Abstract
Человеческие Noroviruses являются ведущей причиной эпидемии и спорадической гастроэнтерита во всем мире. Поскольку большинство инфекций либо передаваться непосредственно по маршруту от человека к человеку или косвенно через экологические поверхностей или продуктов питания, загрязненных фомиты и неживые поверхности являются важными инструментами для распространения вируса во время вспышек норовируса.
Мы разработали и оценили протокол с использованием макропена мазки для обнаружения и типирования человека норовирусами с твердых поверхностей. По сравнению с волокном тампоны или антистатическими салфетками, макропена тампоны позволяют восстановление вируса (диапазон 1.2-33.6%) от поверхностей сиденье для унитаза до 700 см 2. Протокол включает в себя шаги для извлечения вируса из смывов и дальнейшей концентрации вирусной РНК с использованием спиновых столбцов. В общей сложности 127 (58,5%) из 217 образцов мазков, которые были собраны с поверхности в круизных судах и учреждениях длительного ухода, где были норовирус гастроэнтеритсообщили положительный результат на GII норовируса по RT-КПЦР. Из них 29 (22,8%), может быть с успехом проведено генотипирование. В заключение, обнаружение норовируса по экологическим поверхностей с использованием протокола было разработано может помочь в определении уровня загрязнения окружающей среды во время вспышек, а также обнаружения вируса, когда клинические образцы не доступен; она может также способствовать мониторинг эффективности стратегий реабилитации.
Introduction
Человеческие Noroviruses являются ведущей причиной эпидемии и спорадической острого гастроэнтерита во всем мире 1, 2, 3. Вирус чрезвычайно заразен и передача происходит путем прямого человека к человеку взаимодействия или косвенно через контакт с зараженной пищей, водой или экологических поверхностей. Норовирусы может быть пролита в течение длительных периодов времени и длительное выживание вируса на экологических поверхностях было зарегистрировано 1, 2, 3. В пик линьки миллиарды вирусных частиц освобождаются на грамм фекалий, а также рвотные массы содержит достаточное количество вирусных частиц , чтобы вызвать инфекцию 4, 5, 6, 7, 8,эф "> 9, 10. Кроме того, передача вируса между неодушевленных поверхностей и кожи человека может произойти легко 2, 11, 12. Таким образом, мониторинг загрязнения окружающей среды может помочь в расследовании вспышек эпидемий и при оценке эффективности очистки и процедуры дезинфекции.
Несколько протоколов отбора проб окружающей среды были описаны для обнаружения ротавирусов, колифага МС2, калицивироз (FCV), и бактериофаг Р22 13, 14, 15, 16. Тем не менее, условия проверки , описанные в этих исследованиях, в том числе быстрого иссушения (<1 час) и небольших участков поверхности (25 х 100 см 2), не может адекватно представлять настройки полей. Кроме того, ожидается, низкие уровень загрязнения ENVIROnmental поверхности требуют протоколы, которые способны обнаружить очень мало вирусных частиц.
Мы разработали макропена на основе метода дискретизации поверхности для обнаружения и типирования норовирус. Этот метод был утвержден в течение нескольких норовируса вспышек. Протокол включает в себя 1), как собирать образцы мазков из окружающей среды поверхностей (2), как наилучшим образом сохранить целостность образцов во время сбора и доставки в лабораторию, и 3) лабораторные испытания и типирование норовирус.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Тампон Отбор проб в поле
- Носите чистую пару перчаток.
- Измерьте размер области выборки, не касаясь поверхности с помощью измерительной ленты или линейки. Попробуйте оценить область как можно более точно и заполнить форму отчета (Дополнительная таблица 1).
- Проверьте комплект тампон на предмет возможных утечек и транспортных мешков образцов этикеток и мазков комплектов.
- Переместить тампон через область отбора проб следующим образом: один удар в горизонтальном направлении, один удар в вертикальном направлении, и один удар в диагональном направлении. Не тампоном площадь поверхности больше , чем 700 см 2.
- Поместите каждый тампон в пробирку и плотно закройте крышку.
2. Хранение и транспортировка мазков в лаборатории
- Держите тампоны при 4 ° С в течение до 48 часов. Если требуется хранение в течение более длительных периодов, хранить тампоны при -20 ° С (или -70 ° С).
- Храните пробирки при температуре 0-4 ° С (т.е., , Используйте холодные компрессы) в изолированном контейнере во время транспортировки в лабораторию и корабля в течение 24-48 ч сбора.
3. Вирус Концентрация РНК вируса экстракции и очистки
Примечание: Все стадии центрифугирования используют настольную центрифугу при 5000 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, если не указано иное. Будьте особенно осторожны при работе с универсальным экстракция нуклеиновой кислоты (UNEX) буфера. Надеть очки или маску.
- Этикетка один 15 мл трубки и один столбец РНК Midi для каждого образца. Включите отрицательного контроля экстракции в каждом эксперименте.
- Для приготовления раствора лизис в течение 10 тампонов, смешайте 25 мл буфера UNEX 25 мл PBST (PBS, рН 7,2, содержащем 0,02% твина-80).
- Добавьте 50 мкл колифага MS2 суспензии (10 6 БОЕ / мкл) в 50 мл раствора лизиса.
- Поместите тампон в 15 мл пробирку и добавляют 5 мл раствора лизиса. Смешать и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавить 5 мл 100% этанола в каждую пробирку и вихря в течение 10 с.
- Осторожно удалите тампон из 15 мл трубки (она содержит UNEX буфер) нажав его осторожно по отношению к стороне трубки, чтобы удалить лишнюю жидкость, а затем выбросить тампон. Остальные объемы должны быть в пределах 9-10 мл.
4. Midi Колонка вирусной нуклеиновой кислоты экстракции
- Тщательно передачи 4,5 мл смеси UNEX / этанол из стадии 3.6 на миди колонку, центрифугу и отбросьте фильтрат.
- Загрузите еще 4,5 мл из той же смеси на ту же колонку, центрифугу, и отбросьте фильтрат.
- Для первой промывки, добавляют 3,5 мл 70% -ного этанола на Midi колонке, центрифугу и отбросьте фильтрат.
- Для второй промывки, добавляют еще 3,5 мл 70% -ного этанола на колонку Midi. Центрифуга и отбросьте фильтрат.
- Для сухого спина, центрифугировать столбцы Midi, чтобы удалить все следы этанола (что может негативно повлиять на восстановление вирусной РНК).
- Поместите колонку Midi в новой 15 мл центрифужную пробирку. Добавьте 250 мкл буфера для элюции на колонку Midi; ждать в течение 1 мин перед тем центрифугирование, чтобы получить самую высокую вирусную РНК восстановления.
- Хранить извлеченную нуклеиновую кислоту, при температуре -70 ° С или немедленно перейти к шагу 5.
5. Концентрация вирусной нуклеиновой кислоты с использованием РНК Clean и обогатительной наборы
- Добавить 500 мкл буфера для связывания РНК в 250 мкл РНК элюировали в стадии 4.7 выше и вихре в течение 10 с.
- Добавить 750 мкл 100% -ного этилового спирта и перемешивают механически в течение 10 с.
- Добавьте столбец спина для каждого образца. Загрузите образец 750 мкл на ротационную колонку.
- Центрифуга спин колонки при 12000 мкг в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
- Загрузите оставшиеся 750 мкл на ротационную колонку и центрифуге при 12000 мкг в течение 1 мин.
- Для предварительной стирки, добавьте 400 мкл РНК Prep буфера в каждую ротационную колонку и центрифуге при 12000 мкг в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
- Для первой промывки, добавляют 800 мкл РНК промывочного буфера в каждую ротационную колонку и центрифугировать при 12000 х г в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
- Для второй промывки, добавьте 400 мкл РНК промывочного буфера в ротационную колонку и центрифугу при 12000 мкг в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
- Для сухого спина, центрифугировать столбец спина, чтобы удалить все следы промывочного буфера при 12000 мкг в течение 2 мин.
- Аккуратно перенести спиновую колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Добавьте 25 мкл буфера для элюции на ротационную колонку и инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Это увеличит восстановление вирусной РНК из колонки.
- Накопление РНК путем центрифугирования колонки спина при 10000 мкг в течение 1 мин.
- Либо перейти непосредственно к RT-кПЦР (стадия 6), или магазин РНК при -70 ° С.
6. Мультиплех RT-КПЦР Обнаружение геногруппа I и II Норовирусы и колифага MS 2 (Дополнительный таблица 2)
- Чистые рабочие поверхности, pipettэс, и центрифуг с обеззараживающим раствором РНКазы для уменьшения возможного загрязнения.
- Оттепель RT-КПЦР реагенты на льду. Оттепель РНК на льду (в отдельной области / комнате).
- Определить количество реакций и добавить по крайней мере , на 10% больше из них (например , если требуется 10 реакций, сделать мастер смеси для 11).
- Вихревые компоненты индивидуальные мастер-микс, для 25х RT-КПЦР фермента, в течение 5 с исключением. Тщательно перемешать фермент слегка ударяя по пробирке с пальцем.
- Кратко компонентов смеси центрифуг мастер в течение 5 с.
- Подготовка мастер смеси для реального времени RT-PCR обнаружения норовирусной GI и GII согласно инструкции к набору и добавления Норовирусная-специфических олигонуклеотидных праймеров и зондов в 1,5 мл микроцентрифужных трубки (Дополнительный таблица 3).
- Смешайте мастер смеси с помощью пипетки в 5-10 раз вверх и вниз (вортексе не рекомендуется). Аликвоты 22 мкл мастер смеси в каждую лунку ПЦР в реальном времени 96-луночного планшета.
- Vortex РНК образцав течение 5 сек, и собирать кратковременным (5 с) центрифугированием.
- Добавьте 3 мкл образца РНК и GI и GII положительного контроля к пластине RT-КПЦР (следовать шаблон из таблицы 2). Добавить 3 мкл нуклеазы-Freewater в не-шаблон контроля (NTC) скважин.
- Печать в режиме реального времени пластина с оптической клейкой пленкой.
- Тщательно центрифугировать в режиме реального времени пластины при 1300 х г в течение 1 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха или капли жидкости, которые могут присутствовать в лунках.
- Настройка ПЦР в реальном времени инструмента и настройки следующие термоциклирования условия: 1) RT шаг в течение 10 мин. при 45 ° C (2) активация Taq-полимеразы, 10 мин. при температуре 95 ° С и (3) 45 циклов по 15 с при 95 ° С и 60 с при 60 ° С.
7. Количественное норовирус в тампон Образцы
- Проверьте результаты положительного и отрицательного контроля для проверки результатов RT-КПЦР (Дополнительный таблица 3).
- Определите, соответствует ли каждый стандарт КриваяДопустимые значения приведены в таблице 2 Дополнительной и рассчитать общее стандартное отклонение для стандартной кривой , используя уравнение 1.
(Уравнение 1)% КПД = 100 х 10 ( в среднем Ct Значения-Intercept) / Slope. - Если Термоциклер программное обеспечение ПЦР не вычисляет наклон для каждой стандартной кривой, определяют наклон и R 2 значения с помощью регрессии с помощью статистического программного обеспечения (например , Excel, SPSS, или SAS). Кроме того, рассчитать КПД% для стандартных кривых следующим уравнением I
- Запишите номер РНК копий , рассчитанное с помощью программного обеспечения термоциклера для всех испытательных образцов , основанных на стандартных кривых , которые соответствуют критериям , указанным в дополнительном таблице 4. Перезапустите любые образцы со стандартными кривыми тствия не отвечают критериям или имеют ложноположительные управления. Проверьте значения Ct из колифага MS2, который был добавлен в качестве внутреннего контроля для контроля ингибирования ПЦР.
- Определить общее количество копий РНК робразец эр умножающими количества РНК копий, вычисленное на этапе 7.2 отношением объема (от 25 до 50 мкл) Общую РНК в качестве элюента до, что РНК (от 3 до 5 мкл), используемого для реакции RT-КПЦР. В качестве альтернативы, рассчитать плотность РНК путем деления общего количества РНК копий на площадь поверхности объекта (см 2) анализируемый.
8. генотипирование в режиме реального времени RT-PCR положительных образцов с помощью Hemi вложенную обычных ПЦР-амплификации
- Приготовьте первый раунд мастер - смеси для каждого праймера набор анализа RT-PCR (дополнительные таблицы 2 и 5).
- Добавьте 5 мкл норовирусной положительной РНК 20 мкл основной смеси.
- Запуск RT-PCR при следующих условиях: (1) RT шагом в течение 30 мин при 42 ° C (2) активация Taq-полимеразы, 15 мин при 95 ° С, и (3) 40 циклов 30 с при 95 ° C , 30 сек при 50 ° С и 60 с при 72 ° С. После 40 циклов, инкубировать еще в течение 10 мин при 72 ° С.
- Подготовьте второй раунд матер смеси для каждого праймера набор анализа RT-PCR (дополнительные таблицы 2 и 5).
- Добавьте 23 мкл основной смеси и добавьте 2 мкл первого раунда продуктов RT-PCR (от первого раунда) в каждую пробирку (в идеале первый круглый продукт должен быть разбавлен 1/10 в РНКазы свободной воды).
- Повторите шаг 8.3.
- Готовят гель 2% -ном агарозном в 100 мл 1x Трис-ацетат ЭДТА (40 мМ Трис, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА при рН 8,3). После растворения агарозы путем нагревания смеси в микроволновой печи, добавить 10 мкл красителя нуклеиновой кислоты на 100 мл приготовленного гель после охлаждения смеси до 60-70 ° С, влить гель и вставьте гребни. Пусть гель оседать в течение не менее 30 мин.
- Смешайте по 15 мкл каждого продукта RT-PCR с 3 мкл 6х красителем. Нагрузка 15 мкл каждого образца и electrophorese агарозном геле при 100 В в течение 1 ч.
- Акцизный мишень ОТ-ПЦР фрагменты соответствующего размера (330 пар оснований для GI и 341 пар оснований для GII) из геля А.Н.d очищают РНК с использованием набора для экстракции из геля коммерчески. Очищенный продукт ПЦР теперь может быть использован для Sanger секвенирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана блок - схема протокола отбора проб тампоном. Этот протокол состоит из четырех основных этапов; 1) сбор образцов, 2) хранения и транспортировки пробы, 3) вирусной РНК очистки и концентрирования и 4) RT-КПЦР анализ и генотипирование.
Рисунок 1: Блок - схема итогового протокола для отбора проб окружающей среды поверхности норовируса Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В таблице 1 приведены результаты из 34 мазков , которые были собраны с круизного судна , которые сообщили о случаях подозреваемого норовирусной гастроэнтерита во время плавания. Образцы мазков были извлечены и теSTED в двух экземплярах для норовируса по мультиплекс в режиме реального времени RT-КПЦР. Семнадцать (18,5%) образцов дали положительный результат в том числе 8 проб с поверхностей в кабинах, где остались пассажиры с симптомами норовируса и 9 из помещений общего пользования на корабле. Число геномных копий на выборку были рассчитаны из значений Ct (которые варьировались от 16 до 31) с использованием стандартной кривой с норовирусной GII.7 РНК-транскрипта. Среднее число геномных копий из образцов мазков в каютах составила 3,6 log 10 (диапазон: 2,4 - 4,5 log 10 копий РНК), который был значительно выше , чем копии генома от помещений общего пользования (диапазон: 1,2 - 2,1 log 10 геномных копий) ( P <0,001). Четыре (23,5%) из 17 положительных мазков, были в состоянии быть проведено генотипирование, и все образцы имели одинаковые GII.1 последовательности.
| Место экологического подкачки собрано | | Среднее значение Ct (# положительное от общего количества испытанных образцов) | Генотип | Норовирусная РНК число копий за отобранного область С | |
| Атриум | Поручни | 34,3 (1/2) | GII | 16 |
| каюту | Сиденье для унитаза | 31,4 (2/2) | GII. б | 31217 |
| каюту | кран | 37.5 (1/2) | GII | 491 |
| каюту | Дверная ручка | 35,0 (2/2) | GII | 2675 |
| каюту | Дистанционное управление | 38,6 (2/2) | GII.1 б | 233 |
| Кабина B | Сиденье для унитаза | 33,5 (2/2) | GII.1 б | 986 | Мороженое машины | 34,2 (2/2) | GII | 16 |
| открытый плавательный бассейн | Таблица Приправы | 35,2 (1/2) | GII | 15 |
| открытый плавательный бассейн | Стол | 35,3 (1/2) | GII | 14 |
| Пиццерия | поверхность Счетчик | 35,7 (1/2) | GII | 14 |
| Главный камбуз | Fun времени машины | 37,1 (1/2) | GII | 64 |
| Торговый автомат | Touchable Поверхности | 38,8 (1/2) | GII | 18 |
| Экипаж салон | Клавиатура и мышь Поверхность | 36,8 (1/2) | GII | 80 |
| Кабина C | Кран и ручка двери | 31,6 (2/2) | GII.1 б | 26458 |
| Кабина C | телефон | 36,4 (2/2) | GII | 1035 |
| Кабина C | клавиатура | 33,0 (2/2) | GII | 1317 |
| Медицинский центр | буфер обмена | 36,0 (2/2) | GII | 113 |
| Каюта А, В и С были заняты людьми , которые были клинически больным с симптомами вирусных gastoenteristis. | ||||
| б Четыре из 17 GII-положительных образцов мазков может быть проведено генотипирование. | ||||
| копии с РНК caluated на основе стандартной кривой норовирус GII.7 РНК - транскриптов. | ||||
| Примечание: выше даты были немного изменены из оригинальной статьи 6. | ||||
Таблица 1: Результаты 34 мазков , которые были собраны с круизного судна , которые сообщили о случаях подозреваемого норовирусной гастроэнтерита во время плавания.
На рисунке 2 показано соотношение значений Ct , определяемых с помощью ОТ-кПЦР и возможность секвенирования этих образцов. В общей сложности 127 из 217 мазков дали положительный результат на GII норовируса по RT-КПЦР. Образцы отображается широкий диапазон (12-40) значений Ct. В общей сложности, 29 (22,8%) из RT-КПЦР положительных образцов может быть проведено генотипирование. Образцы мазков со значениями Ct ниже 27 и в диапазоне от 28-31 генотипирования по ставкам в размере 100% и 72,2%, соответственно. В противоположность этому, только 22,0% и 1,6% проб мазков со значениями Ct от 32-36 и 37-40, соответственно, добытых в геми-вложенная ампликонов, которые могут быть успешно секвенировали.
Рисунок 2: Результаты скрининга и секвенирование образцов мазков , которые были собраны в ходе подтвержденных вспышек норовируса RT-КПЦР. Белые столбики представляют число RT-КПЦР образцов вируса положительный мазок. Человеческие Норовирус нуклеиновых кислот в этих RT-КПЦР положительных образцов амплифицировали с использованием Hemi-вложенным ПЦР и затем секвенировали для подтверждения генотипа. Черные полосы и линии представляют число и процент генотипа подтвердили образцы мазков, соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Диапазон Ct значение | Количество RT-КПЦР положительных образцов | Количество (%) из последовательностей подтвердил образцов А |
| 20-23 | 4 | 3 (75) |
| 24-27 | 3 | 3 (100) |
| 28-31 | 18 | 13 (72,2) |
| 32-36 | 41 | 9 (22,0) |
| 37-40 | 61 | 1 (1,6) |
| а) геми гнездовой ПЦР | ||
Таблица 2: RT-КПЦР и результаты генотипирования образцов мазков.
| Номер пробы | МЕСТО НАХОЖДЕНИЯ | Описание поверхности | Площадь поверхности (см 2) | Дата / время сбора проб | Чистый (Y / N) | Если очистить то , что дезинфицирующее использовали? </ Сильный> | Подробное описание материала поверхности и местоположение |
| 1 | Номер # 7-1302 | Сиденье для унитаза | 700 см 2 | 6/26/2016; 9:00 утра | Нет | непригодный | Сиденье для унитаза [верхние поверхности), и жесткий plastoc |
| 2 | Номер # 7-1330 | Телефон ручка | 500 см 2 | 6/26/2016; 9:25 утра | да | 1000 частей на миллион отбеливатель | Жесткий пластик, кнопки резиновые |
Дополнительный Таблица 1: Пример описания образца формы.
| геногруппа / вирус | Имя олигонуклеотидный праймер / зонд | Последовательность 5 → 3 & #900; | Справка |
| солдат | Cog1F | CGY TGG ATG CGI TTY CAT Г.А. | 17 |
| Cog1R | СТТ AGA CGC CAT CAT CAT TYA C | 17 | |
| G1SKF | CTG GAA CCC TTY GTA AAT Г.А. | 17 | |
| G1SKR | CCA ACC CAR CCA TTR TAC | 17 | |
| Ring1E-зонд | FAM - TGG ACA GGR GAY CGC - MGBNFQ | Эта учеба | |
| GII | Cog2F | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG А.Г. | 17 |
| Cog2R | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA | 17 | |
| Ring2-праймер | TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT | 17 | |
| G2SKR | CCR CCN GCA TRH CCR TTR TAC AT | <TD> 17||
| Ring2-зонд | Cy5 или КВАЗАР 670 - TGG GAG GGC GAT CGC AAT КТ - BHQ2 б | 17 | |
| MS2 | MS2F | TGG CAC TAC CCC TCT CCG ТАТ TCA CG | 18 |
| MS2R | GTA CGG GCG ACC CCA CGA TGA C | 18 | |
| MS2P-зонд | HEX - CAC ATC GAT AGA TCA AGG ТГК CTA CAAGC - BHQ1 гр | 18 | |
| зонд GI TaqMan является 5'-меченные с 6-карбоксифлуоресцеина (FAM) и 3'-метили MGBNFQ (Minor-паз связывающим участком) | |||
| б GII зонд TaqMan 5'-меченные с Cy5 или Quasar 670 и 3'-меченных с Black Hole гасителя; Черная дыра утоления (BHQ) 2 используется в связи с наличием, BHQ 3 является предпочтительным. | |||
| с MS2 TaqMan зонд 5R17, меченных с HEX и 5'-меченные с BHQ1 | |||
Дополнительный Таблица 2: Олигонуклеотидные праймеры и зонды информация.
| Компонент | Объем на реакцию (мкл) | Конечная концентрация |
| 2x ОТ-ПЦР-буфера * | 12,5 | 1x |
| Нуклеазы без воды * | 1,08 | н / |
| Обнаружение Enhancer * | 1,67 | н / |
| Зубчатая 1F (10 мкМ) | 1 | 400 нМ |
| Cog 1Р (10 мкМ) | 1 | 400 нМ |
| Кольцо 1E-зонд (10 мкМ) | 0,5 | 200 нМ | 1 | 400 нМ |
| Cog 2R (10 мкМ) | 1 | 400 нМ |
| Кольцо 2-зонд (10 мкМ) | 0,5 | 200 нМ |
| MS2F (10 мкМ) | 0,25 | 100 нмоль |
| MS2R (10 мкМ) | 0,25 | 100 нмоль |
| MS2P-зонд (10 мкМ) | 0,25 | 100 нмоль |
| 2x-ПЦР фермент * | 1 | 1x |
| Объем Master Mix | 22 | |
| * Включено в режиме реального времени RT-PCR набор | ||
Дополнительный Таблица 3: Master смесь для мультиплекса в реальном времени GI / GII / MS2 норовирусной RT-PCR
| Тип управления | интерпретация результата | ||
| Образец | Отрицательный контроль | Должен быть отрицательным | |
| Положительный контроль | Должно быть положительным | ||
| Отрицательный образец | Образец является отрицательным, если каждое значение Ct является незаметного для GI / GII | ||
| Положительный пример | Значения Ct (GI / GII) обоих повторах составляет <38; это (произвольно) отсечение должно быть определено экспериментально для каждой платформы реального времени ПЦР и набора | ||
| Ориентировочное положительная проба | Образец предварительно положительным, если значение Ct (GI / GII) одной повторности является <38 | ||
| Внутренний контроль процесса (MS2) | Образцы с пороговым значением цикла ≥32 F (Ct)или MS2 должны быть повторно неразбавленным и разводили 1/10. | ||
| параметр | Приемлемое значение | ||
| Стандартная кривая с использованием норовирус РНК - транскриптов | R 2 | > 0,97 | |
| коэффициент полезного действия | 90% до 115% | ||
Дополнительный Таблица 4: Элементы управления для включения в каждом тесте RT-КПЦР для обнаружения норовируса в пробах окружающей среды мазков.
| Компонент | Конечная концентрация | об / RXN (мкл) |
| 5x ОТ-ПЦР буфер | 1x | 5.00 |
| дНТФ смеси (10 мМ) 0,4 мМ | 1,00 | |
| Фермент смесь (RT и Taq) | 1,00 | |
| Форвард Праймер | 0,5 мкМ | 0,50 |
| Обратный праймер а | 0,5 мкМ | 0,50 |
| ингибитор РНКазы (20 ед / мкл) | 20 U | 1,00 |
| РНКазы вода | 11.00 | |
| Общий объем | 20.00 | |
| прямой и обратный праймер наборы для GI и GII группы являются Cog1F + G1SKR и Cog2F + G2SKR соответственно. | ||
| Второй раунд RT-PCR | ||
| Компонент | Конечная концентрация | об / RXN (мкл) |
| 5x ОТ-ПЦР-буфера < / TD> | 1x | 5.00 |
| дНТФ смеси (10 мМ) | 0,4 мМ | 1,00 |
| Фермент смесь (RT и Taq) | 1,00 | |
| Прямой праймер б | 0,5 мкМ | 0,50 |
| Обратный праймер б | 0,5 мкМ | 0,50 |
| ингибитор РНКазы (20 ед / мкл) | 20 U | 1,00 |
| РНКазы вода | 14.00 | |
| Общий объем | 23,0 | |
| б прямого и обратного праймеров наборы для GI и GII группы являются G1SKF + G1SKR и Ring2 праймер + G2SKR соответственно. | ||
| Примечание: выше informaion был немного изменен из оригинальной статьи 19 | ||
| Фаза I | поле выборки | 1. Проверьте комплекты макропена мазков (например, дата окончания срока действия, трубки утечки, и тампон влажности) |
| 2. Тампон поверхность (площадь поверхности предел до ≤100 дюйм 2 (645 см 2)) | ||
| 3. Поместите тампоны в транспортные трубки и затяните крышки надежно, чтобы предотвратить утечку во время транспортировки | ||
| 4. Поместите тампон комплект в Ziplock мешок | ||
| Фаза II | Образец для транспортировки и хранения | 1. Семплированные мазки следует хранить -70 ° C (или -20 ° С) |
| 2. Транспортировка тампонобразцы в лабораторию при температуре 0-4 ° C (холодные-пакеты) в изолированном контейнере и корабля в течение 48 ч коллекторных тампоны | ||
| Фаза III | РНК etraction | 1. Проверьте буфера для лизиса (например, данные о завершении срока действия) |
| 2. Добавить MS2 в качестве внутреннего контроля в буфере для лизиса перед добавлением 100% этанола | ||
| Очистка РНК и концентрация | 3. скамейка Clean лаборатории и мелкого оборудования с использованием раствора для удаления РНК РНКазы | |
| 4. Изменение перчатки часто во время шагов, чтобы избежать РНК перекрестного загрязнения | ||
| Этап IV | ОТ-ПЦР анализ (QA / QC) | 1. Включить количественно Norovirus транскриптов РНК (GI и GII) для каждого анализа RT-КПЦР для контроля изменений в значениях Ct для каждого прогона ПЦР |
| 2.Используйте отсутствие сигнала MS2 контролировать наличие ингибиторов ПЦР |
Дополнительный Таблица 6: Перечень документов для процедуры контроля заболеваний отбор проб окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Норовирусы имеют 50% человеческого инфекционную дозу между 18 и 10 3 вирусных частиц 20. Поэтому, даже загрязнение низкого уровня поверхности может представлять опасность для здоровья населения. Некоторые аспекты протокола отбора проб тампоном были оценены в том числе: 1) различные мазков материалы, 2) хранение состояние тампонов во время транспортировки, 3) концентрации вирусной РНК, и 4) колифага MS2 как внутреннего контроля экстракции.
До недавнего времени только производительность тампоны из хлопка, полиэстера, нейлона и антистатической салфеткой) не были оценены и предложены для использования в полевых условиях 13, 14, 15, 21, 22. Из них ватные тампоны были по 15216 протоколу ISO для обнаружения норовируса и Вирус гепатита А от поверхностей для приготовления пищи и фомиты 23 рекомендуется. Каккогда - либо, имеются ограниченные данные по проведению испытаний на ватные тампоны в полевых условиях с большими высокочастотными сенсорными поверхностями , такими как дверные ручки, компьютеры и унитазы , которые были часто замешаны в передаче норовирусами 24, 25. Кроме того, размер этих экологических поверхностей превышает способность волоконно-тампоны. В нашем исследовании мы показали , что макропена тампоны, которые имеют большую голову тампон , чем волоконно-наконечник тампоны, имеют более высокий уровень восстановления для человека норовируса при отборе проб окружающей среды поверхностей с площадью до 700 см 2.
Норовирусы в растворе относительно нестабильными при температуре окружающей среды и требуют по меньшей мере охлаждения. Таким образом, доставка в лабораторию должно происходить при температуре 0-4 ° С в течение 48 часов после сбора из мазков. Объем образца, который, как правило, могут быть протестированы в ПЦР-реакции, гораздо меньше, чем от суммыобразец после элюции с тампоном (3-5 мкл по сравнению с 5-10 мл), который, без концентрации, значительно снижает частоту позитивности. В окружающей среде вирусологии, полиэтиленгликоль (PEG) успешно используется для концентрирования вирусов из больших объемов экологических вод. Тем не менее, объемы до 10 мл можно легко извлечь и концентрируют с помощью Midi спиновых столбцов объемов столь же низко как 250 мкл, и дополнительно концентрируют в 10 раз с высокой добычи нефти с использованием спиновых столбцов.
Несмотря на то, РТ-КПЦР является золотым стандартом для чувствительного обнаружения и определения количества норовирусной, чувствительность этих анализов может быть легко влияет наличие ингибиторов ПЦР, которые совместно извлеченной из образцов тампона. Таким образом, включение элемента управления экстракции, таких как колифага вируса MS2 частиц, в мультиплексной ПЦР формате, который обнаруживает как Norovirus, а также MS2, помогает контролировать наличие ингибирования ПЦР и оценки вариации среди различных экспериментов. </ Р>
Тестируемые переменные метода лабораторной проверки имеют решающее значение для определения дискриминационного способности метода испытаний и дополнительно переведены в предположительной эффективности выборки поля метода. Принимая реального мира полевых условиях (например, задержка выборки, большие площади поверхности до 700 см 2) во внимание, предел обнаружения норовируса составлял 3,4 log 10 (нержавеющая сталь) и 4 log 10 (сиденье для унитаза) копии норовирус на поверхности сэмпл 6. Следовательно, отрицательные результаты мазка не являются окончательными, что ни один вирусное загрязнение не произошло. Клинической и эпидемиологической информации о норовирусной болезни всегда козыри на окружающую выводах 2, 6.
Наши данные из круизного судна показали, что высокие сенсорные поверхности, такие как телефоны, компьютерные клавиатуры, и дверные ручки положительный результат на норовируса в каютах, где людис вирусным гастроэнтеритом сообщили остался. Эти поверхности либо стали загрязненными в результате прямого контакта или косвенно через капельки , произведенных в течение смыва туалетов или приступы рвоты 6, 7, 8, 9, 10.
В заключение, обнаружение норовируса на экологических поверхностях, используя этот недавно разработанный протокол тампон может помочь в определении уровня загрязнения окружающей среды во время вспышек, выявления вируса, когда клинические образцы не доступен и в мониторинге эффективности методов очистки. Волокно наконечником тампоном (хлопок и вискоза) на основе методов отбора проб поверхностных широко используются для исследования других кишечных вирусов (например , ротавирус и аденовирус) 27, 28, 29. Учитывая вышекоэффициент полезного действия для восстановления норовируса из макропена мазков над этими волокнами тампоны 6, мы ожидали , что макропена тампоны смогут обнаружить другие кишечные вирусы , а также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Generic name for kits | |||
| Macrofoam swab | Premoistened EnviroMax Swab kit | Puritan | 2588060PFUW |
| RNA Lysis buffer | CDC UNEX buffer | Microbiologics | Cat No MR0501 |
| RNA extraction spin column | Midi column | Omega Biotek | Cat No R6664-02 |
| RNA purification spin column | Zymol RNA Clean and Concentrator kit | Zymo Research | Cat No R1016 |
| Real time RT-PCR kit | AgPath kit One-Step RT-PCR Kit | Life Technologies | Cat No 4387391 |
| Conventional RT-PCR kit | Qiagen one step RT-PCR kit | Qiagen kit | Cat No 210212 |
| Gel extraction kit | Qiagen QIAquick gel extraction kit | Qiagen kit | Cat No 28704 or 28706 |
| Coliphage MS2 | ATCC | Cat No 15597-B1 | |
| RNA run-off transcripts | |||
| Realtime PCR platform | Applied Biosystems | Model ABI 7500 | |
| Optical 96-well reaction plate | Thermo Scientific | Cat No 4316813 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Thermo Scientific | Cat No 4306311 |
References
- Isakbaeva, E. T., et al. Norovirus transmission on cruise ship. Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).
- Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. Environmental transmission of norovirus gastroenteritis. Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).
- Malek, M., et al. Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005. Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).
- Atmar, R. L., et al. Norwalk virus shedding after experimental human infection. Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).
- Norovirus gastroenteritis. N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).
- Park, G. W., et al. Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).
- Barker, J., Jones, M. V. The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet. J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting. PloS one. 10, 0134277 (2015).
- Atmar, R. L., et al. Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus. J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).
- Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies. J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).
- Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007. MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).
- Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses. J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).
- Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites. Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).
- Taku, A., et al. Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces. J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).
- Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces. Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).
- Herzog, A. B., et al. Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).
- Vega, E., et al. CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States. Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).
- Rolfe, K. J., et al. An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping. J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).
- Kittigul, L., et al. Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study. J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).
- Teunis, P. F., et al. Norwalk virus: how infectious is it. J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).
- Wollants, E., et al. Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips. J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).
- Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites. Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).
- Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR. International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).
- Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).
- Wu, H. M., et al. A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).
- Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review. Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).
- Gallimore, C. I., et al. Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit. J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).
- Ganime, A. C., et al. Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units. Am J Infect Control. , (2016).
- Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings. Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).
