Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Published: February 6, 2017 doi: 10.3791/55205
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Viral Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

Abstract

noroviruses الإنسان هي السبب الرئيسي لانتشار الوباء والتهاب المعدة والأمعاء متفرقة في جميع أنحاء العالم. لأنه إما تنتشر معظم حالات العدوى مباشرة عبر الطريق من شخص إلى شخص أو بشكل غير مباشر من خلال الأسطح البيئية أو المواد الغذائية، الملابس والأشياء الملوثة والأسطح غير حية هي وسائل هامة لانتشار الفيروس خلال تفشي نوروفيروس.

قمنا بتطوير وتقييم بروتوكول باستخدام مسحات macrofoam للكشف والكتابة من noroviruses الإنسان من الأسطح الصلبة. مقارنة مع مسحات ذات الرؤوس الألياف أو مناديل التحجر، ومسحات macrofoam تسمح الانتعاش فيروس (المدى 1،2 حتي 33،6٪) من الأسطح مقعد المرحاض لمدة تصل إلى 700 سم 2. ويتضمن البروتوكول الخطوات اللازمة لاستخراج الفيروس من مسحات ومزيد من تركيز الحمض النووي الريبي الفيروسي باستخدام الأعمدة تدور. في المجموع، 127 (58.5٪) من 217 عينات المسحة التي تم جمعها من الأسطح في السفن السياحية ومرافق الرعاية طويلة الأجل حيث نوروفيروس التهاب المعدة والأمعاء كانذكرت ثبتت اصابتهم GII نوروفيروس بواسطة RT-QPCR. هذه 29 (22.8٪) يمكن مرمزة بنجاح. وفي الختام، والكشف عن نوروفيروس على الأسطح البيئية باستخدام بروتوكول ضعنا يمكن أن تساعد في تحديد مستوى التلوث البيئي خلال تفشي وكذلك الكشف عن الفيروس عندما العينات السريرية غير متاحة؛ كما أنها قد تسهل رصد فعالية استراتيجيات العلاج.

Introduction

noroviruses الإنسان هي السبب الرئيسي لانتشار الوباء والتهاب المعدة والأمعاء الحاد متفرقة في جميع أنحاء العالم 1، 2، 3. فيروس معد للغاية ويحدث انتقال العدوى عن طريق الشخص المباشر للشخص التفاعل أو بشكل غير مباشر من خلال اتصال مع الغذاء الملوث أو الماء أو الأسطح البيئية. Noroviruses يمكن تسليط لفترات طويلة وطويلة بقاء الفيروس على الأسطح البيئية وقد تم توثيق 1، 2، 3. خلال ذروة سفك، يتم الإفراج عن المليارات من جزيئات الفيروس في كل غرام من البراز، ويحتوي على القيء أيضا وجود عدد كاف من الجسيمات الفيروسية أن تسبب عدوى 4، 5، 6، 7، 8،EF "> 9 و 10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يحدث نقل الفيروس بين الأسطح غير حية وجلد الإنسان بسهولة 2، 11، 12. وبالتالي، رصد التلوث البيئي قد تساعد في التحقيقات اندلاع وفي تقييم فعالية تنظيف و إجراءات التطهير.

وقد وصفت عدة بروتوكولات أخذ العينات البيئية للكشف عن فيروس الروتا، عاثية العصية القولونية MS2، الفيروسة الكأسية القطط (FCV)، والجراثيم P22 13، 14، 15، 16. ومع ذلك، فإن الظروف التحقق من صحة وصفها في هذه الدراسات، بما في ذلك جفاف سريع (<1 ساعة) ومساحات صغيرة (25 × 100 سم 2)، قد لا تمثل إعدادات المجال على نحو كاف. بالإضافة إلى ذلك، من المتوقع مستويات تلوث منخفضة من بيئىتتطلب الأسطح nmental البروتوكولات التي هي قادرة على الكشف عن عدد قليل جدا من جزيئات الفيروس.

قمنا بتطوير طريقة أخذ العينات السطحية القائمة على macrofoam للكشف والكتابة من نوروفيروس. تم التحقق من صحة هذه الطريقة خلال عدة تفشي نوروفيروس. ويتضمن البروتوكول 1) كيفية جمع عينات مسحة من الأسطح البيئية (2) كيفية الحفاظ على أفضل سلامة العينات أثناء جمع والشحن إلى المختبر، و3) الاختبارات المعملية والكتابة من نوروفيروس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. مسحة أخذ العينات في الميدان

  1. ارتداء زوج من القفازات النظيفة.
  2. قياس حجم المنطقة أخذ العينات دون لمس السطح باستخدام شريط قياس أو الحاكم. محاولة لتقدير المساحة بأكبر قدر ممكن، وملء استمارة التقرير (الجدول التكميلي 1).
  3. تحقق عدة مسحة لالتسربات المحتملة وأكياس نقل العينات التسمية ومجموعات مسحة.
  4. نقل مسحة في جميع أنحاء المنطقة أخذ العينات على النحو التالي: ضربة واحدة في الاتجاه الأفقي، بضربة واحدة في الاتجاه الرأسي، وبضربة واحدة في اتجاه قطري. لا مسحة مساحة أكبر من 700 سم 2.
  5. وضع كل مسحة في أنبوب وإحكام الغطاء بإحكام.

2. التخزين والنقل من مسحات إلى المختبر

  1. حافظ على مسحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة. إذا كان المطلوب التخزين لفترات أطول، وتخزين مسحات في -20 درجة مئوية (أو -70 درجة مئوية).
  2. إبقاء الأنابيب في 0-4 درجة مئوية (أي. استخدام حزم الباردة) في وعاء معزول أثناء النقل إلى المختبر وتشحن في غضون 24-48 ساعة من جمعها.

3. تركيز الفيروسات، الفيروسي RNA استخراج وتنقية

ملاحظة: جميع الخطوات الطرد المركزي تستخدم أجهزة الطرد المركزي الجدول أعلى في 5000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ما لم ينص على خلاف ذلك. كن حذرا عند التعامل مع العازلة العالمي استخلاص الحمض النووي (UNEX). ارتداء نظارات واقية أو درع الوجه.

  1. تسمية واحدة 15 مل أنبوب واحد العمود RNA ميدي لكل عينة. تشمل مراقبة استخراج السلبية في كل تجربة.
  2. لإعداد حل تحلل لمدة 10 مسحات، خلط 25 مل من العازلة UNEX مع 25 مل من PBST (PBS الرقم الهيدروجيني 7.2 تحتوي على 0.02٪ توين-80).
  3. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق عاثية العصية القولونية MS2 (10 6 PFU / ميكرولتر) إلى 50 مل من محلول تحلل.
  4. وضع مسحة في أنبوب 15 مل وإضافة 5 مل من محلول تحلل. خلط واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة 5 مل الإيثانول بنسبة 100٪ لكل أنبوب ودوامة لمدة 10 ثانية.
  6. إزالة بعناية مسحة من أنبوب 15 مل (أنه يحتوي على عازلة UNEX) الضغط برفق على جانب من أنبوب لإزالة السائل الزائد ثم تجاهل مسحة. وينبغي أن تكون الكميات المتبقية بين 9-10 مل.

4. ميدي العمود الفيروسية نوكليك حمض استخراج

  1. نقل بعناية 4.5 مل UNEX / الايثانول خليط من الخطوة 3.6 على عمود ميدي، الطرد المركزي والتخلص من الترشيح.
  2. تحميل 4.5 مل أخرى من نفس الخليط على العمود نفسه، الطرد المركزي، وتجاهل الترشيح.
  3. لغسل الأولى، إضافة 3.5 مل من الايثانول 70٪ على ميدي العمود، الطرد المركزي والتخلص من الترشيح.
  4. لغسل الثاني، إضافة 3.5 مل أخرى من 70٪ من الإيثانول على العمود ميدي. الطرد المركزي والتخلص من الترشيح.
  5. لالجاف تدور، الطرد المركزي الأعمدة ميدي لإزالة كل آثار الإيثانول (والتي يمكن أن تؤثر سلبا على الانتعاش RNA الفيروسي الخاص بك).
  6. ضع عمود ميدي في 15 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة. إضافة 250 شطف العازلة ميكرولتر على العمود ميدي. الانتظار لمدة 1 دقيقة قبل الطرد المركزي للحصول على أعلى الانتعاش RNA الفيروسي.
  7. تخزين الحمض النووي المستخرج في -70 درجة مئوية أو الشروع فورا في الخطوة 5.

5. تركيز الأحماض النووية الفيروسية عن طريق الحمض النووي الريبي النظيفة والمكثف أطقم

  1. إضافة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي العازلة ملزمة إلى 250 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي مزال في الخطوة 4.7 أعلاه ودوامة لمدة 10 ثانية.
  2. إضافة 750 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100٪ ودوامة لمدة 10 ثانية.
  3. تسمية عمود الدوران لكل عينة. تحميل العينة 750 ميكرولتر على عمود الدوران.
  4. أجهزة الطرد المركزي الأعمدة تدور في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
  5. تحميل 750 ميكرولتر المتبقية على عمود الدوران والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  6. لمرحلة ما قبل الغسيل، وإضافة 400 ميكرولتر العازلة RNA الإعدادية لكل عمود الدوران والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
  7. لغسل الأولى، إضافة 800 ميكرولتر RNA الاحتياطي اغسل إلى كل عمود الدوران والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
  8. لغسل الثاني، إضافة 400 ميكرولتر RNA الاحتياطي اغسل تدور العمود والطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
  9. لالجاف تدور، الطرد المركزي عمود الدوران لإزالة كل آثار غسل العازلة في 12000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  10. نقل بعناية عمود الدوران إلى أنبوب 1.5 مل microcentrifuge نظيفة.
  11. إضافة 25 ميكرولتر شطف العازلة على عمود الدوران واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. سيؤدي هذا إلى زيادة الانتعاش من الحمض النووي الريبي الفيروسي من العمود.
  12. جمع الحمض النووي الريبي بواسطة الطرد المركزي عمود الدوران في 10000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  13. إما الانتقال مباشرة إلى RT-QPCR (الخطوة 6) أو تخزين الحمض النووي الريبي في -70 درجة مئوية.

6. Mutiplex RT-QPCR الكشف عن Genogroup الأول، والثاني Noroviruses، وعاثية العصية القولونية MS 2 (الجدول التكميلي 2)

  1. أسطح عمل نظيفة، pipettوفاق، وأجهزة الطرد المركزي مع ريبونوكلياز الحل لإزالة التلوث للحد من تلوث محتمل.
  2. ذوبان الجليد الكواشف RT-QPCR على الجليد. RNA ذوبان على الجليد (في منطقة / غرفة منفصلة).
  3. تحديد عدد من ردود الفعل وإضافة 10٪ على الأقل أكثر منها (على سبيل المثال إذا كانت هناك حاجة 10 ردود الفعل، وجعل مزيج الرئيسي ل11).
  4. مكونات مزيج الرئيسي الفردية دوامة، باستثناء 25X RT-QPCR الانزيم، لمدة 5 ق. بعناية مزيج انزيم عبها الأنبوب مع إصبع.
  5. لفترة وجيزة مكونات مزيج الرئيسي الطرد المركزي لمدة 5 ثوان.
  6. تحضير مزيج الرئيسي لالحقيقي كشف RT-PCR من GI نوروفيروس وGII وفقا للتعليمات عدة وإضافة الاشعال النوكليوتيد-نوروفيروس محددة وتحقيقات في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge (الجدول التكميلي 3).
  7. خلط مزيج الرئيسي من قبل pipetting 5-10 مرات صعودا وهبوطا (لا ينصح vortexing ل). قسامة 22 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل بئر في الوقت الحقيقي PCR لوحة 96-جيدا.
  8. دوامة عينة الحمض النووي الريبيلمدة 5 ثوان، وجمع من قبل وجيزة (5 ق) الطرد المركزي.
  9. إضافة 3 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي والجهاز الهضمي وGII الضوابط الإيجابية لوحة RT-QPCR (اتبع قالب من الجدول 2). إضافة 3 ميكرولتر من نوكلياز-freewater في الآبار عدم قالب التحكم (NTC).
  10. ختم لوحة في الوقت الحقيقي مع الفيلم لاصقة البصرية.
  11. بعناية أجهزة الطرد المركزي لوحة في الوقت الحقيقي في 1300 x ج لمدة 1 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء أو قطرات سائلة التي قد تكون موجودة في الآبار.
  12. انشاء الوقت الحقيقي PCR الصك وانشاء الظروف الحراري thermocycling التالية: 1) خطوة RT لمدة 10 دقيقة. في 45 ° C (2) تفعيل طق البلمرة، 10 دقيقة. في 95 درجة مئوية و (3) 45 دورات من 15 ثانية في 95 درجة مئوية، و60 ثانية في 60 درجة مئوية.

7. الكمي من نوروفيروس في عينات المسحة

  1. تحقق نتائج الضوابط الإيجابية والسلبية للتحقق من صحة النتائج RT-QPCR (الجدول التكميلي 3).
  2. تحديد ما إذا كان كل منحنى قياسي يفيالقيم المقبولة الواردة في الجدول التكميلي 2 وحساب الانحراف المعياري العام للمنحنى قياسي باستخدام المعادلة 1.
    (المعادلة 1)٪ كفاءة = 100 × 10 (متوسط ط م القيم-الإعتراض) / المنحدر.
  3. إذا لم PCR برنامج cycler الحرارية حساب المنحدر لكل المنحنى القياسي، تحديد المنحدر و R 2 القيم عن طريق الانحدار باستخدام برنامج إحصائيات (مثل إكسل، SPSS، أو SAS). وبالإضافة إلى ذلك، وحساب الكفاءة٪ لمنحنيات القياسية التالية المعادلة أنا
  4. تسجيل عدد نسخ الحمض النووي الريبي وتحسب على أساس برنامج cycler الحرارية لجميع عينات الاختبار استنادا إلى المنحنيات القياسية التي تفي بالمعايير المحددة في الجدول التكميلي 4. إعادة تشغيل أي عينات مع المنحنيات القياسية قبعة ر لا تلبي معايير أو ضوابط إيجابية كاذبة. تحقق القيم ط م من عاثية العصية القولونية MS2، الذي اضاف باعتبارها الرقابة الداخلية لمراقبة PCR تثبيط.
  5. تحديد العدد الإجمالي من الحمض النووي الريبي نسخ صعينة إيه من ضرب عدد نسخ الحمض النووي الريبي المحسوبة في الخطوة 7.2 من نسبة حجم (25-50 ميكرولتر) من إجمالي شاطف RNA إلى أن من الحمض النووي الريبي (3-5 ميكرولتر) المستخدمة للتفاعل RT-QPCR. بدلا من ذلك، حساب كثافة الحمض النووي الريبي عن طريق قسمة إجمالي عدد نسخ الحمض النووي الريبي في منطقة سطح الجسم (سم 2) تحليلها.

8. التنميط الجيني لفي الوقت الحقيقي العينات RT-PCR إيجابي من قبل هيمي متداخلة التقليدية PCR التضخيم

  1. تحضير الجولة الأولى من مزيج الرئيسي لكل مجموعة التمهيدي للفحص RT-PCR (الجداول التكميلية 2 و 5).
  2. إضافة 5 ميكرولتر من نوروفيروس RNA إيجابية ل20 ميكرولتر من مزيج الرئيسي.
  3. تشغيل RT-PCR وفقا للشروط التالية: (1) RT خطوة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية (2) تفعيل طق البلمرة، و 15 دقيقة في 95 درجة مئوية، و (3) 40 دورات من 30 ثانية في 95 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 50 درجة مئوية، و 60 ثانية في 72 درجة مئوية. بعد 40 دورة، واحتضان لمدة 10 دقيقة إضافية عند 72 درجة مئوية.
  4. تحضير الجولة الثانية من مزيج الأم لكل مجموعة التمهيدي للفحص RT-PCR (الجداول التكميلية 2 و 5).
  5. إضافة مزيج الرئيسي 23 ميكرولتر وإضافة 2 ميكرولتر من الدور الاول المنتجات RT-PCR (من الجولة الأولى) إلى كل أنبوب (مثالي المنتج الجولة الأولى يجب تخفيفه 10/01 في ريبونوكلياز خالية من المياه).
  6. كرر الخطوة 8.3.
  7. إعداد agarose هلام 2٪ في EDTA 100 مل 1X تريس، خلات (40 ملي تريس، 20 ملم حمض الخليك، و1 ملم EDTA، في درجة الحموضة 8.3). بعد حل الاغاروز عن طريق تسخين الخليط في فرن الميكروويف، وإضافة 10 ميكرولتر من وصمة عار الحمض النووي لكل 100 مل من هلام مستعدة بعد تبريد الخليط إلى 60-70 درجة مئوية، صب جل وإدراج أمشاط. السماح للهلام يستقر لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  8. مزيج 15 ميكرولتر من كل منتج RT-PCR مع 3 ميكرولتر من صبغ تحميل 6X. تحميل 15 ميكرولتر من كل عينة وelectrophorese هلام الاغاروز في 100 فولت لمدة 1 ساعة.
  9. شظايا المكوس الهدف RT-PCR ذات حجم مناسب (330 نقطة أساس لمعهد جوته و 341 نقطة أساس لGII) من هلامد تنقية الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج الهلام التجارية. ويمكن الآن للمنتج PCR المنقى أن تستخدم لسانجر التسلسل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويعرض الشكل 1 مخطط للبروتوكول أخذ العينات مسحة. يتكون هذا البروتوكول من أربع خطوات رئيسية. 1) جمع العينات، 2) تخزين العينات والنقل، 3) الفيروسية تنقية الحمض النووي الريبي وتركيز و4) RT-QPCR فحص والتنميط الجيني.

شكل 1
الشكل 1: مخطط تدفق البروتوكول النهائي لأخذ العينات السطحية البيئية للنوروفيروس الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويلخص الجدول 1 نتائج من 34 عينة مسحة التي تم جمعها من سفينة الرحلات البحرية التي أبلغت عن حالات الاشتباه التهاب المعدة والأمعاء نوروفيروس خلال الرحلة. تم استخراج عينات مسحة والشركة المصرية للاتصالاتSTED في نسختين لنوروفيروس من تعدد الإرسال في الوقت الحقيقي RT-QPCR. اختبار سبعة عشر (18.5٪) عينة إيجابية بما في ذلك 8 عينات من السطوح في كابينة الركاب حيث يعانون من أعراض نوروفيروس قد بقوا و 9 من المجالات المشتركة على متن السفينة. تم حساب عدد النسخ الجينومية لكل عينة من القيم ط (والتي تراوحت بين 16 و 31) باستخدام المنحنى القياسي من نوروفيروس نسخة GII.7 الحمض النووي الريبي. وكان متوسط عدد نسخ الجينوم من عينات مسحة في كابينة 3.6 السجل 10 (المدى: 2،4-4،5 سجل 10 RNA نسخة)، وهو أعلى بكثير من نسخ الجينوم من المجالات المشتركة (المدى: 1،2-2،1 سجل 10 الجينوم نسخة) ( P <0.001). أربعة (23.5٪) من 17 عينة مسحة إيجابية كانت قادرة على أن تكون مرمزة، وكانت جميع العينات تسلسل GII.1 متطابقة.

الليدو >
موقع تبادل البيئي جمعت متوسط قيمة ط م (# إيجابي من إجمالي عدد العينات التي تم فحصها) الطراز العرقى نوروفيروس RNA نسخ العدد في عينات منطقة ج
الأذين الدرابزين 34.3 (1/2) GII 16
المقصورة مقعد المرحاض 31.4 (2/2) GII. ب 31217
المقصورة صنبور 37.5 (1/2) GII 491
المقصورة مقبض الباب 35.0 (2/2) GII 2675
المقصورة جهاز التحكم 38.6 (2/2) GII.1 ب 233
المقصورة B مقعد المرحاض 33.5 (2/2) GII.1 ب 986
آلة الآيس كريم 34.2 (2/2) GII 16
الليدو توابل الجدول 35.2 (1/2) GII 15
الليدو الجدول الأعلى 35.3 (1/2) GII 14
بيتزا سطح مضادة 35.7 (1/2) GII 14
مخزن الرئيسية آلة وقت ممتع 37.1 (1/2) GII 64
آلة للبيع الأسطح القابلة للمس 38.8 (1/2) GII 18
صالة الطاقم لوحة المفاتيح والفأرة السطحية 36.8 (1/2) GII 80
المقصورة C صنبور ومقبض الباب 31.6 (2/2) GII.1 ب 26458
المقصورة C هاتف 36.4 (2/2) GII 1035
المقصورة C لوحة المفاتيح 33.0 (2/2) GII 1317
مركز طبي الحافظة 36.0 (2/2) GII 113
والمقصورة، وقد احتلت باء وجيم من قبل الأفراد الذين تعرضوا لسوء سريريا مع أعراض gastoenteristis الفيروسية.
ب يمكن مرمزة أربعة من العينات مسحة 17 GII الإيجابية.
تم caluated ج RNA نسخ على أساس منحنى قياسي من نسخ الرنا نوروفيروس GII.7.
ملاحظة: فوق التاريخ تم تعديلها قليلا من المادة 6 الأصلية.

الجدول 1: نتائج 34 عينة مسحة التي تم جمعها من سفينة الرحلات البحرية التي أبلغت عن حالات الاشتباه التهاب المعدة والأمعاء نوروفيروس خلال الرحلة.

ويبين الشكل 2 العلاقة بين القيم ط يحدده RT-QPCR والقدرة على تسلسل هذه العينات. في المجموع، واختبارها 127 من 217 عينة مسحة إيجابية لGII نوروفيروس بواسطة RT-QPCR. عرض العينات مجموعة واسعة (12-40) من القيم ط. في المجموع، 29 (22.8٪) من العينات إيجابية RT-QPCR يمكن مرمزة. تم مرمزة عينات مسحة مع القيم ط م أقل من 27 وتتراوح بين 28-31 في معدلات 100٪ و 72.2٪ على التوالي. في المقابل،٪ فقط 22.0 و 1.6٪ من عينات مسحة مع القيم ط م من 32-36 و37-40 على التوالي، أنتج amplicons-نصفي المتداخلة التي يمكن أن تكون متسلسلة بنجاح.

ithin الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2: نتائج RT-QPCR فحص وتسلسل عينات المسحة التي تم جمعها خلال تفشي نوروفيروس المؤكدة. تمثل أشرطة بيضاء عدد RT-QPCR عينات مسحة إيجابية الفيروس. وتضخمت الإنسان الأحماض النووية نوروفيروس في تلك العينات الإيجابية RT-QPCR باستخدام متداخلة نصفي فحص PCR ومن ثم التسلسل لتأكيد التنميط الجيني. أشرطة سوداء وخط تمثل عدد ونسبة التركيب الوراثي وأكد عينات مسحة، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مجموعة قيمة ط م عدد RT-QPCR عينات إيجابية عدد (٪) من أكد تسلسل عينات ل
20-23 4 3 (75)
24-27 3 3 (100)
28-31 18 13 (72.2)
32-36 41 9 (22.0)
37-40 61 1 (1.6)
أ) هيمي متداخلة PCR

الجدول 2: RT-QPCR والنتائج التنميط الجيني لعينات مسحة.

رقم العينة موقعك وصف السطح المساحة (سم 2) تاريخ / وقت جمع العينة نظيفة (Y / N) إذا تنظيفها، ما مطهر استخدمت <؟/ قوي> وصف مفصل من المواد السطحية والمكان
1 الغرفة رقم 7-1302 مقعد المرحاض 700 سم 2 2016/6/26. 09:00 لا غير قابل للتطبيق مقعد المرحاض [أعلى السطوح)، وplastoc الصعب
2 الغرفة رقم 7-1330 التعامل مع الهاتف 500 سم 2 2016/6/26. 09:25 نعم فعلا 1000 جزء في المليون التبييض البلاستيك الصلب، المطاط زر

الجدول التكميلي 1: مثال لشكل وصف العينة.

<td> 17
genogroup / فيروس اسم النوكليوتيد التمهيدي / مسبار تسلسل 5 → 3 & #900؛ مرجع
GI Cog1F CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA 17
Cog1R CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C 17
G1SKF CTG CCC غا TTY GTA AAT GA 17
G1SKR التقييم القطري المشترك ACC CAR CCA فريق العمل المعني بالموارد معاهدة الصداقة والتعاون و 17
Ring1E مسبار FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ ل هذه الدراسة
GII Cog2F CAR غار BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG 17
Cog2R TCG ACG التقييم القطري المشترك تكت TCA عقاري ACA 17
Ring2 التمهيدي TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT 17
G2SKR CCR CCN الائتلاف TRH CCR فريق العمل المعني بالموارد TAC AT
Ring2 مسبار Cy5 أو QUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 ب 17
MS2 MS2F TGG CAC TAC CCC تكت CCG TAT TCA CG 18
MS2R GTA CGG GCG ACC التقييم القطري المشترك CGA TGA C 18
MS2P مسبار HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 ج 18
و5'المسمى التحقيق GI TAQMAN مع 6 carboxyfluorescein (فام) و3'المسمى مع MGBNFQ (الصغرى الأخدود موقع ملزم)
و5'المسمى ب GII TAQMAN التحقيق مع Cy5 أو كوازار 670 و3'المسمى مع الثقب الأسود فاكهه تقضي؛ الثقب الأسود فاكهه تقضي (BHQ) 2 استخدامها نظرا لتوافر، BHQ 3 هو المفضل.
ج MS2 TAQMAN التحقيق هو 5R17؛ -labeled مع الهيكس و5'المسمى مع BHQ1

الجدول التكميلي 2: الاشعال النوكليوتيد وتحقيقات المعلومات.

الترس 2F (10 ميكرومتر)
مكون حجم في رد الفعل (ميكرولتر) التركيز النهائي
2X RT-PCR العازلة * 12.5 1X
Nuclease خالية من المياه * 1.08 ن / أ
كشف محسن * 1.67 ن / أ
الترس 1F (10 ميكرومتر) 1 400 نانومتر
الترس 1R (10 ميكرومتر) 1 400 نانومتر
حلقة 1E مسبار (10 ميكرومتر) 0.5 200 نانومتر
1 400 نانومتر
الترس 2R (10 ميكرومتر) 1 400 نانومتر
الحلقة 2 مسبار (10 ميكرومتر) 0.5 200 نانومتر
MS2F (10 ميكرومتر) 0.25 100 نانومتر
MS2R (10 ميكرومتر) 0.25 100 نانومتر
MS2P مسبار (10 ميكرومتر) 0.25 100 نانومتر
2X RT-PCR انزيم * 1 1X
حجم ميكس ماجستير 22
وشملت * في الوقت الحقيقي عدة RT-PCR

الجدول التكميلي 3: مزيج الرئيسي لتعدد الإرسال في الوقت الحقيقي-GI / قسم الإعلام / MS2 نوروفيروس RT-PCR

نوع من الرقابة نتيجة التفسير
عينة سيطرة سلبية يجب أن تكون سلبية
مراقبة إيجابية يجب أن تكون إيجابية
عينة سلبية عينة سلبية إذا كل قيمة ط م غير قابل للكشف عن GI / GII
عينة إيجابية القيم ط (GI / GII) كل من مكررات هو <38؛ هذا (تعسفيا) قطع بحاجة إلى أن تحدد تجريبيا لكل الحقيقي PCR منصة وعدة
عينة إيجابية مؤقتة عينة إيجابية مبدئيا إذا كانت القيمة ط (GI / GII) من تكرار واحد هو <38
التحكم في العمليات الداخلية (MS2) العينات مع دورة عتبة (CT) قيمة ≥32 وأو MS2 يجب اختبارها مخفف و1/10 المخفف.
معامل قيمة مقبولة
منحنى قياسي باستخدام النصوص نوروفيروس RNA R 2 > 0.97
نجاعة 90٪ إلى 115٪

الجدول التكميلي 4: يتحكم أن تدرج في كل اختبار RT-QPCR للكشف عن فيروس النورو في عينات مسحة البيئية.

مكون التركيز النهائي المجلد / rxn (ميكرولتر)
عازلة 5X RT-PCR 1X 5.00
مزيج dNTP (10 ملم) 0.4 ملم 1.00
مزيج انزيم (RT وطق) 1.00
إلى الأمام التمهيدي ل 0.5 ميكرومتر 0.50
عكس التمهيدي ل 0.5 ميكرومتر 0.50
المانع ريبونوكلياز (20 U / ميكرولتر) 20 U 1.00
المياه خالية من ريبونوكلياز 11.00
الحجم الكلي 20.00
إلى الأمام وعكس مجموعات التمهيدي لمعهد جوته ومجموعة GII هي Cog1F + G1SKR، وCog2F + G2SKR، على التوالي.
الجولة الثانية RT-PCR
مكون التركيز النهائي المجلد / rxn (ميكرولتر)
عازلة 5X RT-PCR < / td> 1X 5.00
مزيج dNTP (10 ملم) 0.4 ملم 1.00
مزيج انزيم (RT وطق) 1.00
إلى الأمام التمهيدي ب 0.5 ميكرومتر 0.50
عكس التمهيدي ب 0.5 ميكرومتر 0.50
المانع ريبونوكلياز (20 U / ميكرولتر) 20 U 1.00
المياه خالية من ريبونوكلياز 14.00
الحجم الكلي 23.0
ب إلى الأمام وعكس مجموعات التمهيدي لمعهد جوته ومجموعة GII هي G1SKF + G1SKR، وRing2 التمهيدي + G2SKR، على التوالي.
ملاحظة: فوق من informaion تم تعديل طفيف من المادة الأصلية 19
_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الجدول التكميلي 5: هيمي متداخلة مزيج ماستر RT-PCR.

المرحلة الاولى أخذ العينات الميدان 1. تحقق مجموعات macrofoam مسحة (على سبيل المثال، تاريخ انتهاء الصلاحية، تسرب أنبوب، والرطوبة مسحة)
2. المسحة السطحية (منطقة الحد السطح ل≤100 بوصة 2 (645 سم 2))
3. ضع مسحة في أنابيب النقل، وتشديد قبعات بشكل آمن لمنع تسرب أثناء الشحن
عدة مسحة 4. مكان في [زيبلوك كيس
المرحلة الثانية نقل العينات والتخزين يجب أن يتم تخزين 1. مسحات عينات -70 درجة مئوية (أو -20 درجة مئوية)
2. نقل بضائع مسحةالعينات إلى مختبر في 0-4 درجة مئوية (حزم الباردة) في وعاء معزول والسفينة في غضون 48 ساعة من جمع مسحات
المرحلة الثالثة RNA etraction 1. تحقق تحلل العازلة (على سبيل المثال، بيانات انتهاء الصلاحية)
2. إضافة MS2 باعتبارها الرقابة الداخلية إلى تحلل العازلة قبل إضافة الإيثانول بنسبة 100٪
تنقية الحمض النووي الريبي وتركيز 3. تنظيف مقاعد البدلاء المختبر والمعدات الصغيرة باستخدام الحمض النووي الريبي ريبونوكلياز الحل إزالة
4. قفازات تغير كثيرا خلال خطوات لتجنب الحمض النووي الريبي عبر التلوث
المرحلة الرابعة RT-PCR الفحص (QA / QC) 1. وتشمل كمية الرنا نسخة نوروفيروس (GI وقسم الإعلام) لكل فحص RT-QPCR للسيطرة على الاختلافات في القيم ط لكل شوط PCR
2.استخدام عدم وجود إشارة MS2 لرصد وجود مثبطات PCR

الجدول التكميلي 6: قائمة مراجعة للإجراءات أخذ العينات البيئية مركز السيطرة على الأمراض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Noroviruses لها الجرعة المعدية الإنسان 50٪ بين 18 و 10 3 جزيئات الفيروس 20. ولذلك، حتى التلوث على مستوى منخفض من الأسطح قد تشكل خطرا على الصحة العامة. تم تقييم عدة جوانب بروتوكول أخذ العينات مسحة بما في ذلك: 1) المواد مسحة مختلفة، 2) مسحات حالة التخزين أثناء النقل، 3) تركيز الحمض النووي الريبي الفيروسي، و 4) عاثية العصية القولونية MS2 عن السيطرة استخراج الداخلية.

حتى وقت قريب، إلا أن أداء مسحات مصنوعة من القطن والبوليستر والنايلون والتحجر مسح) قد تم تقييمها واقترح للاستخدام الميداني 13، 14، 15، 21، 22. من هذه، وقد أوصى قطعة قطن بواسطة بروتوكول ISO 15216 للكشف عن فيروس النورو والتهاب الكبد الوبائي أ من أسطح إعداد الطعام والملابس والأشياء 23. ماذامن أي وقت مضى، هناك بيانات محدودة عن أداء اختبار مسحات القطن تحت الظروف الحقلية مع أسطح عالية تعمل باللمس كبيرة مثل مقابض الأبواب وأجهزة الكمبيوتر، ومقاعد المراحيض التي تم كثيرا المتورطين في نقل noroviruses 24 و 25. بالإضافة إلى ذلك، فإن حجم هذه الأسطح البيئية يتجاوز قدرة مسحات ذات الرؤوس الألياف. في دراستنا، أثبتنا أن مسحات macrofoam، التي لها رأس مسحة أكبر من مسحات الألياف الحافة، ومعدلات الانتعاش العليا للنوروفيروس البشري عند أخذ العينات الأسطح البيئية مع مساحة تصل إلى 700 سم 2.

Noroviruses في حل غير مستقرة نسبيا عند درجة حرارة الغرفة، وتتطلب ما لا يقل عن التبريد. ولذلك، ينبغي أن يحدث الشحن إلى المختبر في 0-4 درجة مئوية خلال 48 ساعة بعد جمع مسحات. حجم العينة التي يمكن عادة يتم اختبارها في تفاعل PCR هو أصغر بكثير من حجمالعينة بعد شطف من مسحة (3-5 ميكرولتر مقابل 5-10 مل) التي، من دون تركيز، يقلل بشكل ملحوظ من معدل الإيجابية. في علم الفيروسات البيئي، وقد تم استخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) بنجاح على التركيز الفيروسات من كميات كبيرة من المياه البيئية. ومع ذلك، كميات تصل إلى 10 مل يمكن استخراجها بسهولة وتتركز باستخدام الأعمدة تدور ميدي لكميات منخفضة تصل إلى 250 ميكرولتر، وزيادة تركيز 10 أضعاف مع استرداد عالية باستخدام الأعمدة تدور.

على الرغم من أن RT-QPCR هو معيار الذهب للكشف عن حساسية وتقدير من نوروفيروس، وحساسية هذه المقايسات يمكن أن تتأثر بسهولة من خلال وجود مثبطات PCR التي تشارك في المستخرج من عينات مسحة. ولذلك، إدراج عنصر تحكم استخراج مثل جسيمات عاثية العصية القولونية MS2 الفيروس، في شكل PCR متعدد يكشف كل من نوروفيروس وكذلك MS2، ويساعد على رصد وجود PCR تثبيط وتقييم التباين بين التجارب المختلفة. </ P>

المتغيرات اختبار طريقة التحقق من صحة مختبر حاسمة لتحديد القوة التمييزية لطريقة الاختبار ويتم ترجمتها إلى مزيد من الأداء أخذ عينات ميدانية المرجح طريقة ل. أخذ الظروف الحقلية العالم الحقيقي (على سبيل المثال، وتأخر أخذ العينات، ومساحات أكبر تصل إلى 700 سم 2) في الاعتبار، كان حد الكشف عن نوروفيروس 3.4 السجل 10 (الفولاذ المقاوم للصدأ) و 4 سجل 10 (مقعد المرحاض) نسخة نوروفيروس في سطح العينة 6. ونتيجة لذلك، النتائج مسحة سلبية ليست نهائية أن عدم وجود تلوث فيروسي قد حدث. المعلومات السريرية والوبائية للمرض نوروفيروس ينسخ دائما النتائج البيئية 2 و 6.

وأظهرت البيانات المتوفرة لدينا من السفن السياحية التي السطوح اتصال عالية مثل الهواتف، لوحة مفاتيح الكمبيوتر، ومقابض الأبواب اختبار إيجابي لفيروس النورو في كابينة حيث الناسوالإبلاغ عن التهاب المعدة والأمعاء الفيروسي قد بقي. هذه السطوح إما أصبحت ملوثة عن طريق الاتصال المباشر أو غير مباشرة عن طريق الرذاذ الناتج أثناء غسل المراحيض أو الحلقات 6 و 7 و 8 و 9 و 10 القيء.

وفي الختام، والكشف عن نوروفيروس على الأسطح البيئية باستخدام هذا البروتوكول مسحة المطورة حديثا يمكن أن تساعد في تحديد مستوى التلوث البيئي خلال الفاشيات، كشف عن الفيروس عندما العينات السريرية غير متوفرة وفي رصد فعالية ممارسات التنظيف. يميل الألياف مسحة (القطن والحرير الصناعي) على أساس أساليب أخذ العينات السطحية التي استخدمت على نطاق واسع لتحقيق الفيروسات المعوية الأخرى (مثل فيروس الروتا، واتش) 27، 28، 29. وبالنظر إلى أعلىكفاءة استرداد نوروفيروس من مسحات macrofoam على تلك الألياف يميل مسحات 6، كنا نتوقع أن مسحات macrofoam سوف تكون قادرة على كشف الفيروسات المعوية الأخرى كذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Generic name for kits
Macrofoam swab Premoistened EnviroMax Swab kit  Puritan 2588060PFUW
RNA Lysis buffer  CDC UNEX buffer Microbiologics Cat No MR0501
RNA extraction spin column Midi column Omega Biotek Cat No R6664-02
RNA purification spin column Zymol RNA Clean and Concentrator kit  Zymo Research Cat No R1016
Real time RT-PCR kit AgPath kit One-Step RT-PCR Kit Life Technologies Cat No 4387391
Conventional RT-PCR kit Qiagen one step RT-PCR kit Qiagen kit Cat No 210212
Gel extraction kit Qiagen QIAquick gel extraction kit Qiagen kit Cat No 28704 or 28706
Coliphage MS2 ATCC Cat No 15597-B1
RNA run-off transcripts
Realtime PCR platform Applied Biosystems Model ABI 7500
Optical 96-well reaction plate Thermo Scientific Cat No 4316813
MicroAmp Clear Adhesive Film  Thermo Scientific Cat No 4306311

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
  2. Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
  3. Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
  4. Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
  5. Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
  6. Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
  7. Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
  8. Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
  9. Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
  10. Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
  11. Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
  12. Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
  13. Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
  14. Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
  15. Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
  16. Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
  17. Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
  18. Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
  19. Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
  20. Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
  21. Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
  22. Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
  23. Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
  24. Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
  25. Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
  26. Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
  27. Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
  28. Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
  29. Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).

Tags

علم المناعة، العدد 120، نوروفيروس البشري، وأخذ العينات البيئية، وأخذ العينات السطحية، macrofoam مسحة، نصفي متداخل PCR، تعدد الإرسال فحص RT-QPCR
مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, G. W., Chhabra, P.,… More

Park, G. W., Chhabra, P., Vinjé, J. Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces. J. Vis. Exp. (120), e55205, doi:10.3791/55205 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter