og konsentrert ved hjelp av Midi spinnkolonner til volumer så lavt som 250 ul og videre konsentrert 10 ganger med høy utvinning ved hjelp av sentrifugekolonner.
Selv om RT-qPCR er gullstandard for sensitiv deteksjon og kvantifisering av norovirus, kan følsomheten av disse analyser lett bli påvirket av tilstedeværelsen av PCR-inhibitorer som er ko-ekstrahert fra penselprøver. Derfor er inkluderingen av en ekstraksjon kontroll, for eksempel coliphage MS2 viruspartikler, i en multipleks PCR format som detekterer begge norovirus samt MS2, bidrar til å overvåke tilstedeværelsen av PCR-inhibering og for å vurdere variasjon mellom forskjellige eksperimenter. </ P>
Test variablene i en laboratorievalideringsfremgangsmåten er kritisk for å bestemme den diskriminerende effekt av en testmetoden, og videre oversatt til metodens sannsynlig felt sampling ytelse. Tar virkelige verden felt tilstand (f.eks, forsinket sampling, større flater på opp til 700 cm 2) i betraktning, deteksjonsgrensen for norovirus var 3,4 log 10 (rustfritt stål) og fire log 10 (toalettsete) kopier norovirus per overflate samplet 6. Derfor negative pensel resultatene er ikke entydige at ingen viruskontaminasjon har oppstått. Klinisk og epidemiologisk informasjon om norovirus sykdom alltid trumfer miljø funnene 2, 6.
Våre data fra et cruiseskip viste at høy-touch overflater som telefoner, tastaturer, og dørhåndtak testet positivt for norovirus i hytter hvor folkmed rapportert viral gastroenteritt hadde bodd. Disse flatene enten ble forurenset gjennom direkte kontakt eller indirekte via dråper som produseres under toalettet spyle eller oppkast episoder 6, 7, 8, 9, 10.
I konklusjonen, påvisning av norovirus på miljø overflatene med denne nyutviklede protokollen pinne kan hjelpe med å bestemme nivået av miljøforurensning under utbrudd, oppdage virus når kliniske prøver er ikke tilgjengelige og overvåking av effektiviteten av rengjøring praksis. Fiber pinne (bomull og rayon) basert overflateprøvetakingsmetoder har blitt mye brukt til å undersøke andre enteriske virus (f.eks rotavirus og adenovirus) 27, 28, 29. Med tanke på høyereutnyttelsesgrad for norovirus av macrofoam vattpinner i løpet av disse fibrene tipped vattpinner 6, forventet vi at macrofoam vattpinner vil være i stand til å oppdage andre enteriske virus også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
