Abstract
人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な胃腸炎の主要な原因です。ほとんどの感染はいずれかの環境表面や食品を介して間接的に個人対個人の経路を介して直接広がったりしているため、汚染された媒介物と無生物表面は、ノロウイルスの集団感染時のウイルスの拡散のための重要な媒体です。
私たちは、硬質表面からのヒトノロウイルスの検出およびタイピングのためのマクロフォームスワブを使用してプロトコルを開発し、評価しました。繊維が先端に付いた綿棒や帯電防止ワイプと比較すると、マクロフォームスワブは、最大700 cm 2の便座表面からのウイルス回収（範囲1.2から33.6パーセント）を許可します。プロトコルは、スピンカラムを用いてウイルスRNAのスワブからウイルスを抽出し、さらに濃縮するためのステップを含みます。ノロウイルス胃腸炎がされていたクルーズ船や介護施設での表面から収集された217スワブサンプルの合計で、127（58.5パーセント）RT-qPCRによりGIIのノロウイルス検査で陽性と報告しました。これらの29（22.8％）のうち、正常遺伝子型を決定することができました。結論として、私たちが開発したプロトコルを使用して、環境面でのノロウイルスの検出は、臨床試料が入手できないときに大流行中の環境汚染のレベルだけでなく、ウイルスの検出を判断する際に役立つかもしれ。それはまた、改善戦略の有効性の監視を容易にすることができます。
Introduction
人間のノロウイルスは、世界的流行と散発的な急性胃腸炎の主要な原因1、2、3です。ウイルスは非常に伝染性であり、送信は、人との対話にまたは間接的に汚染された食物、水や環境表面との接触を介して直接人を介して行われます。ノロウイルスは、長時間流すことができ、環境表面上のウイルスの生存期間の延長は1、2、3に記載されています。ピークの排出時には、ウイルス粒子の数十億は糞便1g当たり放出される、および嘔吐はまた、感染4を引き起こすウイルス粒子の十分な数が含まれている5、6、7、8、EF "> 9、10。また、無生物表面と人間の皮膚との間のウイルスの移動が容易に発生する可能性があります2、11、12。したがって、環境汚染のモニタリングがアウトブレイク調査を支援し、クリーンアップの有効性を評価する際にすることができ、消毒手順。
いくつかの環境サンプリングプロトコルは、ロタウイルスの検出のために記載されており、大腸菌ファージMS2、ネコカリシウイルス（FCV）、及びバクテリオファージP22 13、14、15、16。しかし、高速乾燥（<1時間）と小さい表面領域（25×100 cm 2）を含む、これらの研究に記載の検証条件は、適切にフィールドの設定を表していない場合があります。また、エンバイロの低い汚染レベルを期待nmental表面は、非常に少数のウイルス粒子を検出することができるプロトコルを必要とします。
私たちは、ノロウイルスの検出とタイピングのためのマクロフォームベースの表面サンプリング法を開発しました。この方法は、いくつかのノロウイルス集団発生時に検証されています。プロトコルは、1）（2）どのように最善の研究室に収集・輸送中のサンプルの完全性を維持するために、およびノロウイルスの3）実験室での試験とタイピング環境表面からスワブサンプルを収集する方法。
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Protocol
フィールド1.スワブサンプリング
- 手袋のきれいなペアを着用してください。
- 測定テープや定規を用いて表面に触れることなくサンプリング領域のサイズを測定します。できるだけ正確に面積を推定し、報告書（補足表1）を記入してみてください。
- 可能な漏れやラベルサンプル輸送バッグや綿棒キット用綿棒キットを確認してください。
- 水平方向に1ストローク、垂直方向に1ストローク、および斜め方向の1ストロークを次のようにサンプリングエリア全体に綿棒を移動します。 700センチメートル2よりも大きな表面積を綿棒ないでください。
- チューブに各綿棒を置き、しっかりとキャップを締めます。
研究室への綿棒の2貯蔵および輸送
- 最大48時間、4℃で綿棒を保管してください。長期間保管が必要な場合は、-20℃でスワブを格納する（または-70°C）。
- すなわち、（0-4℃でチューブを保ちます。 、コレクションの24〜48時間以内に研究室や船への輸送の間に断熱容器に）コールドパックを使用します。
3.ウイルス濃度、ウイルスRNA抽出および精製
注：特に明記しない限り、すべての遠心分離工程は、室温で5分間、5000×gでテーブルトップ遠心機を使用しています。ユニバーサル核酸抽出（UNEX）緩衝液を用いて作業する場合、余分な注意が必要です。ゴーグルまたはフェイスシールドを着用してください。
- 1 15 mLチューブと各サンプルに対して1つのRNA Midiカラムにラベルを付けます。各実験における負の抽出制御が含まれます。
- 10スワブのための溶解液を調製し、PBSTの25ミリリットル（PBS pH7.2の0.02％のTween-80を含む）でUNEXバッファの25ミリリットルを混ぜます。
- 溶解液の50 mLに大腸菌ファージMS2懸濁液（10 6 PFU /μL）の50μLを追加します。
- 15 mLチューブに綿棒を置き、5ミリリットル溶解液を追加します。混合し、室温で10分間インキュベートします。
- 10秒のための各チューブ、ボルテックスに5ミリリットルの100％エタノールを追加します。
- 慎重に余分な液体を除去した後、綿棒を破棄するために、チューブの側面に軽く押す（これはUNEXのバッファが含まれている）15 mLチューブから綿棒を削除します。残りのボリュームは9-10 mLの間であるべきです。
4. Midiカラムウイルス核酸の抽出
- 慎重ミディカラム、遠心分離器の上にステップ3.6から4.5 mLのUNEX /エタノール混合物を転送し、ろ液を捨てます。
- 同じ混合物から別の4.5 mLを同じ列、遠心分離機にロードし、ろ液を捨てます。
- 最初の洗浄のための、ミディカラムに70％エタノールの3.5ミリリットルを追加し、遠心分離し、ろ液を捨てます。
- 第二の洗浄のために、ミディカラムに70％エタノールの別の3.5ミリリットルを追加します。ろ液を遠心分離し、廃棄します。
- ドライスピンのために、（マイナスのウイルスRNAの回収率に影響を与える可能性がある）エタノールのすべての痕跡を除去するために、ミディカラムを遠心してください。
- 新しい15ミリリットルの遠心分離管にMidiカラムを配置します。 Midiカラムに250μlの溶出バッファーを追加します。最高のウイルスRNAの回収率を得るために、遠心分離前に1分間待ちます。
- -70℃で抽出された核酸を保存するか、手順5に即座に進みます。
RNAクリーンとコンセントレータキットを使用したウイルス核酸の5濃度
- 上記のステップ4.7で溶出したRNAと10秒間渦の250μLに結合バッファーRNAの500μLを追加します。
- 750μLを10秒間100％エタノールと渦を追加します。
- 各サンプルのスピンカラムにラベルを付けます。スピンカラムに750μLのサンプルをロードします。
- 1分間12,000×gでスピンカラムを遠心します。フロースルーを捨てます。
- 1分間12,000×gでスピンカラムと遠心上に残りの750μLをロードします。
- 予備洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に400μLRNAプレップバッファを追加します。フロースルーを捨てます。
- 最初の洗浄のために、1分間12,000×gで各スピンカラムや遠心に800μLのRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。
- 第二の洗浄のために、1分間12,000×gで列や遠心分離機を回転するように400μLRNA洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。
- ドライスピンのために、2分間12,000×gで、洗浄緩衝液のすべての痕跡を除去するために、スピンカラムを遠心してください。
- 注意深く新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブにスピンカラムを移します。
- スピンカラムに25μlの溶出緩衝液を加え、室温で1分間インキュベートします。これは、カラムからのウイルスRNAの回収率を増加させます。
- 1分間万×gでスピンカラムを遠心分離することにより、RNAを収集します。
- どちらか-70℃でRT-qPCRを（ステップ6）、またはストアRNAに直接進みます。
6. Genogroup IのMutiplex RT-qPCRの検出、およびIIノロウイルス、およびコリファージMS 2（補足表2）
- クリーンな作業面、pipettES、および汚染の可能性を低減するためのRNase汚染除去溶液で遠心分離機。
- 氷の上でRT-qPCRの試薬を解凍します。 （別の領域/客室内に）氷上で解凍RNA。
- 反応の数を決定し、それらの少なくとも10％以上を追加（10の反応が必要な場合など 、11のためのマスターミックスを作ります）。
- 5秒間の25倍RT-qPCRの酵素を除き、渦個々のマスターミックスコンポーネント、。慎重に指でチューブをフリックすることにより酵素を混ぜます。
- 5秒間簡単に言えば遠心マスターミックスコンポーネント。
- キットの説明書に従って、ノロウイルスGIとGIIのリアルタイムRT-PCR検出のためのマスターミックスを調製し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（補足表3）でノロウイルス特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを追加します。
- 上下に5〜10回ピペッティングすることによりマスターミックスをミックス（ボルテックスは推奨されません）。リアルタイムPCR 96ウェルプレートの各ウェル内のマスターミックスのアリコートを22μL。
- 渦サンプルRNA5秒間、および簡単な（5秒）遠心分離によって収集します。
- RT-qPCRのプレート（ 表2からテンプレートに従ってください）に試料RNAとGIとGII陽性対照の3μLを追加します。無テンプレート対照（NTC）をウェルにヌクレアーゼ-Freewaterのの3μLを追加します。
- 光学接着フィルム付きリアルタイムプレートをシール。
- 注意深くウェル中に存在し得る気泡又は液滴を除去するために1分間、1300×gでリアルタイムプレートを遠心。
- 10分間1）RTステップ：リアルタイムPCR装置とセットアップ以下の熱サイクル条件を設定します。 Taqポリメラーゼの45℃（2）活性化、10分間。 95℃、（3）95℃で15秒の45サイクル、および60℃で60秒で。
スワブ試料中のノロウイルスの7.定量
- RT-qPCRの結果（ 補足表3）を検証するために、正と負の対照の結果を確認します。
- 各標準曲線は満たしているかどうかを判断許容可能な値は、補足表2に与えられ、式1を使用して標準曲線の全体的な標準偏差を計算します。
（式1）％効率= 100×10（平均CT値-切片）/傾き 。 - PCRサーマルサイクラーソフトウェアは各標準曲線の傾きを計算していない場合は、（Excel など 、SPSS、またはSAS）統計ソフトウェアを使用して回帰により傾きとR 2の値を決定します。また、私は次式の標準曲線について％の効率を計算します
- 補足表4で指定された基準を満たす標準曲線に基づいて、すべてのテストサンプル用のサーマルサイクラーソフトウェアによって計算されたRNAコピー数を記録します。基準を満たすか、偽陽性コントロールを持っていない標準曲線tの帽子を持つ任意のサンプルを再実行します。大腸菌ファージMS2のCt値をチェックし、PCR阻害を監視するための内部対照として加えました。
- RNAコピーpの合計数を決定RT-qPCRの反応に使用されるRNA（3μL5）の総RNA溶出液の量（25〜50μL）の比で段階7.2で計算されたRNAコピー数を乗算することにより、ERのサンプル。代替的に、分析対象物の表面積（cm 2）を、総RNAのコピー数を割ることによってRNA濃度を算出します。
ヘミネストされた従来のPCR増幅によるリアルタイムRT-PCR陽性サンプルの8ジェノタイピング
- RT-PCRアッセイの各プライマーセットのためにマスターミックスの最初のラウンドを準備します（ 補足表2、および5）。
- マスターミックスの20μLにノロウイルス陽性のRNAの5μLを追加します。
- 以下の条件でRT-PCRを実行する：（1）RTが95℃で、Taqポリメラーゼの42℃（2）活性化、15分で30分間工程、及び（3）95℃で30秒の40サイクル、50℃で30秒、および72℃で60秒。 40サイクル後、72℃でさらに10分間インキュベートします。
- RT-PCRアッセイの各プライマーセット（ 補足表2および5）のための母校ミックスの第二ラウンドを準備します。
- 23μLマスターミックスを追加し、（理想的には、第一ラウンドの製品は、RNaseフリー水で1/10に希釈してください）を各チューブに（最初のラウンドから）2μL第一ラウンドのRT-PCRの製品を追加。
- 繰り返し手順8.3。
- 100ミリリットル1×トリス - 酢酸EDTA（40 mMトリス、20mMの酢酸、およびpH 8.3で1 mMのEDTA）中の2％アガロースゲルを準備します。 60〜70℃に冷却した後、混合物を調製したゲルの100ミリリットルあたりの核酸染色の10μLを追加し、電子レンジで混合物を加熱することにより、アガロース溶解した後、ゲルを注ぎ、コームを挿入します。ゲルは、少なくとも30分間沈降してみましょう。
- 6×ローディング色素の3μLで各RT-PCR産物の15μlのを混ぜます。負荷の各サンプル15μL、1時間、100Vでアガロースゲルを電気泳動します。
- ゲルANから適切なサイズの物品税の対象RT-PCR断片（GIとGIIのための341 bpのための330 bp）の商業ゲル抽出キットを用いてRNAを精製dは。精製したPCR産物は、現在サンガー配列決定のために使用することができます。
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Representative Results
図1は、スワブサンプリングプロトコルを示すフローチャートです。このプロトコルは、4つの主要なステップで構成されています。 1）サンプル収集、2）サンプルの保管および輸送、3）ウイルスRNA精製および濃縮し、4）RT-qPCRのアッセイおよび遺伝子型決定。
図1：ノロウイルスの環境表面サンプリングのための最終的なプロトコルのフロー・チャート この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1は、航海中に疑われるノロウイルス胃腸炎の症例を報告していたクルーズ船から収集した34スワブサンプルから得られた結果をまとめたものです。スワブサンプルを抽出し、TEました多重リアルタイムRT-qPCRによりノロウイルスのために二重にSTED。セブンティーン（18.5％）のサンプルは、ノロウイルスの症状を持つ乗客は船の上の共通領域から滞在し、9いたキャビン内表面から8サンプルを含む陽性反応を示しました。サンプルあたりゲノムコピー数がノロウイルスGII.7 RNA転写物の標準曲線を用いて（16から31の範囲であった）のCt値から計算しました。共用エリア（範囲：1.2から2.1ログ10ゲノムコピー）からのゲノムコピーよりも有意に高かった- ：（4.5 log 10のRNAコピー2.4の範囲）、（キャビン内スワブサンプルからゲノムコピー数の中央値は3.6 log 10でしたP <0.001）。 17正のスワブサンプルのうち4つ（23.5％）が遺伝子型を決定することができた、とすべてのサンプルは、同一のGII.1配列を有しました。
| 場所の環境スワップを収集しました | | 平均Ct値（試験したサンプルの総数の正＃） | 遺伝子型 | サンプリングされた領域CあたりのノロウイルスRNAコピー数 | |
| アトリウム | 手すり | 34.3（1/2） | GII | 16 |
| キャビンA | 便座 | 31.4（2/2） | GII。 B | 31217 |
| キャビンA | 蛇口 | 37.5（1/2） | GII | 491 |
| キャビンA | ドアハンドル | 35.0（2/2） | GII | 2675 |
| キャビンA | リモコン | 38.6（2/2） | GII.1 B | 233 |
| キャビンB | 便座 | 33.5（2/2） | GII.1 B | 986 | アイスクリームマシン | 34.2（2/2） | GII | 16 |
| 保養地 | テーブルの調味料 | 35.2（1/2） | GII | 15 |
| 保養地 | テーブルトップ | 35.3（1/2） | GII | 14 |
| ピザ屋 | カウンター表面 | 35.7（1/2） | GII | 14 |
| メインギャレー | 楽しい時間のマシン | 37.1（1/2） | GII | 64 |
| 自動販売機 | 触れる表面 | 38.8（1/2） | GII | 18 |
| クルーラウンジ | キーボードの表面とマウス | 36.8（1/2） | GII | 80 |
| キャビンC | 蛇口やドアハンドル | 31.6（2/2） | GII.1 B | 26458 |
| キャビンC | 電話 | 36.4（2/2） | GII | 1035 |
| キャビンC | キーボード | 33.0（2/2） | GII | 1317 |
| 医療センター | クリップボード | 36.0（2/2） | GII | 113 |
| キャビンAは、BとCは、ウイルスgastoenteristisの症状を臨床的に病気になっていた個人によって占有されています。 | ||||
| B 17 GII陽性スワブサンプルのうち4つは遺伝子型を決定することができました。 | ||||
| Cの RNAコピーは、ノロウイルスGII.7 RNA転写物の標準曲線に基づいてcaluatedました。 | ||||
| 注意：日付の上にわずかに元の記事6から変更されました。 | ||||
表1：航海中に疑われるノロウイルス胃腸炎の症例を報告していたクルーズ船から収集した34スワブサンプルからの結果。
図2は、RT-qPCRをこれらのサンプルを配列決定する能力によって決定Ct値の関係を示しています。合計では、217スワブサンプルのうち127は、RT-qPCRによりGIIのノロウイルス検査で陽性。サンプルは、Ct値の広い範囲（12-40）の表示しました。合計では、RT-qPCRの陽性サンプルの29（22.8％）が遺伝子型を決定することができました。 Ct値27以下と28から31の間の範囲でスワブ試料をそれぞれ100％と72.2パーセントの割合で遺伝子型決定しました。対照的に、唯一の22.0％および32〜36及び37〜40のCt値を持つスワブサンプルの1.6％が、それぞれ、正常配列決定することができる半ネストされたアンプリコンを生成しました。
図2：確認されたノロウイルスのアウトブレイクの間に収集されたスワブサンプルのRT-qPCRのスクリーニングおよび配列決定の結果。白いバーは、RT-qPCRを正のスワブサンプルウイルスの数を表します。これらのRT-qPCRの陽性試料中のヒトノロウイルス核酸は、半ネステッドPCRアッセイを用いて増幅された後、遺伝子型判定の確認のために配列決定しました。黒いバーと行番号を表し、遺伝子型の割合は、それぞれ、スワブサンプルを確認しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| CT値範囲 | RT-qPCRの陽性サンプルの数 | 配列の数（％）は、サンプルAを確認しました |
| 20-23 | 4 | 3（75） |
| 24-27 | 3 | 3（100） |
| 28-31 | 18 | 13（72.2） |
| 32-36 | 41 | 9（22.0） |
| 37-40 | 61 | 1（1.6） |
| a）は、半ネステッドPCRに | ||
表2：RT-qPCRのとスワブサンプルのジェノタイピング結果。
| サンプル番号 | ロケーション | 面の説明 | 表面積（cm 2）を | サンプル収集の日付/時間 | クリーン（Y / N） | 洗浄した場合、どのような消毒剤を使用しました<？/強いです> | 詳細な表面材料の説明および場所 |
| 1 | 部屋＃7から1302まで | 便座 | 700センチメートル2 | 2016年6月26日;午前9:00 | いいえ | 適用できません | 便座[上面）、およびハードplastoc |
| 2 | 部屋＃7から1330 | 電話ハンドル | 500センチメートル2 | 2016年6月26日; 9:25 | はい | 千ppmの漂白剤 | 硬質プラスチック、ゴムボタン |
補足表1：サンプル記述形式の例。
| genogroup /ウイルス | 名前オリゴヌクレオチドプライマー/プローブ | 配列5→3＆＃900; | 参照 |
| GI | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA | 17 |
| Cog1R | CTT AGA CGC CATのCATのCAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC A | 17 | |
| Ring1Eプローブ | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ A | この研究 | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| RING2プライマー | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <TD> 17||
| RING2プローブ | Cy5のかQUASAR 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - BHQ2 bの | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG TAT TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| MS2Pプローブ | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG TGC CTA CAAGC - BHQ1 cを | 18 | |
| GI TaqManプローブは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）で5 '標識し、MGBNFQ（マイナーグルーブ結合部位）と3'標識されています | |||
| B GII TaqManプローブはCy5のかクエーサー670で5'-標識し、ブラックホールクエンチャーで3'-標識されています。ブラックホールクエンチャー（BHQ）在庫状況により使用2、BHQ 3が好ましいです。 | |||
| C MS2 TaqManプローブは5Rであります17; HEXで標識し、BHQ1で5 '標識 | |||
補足表2：オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ情報。
| 成分 | 反応あたり容量（μL） | 最終濃度 |
| 2X RT-PCRバッファー* | 12.5 | 1倍 |
| ヌクレアーゼフリー水* | 1.08 | N / A |
| 検出エンハンサー* | 1.67 | N / A |
| コグ1F（10μM） | 1 | 400 nMの |
| コグ1R（10μM） | 1 | 400 nMの |
| リング1E-プローブ（10μM） | 0.5 | 200 nMの | 1 | 400 nMの |
| コグ2R（10μM） | 1 | 400 nMの |
| リング2プローブ（10μM） | 0.5 | 200 nMの |
| MS2F（10μM） | 0.25 | 100 nMの |
| MS2R（10μM） | 0.25 | 100 nMの |
| MS2Pプローブ（10μM） | 0.25 | 100 nMの |
| 2X RT-PCR酵素* | 1 | 1倍 |
| マスターミックスのボリューム | 22 | |
| *リアルタイムRT-PCRキットに含ま | ||
補足表3：多重リアルタイムGI / GII / MS2ノロウイルスRT-PCR用マスターミックス
| コントロールのタイプ | 結果の解釈 | ||
| サンプル | 負の制御 | 負でなければなりません | |
| 陽性対照 | 正でなければなりません | ||
| 陰性試料 | 各Ct値はGI / GIIため検出不可能である場合、試料は陰性であります | ||
| 陽性試料 | 両方の複製のCt値（GI / GII）は<38です。これは、（任意に）カットオフは、各リアルタイムPCRプラットフォームとキットを実験的に決定される必要があります | ||
| 仮の陽性試料 | サンプルは1複製のCt値（GI / GII）である場合、暫定的に正である<38 | ||
| 内部プロセス制御（MS2） | ≥32Fの閾値サイクル（Ct）値を有するサンプルまたはMS2は、希釈せずに再テストされるべきであり、1月10日には、希釈しました。 | ||
| パラメーター | 許容値 | ||
| ノロウイルスRNA転写物を使用して、標準曲線 | R 2 | > 0.97 | |
| 効率 | 115％の90％ | ||
補足表4：環境スワブサンプル中のノロウイルスの検出のための各RT-qPCRのテストに含める制御します。
| 成分 | 最終濃度 | 容量/ RXN（μL） |
| 5X RT-PCRバッファー | 1倍 | 5.00 |
| dNTPミックス（10mMの） 0.4 mMの | 1.00 | |
| 酵素ミックス（RTおよびTaq） | 1.00 | |
| フォワードプライマーA | 0.5μM | 0.50 |
| リバースプライマーA | 0.5μM | 0.50 |
| RNaseインヒビター（20 U /μl）を | 20 U | 1.00 |
| RNaseフリー水 | 11.00 | |
| 全容積 | 20.00 | |
| 前方とGIとGIIグループのためのプライマーセットをリバースそれぞれ、Cog1F + G1SKRであり、Cog2F + G2SKR。 | ||
| 第二ラウンドRT-PCR | ||
| 成分 | 最終濃度 | 容量/ RXN（μL） |
| 5×RT-PCR緩衝液< / TD> | 1倍 | 5.00 |
| dNTPミックス（10mMの） | 0.4 mMの | 1.00 |
| 酵素ミックス（RTおよびTaq） | 1.00 | |
| フォワードプライマーB | 0.5μM | 0.50 |
| リバースプライマーB | 0.5μM | 0.50 |
| RNaseインヒビター（20 U /μl）を | 20 U | 1.00 |
| RNaseフリー水 | 14.00 | |
| 全容積 | 23.0 | |
| BフォワードおよびGIとGIIグループのためのプライマーセットをリバースそれぞれ、G1SKF + G1SKRであり、RING2プライマー+ G2SKR。 | ||
| 注：informaionの上にわずかに元の記事19から変更されました | ||
| フェーズI | フィールドサンプリング | 1.チェックマクロフォームスワブキット（ 例えば 、有効期限、チューブの漏洩、およびスワブ湿り） |
| 2.綿棒表面（≤100インチ2（645センチメートル2）に制限表面積） | ||
| 3.輸送チューブにスワブ、及び輸送中に漏れる防ぐためにしっかりとキャップを締め | ||
| ジップロック袋で4.綿棒キット | ||
| フェーズII | サンプルの輸送および保管 | 1.サンプリングスワブを-70℃保存されている（または-20℃）する必要があります |
| 2.輸送用綿棒収集スワブの48時間内の断熱容器と船で0-4°C（コールドパック）での研究室へのサンプル | ||
| 第III相 | RNAのetraction | 1.チェック溶解緩衝液（ 例えば 、有効期限データ） |
| 2. 100％エタノールを添加する前に溶解バッファに内部対照としてMS2を追加 | ||
| RNAの精製および濃縮 | 3.クリーン実験台及びRNAのRNase除去液を用いた小型機器 | |
| RNA交差汚染を回避するための手順の間に頻繁4.変更手袋 | ||
| フェーズIV | RT-PCRアッセイ（QA / QC） | 1.各PCR実行のCt値の変動を制御するために、各RT-qPCRのアッセイのための定量化ノロウイルス転写産物のRNA（GIとGII）を含めます |
| 2。PCR阻害剤の存在を監視するためにMS2信号の不在を使用 |
補足表6：CDCの環境サンプリング手順のチェックリスト。
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Discussion
ノロウイルスは18と10 3ウイルス粒子20との間に50％のヒト感染用量を持っています。したがって、表面のも低レベルの汚染は、公衆衛生上のリスクをもたらすことができます。 1）異なるスワブ材料、2）貯蔵条件スワブ輸送の間、3）ウイルスRNAの濃度、及び4）大腸菌ファージMS2内部抽出コントロールとして：スワブサンプリングプロトコルのいくつかの側面を含めて評価しました。
最近まで、綿、ポリエステル、ナイロンなど）ワイプ帯電防止から作られたスワブの唯一の性能が評価されたフィールドの使用13、14、15、21、22のために提案されています。これらのうち、綿棒は、ノロウイルスおよび肝炎食品調理面と媒介物23からのウイルスを検出するためのISO 15216プロトコルによって推奨されています。どうやってこれまで、頻繁にノロウイルス24、25の伝達に関与しているようなドアノブ、コンピュータ、およびトイレの便座などの大ハイタッチ表面とフィールド条件の下で綿棒のテストのパフォーマンス上の限られたデータがあります。さらに、これらの環境表面の大きさは、ファイバ先端に付いた綿棒の容量を超えています。私たちの研究では、700センチメートル2までの領域で環境表面をサンプリングする際、繊維先端綿棒よりも大きな綿棒ヘッドを持つマクロフォームスワブは、人間のノロウイルスのためのより高い回収率を有することが実証されました。
溶液中のノロウイルスは、周囲温度では比較的不安定であり、少なくとも冷蔵を必要とします。そのため、研究室への出荷は、スワブの採取後48時間以内に0-4°Cで発生します。典型的には、PCR反応において試験することができるサンプルの量は、量よりもはるかに小さいです集中することなく、大幅に陽性率を減少させ、綿棒（5-10 mLの対3-5μL）からの溶出後のサンプル。環境ウイルス学では、ポリエチレングリコール（PEG）は、環境水の大量のウイルスを濃縮するために首尾よく使用されています。しかし、ボリューム最大10 mLを容易に抽出しμL250という低いボリュームにミディスピンカラムを用いて濃縮し、さらにスピンカラムを用いて、高回収率で10倍に濃縮することができます。
RT-qPCRの感受性検出およびノロウイルスの定量化のためのゴールドスタンダードであるが、これらのアッセイの感度を容易にスワブサンプルから共抽出されたPCR阻害剤の存在によって影響され得ます。したがって、このような大腸菌ファージMS2ウイルス粒子として抽出制御の包含は、ノロウイルスと同様にMS2の両方を検出するマルチプレックスPCRフォーマットで、PCR阻害の有無を監視し、異なる実験間のばらつきを評価するのに役立ちます。</ P>
実験室の検証メソッドのテスト変数は、試験方法の識別力を決定するために重要であり、さらに方法の可能性が高いフィールドサンプリング性能に変換されます。アカウントに（ 例えば 、遅延サンプリング、最大700 cm 2のより大きな表面積）現実世界のフィールド条件をとると、ノロウイルスの検出限界は3.4ログ10（ステンレス鋼）であったと面当り4ログ10（便座）コピーノロウイルスは、サンプリングされました6。その結果、負の綿棒結果にはウイルス汚染が発生していないことを決定的なものではありません。ノロウイルス疾患の臨床的および疫学的情報は常に環境調査結果2、6切り札 。
クルーズ船からの我々のデータは、電話、コンピュータのキーボード、およびドアハンドルなどのハイタッチ面はキャビン人にノロウイルス検査で陽性ことが示されましたで報告されたウイルス性胃腸炎が滞在していました。これらの表面は、便器洗浄または嘔吐エピソード6、7、8、9、10の間に生成される液滴を介して間接的に直接接触を介して汚染されたかのいずれかとなりました。
結論として、この新たに開発されたスワブプロトコルを使用して環境面でノロウイルスの検出は、臨床サンプルが利用可能であり、洗浄の実践の有効性を監視していないとき、ウイルスを検出し、流行時に環境汚染のレベルを決定するのを助けることができます。繊維は、綿棒（綿及びレーヨン）ベースの表面サンプリング方法が広く、他の腸内ウイルス（ 例えばロタウイルス、およびアデノウイルス）を調査するために使用されている27、28、29をひっくり返し。以上を考慮すると綿棒6傾け、それらの繊維の上にマクロフォームスワブのノロウイルスのための回収効率、我々は、マクロフォームスワブは、他の腸内のウイルスを検出することができますことを期待。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
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